ndice

Pg. Resumen ................................................................................................................... 3 Introduccin............................................................................................................. 4 Objetivo .................................................................................................................... 6 Materiales y mtodos .............................................................................................. 6 1. Pretratamiento del material lignocelulsico ............................................. 6 2. Microorganismo utilizado y medios de cultivo ......................................... 7 3. Ensayos de fermentacin ............................................................................ 8 a. Efecto de actico y furfural ............................................................ 8 b. Pruebas de adaptacin .................................................................... 8 c. Efecto del tamao de inculo y dilucin de la fraccin lquida... 8 d. Comparacin entre la cepa parental y adaptada ......................... 8 4. Determinaciones analticas ......................................................................... 9 a. Determinacin de azcares de la fraccin lquida........................ 9 b. Determinacin de productos de degradacin .............................. 9 presentes en la fraccin lquida. c. Determinacin de etanol ................................................................. 9 5. Realizacin de experimentos y anlisis estadstico de los resultados...... 9 Resultados y Discusin............................................................................................ 10 1. Composicin de la fraccin lquida............................................................ 10 2. Efecto de la concentracin de cido actico .............................................. 11 y furfural en medio sinttico 3. Ensayos con la fraccin lquida obtenida tras el pretratamiento ........... 15 a. Adaptacin ....................................................................................... 15 b. Efecto del volumen de inculo y disolucin ................................. 16 de la fraccin lquida c. Perfil de fermentacin..................................................................... 18 Conclusiones ............................................................................................................ 20 Bibliografa .............................................................................................................. 21

Adaptacin de una cepa de Saccharomyces cerevisiae a los txicos presentes en el material lignocelulsico pretratado.

Resumen. Los biocombustibles lquidos como el bioetanol, obtenidos a partir de biomasa lignocelulsica estn considerados como una de las mejores alternativas para reducir la dependencia de los combustibles fsiles y disminuir las emisiones de CO2, principal causa del efecto invernadero. Entre los procesos de produccin de etanol a partir de biomasa lignocelulsica, aquellos basados en una hidrlisis enzimtica, son los que presentan mejores perspectivas. Sin embargo, existen factores fsico-qumicos y estructurales que impiden la digestibilidad de la celulosa presente en la biomasa lignocelulsica. Por lo tanto, requiere un pretratamiento previo de la misma que altere su estructura y aumente la accesibilidad de las enzimas a la celulosa convirtindola en azcares fermentables. Entre los diferentes pretratamientos, la explosin por vapor se ha mostrado como uno de los ms eficientes debido a su bajo requerimiento de catalizadores, consumo energtico y alteracin de la estructura en residuos agrcolas. Una de las desventajas de la explosin por vapor es que durante el pretratamiento se generan una serie de compuestos solubles de degradacin de la lignocelulosa (cidos, furanos y fenoles) que actan como inhibidores tanto de las enzimas como los microorganismos. En este trabajo mediante un proceso de adaptacin gradual a medios con mayor contenido en productos de degradacin se ha conseguido que una cepa comercial de Saccharomyces cerevisiae presente una mayor productividad volumtrica en comparacin con la cepa parental.

Abstract. Liquid biofuels obtained from biomass feedstock, as ethanol, is regarded as an attractive alternative to fuel oil to reduce dependence on fossil fuels and diminish CO2 emissions, main cause of greenhouse effect. Among biomass-to-ethanol processes, those based on enzymatic hydrolysis seems to be promising. However, there are physical-chemical, structural and compositional factors that hinder the enzymatic digestibility of cellulose present in lignocellulose biomass. So, previous to enzymatic hydrolysis a pre-treatment is required is required to alter the structure of cellulosic biomass making cellulose more accessible to enzymes that convert the carbohydrate polymers into fermentable sugars. Steam explosion has been proposed as an efficient pretreatment of lignocellulosic materials due to its low use of chemicals, low energy consumption and efficient biomass disruption characteristics for agricultural residues. One of the main drawbacks of steam explosion is that during the pretreatment some soluble toxic compounds from lignocellulosic degradation (acid, furans and phenolic compounds) that might act as inhibitors of enzymes and microorganisms are generated. In this work by gradual adaptation to liquid fraction with higher content of toxic compounds a strain of commercial Saccharomyces cerevisiae resulted in higher volumetric productivity in comparison to parental strain.

Introduccin. Debido al crecimiento de la poblacin, el consumo de combustible aumenta cada da. El combustible ms usado proviene de combustibles fsiles y se prev que para el ao 2050 se haya agotado. Adems las continuas guerras en Oriente Medio han hecho que en los ltimos aos el precio del barril de petrleo se haya incrementado considerablemente. Para eliminar, en la medida de lo posible, la dependencia energtica de otros pases y reducir los gases de efecto invernadero, que han provocado un cambio climtico global, se estn buscando alternativas energticas en las energas renovables. Una solucin es el uso de energa solar en forma de biomasa (Snchez y Cardona, 2008). Una de ellas es el bioetanol, el cual se produce a partir de biomasa renovable, produce menos emisiones nocivas que los combustibles fsiles y genera una cantidad neta de CO2 nula. Aunque en los ltimos aos se han logrado avances significativos en el desarrollo de tecnologas de produccin de biocombustibles lquidos, los principales inconvenientes para su comercializacin siguen siendo el elevado coste de produccin y la disponibilidad de las materias primas. En la actualidad, el bioetanol se obtiene a partir de productos agrcolas como la caa de azcar, del almidn de maz, etc. Este bioetanol de primera generacin tiene un problema ya que tiene un conflicto con el mercado alimentario, porque compite con ste en el precio de la materia prima y hace que los productos bsicos de la dieta, obtenidos a partir de estos productos, aumenten de precio. Por otro lado, para lograr un precio competitivo del etanol respecto a la gasolina, se deben reducir los costes de produccin comenzando por el precio de la materia prima, ya que supone entre un 60 y 70% del coste final de etanol (Whyman, 2001, Klein-marcuschamer y col., 2010). Por este motivo la utilizacin de materias primas lignocelulsica aparece como una opcin prometedora para garantizar la obtencin de etanol a bajo coste aumentando la rentabilidad del proceso y posibilitando que este producto sea adoptado por la industria. Este es el llamado bioetanol de segunda generacin, se trata de una alternativa energtica ms a los combustibles fsiles. Se obtiene a partir de los residuos de material lignocelulsico por lo que no competir con los alimentos bsicos en el precio y adems es una materia prima ms barata, ya que es un material que normalmente se desecha. Algunos ejemplos de biomasa lignocelulsica son productos de residuos de la industria forestal, industria agrcola (paja de trigo, que es el cultivo ms ampliamente cultivado) y residuos municipales. Cabe destacar que la lignocelulosa es el biopolmero ms abundante en la tierra (Snchez y Cardona, 2008). La biomasa lignocelulsica presenta una compleja estructura, constituida por tres componentes mayoritarios, celulosa, hemicelulosa y lignina, junto con otros componentes minoritarios como extractivos, protenas, cenizas, etc. La celulosa es un homopolmero de unidades de glucosa unidas por enlaces (1,4) formando cadenas lineales que se unen entre s mediante puentes de hidrgeno. Estas cadenas se disponen en sucesivas capas situadas en el mismo plano, amontonadas unas encima de otras, formando una partcula tridimensional cristalina (Zhang y Lynd, 2004). Las hemicelulosas constituyen el grupo de carbohidratos fcilmente hidrolizables de la pared vegetal, formado por todos los polisacridos no celulsicos y sustancias relacionadas tales como, por ejemplo, los cidos urnicos y sus derivados (Ericksson y col., 1990). La hemicelulosa se clasifica generalmente en funcin del monmero principal del esqueleto hidrocarbonado. Actualmente, se reconocen tres grupos bien definidos de hemicelulosas, como componentes individuales o colectivos, de todos los materiales lignocelulsicos: los xilanos, mananos y galactanos. La lignina es un polmero tridimensional amorfo, originado por la polimerizacin deshidrogenativa de unidades de fenilpropano ligadas por diferentes tipos de enlace que se alternan de forma desordenada.

Para la produccin de etanol a partir de materiales lignocelulsicos se han desarrollado mltiples procesos en los que la hidrlisis de la celulosa puede realizarse mediante catalizadores cidos o enzimticos. Sin embargo, actualmente se estn realizando considerables esfuerzos enfocados al desarrollo de los procesos catalizados enzimticamente. Mediante estos procesos las materias primas ligocelulsicas son transformadas a azcares fermentables que posteriormente son transformados a etanol. El material lignocelulsico es recalcitrante a la hidrlisis y necesita de un paso previo antes de ser convertido a bioetanol. El proceso de conversin va enzimtica de la lignocelulosa hasta bioetanol tpicamente se lleva a cabo en cuatro etapas: pretratamiento, hidrlisis enzimtica, fermentacin alcohlica y destilacin (Parawira y Tekere, 2011). Antes de la aplicacin de enzimas que catalicen la hidrlisis de los polisacridos es necesario algn tratamiento previo de la biomasa que modifique la estructura del material y lo haga ms accesible a la accin de las enzimas. El objetivo general es reducir la cristalinidad de la celulosa, disociar el complejo celulosa-lignina, aumentar el rea superficial accesible y disminuir la presencia de aquellos compuestos que dificultan la hidrlisis. Existen en la bibliografa diversos pretratamientos (Yang y Whyman, 2008; Carvalheiro y col, 2008; Alvira y col, 2010) de los cuales, el pretratamiento de explosin por vapor es considerado como un procedimiento eficaz para alterar el empaquetamiento de las fibras de celulosa y aumentar as la accesibilidad de las enzimas celulolticas. El pretratamiento se lleva a cabo bajo varias condiciones para romper y eliminar la lignina, despolimerizar la celulosa y hemicelulosa y hacer la biomasa disponible para las enzimas hidrolticas y su posterior fermentacin. El pretratamiento de explosin por vapor (autohidrlisis), consiste en someter a la biomasa a una temperatura de 160 230 C, mediante la adicin de vapor saturado durante un tiempo determinado (1-15 minutos) tras el cual se produce una rpida descompresin. Esto hace que la estructura de la biomasa se expanda y se produzca la hidrlisis de los grupos acetilos de la hemicelulosa, producindose as la solubilizacin de la hemicelulosa y formndose cidos que catalizarn otras reacciones de hidrlisis. Esta tcnica probablemente sea la ms utilizada para llevar a cabo el pretratamiento del material, ya que consume bajo tiempo de produccin y no usa productos qumicos. Cuando el material lignocelulsico es pretratado con procesos termo-qumicos, como es la explosin por vapor, se generan compuestos inhibitorios para las clulas de levadura, que afectaran a la viabilidad de la clula, sus funciones metablicas y a la produccin de etanol disminuyendo su productividad y rendimiento, afectando econmicamente al proceso de produccin de bioetanol. Estos compuestos son productos de degradacin producidos de los tres principales compuestos de la lignocelulosa, que son, celulosa, hemicelulosa y lignina. La naturaleza y la concentracin de los compuestos van a variar ampliamente dependiendo de las condiciones del pretratamiento (tiempo, pH, temperatura, etc.) y del material lignocelulsico que se haya usado (Larsson, 2000). Los compuestos mayoritarios presentes que son txicos para la levadura son: Furfural, proveniente de la deshidratacin de las pentosas. HMF derivado de la deshidratacin de las hexosas. cidos alifticos como son: Actico, frmico y levulnico que se producen por la desacetilacin de la hemicelulosa o la ruptura de HMF. Los grupos acetilo presentes en la hemicelulosa tambin son liberados como cido actico. La lignina es degradada a compuestos aromticos, fenoles de bajo peso molecular, como pueden ser siringaldehdo, 4-hidroxibenzaldehdo y vainillina. Furfural, HMF y cido actico son los productos de degradacin que a menudo estn presentes y son fcilmente detectables, por lo

que se usa para medir los efectos inhibitorios del compuesto lquido. Sin embargo, stos no son los compuestos ms inhibitorios, y por supuesto el efecto txico se debe a la suma de todos los compuestos inhibitorios presentes que determinan la productividad y rendimiento de etanol. Los compuestos anteriormente citados que se producen en el pretratamiento tienen efecto txico sobre los microorganismos utilizados en los procesos de fermentacin del material lignocelulsico. Entre los efectos producidos por estos compuestos se encuentran: reduccin de la tasa especfica de crecimiento; disminucin de la productividad volumtrica de etanol; descenso de la productividad especfica de etanol y disminucin de la produccin de biomasa (Larsson, 2000; Palmqvist y col., 1999). Para que la productividad y el rendimiento en la produccin de etanol sea mayor se puede realizar un paso previo de detoxificacin de los compuestos txicos. Se podran eliminar estos compuestos mediante procesos fsicos, qumicos, enzimticos o biolgicos. Pero esto supondra aadir un paso ms al proceso industrial, lo que conllevara un aumento en el coste del proceso y un aumento en la cantidad de productos de desecho. La mejor alternativa podra ser el uso de microorganismos o enzimas, capaces de degradar los compuestos txicos (Hahn-Hagerdal y col., 2007). Tambin se est estudiando la adaptacin de los microorganismos a estos compuestos txicos (TomsPej y col., 2010). Aunque la detoxificacin qumica, fsica, enzimtica y biolgica ha dado buenos resultados se desea conseguir una buena adaptacin ya que as estos microorganismos adaptados, no solo reduciran el coste de detoxificacin sino que tambin evitaran la prdida de azcares fermentables. Saccharomyces cerevisiae tiene una capacidad innata para tolerar algunos compuestos como pueden ser los fenoles y furanos, convirtindolos en compuestos menos perjudiciales (Almeida y col, 2007) El microorganismo ms utilizado para la fermentacin de la lignocelulosa y as su conversin hasta bioetanol es la levadura S. cerevisiae, se sabe que es el mejor microorganismo para este proceso, porque produce alto rendimiento de etanol, posee gran tolerancia a altos niveles de etanol, por encima del 10% y es capaz de tolerar ciertas concentraciones de compuestos inhibitorios producidos en el pretratamiento ya que posee vas metablicas para su degradacin (Almeida y col, 2007). Una desventaja de la utilizacin de este microorganismo es que no es capaz de fermentar los azcares de 5 tomos de carbonos, aunque este problema se est solventando con la fermentacin conjunta con otros microorganismos (Chen, 2011), e incluso se est llevando a cabo procesos de mejora gentica en S. cerevisiae para poder fermentar las pentosas. Objetivo El objetivo de este trabajo es la adaptacin de una cepa comercial de S. cerevisiae, mediante un proceso de adaptacin gradual, a la fraccin liquida obtenida tras el pretratamiento de explosin a vapor de paja de trigo.

Materiales y mtodos. 1. Pretratamiento del material lignocelulsico. El pretratamiento se llev a cabo mediante la tcnica de explosin por vapor con paja de trigo a 210 C durante 5 minutos en una planta piloto localizada en las instalaciones del CIEMAT (Ballesteros y col., 2004) (Figura1). Despus del pretratamiento el material pretratado o

slurry se filtr obtenindose por un lado una fraccin lquida y por otro una fraccin slida. Para el estudio que trata este trabajo se utiliz la fraccin lquida determinndose su composicin en cuanto a azcares solubles y productos de degradacin como se indica posteriormente.

Figura 1. Planta de pretratamiento de explosin por vapor

2. Microorganismo utilizado y medios de cultivo. La levadura utilizada en el presente trabajo es una cepa industrial de S. cerevisiae (Ethanol Red Fermentis, Marcq en Baroeul,Cedex, France). Previamente a su uso, la levadura se rehidrat en cinco veces su peso con agua destilada estril y posteriormente se incub a 35C, 150 rpm durante 24 horas en medio de cultivo sinttico. Se utilizaron dos tipos de medio de cultivo: sinttico y la fraccin lquida obtenida tras el pretratamiento (en diferentes concentraciones). La composicin del medio sinttico fue de 50 g/L de glucosa, 2g/L de extracto de levadura, 7,5 g/L de sulfato amnico, 1g/L de fosfato potsico y 0,3g/L de sulfato magnsico. El medio de cultivo sinttico se esteriliz en autoclave a 121 C durante 20 min. Esta misma concentracin de glucosa y sales fue aadida a la fraccin lquida utilizada en los ensayos de adaptacin. Para evitar la contaminacin del medio de cultivo real, se prepar en el momento de su utilizacin y se conserv en frigorfico a 4 C. La concentracin de la fraccin lquida se realiz en un rotavapor Laborota 4000-efficient. Mediante esta tcnica, la fraccin lquida, obtenida mediante la tcnica de explosin por vapor, se concentr hasta un 20% del volumen inicial. Esta fraccin lquida concentrada se utiliz para obtener el medio de crecimiento real que se utiliz para el crecimiento del microorganismo en el proceso de adaptacin y para realizar diferentes ensayos de fermentacin El pH de todas las muestras se ajusto a 5 con NaOH al 40% en un pH-metro GLP21 (Crisol).

El contaje de clulas se llev a cabo en un contador celular Beckman Coulter Vi-cell XR utilizando el Pack de reactivos Vi-cell. Se trata de una tcnica basada en un colorante diferencial en el que el aparato toma una serie de imgenes que sern analizadas en funcin de los criterios establecidos. La muestra se mezcla con el reactivo de trypan blue, las clulas muertas han de tomar el colorante y aparecer de un color azul mientras que las clulas vivas no toman este colorante y se ven translucidas. Todos los ensayos realizados en este trabajo se llevaron a cabo bajo condiciones no estriles.

3. Ensayos de fermentacin. Los ensayos de fermentacin se realizaron en matraces Erlenmeyer de diferente volumen dependiendo del ensayo, incubndose a 35 C en un agitador orbital a 150 rpm. a. Efecto de actico y furfural. Para ver el efecto de dos de los compuestos txicos presentes en el material lignocelulsico pretratado, se realiz un ensayo de fermentacin en medio de crecimiento sinttico ajustado a pH 5 al que se aadieron diferentes concentraciones de cido actico y furfural conforme a un diseo factorial en tres bloques con 2 puntos centrales. Los matraces se inocularon con 1g/L de inculo crecido durante 16 horas en medio sinttico. Tras 24 horas de fermentacin se tom muestras del medio determinndose produccin de etanol y el nmero de clulas totales y clulas viables que haban crecido. b. Pruebas de adaptacin La adaptacin de S. cerevisiae se llev a cabo en matraces Erlenmeyer de 50 mL con 10 mL de medio de fraccin lquida a la que se aadieron glucosa y sales como se coment anteriormente. La adaptacin se llev a cabo de forma gradual con diferentes diluciones de la fraccin lquida concentrada. c. Efecto del tamao de inculo y concentracin de la fraccin lquida. En matraces Erlenmeyer con diferentes concentraciones de medio de crecimiento real y diferentes cantidades de inculo se realiz un ensayo en el que trascurridas 24 horas se tomaron muestras para medir la cantidad de etanol y el nmero de clulas totales y clulas viables. d. Comparacin entre la cepa parental y adaptada. En matraces Erlenmeyer con diferentes concentraciones de la fraccin lquida se realiz un perfil de fermentacin tomando muestra cada dos horas de la cepa parental y la cepa adaptada, y cuantificndose tanto el nmero de clulas como la produccin de etanol. Los matraces fueron inoculados con 0,6 g/L de inculo. Las concentraciones de la fraccin lquida utilizadas fueron de 20%, 40% y 60%.

4. Determinaciones analticas. a. Determinacin de azcares de la fraccin lquida. Los azcares (glucosa, galactosa, arabinosa y xilosa) fueron analizados mediante un cromatgrafo de lquido HPLC, Waters, modelo 590, equipado con un detector de ndice de refraccin, Waters 410, una columna cromatogrfica Aminex HPX87P, resina en forma inica de plomo de 300 mm x 7,8 mm de dimetro interno, de la firma comercial Bio-Rad Labs, CA, USA. La temperatura de trabajo fue de 85 C y como fase mvil se utiliz agua de calidad reactiva Millipore a un flujo de 0,6 mL/min. b. Determinacin de productos de degradacin presentes en la fraccin lquida. El anlisis cualitativo y cuantitativo de los compuestos, vainillina, siringaldehdo, 4hidroxibenzaldehdo, cido cumrico, cido frmico, furfural y 5-hidroximetilfurfural (HMF), se realiz mediante cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) en un cromatgrafo de lquidos Hewlett Packard (HP) modelo 1100 con un detector UV de fotodiodos (Diodo Array) HP 1040A. Se utiliz una columna cromatogrfica Aminex HPX87H (Sulfonated divinyl benzene styrene copolymer), resina en forma inica de hidrgeno de 300 mm x 7,8 mm de dimetro interno, (Bio-Rad Labs, CA, USA). La temperatura de trabajo fue de 55 C. La fase mvil fue una mezcla (v/v) de 82% cido sulfrico 5 mM y 18% acetonitrilo a un flujo de 0,3 mL/min. La utilizacin de un detector de fotodiodos permite hacer un barrido total de longitudes de onda, obtenindose el espectro de absorcin UV completo para cada pico cromatogrfico. Esta tcnica permite medir absorbancias frente a tiempos de retencin y longitudes de onda simultneamente, lo que proporciona resultados a diferentes longitudes de onda para cada compuesto contenido en la muestra, y permite obtener un anlisis cuantitativo para cada compuesto a la longitud de onda de mxima absorcin. El rango de longitudes de onda en el que han sido realizados los anlisis fue de 200-320 nm. La determinacin analtica de los cidos actico y frmico se realiz mediante un cromatgrafo de lquidos HPLC, Waters, modelo 590, provisto de un detector de ndice de refraccin, Waters 410. La separacin cromatogrfica se realiz mediante una columna de acero inoxidable, Aminex HPX-87H (Bio-Rad Labs, CA, USA) de 300 mm x 7.6 mm de dimetro interno. La fase mvil utilizada fue cido sulfrico 5 mM, a un flujo de 0,6 mL/min y 65 C de temperatura de columna. c. Determinacin de etanol. El etanol se analiz en un cromatgrafo de gases Hewlett Packard 5890 serie II, equipado con un inyector automtico Agilent serie 6890, un detector de ionizacin de llama (FID) y una columna Carbowax 20M (2 m x 1/8 in) a una temperatura de 85 C. La temperatura del detector e inyector fue de 150 C.

5. Anlisis estadstico de los resultados. El anlisis estadstico de los resultados se llev a cabo usando el software comercial Statgraphics Plus v.5.0 (ManugisticsInc., Rockville, MD).

Resultados y Discusin. 1. Composicin de la fraccin lquida. La paja de trigo fue pretratada a 210 C 5 min. Despus del pretratamiento se obtiene un slurry que lleva en su composicin slidos solubles y slidos insolubles. En la fraccin lquida, obtenida una vez separada de los slidos insolubles mediante filtracin a vaco, se analizaron tanto los azcares solubles como los productos de degradacin y cuya composicin se muestra en la tabla 1.

Tabla 1. Composicin de la fraccin lquida obtenida despus del pretratamiento mediante explosin por vapor de paja de trigo Compuesto (g/L) Azcares Glucosa Xilosa Galactosa Arabinosa Productos de degradacin cido frmico cido actico HMF Furfural 4-hidroxibenzaldehdo Vainillina Siringaldehdo cido cumrico cido ferlico Lquido Explosin por vapor Liquido Explosin por vapor Sin concentrar Concentrado 0,2 0,66 0,12 0,36 0,22 0,39 0,01 0,12 0,003 0,01 0,005 0,02 0,02 0,8 2,92 1,52 1,52 0,79 1,02 0,07 0,05 0,01 0,04 0,02 0,05 0,06

Durante el pretratamiento de explosin por vapor, el vapor saturado a elevada temperatura produce la hidrlisis de los restos acetilos de las hemicelulosas, liberando cido actico, que crea unas condiciones ligeramente cidas y, a la temperatura del proceso, cataliza la hidrlisis de la hemicelulosa (autohidrlisis). En las condiciones en las que se realiza el pretratamiento se produce la solubilizacin de los compuestos procedentes de la hemicelulosa y la lignina. El prehidrolizado de paja de trigo explosionada analizado est formado por una mezcla de azcares hidrolizables (glucosa, xilosa, etc.) y productos de degradacin, como cidos carboxlicos de cadena corta, furanos y fenoles. Respecto a los azcares, el principal azcar detectado corresponde a la xilosa, encontrndose en una concentracin media de 0,66 g/L, que se corresponde con un 49,25 % de los azcares totales presentes en el prehidrolizado. Esta xilosa procede de la hidrlisis de las hemicelulosas que al ser la fraccin mas lbil se hidroliza en estas condiciones de pretratamiento.

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El tipo y concentracin de los compuestos txicos originados durante el pretratamiento van a depender de la materia prima y del pretratamiento utilizado (temperatura, tiempo de residencia, empleo de catalizadores cidos). El cido actico, procedente de la hidrlisis de los grupos acetilo de la fraccin hemicelulsica, fue el compuesto mayoritario encontrado, en una concentracin media de 0,39 g/L. La concentracin media de cido frmico, procedente de la descomposicin en condiciones cidas del furfural e HMF, fue de 0,22 g/L. Puesto que no se detect cido levulnico en el prehidrolizado, se podra pensar que el cido frmico procede fundamentalmente de la degradacin del furfural. El furfural se encontr en una concentracin de 0,12 g/L. Este compuesto procede de la degradacin de las pentosas, xilosa mayoritariamente, y arabinosa. Otro derivado furnico detectado fue el 5-hidroximetilfulfural (HMF) en una concentracin media de 0,01 g/L. Este compuesto se origina como consecuencia de la degradacin de hexosas que se liberan principalmente a partir de la fraccin hemicelulsica que, en el caso de las biomasas herbceas son minoritarias, lo que explicara la baja concentracin de HMF detectada en el prehidrolizado. Durante el pretratamiento, una parte de la lignina tambin se degrada originando gran variedad de compuestos fenlicos, que pueden estar en forma de monmeros, dmeros o polmeros con gran variedad de sustituyentes. Estos compuestos incluyen cidos, aldehdos y alcoholes aromticos. Un derivado fenlico detectado en el prehidrolizado fue el cido 4hidroxibenzoico, en una concentracin de 3 mg/L. Este compuesto se origina por rotura de los enlaces ster que lo unen a los alcoholes cinmicos presentes en la lignina (Sjstrm, 1993). Adems se detectaron otros compuestos fenlicos en el prehidrolizado como los derivados de los cidos cinmicos: cido ferlico (20 mg/L) y cido cumrico (20 mg/L) ambos compuestos son caractersticos de materiales herbceos en los que se encuentran esterificados actuando de puente de unin entre la lignina y la hemicelulosa y, en el caso del cido ferlico, adems puede presentar uniones tipo ter (Sun y col., 2002). Como puede apreciarse, todos los compuestos analizados se encuentran en una mayor concentracin en la fraccin liquida concentrada excepto el furfural, cuya concentracin es menor debido a que al ser un compuesto voltil parte se evapora durante el proceso.

2. Efecto de la concentracin de cido actico y furfural en medio sinttico. Para estudiar el efecto de los compuestos txicos presentes en el material lignocelulsico pretratado de paja de trigo en S. cerevisiae, se seleccionaron dos compuestos que en la bibliografa se haba demostrado que afectaban a S. cerevisiae en su viabilidad y por lo tanto en la produccin de etanol. Los compuestos seleccionados fueron cido actico y furfural, que corresponden adems con dos de los compuestos de degradacin que se encuentran en mayor concentracin en el hidrolizado obtenido despus del pretratamiento. En primer lugar se realiz un ensayo en medio sinttico al que se le aadieron diferentes concentraciones de cido actico y furfural como se muestra en la tabla 2. Con el fin de estudiar el efecto de la concentracin de ambos compuestos, se aplic un diseo experimental factorial con tres bloques y 2 puntos centrales por bloque.

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Tabla 2. Concentraciones de cido actico y furfural y parmetros de fermentacin estudiados (concentracin de etanol, clulas totales, clulas viables y porcentaje de viabilidad). Bloque COMPUESTOS Ac. Furfural Actico (g/L) (g/L) 2 2 4 3 6 4 4 3 4 3 4 2 6 3 2 4 4 3 4 3 6 2 2 3 4 4 4 3 4 3 PARMETROS Totales/mL Viables/mL Viabilidad (x 106) (x106) (%) 75,3 84,6 18,5 83,7 88,5 79,3 66,3 61,5 74,6 73,7 69,6 92,0 17,2 93,4 88,2 36,7 55,0 6,9 54,3 58,3 39,3 33,8 23,8 41,8 37,2 30,5 49,4 4,9 58,7 57,6 48,8 68,0 37,3 65,9 65,9 49,5 51,0 38,7 56,0 50,4 43,8 53,7 28,7 62,8 65,4

Etanol (g/L) 20,1 18,8 2,4 18,6 18,7 18,5 19,1 18,1 20,1 18,9 19,0 19,1 2,2 18,7 19,4

En la figura 2 se muestra el grafico de Pareto obtenido en el anlisis de los efectos del acido actico y furfural sobre la produccin de etanol por parte de S. cerevisiae la produccin a las 24 horas de fermentacin. Igualmente en las figuras 3 y 4 se muestra los grficos de contorno y superficie respuesta respectivamente.

B:Furfural BB AB+block A:Actico AA 0 2 4 6 8

+ -

Figura 2. Grfico de Pareto correspondiente a la produccin de etanol. A: Actico, B: Furfural

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Como puede observarse, ambos compuestos muestran un efecto negativo estadsticamente significativo sobre la produccin de etanol, siendo el furfural el que presenta un mayor efecto negativo. Igualmente se produce una interaccin negativa de ambos compuestos lo cual indica que el efecto conjunto negativo sobre la produccin de etanol es mayor que la suma de los efectos por separado. Esto se puede observar con mayor claridad en la figuras 3 y 4 donde un aumento simultneo de la concentracin de ambos compuestos origina un descenso notable de la produccin de etanol. As, concentraciones inferiores a los 4 g/l de ambos compuestos prcticamente no muestran efecto negativo alcanzndose concentraciones superiores a los 18 g/L, mientras que concentraciones superiores a 4 g/L originan un notable descenso de la produccin obtenindose una concentracin de etanol de aproximadamente 2 g/L.

4 3.6 Furfural 3.2 2.8 2.4 2 2 3 4 Acetico 5 6

Etanol (g/L) 0.0-4.0 4.0-8.0 8.0-12.0 12.0-16.0 16.0-20.0 20.0-24.0

Figura 3. Grfico de contorno para la produccin de etanol

Etanol (g/L)

24 20 16 12 8 4 0

4 Actico (g/L)

6 2

3.6 4 2.8 3.2 2.4 Furfural (g/L)

Etanol (g/L) 0.0-3.0 3.0-6.0 6.0-9.0 9.0-12.0 12.0-15.0 15.0-18.0 18.0-21.0 21.0-24.0

Figura 4. Grfico superficie respuesta para la produccin de etanol 13

En las figuras 5, 6 y 7 se muestran los grficos de Pareto, contorno y superficie respuesta, respectivamente que presentan los efectos del furfural y cido actico sobre la produccin de clulas viables a las 24 horas de fermentacin.

BB B:Furfural A:Actico AB+block AA 0 1 2 3 4 5 6

+ -

Figura 5. Grfico de Pareto correspondiente al nmero de clulas viables. A: Actico, B: Furfural.

Como se observa en la figura 5, aunque todos los efectos son negativos, nicamente el furfural presenta un efecto estadsticamente significativo. De este modo, independientemente de la concentracin de cido actico ensayada, al aumentar la concentracin de furfural se produce una disminucin del nmero de clulas viables. As por ejemplo, para una concentracin de actico de 4 g/L y de furfural de 3 g/L el nmero de clulas viables est alrededor de 50 millones/mL. Sin embargo, para la misma concentracin de actico un aumento a 4 g/L de furfural origina un descenso del nmero de viables inferior a 5 millones/mL (tabla 2). Este efecto negativo se puede observar ms fcilmente en las figuras 6 y 7, donde se aprecia como al aumentar la concentracin de furfural se produce un notable descenso del nmero de viables.

14

4 3.6 Furfural 3.2 2.8 2.4 2 2 3 4 Acetico 5 6

Viables (10exp6) 30.0-36.0 36.0-42.0 42.0-48.0 48.0-54.0 54.0-60.0 60.0-66.0

Figura 6. Grfico de contorno para el nmero de clulas viables

60 50 40 30 20 10 0 2

Viables (10exp6) 0.0-8.0 8.0-16.0 16.0-24.0 24.0-32.0 32.0-40.0 40.0-48.0 48.0-56.0

Viables

4 5 Actico (g/L)

6 2

3.6 4 2.8 3.2 2.4 Furfural (g/L)

Figura 7. Grfico superficie respuesta para el nmero de clulas viables.

3. Ensayos con la fraccin lquida obtenida tras el pretratamiento. a. Adaptacin. Debido a las condiciones de la planta de explosin a vapor (parte del vapor condensa durante la despresurizacin) utilizada en el pretratamiento de paja de trigo, el volumen de fraccin liquida obtenido es muy superior al que se originara en un proceso real a escala industrial. Por ello, esta fraccin fue sometida a un proceso de concentracin como se coment en el apartado de materiales y mtodos.

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La adaptacin del microorganismo se realiz en matraces Erlenmeyer, utilizando un volumen de inculo relativamente bajo (0,1 g/L) e incubndose a 35 C en un orbital a 150 rpm. Las pruebas se iniciaron utilizando como medio de crecimiento la fraccin liquida (concentrada con anterioridad) diluida 5 veces y posteriormente se fueron utilizando estos medios como inculos de medios ms concentrados. De esta forma se someti a la levadura a un incremento gradual de la concentracin de txicos presentes en la fraccin lquida. As, se consigui que el microorganismo creciese en un medio compuesto por una fraccin liquida de hasta el 60% de la concentrada. Con esta cepa de S. cerevisiae adaptada se realizaron diferentes ensayos para estudiar cmo afectaban diferentes condiciones de cultivo al crecimiento y a la produccin de etanol. b. Efecto del volumen de inculo y concentracin de la fraccin lquida Para la realizacin del estudio del efecto del volumen de inculo y concentracin de la fraccin lquida, se utiliz un diseo factorial 22 con tres puntos centrales como se muestra en la tabla 3. En esta tabla se muestra adems los parmetros de fermentacin obtenidos en dicho estudio. Igualmente estos datos se muestran de forma grfica en las figuras 8 y 9.

Tabla 3: Parmetro obtenidos en los experimentos con diferentes volmenes de inculo y concentraciones de la fraccin lquida. Experiencia PARMETROS Concentracin fraccin Inculo lquida (g/L) Etanol Totales/mL Viables/mL Viabilidad (%) (g/L) (x 106) (x106) (%) 20 0,2 20,1 179,9 143,0 79,5 100 0,2 0,5 6,7 2,6 39,6 20 1 20,0 214,3 169,5 79,1 100 1 1,1 17,2 5,8 33,6 60 0,6 20,3 159,7 147,1 92,1 60 0,6 20,8 168,5 154,4 91,6 60 0,6 21,2 153,2 142,0 92,7

1 2 3 4 5 6 7

En general, independientemente del tamao de inculo se ha alcanzado un alto nmero de clulas viables en los casos en los que la concentracin de la fraccin liquida no era txica. As podemos observar cmo se alcanza un alto nmero de viables (214 millones de clulas en algunas experiencias como puede ser la experiencia 3) con el mayor tamao de inculo. En las experiencias 2 y 4 donde se utiliz una fraccin sin diluir prcticamente no se observ crecimiento, ya que se parti de 3,7 y 15,6 millones de clulas (datos no mostrados) y se ha alcanzado un valor de 6,7 y 17,2 millones de clulas respectivamente. En la figura 8 se muestra el efecto de la dilucin y la cantidad de inculo en el crecimiento de la levadura. Todas las experiencias, excepto la 2 y la 4, alcanzaron una densidad celular alta debido a que no se vio afectada la viabilidad de las clulas por los compuestos de

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degradacin txicos. En las experiencias 2 y 4 debido a la toxicidad de la fraccin lquida no se produjo un crecimiento celular. En la figura 9 se muestra el efecto de las variables estudiadas en la produccin de etanol a las 24 horas de fermentacin. Se puede observar que a las 24 horas no hay diferencia en la cantidad de etanol producido en concentraciones del la fraccin lquida del 20% y 60% (alcanzndose una concentracin de etanol superior a los 20 g/L) independientemente del tamao de inculo utilizado, mientras que cuando se emple la fraccin lquida concentrada (sin diluir) se ve afectada la produccin de etanol para cualquier tamao de inculo utilizado.

Nmero de clulas x10

250 200 150 100 50 0 1 2 3 4 5 6

viables/ml totales/ml

Experiencia

Figura 8. Efecto de la concentracin de la fraccin lquida y de la cantidad de inculo en el crecimiento (nmero clulas totales/mL y nmero de clulas viables/mL).

25 20 Etanol (g/L) 15 10 5 0 1 2 3 4 Experiencia 5 6 7

Figura 9. Efecto de la concentracin de la fraccin lquida y de la cantidad de inculo en la produccin de etanol.

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c. Perfil de Fermentacin. Con la cepa de S. cerevisiae obtenida en el proceso de adaptacin y la cepa parental se realiz un estudio comparativo utilizando como medio de fermentacin diferentes concentraciones (20, 40 y 60%) de la fraccin lquida. No se utilizaron concentraciones ms altas porque como ya se haba comprobado en el apartado anterior en una concentracin superior al 60% se reduca drsticamente la viabilidad de las clulas. Todas las muestras se inocularon con el mismo tamao de inculo de 0,6 g/L. En las figuras 10 y 11 se muestran el nmero de viables y produccin de etanol, respectivamente, obtenidos en las diferentes fermentaciones utilizando tanto la cepa adaptada como la parental. En la figura 10 se puede observar cmo la muestra fermentada con la cepa adaptada y el 20% de concentracin fue la que antes comenz a aumentar el nmero de clulas. Las dems muestras siguieron prcticamente el mismo patrn de crecimiento que la muestra de 20% de concentracin adaptada, pero algo retrasadas. A las 24 horas todas las muestras haban producido prcticamente el mismo nmero de clulas. La muestra con el 60% de concentracin e inoculada con la cepa parental fue la que ms retraso tuvo con respecto a las otras muestras, ya que an transcurridas las 24 horas, no haba alcanzado el mismo nmero de clulas.

20% (Adaptada) 20% (Parental)

40% (Adaptada) 40% (Parental)

60% (Adaptada) 60% Parental

350 300 Viables/ml x 10

6

250 200 150 100 50 0 0 5 10 15 Tiempo (h) 20 25 30

Figura 10. Clulas viables obtenidas en las fermentaciones con diferentes concentraciones de la fraccin lquida concentrada (20 % , ); (40 % , ) ; ( 60% , ). Cepa parental (lneas continas), cepa adaptada (lneas discontinas).

La produccin de etanol se observa en la figura 11. Podemos observar en este perfil de fermentacin que la cepa que comenz a producir antes etanol fue la adaptada crecida en el 20% de concentracin, alcanzando una cantidad de 21 g/L transcurridas 8 - 10 horas. Las

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dems muestras siguieron el mismo patrn de produccin de etanol pero retrasado en algunas horas respecto a esta muestra. Finalmente todas las muestras produjeron la misma cantidad de etanol. La muestra con la cepa parental y un 60% de concentracin fue ms retrasada con respecto a las otras muestras que para alcanzar el valor de 21 g/L tuvieron que transcurrir 24 horas. A mayor concentracin de la fraccin lquida mayor era la diferencia entre la cepa parental y la cepa adaptada.

20%( Adaptada) 20% (Parental)

40% (Adaptada) 40% (Parental)

60% (Adaptada) 60% (Parental)

25 20 Etanol (g/L) 15 10 5 0 0 5 10 15 Tiempo (h) 20 25 30

Figura 11. Produccin de etanol con diferentes concentraciones de la fraccin lquida concentrada (20 % , ); (40 % , ) ; ( 60% , ). Cepa parental (lneas continas), cepa adaptada (lneas discontinas).

En las figuras 12 y 13 se muestra de un modo mas detallado las diferencias entre la cepa parental y la cepa adaptada para la misma concentracin del 60% de fraccin lquida. Como se puede observar, la cepa parental lleva un considerable retraso en el crecimiento y en la produccin de etanol. La cepa adaptada consigui producir su mximo de nmero de clulas a las 10 horas mientras que la cepa parental a las 24 horas an no haba alcanzado el mismo nmero que la adaptada (figura 12). Transcurridas 10 12 horas la produccin de etanol por parte de la cepa adaptada haba obtenido su mximo con un valor de 21 g/L mientras que para que se alcanzase este valor por parte de la cepa parental tuvieron que transcurrir 24 horas de fermentacin. (Figura 13).

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250 Viables/ml x 10 6 200 150 100 50 0 0 10 Tiempo (h) 20 30

Adaptada Parental

Figura 12. Nmero de viables de la cepa adaptada y parental en un medio con una concentracin de la fraccin liquida del 60%.

25 20 Etanol (g/l) 15 10
Adaptada

5 0 0 10 Tiempo (h) 20

Parental

30

Figura 13. Produccin de etanol de la cepa adaptada y parental en un medio con una concentracin de la fraccin liquida del 60%.

Conclusiones. La fraccin lquida obtenida tras el pretratamiento contiene no solo azcares sino una serie de productos de degradacin que impiden el crecimiento de S. cerevisiae cuando se utiliza en concentraciones similares a las que se obtendran en un proceso real. En medio sinttico y dentro de los rangos de concentraciones estudiados (4 g/L) el furfural se muestra como un compuesto txico afectando tanto al nmero de clulas viable como a la produccin de etanol.

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Mediante un proceso de adaptacin a concentraciones crecientes de compuestos txicos presentes en la fraccin lquida, se puede conseguir una levadura adaptada que presente una mayor productividad volumtrica en comparacin con la cepa parental cuando se utiliza como medio de fermentacin un 60% de fraccin lquida.

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