UNIVERSIDAD DEL PER, DECANA DE AMRICA FACULTAD DE MEDICINA E.A.

P TECNOLOGA MDICA LABORATORIO CNICO Y ANATOMIA PATOLGICA

INFORME DE LABORATORIO N 18 TEMA: DETERMINACIN DE GLUCOSA: MTODOS QUMICOS Y MTODOS ENZIMTICOS. PROFESOR: Mg. Hel Jaime Barrn Pastor INTEGRANTES:

Mesa 3A
 Ferro Calderon David  Eduardo Zapana Jos Antonio  Gonzales Saravia Sany  Huaccan Quichua Miriam

Practica n 18 DETERMINACION DE GLUCOSA: METODOS QUMICOS Y METODOS ENZIMATICOS. Objetivos

 En esta prctica optamos por aplicar el mtodo de Glucosa Oxidasa Peroxidasa la cual es ms rpida, en la cual ya tenemos preparados con anticipacin el Reactivo de trabajo y el Reactivo de Glucosa.  Tener en cuenta la importancia de este mtodo que representa el pilar de toda nuestra carrera en laboratorio y en general de las ciencias medicas.

Introduccin
La glucosa es la principal fuente de energa para el metabolismo celular. Se obtiene fundamentalmente a travs de la alimentacin, y se almacena principalmente en el hgado, el cual tiene un papel primordial en el mantenimiento de los niveles de glucosa en sangre (glucemia). Para que esos niveles se mantengan y el almacenamiento en el hgado sea adecuado, se precisa la ayuda de la insulina, sustancia producida por el pncreas. La glucosa es un azcar que es utilizado por los tejidos como forma de energa al combinarlo con el oxgeno de la respiracin. Cuando comemos el azcar en la sangre se eleva, lo que se consume desaparece de la sangre, para ello hay una hormona reguladora que es la insulina producida por el pncreas (islotes pancreticos). Esta hormona hace que la glucosa de la sangre entre en los tejidos y sea utilizada en forma de glucgeno, aminocidos, y cidos grasos. Cuando la glucosa en sangre est muy baja, en condiciones normales por el ayuno, se secreta otra hormona llamada glucagn que hace lo contrario y mantiene los niveles de glucosa en sangre. Cuando la insulina es insuficiente, la glucosa se acumula en sangre, y si esta situacin se mantiene, da lugar a una serie de complicaciones en distintos rganos. Esta es la razn principal por la que se produce aumento de glucosa en sangre, pero hay otras enfermedades y alteraciones que tambin la provocan. El tejido ms sensible a los cambios de la glucemia es el cerebro, en concentraciones muy bajas o muy altas aparecen sntomas de confusin mental e inconsciencia. El mantenimiento de la glucemia, o concentracin plasmtica de glucosa, en los organismos superiores es fundamental para el funcionamiento de todos los rganos, al ser la glucosa un metabolito energtico principal. La coordinacin de los procesos metablicos implicados en este cometido se lleva a cabo por la relacin insulina/glucagn. La ingestin de glucosa o sustancias que la produzcan (almidn, fructosa, galactosa, protenas, pero no grasas) va seguida, en las personas sanas, por un aumento de la glucosa en sangre. Este aumento origina la puesta en marcha del mecanismo regulador: aumento de la utilizacin de glucosa (por gluclisis, entre otras), aceleracin de la glucogenognesis y disminucin de la glucogenlisis; todo ello ocurre principalmente mediante la secrecin de insulina, una hormona pancretica de tipo polipeptdico. En el caso de que la produccin de insulina est disminuida, la glucosa no puede ser utilizada por las clulas, lo cual ocasiona niveles elevados de glucosa en sangre (hiperglucemia); as ocurre en las personas que sufren diabetes del tipo denominado "dependiente de insulina" o "tipo 1".

Glcidos o glcidos La glucosa es el glcido ms abundante en nuestro organismo. Por ese motivo, la determinacin de la glucosa plasmtica constituye la base del diagnstico de los trastornos del metabolismo de los glcidos. * Determinacin de la concentracin de glucosa. Para determinar la concentracin de glucosa se suele usar sangre venosa, pero en pacientes a los que es difcil practicarles una puncin venosa puede emplearse sangre capilar ( en este caso deber tenerse en cuenta que habr un incremento de glucosa de 2-3 mg/dl. Respecto de la sangre venosa). Los mtodos para la determinacin de glucosa pueden ser qumicos o enzimticos. La mayora de los mtodos qumicos se basan en las propiedades reductoras de la glucosa, pero no son especficos y por eso se utilizan poco. Los mtodos enzimticos, en cambio, proporcionan una elevada especificidad; los ms habituales son: - Mtodo de la glucosa-oxidasa: Se basa en la oxidacin de la glucosa por accin del enzima glucosa-oxidasa, en una reaccin que consume oxgeno. Midiendo el consumo de oxgeno se puede determinar cuanta glucosa haba en la muestra. El consumo de oxgeno se mide con un electrodo de oxgeno, por lo que estamos ante un mtodo potenciomtrico. - Mtodo de la peroxidasa: Se basa en dos reacciones enzimticas acopladas que dan como resultado un compuesto coloreado que se mide espectrofotomtricamente. - Mtodo de la hexoquinasa: Actualmente esta reaccin est adaptada a sistemas automatizados y el resultado se obtienen por espectrofotometra. Es un mtodo muy especfico y sin interferencias.

DETERMINACION DE GLUCOSA (METODO DE GLUCOSA OXIDASA-PEROXIDASA)

Materiales
Para la toma de muestra:       Tubo al vaco Capuchn Ligadura Alcohol iodado Algodn Guantes

Para la preparacin de los tubos:  Pipetas  Tubos de ensayo  Gradilla Para la medicin de las absorbancias  Espectrofotmetro

Reactivos
    Plasma Agua destilada Standard de glucosa 10mg/dL Reactivo de trabajo

Procedimiento
1. Hacer la dilucin del suero, medir exactamente en un tubo de ensayo 0.2mL de suero y agregar 4.8mL de agua destilada, mezclar hasta homogenizar.

2. Preparar la siguiente batera de tubos: blanco (B), el standard (St) y muestra problema:

TUBO
mL suero diluido mL standard de glucosa 10mg/dL mL reactivo de trabajo

MP
0.2 2.0

St
0.2 2.0

B
2.0

3. Incubar en bao mara a 37C durante 5 minutos.

4. Mezclar bien la solucin. 5. Leer las absorbancias de los tubos a 520 nm.

6. Encontrar la concentracin de glucosa (en mg/dL) en la muestra de suero. 7. Finalmente realizar los clculos [Glucosa en mg%] = AbsMP x FC x Fd

Resultados
La lectura de la absorvancia nos da:

TUBO ABS

MP 0.249

St
0.309

B 0.083

Aplicando la formula: [Glucosa en mg%] = AbsMP x FC x Fd Y tambin sabemos que:

FC = [St]/Absst = 10/0.226 Fd = 1/d = 1/(0.2/5) AbsMP = 0.249-0.083= 0.166

Reemplazando:

[Glucosa en mg%] = 0.166 x 44.2477876x 25 = 183.6283 mg%

Discusin de resultados
En la determinacin de glucosa (mtodo de glucosa oxidasa-peroxidasa): La glucosa presente en la muestra origina, segn las reacciones descritas a continuacin, un complejo coloreado que se cuantifica por espectrofotometra
peroxidasa

2 H2O2 + 4 Aminoantipirina(AMP) + Fenol

Quinonaimina + 4 H2O

Luego de medir las absorbancias de la muestra problema y del estndar y de efectuar los clculos para hallar la concentracin de la glucosa en la sangre, obtuvimos 183,62mg%. Lo cual resulto elevado, dado que los valores de referencia son de 70-110 mg%. La causa probable de esta hiperglucemia, sera el tiempo que paso desde el paciente comi por ltima vez. Solo haba pasado 1 hora, tiempo en el cual aun se mantiene un nivel alto de glucosa en la sangre.

Cuestionario 1.- Explique los fundamentos para la determinacin de glucosa por los
siguientes mtodos qumicos.
a. Mtodo de la ortotoluidina. Al suero o plasma se aade ortotoluidina disuelta en cido actico glacial y se calienta en bao de agua hirviendo. El color verde estable que forma se mide por medio del espectrofotmetro. V.N. = 60 - 100 mg / 100ml Objeciones al Mtodo. 1. 2. 3. 4. Mtodo que data de 1959. Se han demostrado sus efectos cancergenos. Durante el calentamiento se eliminan vapores txicos por lo que es necesario usar Los reactivos al contacto con la piel producen quemaduras, ya que contienen cido

campana de extraccin.

actico a concentracin elevada, y por lo tanto son corrosivos.

5.

Interfieren la galactosa y manosa y en sus resultados elevados la solucin final

exhibe turbidez con lo cual pierde linealidad mtodo. 6. Por todo lo anterior este mtodo tambin se considera obsoleto.

El proceso de la orto-toluidina es una reaccin de color especifica para hexosas(glucosa, manosa y galactosa) dado que normalmente las aldohexosas que no sean glucosa se encuentran presentes en muy bajas concentraciones, los resultados de este mtodo se aproximan al valor verdadero de la glucosa.

b. Mtodo de Folin Wu. Utiliza un filtrado de cido tngstico de sangre total, que se calienta con una solucin de cobre, con reduccin de los iones cpricos a cuprosos. Los iones cuprosos son entonces medidos fotomtricamente (colorimtricamente) por la adicin de un exceso de cido fosfomolbdico para formar azul de molibdeno. V.N. = de 80 a 120 mg / 100ml Objeciones al Mtodo. 1. La mayor objecin que se hizo a este mtodo fue su inclusin del 15 al 30% de

sustancias sacaroideas que no son glucosa. 2. La cantidad de xido cuproso formado por cantidades crecientes de azcar no aumenta con estricta proporcionalidad, adems, este xido cuproso tiende a reoxidarse cuando est expuesto al aire en suspensin caliente, a eso se debe la forma de los tubos de Folin-Wu con una estrechez seguida por ensanchamiento y adems la precaucin de no agitarlos durante la reaccin para evitar la reoxidacin. 3. 4. Una tercera objecin al resultado, reside en la inestabilidad colorimtrica del azul de Por lo anterior este mtodo dej de emplearse aproximadamente en los aos 60s. molibdeno.

c. Mtodo de Nelson - Somogyi. Utiliza un filtrado de sulfato de zinc en hidrxido de bario que est virtualmente libre de substancias reductoras que no sean glucosa. El ion cuproso formado por el calentamiento de este filtrado con una solucin alcalina de cobre se mide fotomtricamente por la adicin de cido arsenomolbdico que forma un complejo coloreado.

V.N. = 60 d. Metodo de Benedict

100 mg / 100ml

Se basa en la capacidad que tiene la glucosa para reducir los iones cpricos (Cu2+) a iones cuprosos (Cu+). Por calentamiento, los iones cuprosos pueden formar oxido cuproso (Cu2O), el cual puede ser detectado por diversos mtodos. El ms usado es el mtodo de Benedict, el cual detecta azucares reductores totales en orina. Este mtodo es usado para determinar o detectar defectos genticos del metabolismo de los hidratos de carbono en nios, en cuya orina aparecen azucares que son glucosa.

2.

Determine la concentracin de una muestra que se ha diluido al 1/20 en el protocolo de gop-pod en el tubo muestra se adicion 0.1 ml de suero diluido, agua 0.1ml y 2 ml de reactivo. Lectura de la muestra = 0.030, trabajar con los datos del estndar de su mesa. Considere lectura del blanco = 0 Tubo MP 0.1 --St --0.2 B -----

ML de suero diluido mL Estndar de glucosa 10mg/dL mL Reactivo de trabajo Absorvancia

2.0 0.03

2.0 0.309

2.0 0

Aplicando la formula: [Glucosa en mg%] = AbsMP x FC x Fd Y tambin sabemos que:

FC = [St]/Absst = 10/0.309= 32.36246 Fd = 1/d = 1/(0.2/2.2) AbsMP = 0.03-0= 0.03

Reemplazando:

[Glucosa en mg%] = 0.03x 32.36246x 20 = 194.16 = 183.6283 mg%

Conclusin
 El resultado relativamente alto que obtenemos se debe a que la persona a la que le tomamos la muestra de sangre haba almorzado 1 hora y media antes del comienzo de esta prctica; es decir esta persona estaba en un estado posprandial.  Necesitamos plasma por la presencia del fibringeno, por lo cual solo sometemos a centrifugacin la muestra de sangre en el tubo con anticoagulante.

Bibliografa
http:/ / www2. uah.es /ana_garcia/ Hbs -glicosiladas . pdf http:/ / www.itchihuahua. edu.mx/ academic/ industrial / estadistica1/cap02. htm http:/ / www. itchihuahuaii .edu.mx/ academico/CB/MEG/ documentos/ 1.8. html http: // www. itch. edu.mx/academic /industrial/ estadistica1/c ap03. html