Sie sind auf Seite 1von 17

Schweiz.

Lebensmittelbuch

Kapitel 62

Vitaminbestimmungen in Lebensmitteln und Kosmetika


Mitglieder der Subkommission 27

Dr. W. SCHEP (Prsident), F. Hofmann-La Roche AG, Basel W. BLUM, Bundesamt fr Gesundheit, Liebefeld-Bern Dr. F. BRAWAND, Schweizerisches Vitamininstitut, Vesalianum, Basel Dr. MAI H. BUI-NGUYN, Schweizerisches Vitamininstitut, Lausanne Dr. U. LEUENBERGER, Kantonales Laboratorium, Bern Dr. P. HOFMANN, F. Hofmann-La Roche AG, Basel S. REBER, UFAG Laboratorien AG, Sursee Dr. A. SUTTER, Kantonales Laboratorium Baselland, Liestal E. TAGLIAFERRI, Forschungszentrum Nestec AG, Lausanne

Neuausgabe, Mrz 2000

SLMB Mrz 2000

62 Vitamine

Inhaltsverzeichnis

Vitaminbestimmungen in Lebensmitteln und Kosmetika


INHALTSVERZEICHNIS Umschreibung Hinweise zur Analyse Monographien und Untersuchungsmethoden
Fettlsliche Vitamine 1 1.1 1.2 1.2.1 2 2.1 2.2 2.2.1 3 3.1 3.2 3.2.1 4 4.1 4.2 4.2.1 4.2.2 5 5.1 5.2 5.2.1 Vitamin A Monographie Allgemeine Bemerkungen zur Methode Bestimmung der Vitamine A und E mittels Umkehrphasen-HPLC Carotin - Provitamin A Monographie Allgemeine Bemerkungen zur Methode Bestimmung von -Carotin mittels HPLC Vitamin D Monographie Allgemeine Bemerkungen zur Methode Bestimmung von Vitamin D2 / D3 mittels HPLC Vitamin E Monographie Allgemeine Bemerkungen zu den Methoden Bestimmung des Vitamins E (zusammen mit Vitamin A) mittels Umkehrphasen-HPLC (siehe 1.2.1) Bestimmung der Tocopherole mittels Direktphasen-HPLC Vitamin K Monographie Allgemeine Bemerkungen zur Methode Bestimmung mittels Umkehrphasen-HPLC

SLMB Mrz 2000

1/3

62 Vitamine

Inhaltsverzeichnis

Wasserlsliche Vitamine 6 6.1 6.2 6.2.1 6.2.2 7 7.1 7.2 7.2.1 7.2.2 8 8.1 8.2 8.2.1 8.2.2 8.2.3 8.2.4 9 9.1 9.2 9.2.1 10 10.1 10.2 10.2.1 11 11.1 11.2 11.2.1 11.2.2 12 12.1 12.2 12.2.1 12.2.2 12.2.3 Vitamin B1 Monographie Allgemeine Bemerkungen zu den Methoden Bestimmung mittels HPLC und Vorsulenderivatisierung Bestimmung mittels HPLC und Nachsulenderivatisierung Vitamin B2 Monographie Allgemeine Bemerkungen zu den Methoden Mikrobiologische Bestimmung mit Lactobacillus casei Bestimmung mittels HPLC Vitamin B6 Monographie Allgemeine Bemerkungen zu den Methoden Mikrobiologische Bestimmung mit Neurospora sitophila Mikrobiologische Bestimmung mit Saccharomyces carlsbergensis Bestimmung mittels HPLC in Kosmetika Bestimmung mittels HPLC nach berfhrung der Vitamere in Pyridoxol Vitamin B12 Monographie Allgemeine Bemerkungen zu den Methoden Mikrobiologische Bestimmung mit Lactobacillus leichmanii Biotin Monographie Allgemeine Bemerkungen zur Methode Mikrobiologische Bestimmung mit Lactobacillus plantarum Folsure Monographie Allgemeine Bemerkungen zu den Methoden Mikrobiologische Bestimmung mit Streptococcus faecium Mikrobiologische Bestimmung mit Lactobacillus casei Vitamin PP Monographie Allgemeine Bemerkungen zu den Methoden Mikrobiologische Bestimmung mit Lactobacillus plantarum Bestimmung mittels HPLC in angereicherten Lebensmitteln Bestimmung mittels HPLC in Lebensmitteln

SLMB Mrz 2000

2/3

62 Vitamine

Inhaltsverzeichnis

13 13.1 13.2 13.2.1 13.2.2 13.2.3 14 14.1 14.2 14.2.1 14.2.2 14.2.3 15 15.1 15.2 15.2.1 16 16.1 16.2 16.2.1 16.2.2

Pantothensure und Panthenol Monographie Allgemeine Bemerkungen zu den Methoden Mikrobiologische Bestimmung mit Lactobacillus plantarum Photometrische Bestimmung Bestimmung mittels HPLC in Kosmetika Vitamin C Monographie Allgemeine Bemerkungen zu den Methoden Bestimmung mittels HPLC Titrimetrische Bestimmung mit 2,6-Dichlorphenolindophenol Photometrische Bestimmung nach Roe und Osterling Rutin (Ausgabe Lebensmittelbuch 1989) Monographie Allgemeine Bemerkungen zur Methode Photometrische Bestimmung Inosit (Ausgabe Lebensmittelbuch 1989) Monographie Allgemeine Bemerkungen zu den Methoden Mikrobiologische Methode mit Neurospora crassa oder Neurospora inositolles Bestimmung mittels GC

SLMB Mrz 2000

3/3

62 Vitamine

Umschreibungen

Umschreibungen
VITAMINE Unter dem Sammelbegriff Vitamine versteht man eine Gruppe biologisch aktiver Substanzen, die zwar sehr unterschiedliche chemische Strukturen, aber folgende gemeinsame Eigenschaften aufweisen: Sie sind fr den Menschen essentiell. Der Bedarf betrgt nur wenige Mikrogramm bis Milligramm pro Tag. Es sind organische Substanzen. Man kennt heute 13 Vitamine, von denen einige als Gruppe verwandter Stoffe mit qualitativ gleicher Wirkung vorliegen knnen (Vitamere). Innerhalb einer Vitamingruppe kann die biologische Aktivitt je nach der chemischen Struktur stark variieren. Gemss internationalen Abmachungen wird die Wirksamkeit in Gewichtseinheiten oder in internationalen Einheiten (IE oder IU) ausgedrckt. Neben diesen 13 Vitaminen gibt es weitere Stoffe, die man gelegentlich den Vitaminen zugeordnet hat, deren Vitaminnatur aber zweifelhaft oder unbewiesen ist. Von diesen Verbindungen seien Rutin und Inosit erwhnt. Die Vitamine werden in der Regel mit einer Buchstaben-Zahlenkombination bezeichnet, doch existieren zahlreiche Trivialnamen. Speziell zu beachten ist auch die Tatsache, dass viele Vitamine in verschiedenen Derivaten vorliegen knnen, z. B. als Alkohol, Acetat usw. In der Regel werden die Vitamine in fettlsliche und wasserlsliche Gruppen eingeteilt. Zur fettlslichen Gruppe gehren die Vitamine A, D, E und K, whrenddem die anderen Vitamine zu den wasserlslichen Wirkstoffen gezhlt werden. Die unterschiedliche Lslichkeit spielt bei der Extraktion der Vitamine aus Lebensmitteln und Kosmetika eine entscheidende Rolle.

ALLGEMEINE LITERATURHINWEISE Periodisch erscheinende Verffentlichungen: Official Methods of Analysis of AOAC International. Erscheint seit 1920 ca. alle fnf Jahre. Neuster Band: 16. Auflage, 5. Revision, 1999. International Journal for Vitamin and Nutrition Research. Hans Huber Verlag. Erscheint viermal pro Jahr, seit 1932. Munson, P.L., Glover, J., Dicszfalusy, E. and Olson, R.E. (Hrsg.): Vitamins and Hormones. Academic Press. Erscheint jhrlich seit 1945.

SLMB 2002

1/8

62 Vitamine

Umschreibungen

Glick, D. (Hrsg.): Methods of Biochemical Analysis. John Wiley Verlag. Erscheint jhrlich seit 1954. The Vitamins. 7 Bnde, verschiedene Autoren. Academic Press, 1967 - 1971. Einzelverffentlichungen: Mcke, D. (Hrsg.): Einfhrung in mikrobiologische Bestimmungsverfahren; 2. Auflage. Verlag Thieme, Leipzig (1957). Strohecker, R. und Henning, H (Hrsg.): Vitaminbestimmungen, Verlag Chemie GmbH, Weinheim (1963). Freed, M. (Hrsg.): Methods of Vitamin Assay. Interscience Publishers, John Wiley & Sons, New York, London, Sidney (1966). Handbuch der Lebensmittelchemie Band II/2. Springer Verlag (1967). Osborne, D.R. and Voogt, P.: The Analysis of Nutrients in Food. Academic Press, London, New York, San Francisco (1978). Knobloch, E. and Cerna-Hegrovska, J. (Hrsg.): Fodder Biofactors. Elsevier Scientific Publishing Company (1979). Vitamin-Compendium: Die Eigenschaften der Vitamine und ihre Bedeutung fr die Ernhrung von Mensch und Tier. 2., revidierte Auflage. Editiones ROCHE (1980). Isler, O. und Brubacher, G. (Hrsg.): Vitamine I. Fettlsliche Vitamine. George Thieme Verlag, Stuttgart/New York (1982). Augustin, J., Klein, B.P., Becker, D. and Venugopal, P.B. (Hrsg.): Methods of Vitamin Assay. John Wiley & Sons, New York, Chichester, Brisbane, Toronto, Singapore (1985). Brubacher, G., Mller-Mulot, W. and Southgate, D.A.T.: Methods for the Determination of Vitamins in Food. Elsevier London (1985). De Leenheer, A.P., Lambert, W.E. and De Ruyter, M.G.M.: Modern Chromatographic Analysis of the Vitamins; Vol. 30. Marcel Dekker, Inc. New York (1985). Ball, G.G.M.: Fat-soluble Vitamin Assays in Food Analysis. Elsevier Applied Science, London and New York (1988). Isler, O., Brubacher, G., Ghisla, S. und Krutler, B. (Hrsg.): VitamineII. Wasserlsliche Vitamine. George Thieme Verlag, Stuttgart/New York (1988). Ball, G.G.M.: Water-soluble Vitamin Assays in Human Nutrition. Chapman & Hall, London, Glasgow, Weinheim, New York, Tokyo, Melbourne, Madras (1994). Difco Manual. 11. Auflage. Difco Laboratories, Division of Becton Dickinson and Company., Sparks, Maryland 21152, USA (1998). Eitenmiller, R.R. and Landen, W.O.: Vitamin Analysis for the Health and Food Sciences. CRC Press, Boca Raton, London, New York, Washington, D.C. (1999).

SLMB 2002

2/8

62 Vitamine

Umschreibungen

BEURTEILUNGSGRUNDLAGE ZUR UMSCHREIBUNG UND DEKLARATION DER VITAMINE IN LEBENSMITTELN 1 Unter der Bezeichnung Vitamin XY wird oft eine Gruppe chemisch und physiologisch vergleichbarer Verbindungen zusammengefasst. Es ist aber weder festgelegt, welche dieser Verbindungen im Rahmen der Kennzeichnung von Lebensmitteln bei der Deklaration bercksichtigt werden mssen, noch wie den unterschiedlichen physiologischen Wirkungen und biologischen Aktivitten Rechnung zu tragen sei. Eine ausgelobte Verbindung sollte aber so definiert werden, dass eine analytische berprfung der Werte mit vernnftigem Aufwand mglich und eine sinnvolle Qualittskontrolle sowie ein einheitlicher Vollzug gewhrleistet ist. Im Rahmen der Nhrwertkennzeichnung eines Lebensmittels darf auf einen Gehalt an Vitaminen oder Mineralstoffen hingewiesen werden, wenn ein Lebensmittel signifikante Mengen davon enthlt (Art. 5 Nhrwertverordnung, NwV). Angaben, was unter den einzelnen Vitaminen zu verstehen ist, werden fr normale Lebensmittel nicht gemacht. Art. 9 NwV besagt nur, dass Lebensmitteln ausschliesslich die in Anhang 1 NwV aufgefhrten Vitamine und Mineralstoffe zugegeben werden drfen. Ausschliesslich fr Suglingsanfangsnahrung und Folgenahrung (Lebensmittelverordnung (LMV) Anhnge 2, 3, 4) und fr Lebensmittel fr eine gewichtskontrollierende Ernhrung (Anhang 7 LMV) finden sich Umschreibungen, welche aber nicht einheitlich sind. Vielfach wird fr die Beurteilung zustzlich eine wissenschaftliche, auf der physiologischen Wirkung basierende Definition der Vitamine herangezogen, was nicht zu einer Klrung der Situation beitrgt. Fr die Nhrwertkennzeichnung ist die Summe der natrlicherweise vorhandenen und der zugesetzten Verbindungen massgebend (Art. 9 Abs. 2 NwV). Eine einheitliche Umschreibung der Vitamine kann deshalb auch durch eine abschliessende Liste der bei der Herstellung erlaubten Nhrstoffe (analog Kleinkindernahrung, Anhang 3 LMV) nicht erreicht werden. Deshalb wurde die Zusammenstellung (Tabelle 1) mit dem Ziel erarbeitet, eine Vereinheitlichung der Beurteilungskriterien zu erreichen. Sie enthlt zu jedem Vitamin folgende Angaben: a) die spezifische Bezeichnung (z.B. Vitamin A), b) die Substanzen (Vitamere), die bei der Berechnung des Gehalts zu bercksichtigen sind, c) die physiologische Wirksamkeit im Vergleich zur Bezugsverbindung2, d) die Bezugsverbindung, auf die umgerechnet der Gehalt anzugeben ist und e) Angaben dazu, wie die Kennzeichnung auf der Etikette auszusehen hat. Damit steht eine gemeinsame Beurteilungsgrundlage fr alle Beteiligten zur Verfgung. Die Zusammenstellung soll ausschliesslich dazu beitragen, die Kennzeichnung von Lebensmitteln zu vereinheitlichen und erhebt keinen wissenschaftlichen Anspruch. Unbedeutendere und/oder seltene Vitamere wurden nicht in die Tabelle aufgenommen, um nicht unverhltnismssige Analysenkosten ohne Verbesserung der Sicherheit der fraglichen Lebensmittel zu prjudizieren. Auf Angaben zur Umrechnungen in andere Einheiten (IE), zu Synonymen der Bezeichnungen oder auf Vergleiche mit alten

Wurde in einer Arbeitsgruppe vom Bundesamt fr Gesundheit in Zusammenarbeit mit den kantonalen Vollzugsbehrden und Experten aus der Privatwirtschaft erarbeitet 2 die Summe der mit diesen Faktoren korrigierten Megen ergibt den Vitamingehalt

SLMB 2002

3/8

62 Vitamine

Umschreibungen

Nomenklatursystemen wurde ausdrcklich verzichtet. Man halte sich an die Angaben in der Fachliteratur. Dieser Konsens stellt eine Leitlinie zuhanden der Lebensmittelhersteller bzw. -inverkehrbringer und der Vollzugsbehrden dar und soll im Rahmen des Vollzugs der schweizerischen Lebensmittelgesetzgebung Rechtssicherheit schaffen.

SLMB 2002

4/8

62 Vitamine Tabelle 1: Beurteilungsgrundlage zur Umschreibung und Deklaration der Vitamine in Lebensmitteln
Vitamin Analyten Physiologische Wirksamkeit im Vergleich zur Bezugsverbindung 1 Bezugsverbindung Deklaration Bemerkungen

Umschreibungen

Vitamin A

Retinol

Retinol (MG = 286.5)

g Vitamin A /100 g

Provitamin A

-Carotin

(all-E)--Carotin (MG = 536.9)

mg beta-Carotin /100 g

1. Ein eventueller Gehalt an 13-cis-Isomeren ist enthalten. Denn all-trans Retinyl Derivate knnen teilweise zu 13-cis Retinol isomerisieren. 2. Retinylester werden als Retinol berechnet (in der Regel werden Retinylester hydrolisiert und als Retinol erfasst) 1. Gemessen wird der totale -Carotingehalt, d.h. die Summe aller cis- und transIsomeren. 2. In der Regel wird Anteil von alpha-Carotin vernachlssigt. Zur Berechnung der Retinol quivalente gemss NwV wird der betaCarotin Gehalt mit dem Faktor 0.167 multipliziert und zum Vitamin A Gehalt addiert. 3. fr die Quantifizierung der cis--CarotinIsomeren wird der Faktor fr all-trans-Carotin verwendet. Cholecalciferol und Ergocalciferol weisen vergleichbare Molekulargewichte und physiologische Aktivitten auf.

Vitamin D

Cholecalciferol (Vit. D3) Ergocalciferol (Vit. D2)

1.0 1.0

Cholecalciferol (MG = 384.6)

g Vitamin D /100 g

SLMB 2002

5/8

62 Vitamine
Vitamin Analyten physiologische Wirksamkeit im Vergleich zur Bezugsverbindung 1 0,74 0,5 0,25 Bezugsverbindung Deklaration Bemerkungen

Umschreibungen

Vitamin E

RRR--Tocopherol all-rac--Tocopherol RRR--Tocopherol RRR--Tocopherol

RRR--Tocopherol (MG = 430.7)

mg Vitamin E /100 g

1. -Tocopherol und alle Tocotrienole werden vernachlssigt. 2. Da in der Regel nicht das enantiomerenreine RRR--Tocopherol bestimmt wird, wird Tocopherol als all-rac--Tocopherol betrachtet. 3. Tocopherylester werden als Tocopherole berechnet (in der Regel werden Tocopherylester hydrolisiert und als Tocopherole erfasst) 1. Salze und Ester von Ascorbinsure und Dehydroascorbinsure werden ebenfalls erfasst und mssen mit dem entsprechenden Molekulargewicht umgerechnet werden. 2. Erythorbinsure, (Isoascorbinsure) die vielfach als Antioxidans eingesetzt und mit gewissen Analysenmethoden ebenfalls erfasst wird, weist kaum physiologische Wirksamkeit auf und wird deshalb nicht bercksichtigt. Cis/trans-Isomere des Vitamin K1 werden blicherweise nicht getrennt. Das cis-Isomer ist inaktiv. In der Regel ist es wegen des geringen cis-isomer Gehaltes vertretbar, den Gesamtgehalt zu deklarieren.

Vitamin C

L-Ascorbinsure LDehydroascorbinsure

1.0 1.0

L-Ascorbinsure (MG = 176.1)

mg Vitamin C /100g

Vitamin K

Phyllochinon

1.0

Phyllochinon (MG = 450.7)

mg Vitamin K /100 g

SLMB 2002

6/8

62 Vitamine
Vitamin Analyten physiologische Wirksamkeit im Vergleich zur Bezugsverbindung 1.0 Bezugsverbindung Deklaration Bemerkungen

Umschreibungen

Vitamin B1

Thiamin Salze

ThiaminchloridHydrochlorid (MG = 337.3) Riboflavin (MG = 376.4) Nicotinamid (MG = 122.1)

mg Vitamin B1 /100 g

Andere Salze mssen entsprechend ihren Molekulargewichten umgerechnet werden.

Vitamin B2

Riboflavin Riboflavin-5-phosphat Nicotinamid Nicotinsure

1.0 1.0 1.0 1.0

mg Vitamin B2 /100 g

Vitamin PP (Niacin)

mg Vitamin PP /100 g bzw. mg Niacin /100 g

Die Angabe umfasst die Summe der beiden Analyten. In der Regel wird Riboflavin-5phosphat in Riboflavin hydrolysiert. 1. Bei der mikrobiologischen Bestimmung werden beide Formen gleich gut erfasst. Als Referenz dient jedoch das meistens eingesetzte Nicotinsureamid. 2. Ein Beitrag durch vorhandenes Tryptophan wird nicht bercksichtigt 3. Bei der Bestimmung mittels HPLC kann zwischen der Sure und dem Amid unterschieden werden. Die Nicotinsure wird selten eingesetzt. Es ist bei der Bestimmung sicherzustellen, dass die Phosphate hydrolisiert werden.

Vitamin B6

Pyridoxin Pyridoxal Pyridoxamin

1.0 1.0 1.0

mg Vitamin B6 /100 g Pyridoxinhydrochlo rid (MG = 205.6) Pteroylmonoglutaminsure (MG = 441.4) g Folsure /100 g

Folsure

Pteroylderivate

SLMB 2002

7/8

62 Vitamine

Umschreibungen

Vitamin

Analyten

physiologische Wirksamkeit im Vergleich zur Bezugsverbindung 1.0 1.0

Bezugsverbindung

Deklaration

Bemerkungen

Vitamin B12

Cyanocobalamin Hydroxocobalamin D-Biotin


D-Pantothensure

Cyanocobalamin (MG = 1355.4) D-Biotin (MG = 244.3)

g Vitamin B12 /100 g

Hydroxocobalamin wird ebenfalls erfasst.

Biotin Pantothensure

g Biotin /100 g mg Pantothensure /100 g

1.0 1.0

Dexpanthenol (D-Panthenol)

Pantothensure (MG = 219.2)

SLMB 2002

8/8

62 Vitamine

Hinweise

Hinweise zur Analyse


ANWENDUNGSBEREICHE DER BESCHRIEBENEN METHODEN Es besteht heute in der Literatur eine grosse Vielfalt an Bestimmungsmethoden fr die Vitamine, wobei viele dieser Methoden aber nur in speziellen Fllen anwendbar sind. Fr die in diesem Kapitel beschriebene Analytik gilt folgendes: Die fr jedes Vitamin beschriebenen Bestimmungsmethoden sind in der Regel allgemein anwendbar fr Lebensmittel und Kosmetika. Die Auswahl der Methoden sowie die Angaben ber die Einwaagen und Verdnnungen sind auf diejenigen Vitaminmengen ausgerichtet, wie sie in der Schweiz blich sind. Bei Lebensmitteln betragen diese Mengen i.d.R. 33 - 100 % der empfohlenen Tageszufuhr pro Portion des entsprechenden Nahrungsmittels, vgl. Tabelle 62.1/Umschreibung. Der Zusatz von Vitaminen zu Lebensmitteln wird in der Nhrwertverordnung geregelt. In den meisten Fllen werden mit den hier beschriebenen Methoden sowohl zugegebene als auch endogene Vitamingehalte erfasst. Bei gewissen Lebensmitteln liegen jedoch die endogenen Vitamine nicht in freier Form vor, sondern sind an Zellbestandteile wie Proteine und Membranen gebunden. Sofern solche endogenen Vitamingehalte quantitativ ins Gewicht fallen und deshalb miterfasst werden mssen, sind spezielle Extraktionsmethoden notwendig, die in die entsprechenden Bestimmungen ebenfalls miteinbezogen wurden.

EINTEILUNG DER ANALYSENMETHODEN Im wesentlichen lassen sich drei Gruppen von Bestimmungsmethoden unterscheiden: Die chemisch-physikalische Vitaminbestimmung steht heute eindeutig im Vordergrund, wobei die Anwendung der High Performance Liquid Chromatography (HPLC) dominiert. Die mikrobiologischen Methoden haben sich dank ihrer grossen Empfindlichkeit und hohen Spezifitt gut bewhrt. Dabei wird die Stoffwechselttigkeit oder das Wachstum von solchen Mikroorganismen gemessen, fr welche das zu bestimmende Vitamin absolut unentbehrlich ist. Diese Methoden werden vor allem bei denjenigen Vitaminen des BKomplexes angewendet, bei denen keine gleichwertigen chemischen Analysenverfahren vorliegen. Den allgemeinen Prinzipien der Auswertung und den wichtigsten Fehlerquellen bei der mikrobiologischen Analytik ist ein spezieller Abschnitt gewidmet. Die biologische Bestimmung eines Vitamins am Tier, die frher bei vielen Vitaminen die einzig mgliche Bestimmungsmethode darstellte, wird heute nur noch ausnahmsweise z. B. bei kleinen und schwer extrahierbaren Vitamin D-Dosierungen in Lebensmitteln durchgefhrt. Da diese Bestimmungsmethoden heute nicht mehr praxisrelevant sind und HPLC-Verfahren zur Verfgung stehen, wird in diesem Kapitel auf die biologische Bestimmung der Vitamine nicht mehr eingegangen.

SLMB Mrz 2000

1/5

62 Vitamine

Hinweise

TECHNISCHE ANGABEN Generelles In den verschiedenen Analysenmethoden werden Bezugsquellen angegeben, die auch auf die Reinheit der verwendeten Chemikalien hinweisen. Diese Angaben beruhen auf der Meinung und der Arbeit der Untersuchungsgruppe und sollen die Arbeit des Analytikers erleichtern. Die Verwendung anderer Materialien, Gerte und Chemikalien von anderen Herstellern soll damit nicht ausgeschlossen werden. Analysenverluste, die bei der Durchfhrung der Analyse auftreten, mssen bei der Berechnung des Analysenergebnisses bercksichtigt werden. Die Wiederfindungsrate kann durch Standardaddition oder ber einen internen Standard bestimmt werden. Matrixspezifische Erfahrungswerte der Wiederfindungsrate knnen zur Berechnung herangezogen werden. Probenvorbereitung Eines der Hauptprobleme bei den Vitaminanalysen besteht in der Entnahme einer homogenen und reprsentativen Analysenprobe. Sowohl in Lebensmitteln wie auch in Kosmetika sind die meisten Vitamine in relativ kleinen Konzentrationen vorhanden und oft nicht homogen verteilt. So knnen sich die fettlslichen Vitamine in der lipophilen und die wasserlslichen in der hypophilen Phase anreichern. Ferner knnen Vitamine durch Lichteinfluss, Wrmeeinwirkung, Feuchtigkeit oder Schwermetallionen zerstrt werden, wobei an der Oberflche der Probe erheblich grssere Vernderungen auftreten als in der Gesamtprobe. Enthlt das Analysengut Vitamine in physikalisch stabiliserter Form (z. B. Vitamin A, D und E in Pulverform), so ist es auch bei praktisch idealer Durchmischung nicht mglich, die Vitamine homogen auf das ganze Muster zu verteilen. Zudem neigen solche Proben oft zur Entmischung. Der Analytiker erkennt die nicht homogene Verteilung von Vitaminen vor allem daran, dass Doppelwerte eine ungewhnlich grosse Abweichung voneinander zeigen. In solchen Fllen muss eine mglichst grosse Probe von Untersuchungsmaterial nochmals durchgemischt oder, wenn ntig, homogensiert oder gemahlen werden, und es ist oft notwendig mehrere Analysen durchzufhren. Bei der Durchmischung oder Homogenisation muss darauf geachtet werden, dass das Probenmaterial dabei nicht erhitzt wird oder mit Spuren abgeriebenen Metalles von Schlagmhlen oder Mixern in Berhrung kommt. Auch ist ein guter Schutz gegenber Luftsauerstoff durch Begasung mit Stickstoff oder Argon eine wichtige Vorsichtsmassnahme. Die Aufbewahrung der Probe sollte im Dunkeln, nach Mglichkeit unter Ausschluss des Luftsauerstoffs und eventuell bei tiefen Temperaturen erfolgen. Bei tiefgefrorenen Proben sollte das Auftauen unmittelbar vor Analysenbeginn erfolgen, wobei darauf zu achten ist, dass sich der Wassergehalt nicht ndert.

SLMB 2002

2/5

62 Vitamine

Hinweise

Reagenzien: Wasser: Bei allen mikrobiologischen Bestimmungen ist es unbedingt notwendig, bidestilliertes Wasser zu verwenden. Bei den chemischen Methoden gengt es in der Regel, wenn einfach destilliertes oder Ionenaustauscher-Wasser bentzt wird. brige Substanzen: Bei allen Substanzen ohne Reinheitsangaben handelt es sich durchwegs um handelsbliche, analysenreine Chemikalien.

MIKROBIOLOGISCHE METHODEN

PRINZIP Ausgewhlte Mikroorganismen, deren spezifischer Stoffwechsel oder sogar das Wachstum auf die Anwesenheit eines zu bestimmenden Vitamins angewiesen ist, werden einem Extrakt des zu untersuchenden Lebensmittels oder Verbrauchsgegenstandes beigegeben. Die Intensitt der Stoffwechselleistung oder des Wachstums wird gemessen und mit einer Standard-Konzentrationsreihe verglichen.

AUSWERTUNG Das Wachstum und die Vermehrung des Mikroorganismus wird in der Regel titrimetrisch, gravimetrisch oder turbidimetrisch (bzw. nephelometrisch) bestimmt. Die Stoffwechselttigkeit kann aufgrund der Menge der gebildeten Stoffwechselprodukte gemessen werden. Handelt es sich z. B. um mit Lactobacillen durchgefhrte Tests, ist das Stoffwechselprodukt in der Regel Milchsure, welche titrimetrisch erfasst werden kann. Liegen gravimetrische Auswertungen vor, beispielsweise bei Pilzen (Neurospora Arten), kann durch den Wachstumskurvenverlauf die Abhngigkeit der Entwicklung des Testorganismus dargestellt werden durch die Gewichtsmenge des gebildeten Mycels. Tritt bei Zusatz eines zu untersuchenden vitaminhaltigen Substrates im anfangs klaren Testmedium als Folge der Keimvermehrung eine Trbung auf, wird turbidimetrisch ausgemessen. Die turbidimetrische Auswertung der Wachstumsreaktion ist einfacher und mit geringerem Zeitaufwand durchfhrbar, doch die Genauigkeit von turbidimetrischen Messungen liegt unter derjenigen, welche mit gravimetrischen oder titrimetrischen Methoden erreicht werden kann. Zu Kontrollzwecken wird empfohlen, ein Nhrmedium Nullwert (Medium ohne Mikroorganismen) zur Nullabgleichung des Photometers zu verwenden. Eine noch hhere Reproduzierbarkeit wird durch Standardisierung der Menge des Inokulums gewhrleistet (turbidimetrische Messung des Nhrmediums und Einstellung auf optimale Verdnnung). Fast smtliche mikrobiologischen Bestimmungen werden in der Weise ausgewertet, dass man die Wachstumsintensitt des Mikroorganismus nach Zugabe der Standardsubstanz gegen die Konzentration dieses Vitamins in ein Koordinatensystem auftrgt. Um es am Beispiel der Vitamin PP-Bestimmung mit Lactobacillus plantarum nher zu erlutern: Auf

SLMB 2002

3/5

62 Vitamine

Hinweise

die Ordinate sind die zur Neutralisation der durch den Mikroorganismus gebildeten Milchsure erforderlichen Milliliter Natronlauge, c (NaOH) = 0,1 mol/l, aufzutragen, auf der Abszisse die pro Testrhrchen eingesetzte Substanzmengen. Die Testprobe wird so weit verdnnt, dass die zu erwartenden Vitaminmengen in den Messbereich der Standardkurve zu liegen kommen. Sind diese zu erwartenden Vitaminmengen grssenordnungsmssig nicht bekannt, so ist in einem orientierenden Vorversuch zunchst eine fr den Messbereich der Bezugskurve passende Konzentration zu ermitteln. Mit der aus dem Vorversuch erhaltenen Vitaminkonzentration (Testsubstrat) sind mehrere verschieden grosse Verdnnungen herzustellen und zu berprfen. Fr jeden Versuchsansatz ist stets eine neue, nur fr diesen Ansatz gltige Standardkurve anzufertigen. Es ist zu empfehlen, jede der Konzentrationsstufen der Standardreihe und des Testsubstrates mindestens zwei- bis dreifach anzusetzen. Zur Berechnung wird das arithmetische Mittel der zwei bzw. drei erhaltenen Werte jeder Stufe benutzt. Aus dem Mittelwert der einzelnen Konzentrationsstufen wird dann der zugehrige Vitamingehalt des Testsubstrates bestimmt. Die Einzelwerte drfen dabei nicht mehr als maximal 10 % vom Durchschnitt abweichen. Eine allgemein gltige Przisionsangabe ist nicht mglich; der Variationskoeffizient sollte in den meisten Fllen bei ungefhr 5 % liegen. Ganz allgemein muss bemerkt werden, dass die Angaben zu den Reagenzien, zur Ausfhrung und zur Berechnung von zustndigen Experten als optimal angesehen werden. Wenn triftige Grnde vorliegen, so knnen erfahrene Laboratorien nach eingehender Prfung entsprechende Modifikationen anbringen.

FEHLERQUELLEN Wie bei den chemischen, so ist auch bei den mikrobiologischen Methoden mit systematischen und statistischen Fehlern zu rechnen. Fehlerquellen, die zu einer systematischen Verflschung des Analysenresultates fhren, beruhen auf den in Nahrungsmitteln vorkommenden Stoffen (z. B. Schwermetalle, Antibiotika u.a.), die den Stoffwechsel oder das Wachstum der Mikroorganismen beeinflussen. Solche Strungen knnen aber durch die Zugabe einer bekannten Menge des entsprechenden Vitamins zur Analysenprobe ermittelt werden. Wenn mglich muss in diesen Fllen vor der eigentlichen mikrobiologischen Bestimmung ein Trennungsgang eingeschaltet werden, um das zu bestimmende Vitamin von den strenden Begleitstoffen zu befreien.

TECHNISCHE ANGABEN Die ATCC Nummern bei den Mikroorganismen beziehen sich auf die American Type Culture Collection, wo auch alle verwendeten Stmme bezogen werden knnen. Im folgenden werden auch noch drei europische Bezugsquellen angegeben, wobei bei diesen Firmen die ATCC Nummern nicht verwendet werden knnen.

SLMB 2002

4/5

62 Vitamine

Hinweise

1. The American Type Culture Collection3, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110, USA (www.atcc.org). 2. The Culture Collection of Algae and Protozoae, Institute of Freshwater Ecology, Windermere Laboratory, Far Sawrey, AMBLESIDE, Cumbria LA22 OLP UK, England (www.ife.ac.uk/ccap). 3. Centraalbureau voor Schimmelculturen, P.O. Box 273, 3740 AG Baarn, Netherlands (www.cbs.knaw.nl). 4. Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig, Deutschland (www.dsmz.de). Automation Die mikrobiologischen Methoden knnen auch auf Mikrotiterplatten durchgefhrt werden. Die bei den einzelnen Vitaminen beschriebenen Methoden werden dabei prinzipiell gleich angewendet. Die Mikrotiterplatten-Technik bietet einen enormen Automatisierungsgrad und ermglicht eine wesentliche Arbeitserleichterung ohne Einbusse an Qualitt und Genauigkeit.

Schweizer Vertretung: Chemie Brunschwig AG, Belchenstrasse 12, CH-4009 Basel.

SLMB 2002

5/5