FOSFATASA ALCALINA (ALP)

COLESTEROL TOTAL EN SUERO

Nmeros de catlogo: 225-26 225-28 225-S7 Presentaciones: 2 x 250 mL 2 x 500 mL 2 x 125 mL

USO Equipo diagnstico para la determinacin cuantitativa in vitro de colesterol total en suero. PRECAUCION Evitar la ingestin y el contacto con la piel y los ojos. Almacenar a 2-8C. REACTIVOS Reactivo de Color de Colesterol: solucin que contiene amortiguador de fosfato (pH 6.7 a 25C), 1.6 mmol/L de 4- aminoantipirine, > 5560 U/L de peroxidasa (de rbano), > 400 U/L de colesterol esterasa (pncreas porcino), > 400 U/L de colesterol oxidasa (Nocardia sp.), un conservador y un estabilizador. Reactivo de Colesterol Fenol: solucin con 40 mmol/L de fenol, un tensoactivo y un estabilizador. Estndar de Colesterol: solucin con 5 mmol/L (193 mg/dL) de colesterol, un tensoactivo y un conservador. ANTECEDENTES Las diversas metodologas para colesterol han sido revisadas a profundidad por Tonks (1) y ms recientemente por Zak (2). El mtodo enzimtico descrito a continuacin, y utilizado en este anlisis, es una modificacin de la descrita en 1974 por Allain y col (3) y Roschlau y col (4). PRINCIPIO C.E. Esteres de Colesterol Colesterol + Acidos Grasos C.O. Colesterol + O2 Colesten-3-ona + H2O2 Peroxidase 2H2O2 + 4-aminoantipirine + Fenol Quinoneimina + 4H2O Los steres de colesterol son hidrolizados a colesterol libre por la colesterol esterasa (CE). El colesterol libre es entonces oxidado por la colesterol oxidasa (CO) a colesten-3-ona con la produccin simultnea de perxido de hidrgeno. El perxido de hidrgeno producido se acopla con la 4 aminoantipirina y fenol, en presencia de peroxidasa, para producir un cromgeno con absorbancia mxima a 505 nm. La intensidad del color producida es directamente proporcional a la concentracin de colesterol total en la muestra. PREPARACION DEL REACTIVO Catlogos Nmero: 225-26, 225-S7 Prepare el volumen requerido de reactivo de trabajo al mezclar volmenes iguales del reactivo de color y el reactivo de fenol. Agite suave y compoletamente. Catlogo Nmero: 225-28 Prepare 1000 mL de reactivo agregando el reactivo de color (1a) al reactivo de fenol (R1). Agite suave y completamente.
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ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO DEL REACTIVO Los reactivos incluidos son estables hasta la fecha de caducidad especificada en las etiquetas a 2-8C. El reactivo de trabajo preparado es estable por 4 semanas 2-8C y por 5 das a 18-26C. DETERIORO DEL REACTIVO Las soluciones de reactivos deben ser claras. Una turbidez indica deterioro. INSTRUMENTOS Puede usarse cualquier analizador con control de temperatura de 0.5C que sea capaz de leer la absorbancia con exactitud, con una sensibilidad de 0.001 de absorbancia a 505 nm. El ancho de banda deber ser de 10 nm o menos, la desviacin de la luz de 0.5% o menos y la exactitud de longitud de onda dentro de 2 nm. RECOLECCION Y PREPARACION DE LA MUESTRA La muestra de eleccin es suero fresco, claro y no hemolizado. La muestra debe recolectarse por la maana despus de un ayuno de 12 horas. Las muestras para el anlisis de colesterol son estables por una semana a 2-8C y por 4 semanas a -20 a 0C. INTERFERENCIAS Pesce and Bodourian (5) estudiaron las interferencias en la determinacin de colesterol utilizando procedimientos de colesterol oxidasa. Puede encontrar un resumen de la influencia de drogas en las pruebas de laboratorio clnico consultando a Young, D.S. (6). PROCEDIMIENTO Materiales Proporcionados Se incluyen los reactivos de color de colesterol y el reactivo de fenol para colesterol. Los equipos con No. de Catlogo 225-26 y 225-S7 incluyen el estndar de colesterol. Materiales Requeridos 1. Un analizador que rena los requisitos mencionados en la seccin de Instrumentos. 2. Cubetas de 1 cm o una celda de flujo capaz de transmitir luz a 505 nm. 3. Tubos de ensayo con capacidad para 3 mL. 4. 5. 6. 7. Pipetas con capacidad para dispensar 2.5 mL y 25 L Agua desionizada para la preparacin del blanco de reactivo Un cronmetro adecuado para medir el tiempo de incubacin a 5 y 20 minutos Un bao de agua que pueda ajustarse a 37C

Condiciones Genricas Longitud de onda ................................ 505 nm Temperatura ........................................ 18-26C o 37C Paso de luz .......................................... 1 cm Tipo de reaccin .................................. Punto final Tiempo de reaccin ............................. 5 min a 37C 20 min a 18-26C Volumen de la muestra ....................... 25 L Volumen de reactivo ........................... 2.5 mL Volumen total ...................................... 2.525 mL Relacin muestra/reactivo ................... 1/100 Analizador Automatizado 505/600 nm 37C Punto final 5 minutos 5 L 500 L 0.505 mL 1/100

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Procedimiento 1. Prepare el volumen requerido de reactivo de trabajo de colesterol. 2. En tubos de ensayo por separado pipetee 25 L de agua desionizada, del estndar de colesterol, o del suero que se desee analizar. 3. Agregue 2.5 mL del reactivo de trabajo de colesterol y mezcle. 4. Incube por 5 minutos a 37C o 20 minutos a 18-26C y determine la absorbancia del estndar (As) y de cada uno de los sueros (A) a 505 nm utilizando la muestra de agua desionizada como blanco de reactivo. ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL El color de la mezcla de reaccin final es estable por 20 minutos. CALIBRACION Debe emplearse un estndar segn instrucciones para calibrar el procedimiento. CONTROL DE CALIDAD Se debe analizar un suero u orina control con nivel normal y anormal en cada serie de muestras y los resultados debern caer dentro de 2 desviaciones estndar del valor establecido. CALCULO Y RESULTADOS Resultados La colesterol total en suero se expresa en mmol/L (mg/dL). Clculo A Colesterol mmol/L (mg/dL) = x concentracin del estndar As A = absorbancia de la muestra desconocida (de suero o de orina) As = absorbancia del estndar Ejemplo 0.485 Colesterol mmol/L (mg/dL) = x 5 0.352 = 6.88 mol/L (266 mg/dL) 0.485 = absorbancia de la muestra desconocida 0.352 = absorbancia del estndar 0.016 = absorbancia inicial del estndar 5 mmol/L (193 mg/dL) = Concentracin del estndar Limitaciones Una muestra con una concentracin de colesterol que excede el lmite de linealidad debe diluirse con solucin salina a 0.9% y volverse a analizar incorporando el factor de dilucin en el clculo del resultado. Muestras muy ictricas, hemolticas o lipmicas requieren del uso de un blanco de muestra que puede prepararse agregando 25 L de la muestra a 2.5 mL de agua desionizada.

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VALORES ESPERADOS (7) Valores para adultos seleccionados que requieren tratamiento debido a que tienen un riesgo moderado o alto de problemas coronarios*.
Edad (aos) 20-29 30-39 40 o ms Riesgo Moderado > 200 mg/dL (5.17 mmol/L) > 220 mg/dL (5.69 mmol/L) > 240 mg/dL (6.21 mmol/L) Riesgo Alto > 200 mg/dL (5.74 mmol/L) > 240 mg/dL (6.21 mmol/L) > 250 mg/dL (672 mmol/L)

* Sacado de la Recomendacin del Panel de Consenso NIH

Se sugieren estos valores como referencia. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios rangos normales para el rea donde est localizado. CARACTERSTICAS DE RENDIMIENTO Estas caractersticas de rendimiento se obtuvieron en los laboratorios de DCL usando procedimientos automatizados. Estudio de Recuperacin Se aadi colesterol a 3 grupos de sueros humanos frescos para aumentar la concentracin de colesterol en 1.29, 2.58 y 5.17 mmol/L. La recuperacin del colesterol agregado promedi 103%. Rango Lineal El procedimiento manual es lineal hasta 12.93 mmol/L (500 mg/dL). La linealidad usando procedimientos automatizados depender de la proporcin muestra/ reactivo utilizada. Estudios de Precisin La precisin de una corrida a otra se estableci al analizar 2 sueros control, dos veces al da por 10 das.
Colesterol Suero 1 Suero 2 Media mmol/L 5.43 9.85 Desviacin Estndar mmol/L 0.07 0.10 Coeficiente de Variacin % 1.3 1.0

La precisin dentro de la serie se estableci muestreando 2 grupos de sueros humanos 30 veces cada uno.
Colesterol Suero 1 Suero 2 Media mmol/L 5.59 8.40 Desviacin Estndar mmol/L 0.08 0.08 Coeficiente de Variacin % 1.4 1.0

Exactitud Se hizo una comparacin entre este mtodo de colesterol y otro mtodo de colesterol oxidasa/peroxidasa. El anlisis de regresin lineal dio la siguiente ecuacin: Este mtodo = 1.020 (mtodo de referencia) 0.03 mmol/L.

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REFERENCIAS 1. Tonks, D.B., The Estimation of Cholesterol in Serum, A Classification and Critical Review of Methods, Clin. Biochem. 1, 12 (1967). 2. Zak, B., Cholesterol Methodologies: A Review, Clin. Chem. 23, 1201 (1977). 3. Allain, C.C., Poon, L., Chan, S.G., Richmond, W., Fu, P., Enzymatic Determination of Total Serum Cholesterol, Clin. Chem. 20, 470 (1974). 4. Roschlau, P., Bernt, E., Gruber, W., Enzymatishe Bestimmung des Cesamt-Cholesterin s in Serum, Z. Klin. ch em. Klin. Biochem. 12, 226. (1974). 5. Pesce, M.A., Bodourian, S.H., Interference with the Enzymatic Measurement of Cholesterol in Serum by Use of Five Reagent Kits, Clin. Chem. 23, 757-760 (1977). 6. Young, D.S., Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests, AACC Press, Washington, Third Ediiton, 1990. 7. Witte, D.L., Barrett II, D.A., Wycoff, D.A., Evaluation of an Enzymatic Procedure for Determination of Serum Cholesterol with the Abbott-100, Clinical Chemistry 20, No. 10, 1282-1286 (1974).

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