REF - ISSN 1808-0804 Vol.

VI (1), 25 - 32, 2009

DESENVOLVIMENTO E VALIDAO DE METODOLOGIA ANALTICA ESPECTROFOTOMTRICA PARA DOSEAMENTO DE MEBENDAZOL MATRIA-PRIMA E SUSPENSO ORAL
Development and validation and of spectrophotometrical analytical methodology for quantification of mebendazole raw material and oral suspension Ezequiane Machadom Silva ; Lvia Teixeira Duarte ; Andrezza Lopes Sousa; Daniella Ramos Martins; Larissa da Cunha Almeida; Paula Izabella Rocha de Magalhes Pereira; Clvia Ferreira Duarte Garrote; Maria Teresa Freitas Bara*
Laboratrio de Controle de Qualidade de Medicamentos (LCQM), Faculdade de Farmcia; Universidade Federal de Gois, Av. Universitria com 1 Avenida s/n, Setor Universitrio CEP: 74605-220 - Goinia GO. Brasil. *Autor para correspondncia e-mail: mbara@farmacia.ufg.br
Recebido em 15/05/2008 - Aceito em 22/12/2008
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RESUMO: O mebendazol um frmaco que atua como anti-helmntico de amplo espectro de ao contra nematides e cestides. Entre as metodologias utilizadas para sua determinao, destaca-se a possibilidade de determinao quantitativa de mebendazol por meio de mtodos espectrofotomtricos, por apresentarem boa sensibilidade e ter custos mais acessveis. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver e validar uma metodologia analtica para determinao deste frmaco em matria-prima e suspenso oral, utilizando a espectrofotometria de ultravioleta. O mtodo mostrou ser simples, rpido, especfico, linear, exato, preciso e robusto para ser executado na rotina de um laboratrio de controle de qualidade, sendo uma alternativa aos mtodos utilizados. PALAVRAS-CHAVE: controle de qualidade, anlise farmacutica, espectrofotometria. ABSTRACT: The mebendazole is a drug that acts as anti-helminthic of broad spectrum of action against nematodes and cestodes. Among the methodologies used for their determination, highlights the possibility for quantitative determination of mebendazole is through methods spectrophotometrics, to have good sensitivity and have cost more accessible. This study aimed to develop and validate a method for analytical determination of mebendazole in raw material and in oral suspension, using the ultraviolet spectrophotometry. The method proved to be simple, rapid, specific, linear, accurate, precise and robust to run the routine of a laboratory of quality control, and is an alternative to methods used. KEYWORDS: quality control, pharmaceutical analysis, spectrophotometry. INTRODUO O mebendazol um derivado benzimidazlico (Figura 1) utilizado como anti-helmntico com elevada eficcia e tolerabilidade, alm de um amplo espectro de ao contra nematides e cestides (KATZUNG, 1998; SILVA, 2006).

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Figura 1 Estrutura molecular do mebendazol Dentre as atribuies de um laboratrio de controle de qualidade destaca-se a garantia de que sejam feitas as validaes necessrias, de procedimentos analticos, calibrao e qualificao dos equipamentos e vidrarias de preciso (LACHMAN et al., 2001; PINTO et al, 2003). Uma validao visa demonstrar que o mtodo apropriado para a finalidade pretendida, garantindo por meio de estudos experimentais, que o mtodo atenda aos parmetros de especificidade, linearidade, intervalo, preciso, limite de deteco, limite de quantificao, exatido e robustez adequados anlise (BRASIL, 2003). A monografia do mebendazol matria-prima est presente na Farmacopia Brasileira 4 edio (2001), na qual o doseamento feito por titulao em meio no aquoso. No entanto, considera-se que o mtodo titulomtrico possui menor sensibilidade e pode sofrer maior nmero de interferncias quando comparado ao mtodo espectrofotomtrico. A Farmacopia Brasileira 4 Edio, 2005 descreve duas tcnicas analticas por espectrofotometria para suspenso oral de mebendazol, porm uma desta utiliza concentraes muito altas de cido frmico, o que a torna insalubre e de alta periculosidade para o analista. A outra tcnica tem como desvantagem o uso de solventes orgnicos como isopropanol e clorofrmio (FARMACOPIA BRASILEIRA, 2005). Alm disso, ambas possuem etapa de extrao lquido-lquido, que aumenta a possibilidade de interferncias. Este trabalho visou o desenvolvimento e validao de uma metodologia espectrofotomtrica para o doseamento de mebendazol em matrias-primas e em suspenso oral, que seja uma alternativa mais vivel rotina de um laboratrio de controle de qualidade. MTODOS Material e equipamento Foram utilizadas mebendazol SQR (Farmacopia Brasileira), mebendazol - matria-prima e suspenso oral de mebendazol manipulada em farmcia com manipulao. Os solventes utilizados possuiam grau analtico e foram utilizados cido frmico 99% (Vetec) e etanol absoluto grau UV/HPLC (JT Baker). A vidraria utilizada foi certificada pela RBC (Rede Brasileira de Calibrao). Doseamento de Mebendazol matria-prima e suspenso oral Preparo do padro: Transferir 25 mg de padro secundrio de mebendazol para balo volumtrico de 25 mL. Acrescentar 12 mL de cido frmico P.A. (99,0%) e solubilizar com agitao e/ou banho de ultrassom. Completar o volume com etanol P.A. Transferir 1 mL desta soluo para balo volumtrico de 100 mL e completar o volume com etanol P.A. Esta soluo contm 0,01 mg/mL. Preparo da amostra Transferir o equivalente a 100 mg de mebendazol para balo volumtrico de 100 mL. Acrescentar 12 mL de cido frmico P.A. (99,0%) e solubilizar com agitao e/ou banho de ultrassom. Completar o volume com etanol P.A. Transferir 1 mL desta soluo para balo volumtrico de 100 mL e completar o volume com etanol P.A. Medir as absorbncias das solues resultantes (padro e amostra) em 310nm, utilizando etanol para o ajuste do zero. Calcular o teor de mebendazol na amostra a partir das leituras obtidas. Clculos:

Silva, E. M. et al./Revista Eletrnica de Farmcia Vol 6(1), 25-32, 2009. T = Cp x Aa x 100 Cta x Ap

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Onde: T = teor da amostra em porcentagem; Cp = concentrao do padro (mg/mL); Aa = absorbncia da amostra; Cta = concentrao terica da amostra; Ap = absorbncia do padro.

Foram utilizados espectrofotmetros (B582/Micronal e Cary 50/Varian) e comprimento de onda de leitura de 310 nm. O ajuste do zero foi feito com etanol absoluto. No estudo da validao do mtodo para matria-prima foram avaliados os parmetros: especificidade, linearidade, preciso, limite de quantificao, limite de deteco, exatido e robustez. Os parmetros avaliados na validao do mtodo para o produto-acabado foram : especificidade, linearidade, intervalo, preciso (repetibilidade e preciso intermediria), exatido e robustez. RESULTADOS E DISCUSSO O desenvolvimento de mtodos analticos empregados na avaliao de qualidade de fundamental importncia e colabora com as Boas Prticas de Fabricao, integrando os procedimentos relacionados com a Garantia da Qualidade (GIL, 2007). Todo mtodo desenvolvido e no descrito em farmacopia ou formulrios oficiais deve ser validado, sendo avaliados os seguintes parmetros: especificidade, linearidade, intervalo, preciso, exatido e robustez, quando se trata da quantificao do analito em formas farmacuticas. Para este fim, outros documentos podem ser empregados, alm do guia da ANVISA (BRASIL, 2003), tais como United States Pharmacopoea - USP (2007), International Conference on Harmonisation ICH Q2, (2005), Food and Drug Administration - FDA (1994), Instituto Nacional de Metrologia INMETRO (2003), visando uma validao. O desenvolvimento da metodologia analtica para substituir a anlise titrimtrica constante na monografia da Farmacopia Brasileira (2001) baseou-se inicialmente na solubilidade do frmaco em cido frmico e etanol (Farmacopia Brasileira, 2005). Para tanto, demonstrou-se inicialmente a especificidade do mtodo empregado na anlise da matria-prima, uma vez que o mesmo no sofreu interferncia do solvente utilizado no comprimento de onda de deteco (310nm). Os espectros da varredura das solues padro e amostra foram idnticos, j o espectro da varredura do solvente no apresentou nenhum pico de absoro (Figura 2).

C Figura 2 Espectros de absoro do padro (A), solvente (B) e amostra (C), respectivamente. Os resultados para o parmetro de linearidade (Figura 3) demonstraram que o mtodo apresenta intervalo linear na faixa de 50 a 150%.

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Curva de calibrao mebendazol

0,8

0,6

Absorbncia

0,4

0,2

0 0,0000

0,0050

0,0100

0,0150

0,0200

Concentrao da Soluo Padro de Mebendazol (mg/mL)

Figura 3 Linearidade:

y = 45,155x + 0,0186

r= 0,99989

O mtodo apresentou-se preciso nos dois nveis avaliados (Tabelas 1 e 2), com coeficientes de variao (CV) inferiores ao especificado pela resoluo vigente (5,0%), 0,82 e 1,3%, respectivamente para repetibilidade e preciso intermediria. Tabela 1 Resultados da Preciso (repetibilidade) Concentrao Concentrao Massas terica da real da Recuperao pesadas Absorbncias Determinaes amostra amostra (%) (mg) (mg/mL) (mg/mL) D_1 100,2 0,01002 0,01019 101,73 0,4789 D_2 100,3 0,01003 0,01035 103,20 0,4860 D_3 100,8 0,01008 0,01038 102,95 0,4872 D_4 100,4 0,01004 0,01026 102,19 0,4819 D_5 100,5 0,01005 0,01027 102,22 0,4825 D_6 100,5 0,01005 0,01014 100,88 0,4764
Mdia 102,20 DP 0,839945672

DPR 0,821885964 DP = desvio padro DPR= desvio padro relativo

Tabela 2 Resultados da Preciso (intermediria) Massas pesadas (mg) 100,1 100,2 100,3 100,2 100,0 Concentrao Concentrao terica da real da amostra amostra (mg/mL) (mg/mL) 0,01001 0,01006 0,01002 0,01027 0,01003 0,01030 0,01002 0,01019 0,01000 0,01030

Determinaes D_1 D_2 D_3 D_4 D_5

Teor (%) 100,49 102,51 102,71 101,73 103,00

Absorbncias 0,4728 0,4824 0,4838 0,4789 0,4837

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D_6

100,1

0,01001

0,00998

99,73 Mdia 101,70 DP 1,320066686 DPR 1,298046905

0,4694

DP = desvio padro

DPR= desvio padro relativo

A exatido do mtodo foi outro parmetro comprovado, sendo encontrados valores entre 97,38 e 103,88 para as trs concentraes investigadas (Tabela 3). Tabela 3 Resultados da Exatido
Massas pesadas (mg) Concentrao Concentrao RecupeAbsorbnterica da real da rao cias amostra amostra (%) (mg/mL) (mg/mL) Mdia Recuperao (%)

Determinaes

DP

DPR

Recuperao (mg/mL)

D_1 50,1 D_2 50,0 D_3 50,1 D_4 100,2 D_5 100,3 D_6 100,8 D_7 150,2 D_8 150,2 D_9 150,3 DP = desvio padro

0,00501 0,00486 96,98 0,00500 0,00491 98,28 0,00501 0,00485 96,89 0,01002 0,01020 101,76 0,01003 0,01036 103,24 0,01008 0,01041 103,28 0,01502 0,01562 104,01 0,01502 0,01569 104,48 0,01503 0,01550 103,14 DPR= desvio padro relativo
-5

0,2380 0,2405 0,2378 0,4790 0,4862 0,4887 0,7240 0,7272 0,7186

97,3867

0,7781 0,80

102,7610 0,8702 0,85

103,88

0,6779 0,65

0,00485882 0,004914184 0,00485439 0,010195992 0,010355442 0,010410807 0,015621747 0,015692614 0,015502159

Os limites de deteco (6,63x10 mg/mL) e de quantificao (2,21x10 mg/mL) obtidos demonstram que o mtodo sensvel. O mtodo foi robusto para variaes de at 2 unidades no comprimento de onda e para variaes da marca do espectrofotmetro. Os coeficientes de variao obtidos esto dentro dos limites preconizados (Tabela 4). Tabela 4 Resultados da robustez Concentrao real da amostra (mg/mL) 0,01016

-5

Parmetro

Absorvncia

Mdia

DP

DPR

(nm)

308

0,4765

0,477367

0,005551

1,16283 3

310

0,4833

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30

312

0,4723

1 Equipamento 2 DP = desvio padro

0,4833 0,479650 0,4760 0,01021 0,005162 1,07617 6

DPR= desvio padro relativo

O mtodo quando empregado para anlise da suspenso oral de mebendazol apresentou-se especfico, pois foram observados picos de absorbncia no comprimento de onda 310 nm para o padro e a amostra, no sendo observado pico significativo na varredura da matriz (Figura 4).

Figura 4: Espectros de absoro - Matriz (azul), amostra (preto) padro (vermelho) de mebendazol O intervalo linear para a anlise da suspenso de mebendazol foi estabelecido entre as concentraes de 0,005mg/mL a 0,0151mg/mL (Figura 2). O mtodo proposto neste estudo demonstrou preciso e obteve-se um DPR de 2,27 para a repetibilidade e 2,12 para a preciso intermediria (Tabelas 5 e 6). Tabela 5 Resultados da Preciso (repetibilidade) suspenso oral Massas pesadas (g)* 6,3880 6,3447 6,3874 6,3404 6,3832 6,3422 Volume equivalente (mL) 5,027546041 4,993467653 5,027073823 4,990083425 5,023768298 4,991500079 Equivalente em mg 100,5509208 99,86935306 100,5414765 99,8016685 100,475366 99,83000157 Concentrao Concentrao terica da real da amostra amostra (mg/mL) (mg/mL) 0,01006 0,01032 0,00999 0,01055 0,01005 0,01000 0,00998 0,01008 0,01005 0,01006 0,00998 0,01000 Recuperao (%) 102,63 105,66 99,45 101,03 100,09 100,20 Mdia DP 2,311435766 Absorbncias 0,4846 0,4951 0,4701 0,4739 0,4727 0,4703

Determinaes D_1 D_2 D_3 D_4 D_5 D_6

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DPR 2,277007852
*Densidade (g/mL) : 1,270597612. DP = desvio padro DPR= desvio padro relativo A densidade foi empregada para transformar a massa pesada em volume da suspenso oral.

Tabela 6 Resultados da Preciso (intermediria) suspenso oral Massas pesadas (g)* 6,5088 6,5643 6,4936 6,4741 6,4109 6,4099 Volume equivalente (mL) 5,122619235 5,166299386 5,110656383 5,095309303 5,045569023 5,044781993 Equivalente em mg 102,4523847 103,3259877 102,2131277 101,9061861 100,9113805 100,8956399 Concentrao Concentrao terica da real da amostra amostra (mg/mL) (mg/mL) 0,01025 0,00991 0,01033 0,01023 0,01022 0,01031 0,01019 0,01018 0,01009 0,01029 0,01009 0,01035 Recuperao (%) 96,73 99,00 100,88 99,86 101,94 102,57 Mdia DP 2,12995894 DPR 2,126505067
*Densidade (g/mL): 1,270597612. DP = desvio padro DPR= desvio padro relativo A densidade foi empregada para transformar a massa pesada em volume da suspenso oral.

Determinaes D_1 D_2 D_3 D_4 D_5 D_6

Absorbncias 0,4661 0,4805 0,4842 0,4781 0,4831 0,4859

A exatido do mtodo foi comprovada atravs dos percentuais de recuperao encontrados entre 95,71 e 100,69% nas trs concentraes analisadas (Tabela 7). Tabela 7 Resultados da exatido suspenso oral Volume Massas Determipesadas equivalente naes (g) (mL) D_1 D_2 D_3 D_4 D_5 D_6 D_7 D_8 D_9 3,1900 3,3543 3,1791 6,3874 6,3404 6,3422 5,8861 5,8761 5,8611 2,48055988 2,60832037 2,47208398 5,02707382 4,99008343 4,99150008 5,05157913 5,04299691 5,03012358 Equivalente (mg) 49,6112 52,1664 49,4417 100,5415 99,8017 99,8300 151,5474 151,2899 150,9037 Concentrao Concentrao terica da real da amostra amostra (mg/mL) (mg/mL) 0,00496 0,00522 0,00494 0,01005 0,00998 0,00998 0,01515 0,01513 0,01509 0,00472 0,00507 0,00469 0,00999 0,01006 0,01000 0,01543 0,01500 0,01526 Recuperao (%) 95,17 97,13 94,82 99,36 100,79 100,14 101,80 99,17 101,10 Absorbncias 0,2318 0,2474 0,2303 0,4697 0,4728 0,4700 0,7152 0,6961 0,7075 Mdia Recuperao (%) DP

95,709 1,2440

100,095 0,7131

100,69

1,3586

DP = desvio padro

A robustez do mtodo foi comprovada, os resultados demonstram que as variaes de at 2 unidades no comprimento de onda e variaes da marca do espectrofotmetro no interferem no mtodo analtico (Tabela 4). O mtodo proposto neste estudo para anlise de suspenso oral de mebendazol apresenta como vantagens a utilizao de quantidades 10 vezes menores de cido frmico, no tem a etapa de partio lquidolquido, em relao ao mtodo farmacopico (FARMACOPIA BRASILEIRA, 2005) e utiliza somente etanol como solvente orgnico, que menos agressivo ao ambiente e sade do analista.

Silva, E. M. et al./Revista Eletrnica de Farmcia Vol 6(1), 25-32, 2009. CONCLUSES

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O mtodo proposto neste estudo vlido para o doseamento de mebendazol matria-prima e suspenso oral - para a formulao estabelecida - por apresentar os parmetros de validao adequados anlise em questo, sendo uma alternativa aos mtodos descritos nas monografias da Farmacopia Brasileira 2001 e 2005. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS BRASIL. Ministrio da Sade. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria, Resoluo RE n 899, de 29 de Maio de 2003. Guia para validao de mtodos analticos e bioanaliticos. Braslia, 2003. FARMACOPIA BRASILEIRA, Parte II, 3 Fascculo, 4. ed. So Paulo: Atheneu Editora, 2001 FARMACOPIA BRASILEIRA, Parte II, Sexto Fascculo, 4. ed. So Paulo: Atheneu Editora, 2005 GIL, E.S. Controle de qualidade fisico-qumico de qualidade de medicamentos. Pharmabooks. 2 edio. 2007 INSTITUTO NACIONAL DE METROLOGIA, NORMALIZAO E QUALIDADE INDUSTRIAL INMETRO. DOQCGCRE-008: Orientaes sobre validao de mtodos de ensaios qumicos. Brasil, 2003. Disponvel em: http://www.inmetro.gov.br. Acesso em 10 set. 2007. INTERNATIONAL CONFERENCE ON HARMONISATION (ICH) Q2. Validation of analytical procedures: text and methodology, 2005. Disponvel em: http://www.ich.org. Acesso em 29 set. 2007 KATZUNG, B. G. Farmacologia bsica e clnica. Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan, 1998. LACHMAN, L.; HANNA, S. A.; LIN, K. Controle e Garantia de Qualidade. In: LACHMAN, L.; LIEBERMAN, H. A.; KANING, J. L. Teoria e Prtica na Indstria Farmacutica. Volume II. Lisboa: Fundao Calouste Gulbenkian, 2001. Cap. 27. p.799-1104. PINTO, T. J. A.; KANECO, T. M.; OHARA, M. T. Controle Biolgico de Qualidade de Produtos Farmacuticos, Correlatos e Cosmticos. 2 ed. So Paulo: Editora Atheneu, 2003. p. 219- 258. SILVA, P. Farmacologia. Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan, 2006 UNITED STATES. Departament of Health and Human Services. Food and Drug Administration. Reviewer Guidance: validation of chromatographic methods, 1994. Disponvel em http://www.fda.gov/cder. Acesso em 02 ago.2007. UNITED STATES PHARMACOPEIA The National Formulary 30th edithion, NF 25, Rockville: The United States Pharmacopeial Convention, 2007.