REACCION EN CADENA POLIMERASA PCR

BARRAZA GUSTAVO COBA RONALD LOZANO EDUARDO PEREZ ANTONIO STOR ABRAHAM

PROFESOR: Q.F. ALFREDO LAGARES

ASIGNATURA: BIOLOGIA MOLECULAR

UNIVERSIDAD DEL ATLANTICO FACULTAD QUIMICA Y FARMACIA BARRANQUILLA NOVIEMBRE 12 DE 2009

PCR En Abril de 1983, Kary Mullis dio a conocer la Tcnica de reaccin en cadena de la Polimerasa o PCR que es una tcnica para la sntesis "in Vitro" de secuencias especficas de DNA con la cual la insuficiente cantidad de ADN ya no es un problema en los procedimientos de Biologa Molecular ni en los procedimientos de diagnstico basados en el estudio de DNA, ya que por su alta sensibilidad, esta tcnica permite identificar un gen a partir de un solo cabello, una clula somtica o un espermatozoide. Uno de los aportes fundamentales de esta metodologa a la investigacin bsica en biologa molecular consiste, precisamente, en la rapidez y eficiencia mediante las cuales se realiza una tarea que antes requera largas y tediosas jornadas, tras la amplificacin, resulta mucho ms fcil identificar con una muy alta probabilidad virus o bacterias causantes de una enfermedad. La tcnica se basa en la replicacin del ADN en los organismos eucariotas realizada por la DNA polimerasa. Estas enzimas realizan la sntesis de una cadena complementaria de DNA en el sentido 5-> 3 usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una regin de doble cadena. Para crear esta regin doble cadena se usan los denominados iniciadores (primers). Son una pareja de oligonucletidos sintetizados de manera que sean complementarios a cada uno de los extremos 3 del fragmento de DNA que se desea amplificar. Partiendo de este principio, la reaccin en Cadena de la Polimerasa se basa en la repeticin de un ciclo formado por tres etapas: 1 Desnaturalizacin del ADN doble cadena: En la primera etapa

(desnaturalizacin) la doble hlice de ADN se separa en dos hebras. Para ello se realiza una incubacin de la muestra a altas temperaturas (93-97C). La renaturalizacin se producir cuando la temperatura disminuya. 2 Hibridacin de los iniciadores a la zona 3 especfica de cada una de las hebras: En el segundo paso (hibridacin) los cebadores se unen a las zonas 3 complementarias que flanquean el fragmento que queremos amplificar. Se realiza gracias a la bajada de la temperatura (50-65 C) 3 Extensin del cebador por actuacin de la DNA polimerasa: En la tercera etapa (elongacin) se produce la sntesis de una cadena sencilla (producindose un fragmento de doble cadena por la complementariedad) en la direccin 5-> 3 mediante la enzima DNA polimerasa, la cual incorpora los desoxinucletidos fosfato presentes en el medio siguiendo la cadena molde.

Figura 1: Pasos bsicos de la PCR (de Andy Vierstracte 1999) Una vez completado el primer ciclo, disponemos de 2 copias de la muestra original, al final del segundo ciclo tenemos 4, al final del tercero 8. Si los ciclos se producen un nmero "n" de veces y suponiendo que el nmero de copias de ADN se duplica en cada ciclo, obtenemos una cantidad de ADN de 2n, por lo que la amplificacin se realiza en forma de progresin geomtrica.

Figura 2. Amplificacin exponencial del PCR (de Andy Vierstracte 2001) Temperaturas y tiempos de los ciclos Como hemos explicado anteriormente la Reaccin en Cadena de la Polimerasa se realiza en tres etapas que constituyen un ciclo, que repite durante un nmero determinado de veces. El tiempo, la temperatura y el nmero de ciclos son factores determinantes en los resultados de la PCR, por lo tanto modificndolos podemos optimizar la reaccin. Las primeras reacciones se realizaban manualmente cambiando continuamente los tubos de un bao Mara a otro de diferente temperatura (la T de desnaturalizacin, la de hibridacin y la de elongacin). El proceso resultaba demasiado tedioso y era difcil alcanzar las temperaturas y los tiempos correctos, por lo que se desarroll el termociclador que lo haca de manera automtica. A continuacin describiremos de forma ms detallada el tiempo y la temperatura de cada una de las etapas de un ciclo. 1. Desnaturalizacin Se trata de una etapa crtica ya que es muy importante que el ADN molde se desnaturalice completamente. Para lograrlo de manera adecuada se recomiendan temperaturas de 94C durante 30 segundos a 1 minuto. Sin embargo hay que tener en cuenta que la actividad de la enzima decrece de manera muy rpida a partir de los 95C, por lo que a estas temperaturas o superiores es aconsejable disminuir el tiempo de incubacin.

En la prctica se suele aadir un perodo de desnaturalizacin antes de comenzar los ciclos para asegurarnos que se produce a lo largo de toda la muestra de ADN. Esta etapa suele ser de cinco minutos a 94C. 2. Hibridacin En este caso, la temperatura y el tiempo van a depender de 3 factores relacionados con los oligonucletidos: la composicin de bases, el tamao y la concentracin. En la prctica, la temperatura de hibridacin puede oscilar entre 45C y 65C, durante un tiempo comprendido entre 30 segundos y 1 minuto. Un aumento de temperatura o del tiempo favorece la especificidad ya que disminuye las uniones incorrectas de los iniciadores con la hebra molde. 3. Elongacin En la mayora de las reacciones, la etapa de extensin se realiza a 72C. Tericamente esta temperatura puede variar entre 70-72C. El tiempo de extensin depende del tamao de la amplificacin. Se puede estimar un tiempo de 1 minuto para alongar 1 Kb. En la prctica es normal que al final de todos los ciclos se realice una ltima elongacin de cinco minutos a 72C. Hoy todo proceso de la PCR esta automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reaccin para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reaccin. Muchos termocicladores modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos simplemente invirtiendo la corriente elctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad trmica, permitiendo que se alcance rpidamente el equilibrio trmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensacin sobre los tubos de reaccin. Los termocicladores ms antiguos que carecan de este sistema, solucionaban el problema de la condensacin con una capa de aceite en la parte superior de la mezcla de reaccin o con un poco de cera dentro de los tubos.

Figura 3. Termociclador: aparato en el que se efecta la PCR convencional. Reactivos Para realizar la tcnica se necesitan:
y y

y y y y

Desoxinucletidos trifosfato (dNTPs), el sustrato para polimerizar nuevo ADN. Dos cebadores (o primers), oligonucletidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucletidos, normalmente de 18 a 22, que son reconocidos por la polimerasa permitiendo iniciar la reaccin. Deben estar situados enfrentados y a no mucha distancia. Delimitan la zona de ADN a amplificar. Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), o algn otro catin divalente. Tambin se puede emplear manganeso (Mn2+), para mutagnesis de ADN mediante PCR, ya que altas concentraciones de Mn2+ incrementan la tasa de error durante la sntesis de ADN. Actan como cofactores de la polimerasa. Una solucin tampn que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa. ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura ptima alrededor de 70C (la ms comn es la Taq polimerasa). ADN molde, que contiene la regin de ADN que se va a amplificar. Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo.

Tipos de PCR PCR anidada Tcnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificacin es utilizado como molde para realizar una segunda amplificacin con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada. Este tipo de PCR es muy especfica. PCR in situ PCR realizada sobre preparaciones fijas sobre un portaobjetos. La PCR in situ consiste en una reaccin de PCR en secciones histolgicas o clulas, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificacin. Es realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. En la tcnica de PCR in situ se realiza una primera amplificacin de ADN blanco y luego deteccin mediante hibridacin in situ convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades pequesimas de genoma. Esta tecnologa es de gran alcance en la capacidad de amplificar especficamente una poblacin de secuencias de menor representacin. PCR multiplex PCR en la cual se amplifica ms de una secuencia en una misma reaccin. Emplea dos o ms pares de cebadores en nico tubo con el fin de amplificar simultneamente mltiples segmentos de ADN. Consiste en combinar en una nica reaccin los pares de cebadores de los sistemas que queremos amplificar simultneamente, junto con el resto de los reactivos de la reaccin en cantidades suficientes. Sus ventajas: se obtiene la informacin de varios loci en una sola reaccin, menor cantidad de molde para el anlisis, menor cantidad de reactivos, rpida construccin de base de datos. PCR en Transcriptasa reversa (RT-PCR) Donde el molde inicial es ARN y se requiere de una transcriptasa inversa, como Tth, para realizar la conversin del ARN a un tipo de ADN llamado ADNc (ADN complementario). PCR tiempo real (Q-PCR) Reaccin de PCR cuya principal caracterstica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presentes en la muestra original, o para identificar con una muy alta probabilidad, muestras de DNA especficas a partir de su temperatura de fusin (tambin denominado valor Tm, del ingls melting temperature).

Se puede dividir en las tcnicas basadas en fluorocromos no especficos y en tcnicas basadas en sondas especficas. En las tcnicas basadas en fluorocromos, el ADN, que ve multiplicada su cantidad con cada ciclo se une al fluorocromo (generalmente SYBR Green) produciendo fluorescencia que es medida por el termociclador apto para RealTime PCR. Permite cuantificar slo una secuencia por reaccin pero tiene la ventaja de utilizar primers normales para su realizacin. Es mucho ms econmica que la realizacin de Realtime PCR con sondas especficas. Las tcnicas basadas en sondas especficas utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso (reverse), cuando la sonda est intacta, presentan una transferencia energtica de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha FRET no se produce cuando la sonda est daada y los dos fluorocromos estn distantes, producto de la actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa. Esto permite monitorizar el cambio del patrn de fluorescencia y deducir el nivel de amplificacin del gen. La mayora de estos inconvenientes se han solucionado con la introduccin de la PCR realizada en tiempo real (Q-PCR), que elimina cualquier proceso post-PCR puesto que monitoriza la progresin de la amplificacin en el momento en que ocurre. A diferencia de la PCR convencional (en punto final), que mide la acumulacin ADN al final de un nmero predeterminado de ciclos, con Q-PCR esto se hace durante el proceso de amplificacin usando fluorescencia, de forma que su aumento es proporcional a la cantidad de ADN formada. El proceso se puede automatizar fcilmente usando un sistema que realice la amplificacin (termociclador) y que a su vez sea capaz de leer fluorescencia. Existe una amplia oferta de aparatos en el mercado. La mayora pueden trabajar con las diversas opciones de marcado fluorescente y son "abiertos", es decir, permiten programar las condiciones de amplificacin y lectura de forma que su uso no queda limitado a unos reactivos determinados. EL ANLISIS DE LAS MUESTRAS El tamao del fragmento multiplicado puede determinarse sometiendo los productos de la reaccin a una electroforesis en gel de agaroza o poliacrilamida, es decir, a un proceso de separacin por difusin bajo la accin de un campo elctrico. Por otra parte, la identidad del producto puede ser confirmada mediante hibridacin (unin complementaria) con una sonda marcada radiactivamente, cuya secuencia de bases est contenida en el fragmento de inters. En este caso se procede as: el ADN fraccionado por electroforesis es desnaturalizado y luego transferido a una membrana de nitrocelulosa o nylon, que acta como soporte slido (Southern blot), y luego es puesto en contacto con la sonda, que se unir al fragmento buscado ya que ha sido preparada de modo tal que resulta ser complementaria del mismo.

Figura 4. Preparacin del corrido electrofortico

Figura 5. Visualizacin posible con bromuro de etidio, fluoresencias, luz UV, tincin de plata, etc. A: Visualizacin directa. Las muestras colocadas sobre un gel y sometidas a la accin de un campo elctrico (electroforesis) migran de una manera caracterstica que se puede visualizar por tincin (coloreado) del ADN. (Carriles 1-8: productos de distintas PCRs; carril M: marcadores de ADN de tamao conocido.)

B: Southern Blot. El ADN es desnaturalizado (separacin de sus hebras constituyentes) y transferido a una membrana de nitrocelulosa o nylon para luego incubar la hibridacin (unin) con una sonda radiactiva. sta quedar fijada donde se encuentre el tramo de ADN de inters y su presencia se revelar a travs de una autorradiografa (placa fotogrfica sensible a la emisin radiactiva de la sonda). C: Dot Blot. Mtodo anlogo al anterior, pero practicado sobre una siembra en forma de manchas de los fragmentos de ADN a analizar previamente desnaturalizados. A continuacin trataremos de profundizar en los componentes y parmetros ms importantes para obtener una amplificacin ptima. Componentes y optimizacin de la reaccin de amplificacin: Muestra de ADN Existen una serie de reglas sencillas para que el DNA molde no sea un problema en la reaccin: y Integridad del ADN: no puede estar fragmentado en trozos ms pequeos de lo que queremos amplificar. Origen de la muestra y proceso de extraccin: la muestra no debe llevar agentes quelantes (EDTA) que reducen la concentracin de iones de Mg. en la disolucin. Tampoco debe haber determinados factores sanguneos, fenol, detergentes... que inhibiran la actividad de la polimerasa. y Cantidad de la muestra: si se dispone de suficiente cantidad para la amplificacin de ADN genmico de copia nica se usan cantidades de 100500 ng. En el caso de zonas repetidas se puede reducir esta cantidad a 1050 ng. El mnimo oscila entre 10-100 ng y el mximo entre 400-500 ng.

DNA Polimerasa Existen diferentes tipos de DNA polimerasa que llevan a cabo la replicacin del ADN, siguiendo el mismo mtodo de sntesis. Se pueden clasificar en: y Termolbiles: T ptima de 37-42C. Se desnaturalizan con el calor.

Termoestables: T ptima de 74 C. Resiste durante 40-50a 96C.

Inicialmente se us el fragmento Klenow de la DNA polimerasa de E. coli (Saiki y cols., 1985) la cual posee actividad 3-> 5 exonucleasa que le proporciona la capacidad de cambiar el nucletido que ha sido errneamente incorporado. La importancia de esta actividad radica en que aumenta la fidelidad de la replicacin del ADN original. Sin embargo, se trata de una enzima termolbil por lo que no soporta los ciclos y temperaturas utilizados en una PCR. Actualmente la polimerasa que se utiliza es la Taq polimerasa (Estivil, 1991). Es una enzima termoestable aislada de Termus aquaticus (Taq), una bacteria que soporta altas temperaturas. La Taq polimerasa ha simplificado enormemente la tcnica de la PCR, ya que ha permitido su automatizacin (desarrollo del termociclador). Amortiguador de la reaccin Por lo general est formado por: 10 mM tris-HCl (pH=8.4 a T ambiente), 50 mM KCl, 0.1% w/v gelatina y 1.5 mM MgCl2. Algunos autores recomiendan el uso de adyuvantes, los cuales ayudaran en la prctica a aumentar la especificidad y fidelidad de la reaccin en cadena de la polimerasa. El dimetilsulfxido (DMSO) aadido al buffer de la reaccin en un 10% contribuye a la disminucin de la estructura secundaria del ADN (Anderson, 1990). Tambin se pueden usar detergentes como el tween 20, laureth 12 (0.1%) o Tritn x10, que ayudan a estabilizar la enzima. Existen tambin protocolos que incorporan polietilenglicol (PEG), glicerol, formamida, seroalbmina bovina (BSA), etc, aunque no son en ningn caso imprescindibles. Contaminacin en la PCR La Reaccin en Cadena de la Polimerasa es una tcnica muy sensible, por lo que es de gran importancia evitar contaminaciones, ya que es posible que el ADN no deseado (aunque se encuentre en una cantidad muy pequea) se amplifique y obtengamos un resultado que no es real. Vemos que una de sus mayores ventajas de la tcnica, se convierte a la vez en el principal inconveniente. Existen una serie de normas que ayudan a evitar las contaminaciones. En el caso de trabajar con muestras de ARN las precauciones se deben extremar al mximo:

y y y y y

Lugar fsico exclusivo para realizar la PCR Uso de instrumental exclusivo para la PCR Utilizacin de reactivos y tubos estriles Uso de guantes por el manipulador Realizacin de controles de blanco (se aade agua en lugar de ADN, no debe existir amplificacin).

Aplicaciones La tcnica de la PCR tiene multitud de aplicaciones: ya en ciencia bsica, como herramienta de deteccin y/o generacin de acervos de fragmentos de ADN de inters; ya en ciencia aplicada, como elemento resolutivo en s mismo, por ejemplo en diagnstico clnico. Investigacin La PCR convencional se emplea como base para multitud de tcnicas en el laboratorio debido a su robustez y rapidez. De este modo, la PCR de punto final permite controlar y detectar los fragmentos de ADN de inters. Clonacin de un segmento de ADN mediante amplificacin con cebadores que contienen una secuencia apta para la recombinacin dirigida con un plsmido. Una aplicacin de la PCR de extrema importancia es la clonacin de secuencias de ADN en vectores, como pueden ser los plsmidos. Para ello, se emplean cebadores que contienen en su extremo 5' una corta secuencia que permite la interaccin posterior con otra complementaria situada en el vector de clonacin a emplear. Por ejemplo, se puede incluir una diana de restriccin en dichos cebadores, de modo que, y si sta no exista previamente en el fragmento y es nica en el vector, pueda efectuarse una ligacin mediante la ligasa de T4 tras la digestin con la enzima de restriccin apropiada de ambos elementos. Otro mtodo asimilable a esta va es el empleo de la recombinacin dirigida; esto es, se adapta al 5' de los cebadores una secuencia que faculta a una recombinasa la recombinacin dirigida con un vector dado. Medicina
y

Permite el genotipar la especie o especies que provocan un determinado cuadro infeccioso: para ello, se amplifica una zona del genoma bacteriano cuyo producto de PCR posea unas caractersticas de tamao o temperatura de fusin que permitan identificarlo de forma inequvoca. En el caso de infecciones virales que implican la integracin del genoma del patgeno en el ADN del hospedador, como es el de la infeccin por VIH, la PCR

cuantitativa posibilita la determinacin de la carga viral existente y por tanto, del estadio de la enfermedad. La PCR tambin se puede usar en revisiones mdicas rutinarias, como en los servicios de donantes de sangre, para test de rutina. A travs de esta tcnica se pueden detectar infecciones peligrosas en el donante (como VIH o Hepatitis B) mientras an estn en el periodo de incubacin. Dada la sensibilidad de los test de PCR se pueden tomar muestras colectivas o "pools" (por ejemplo, 96 pruebas individuales). Si una de estas muestras colectivas da positivo, se toman a partir de ella muestras progresivamente menores hasta que se encuentra el causante. El diagnstico de enfermedades hereditarias presentes en el genoma es un proceso largo y complicado que puede acortarse significativamente gracias a la PCR. Cada uno de los genes prueba se pueden amplificar mediante sus correspondientes primers y posteriormente secuenciar para detectar la existencia de mutaciones.

Paleontologa, antropologa biolgica, y ciencias forenses Los campos de la paleontologa, antropologa biolgica y la medicina y antropologa forense se han visto enormemente beneficiados por esta tcnica, puesto que todas ellas construyen con frecuencia el conocimiento de sus correspondientes disciplinas gracias a restos o huellas de seres vivos. Uno de los materiales biolgicos que ms informacin puede proporcionar es el ADN. La relativa estabilidad de ste permite que, aunque fragmentado, se conserve durante largos periodos de tiempo si las condiciones son propicias. En ocasiones las muestras intactas con las que se puede contar son extraordinariamente pequeas o estn deterioradas. La PCR soluciona ambos problemas y proporciona cantidades tiles para posteriores pasos de anlisis. En primer lugar aumenta la cantidad de material recuperado a partir de muestras escasas, puesto que como ya se dijo anteriormente, en teora basta una sola molcula para que el proceso pueda tener lugar. Tambin debido a la naturaleza de la tcnica y su propsito de amplificacin de fragmentos pequeos, esta fragmentacin no impide que este ADN pueda ser empleado como molde para una reaccin de PCR.
y

En paleontologa y Antropologa la PCR permite recuperar las escasas cantidades de ADN que an no se han degradado. Algunos lugares en que el ADN podra preservarse son la brea las cenizas volcnicas, el mbar, hielos histricos polares o glaciares y ambientes ridos, sedimentos, as como en los cristales de apatita de restos de esqueleto, siendo posible de ese modo caracterizar cadveres, fsiles u otros restos mediante genotipado por anlisis de microsatlites o incluso genomas de taxones extintos, amplificados de este modo, como pueden ser los realizados mediante el ADN genmico del hombre de Neanderthal. El propsito sera utilizar este ADN amplificado para posteriormente realizar estudios filogenticos o etnogrficos o de poblaciones mediante la comparacin de secuencias de ADN, o el estudio de las causas de la separacin evolutiva de dos especies.

En las ciencias forenses se emplea para establecer la filiacin de una persona o para obtener pruebas a partir de muestras mnimas dejadas por el autor de un crimen como saliva, semen u otros restos de tejidos.

Agronoma y diversidad Tal y como la PCR multiplex permite producir huellas genticas de individuos concretos, dentro del marco de la gentica forense, existen mtodos basados en la PCR que permiten discernir entre grupos infraespecficos de cultivos de inters agronmico. Para ello, se emplean oligonucletidos de un tamao lo suficientemente pequeo como para que ceben de forma relativamente inespecfica, aunque siempre de tal forma que produzcan un patrn de bandas discreto e interpretable. De este modo, la pauta obtenida tras la electroforesis de los fragmentos tiende a agrupar a los individuos de mayor semejanza, que poseen un comportamiento similar, de los que divergen.

BIBLIOGRAFIA y es.wikipedia.org/wiki/Amplificacin_gentica.