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Universidade Federal do Par Laboratrio de Controle de Qualidade

Validao de Metodologia Analtica por Espectrofotometria para Doseamento de Rutina


Ana C.S. VIEIRA, Hennan de L. LOBATO, Marco A.D. de AZEVEDO, Nayara A. da S. BRANDO, Patrick F.P. CARNEIRO & Roberta M.M. BASTOS Laboratrio de Controle de Qualidade, Universidade Federal do Par ______________________________________________________________________
RESUMO. Rutina um flavonide ,solvel em gua, fracamente em lcool e praticamente insolvel em outros solventes orgnicos. Exerce ao vasoprotetora ao atuar sobre a resistncia e permeabilidade capilar. muito utilizada para o tratamento de diversos estados que se caracterizam por hemorragia e excessiva fragilidade capilar (preveno de varizes). Este flavonide tambm pode ser utilizado como antioxidante aumenta a absoro de vitamina C e age na proteo das estruturas dos capilares. A validao de mtodo analtico realizada para garantir de acordo com os princpios bsicos das Boas Prticas de Fabricao (BPFs), que qualquer processo, equipamento ou sistema promova os resultados esperados dentro da variao especificada na qual a substncia em exame ser analisada. Foram avaliados os parmetros de linearidade, exatido, preciso, especificidade, limite de deteco e limite de quantificao. O coeficiente de determinao obtido foi R2= 0,9987, para as concentraes analisadas no intervalo de (20,0-60,0 g/mL). O mtodo mostrou preciso, exato e linear. Entretanto no apresentou deteco e quantificao em conformidade com o estabelecido pela ANVISA, o que sugere mais estudos devem ser realizado para a utilizao do mtodo no controle de qualidade Palavras-chave: validao de metodologia analtica; espectrofotometria; Rutina. ABSTRACT. Rutin is a flavonoid, water soluble, low in alcohol and practically insoluble in other organic solvents. Exerts vasoprotective acting upon the resistance and capillary permeability. It is widely used for the treatment of several states that are characterized by excessive bleeding and capillary fragility (prevention of varicose veins). This flavonoid can also be used as an antioxidant enhances the absorption of vitamin C and acts to protect the structures of capillaries. The validation of analytical method is performed to ensure in accordance with basic principles of Good Manufacturing Practices (GMPs) that any process, equipment or system to promote the expected results within the specified range at which the substance under examination is analyzed. Parameters were evaluated: linearity, accuracy, precision, specificity, detection limit and quantitation limit. The coefficient of determination R2 = 0.9987 was obtained, analyzed for concentrations in the range (20.0 to 60.0 mg / mL). The method was precise, accurate and linear. However showed no detection and quantification in accordance with established ANVISA, suggesting that more studies should be performed to use the method in quality control. Key words: validation of analytical methodology; spectrophotometry; Rutin.

_____________________________________________________________________________________ INTRODUO Rutina (C27H30O16.3H2O) um flavonide que exerce ao vasoprotetora ao atuar sobre a resistncia e permeabilidade capilar, o qual se conhece como efeito vitamnico P. Por isso, muito utilizada para o tratamento de diversos estados que se caracterizam por hemorragia e excessiva fragilidade capilar (preveno de varizes) 1. O flavonide rutina pode ser empregado como antioxidante na preveno ou no tratamento

Laboratrio de Controle de Qualidade, ano 2011


de insuficincia venosa e linftica. um pigmento amarelo slido, semelhante quercetina, sendo que a molcula de rutina a molcula de quercetina ligada a um dissacardeo 1.

MATERIAL E MTODOS Material Foram utilizadas soluo de rutina 100 g/ml, gua purificada, balo volumtrico 100 ml, 10 ml e 5 ml, pipeta volumtrica 1 ml, 2 ml e 3 ml. As avaliaes analticas foram realizadas com o auxlio de um espectrofotmetro da marca ... Mtodos Soluo padro A soluo-me (rutina) foi preparada pesando-se 10 mg de rutina e diluindo-se a referida amostra em um balo volumtrico de 100 ml com gua purificada obtendo-se soluo final de 100 g/ml. Validao A validao da metodologia analtica em questo envolveu os parmetros de linearidade, exatido, preciso, especificidade, limite de deteco e limite de quantificao 4. Linearidade A linearidade foi estabelecida a partir do desenvolvimento de uma curva de calibrao com a soluo de rutina nas concentraes de 10 g/ml, 20 g/ml, 30 g/ml, 40 g/ml e 60 g/ml. As solues de rutina foram levadas ao espectrofotmetro e procederam-se trs leituras para cada ponto de concentrao estabelecido para anlises 6. Exatido A exatido foi avaliada por trs diferentes concentraes 7 da soluo de rutina: 10 g/ml, 20 g/ml e 40 g/ml, sendo que se fizeram trs leituras para cada uma. A exatido foi expressa pela relao entre a concentrao mdia determinada experimentalmente e a concentrao terica correspondente, multiplicados por 100. E: Concentrao mdia experimental x 100 Concentrao Terica sendo E a exatido Preciso O parmetro de preciso foi avaliado atravs de seis anlises 5 de concentrao equivalente a 20 g/ml cada. Os resultados da preciso foram expressos como desvio padro relativo (DPR) segundo a frmula: DPR= DP x 100 CMD em que, DPR: Desvio padro relativo DP: Desvio padro

FIGURA 1: Estrutura qumica da rutina 2 Os flavonides aumentam a absoro de Vitamina C e agem sinergisticamente na proteo das estruturas dos capilares, portanto os dois podem ser tomados juntos. Existe no mercado um produto que associa rutina 65 mg e Vitamina C 15 mg na preveno da destruio da Vitamina C pela oxidao, aumento da resistncia capilar, aumento da efetividade da Vitamina C e aumento da resistncia a infeco 1. A rutina solvel em gua 1:10000, piridina, formamida e solventes alcalinos, fracamente solvel em lcool, acetona e praticamente insolvel em clorofrmio, ter e benzeno. A validao de mtodo analtico realizada para garantir de acordo com os princpios bsicos das Boas Prticas de Fabricao (BPFs), que qualquer processo, equipamento ou sistema promova os resultados esperados dentro da variao especificada na qual a substncia em exame ser analisada 3. Para isto Instrues, Normas, Manuais devem ser mantidos atualizados e disponveis. Conforme definio existente na USP 28 (The United States Pharmacopeia), a validao de mtodos assegura a credibilidade destes em uso rotineiro, sendo algumas vezes mencionado como o processo que fornece uma evidncia documentada de que o mtodo realiza aquilo para o qual indicado para fazer. Os laboratrios de anlise devem realizar a validao de mtodos para atender ao governo ou a outros rgos regulamentadores sendo que os dados obtidos devem fazer parte do conjunto de informaes que ser apresentado a agncias como o FDA (Food and Drug Administration) 3. Baseado na Resoluo RE N 899, da Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA), so avaliados os parmetros de performance analtica: robustez, linearidade, especificidade, preciso, exatido e limites de deteco e de quantificao 3,4. Por tanto, a validao de metodologias analticas necessita ser especfica, robusta, sensvel, precisa e exata, constituindo fundamental importncia para o controle de qualidade dos produtos 5.

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CMD: Concentrao mdia determinada Especificidade No houve absorbncia do placebo no comprimento de onda de 252 nm. Limite de Deteco (LD) O limite de deteco foi determinado matematicamente atravs da relao entre o desvio padro da curva de calibrao e sua inclinao 8, 9, conforme a equao a seguir: LD = DPa x 3 IC sendo DPa: Desvio padro do intercepto com o eixo Y e IC a inclinao da curva de calibrao. Limite de Quantificao (LQ) Este parmetro tambm foi determinado atravs da relao entre o desvio padro da curva de calibrao e sua inclinao 8,9 atravs da seguinte equao: LD = DPa x 10 IC sendo DPa: Desvio padro do intercepto com o eixo Y e IC a inclinao da curva de calibrao. RESULTADOS E DISCUSSO Linearidade, Limites de Deteco (LD) e Limite de Quantificao (LQ) que y representa a concentrao (g/mL) e x a absorbncia (nm) em equivalentes de Rutina (Figura 2). O coeficiente de determinao obtido foi R2= 0,9987, comprovando a adequao do mtodo ao intervalo avaliado, como orienta a Resoluo n 899 de 29 de maio de 2003. O valor obtido para o limites de deteco (LD) foi de 0,000044 g/mL e o limite de quantificao (LQ) foi 0,00014 g/mL estimados pelas equaes presentes na Resoluo n 899 de 29 de maio de 2003. No entanto os valores encontrados esto abaixo dos especificados pela ANVISA, que estabelece que o limite de quantificao seja cinco vezes superior ao rudo da linha de base, e o limite de deteco seja duas a trs vezes superior ao rudo da linha de base. Com esses resultados, verificamos que o mtodo possui sensibilidade para detectar e quantificar as amostras, mas estes no esto em conformidade com a ANVISA.

TABELA I - Resultados do teste de linearidade por espectrofotometria para Rutina


Concentrao terica (g/mL) C (n=3) Desvio Padro DPR (%) Exatido (%)

10 20 30 40 60

10,962 19,033 29,907 39,966 60,222

0,001 0,0005 0,001 0,0005 0,001

0,009 0,002 0,003 0,001 0,001

109,64 95,17 99,7 99,92 100,38

Preciso e Exatido Os dados de preciso (intra-corrida) e exatido do mtodo encontram-se na Tabela II. A preciso encontrada foi de 0,0045%, apresentandose em conformidade com as diretrizes da ANVISA a qual no admite valores superior a 5%. Para o ensaio de exatido foram encontrados resultados entre 102,41%-116,42%, que esto em conformidade com a Resoluo n 899 de 29 de maio de 2003. TABELA II - Resultados de preciso e exatido do mtodo espectrofotomtrico para o doseamento do flavonide Rutina

FIGURA 2 Curva de calibrao construda com padro Rutina (20,0-60,0 g/mL) a 350nm, em que a equao linear mdia obtida foi y = 67,826x + 0,6099. O mtodo espectrofotomtrico apresentou linearidade a 350 nm para as concentraes analisadas (20,0-60,0 g/mL). A equao da regresso linear mdia obtida a partir de trs curvas de calibrao foi y=67,826x+0,6099, em

Ens P E

CT 20 10 20 40

N 6 3 3 3

CM 21,858 11,640 20,751 40,961

DP 0,001 0,0005 0 0,001

DPR (%) 0,0045 0,0042 0 0,0024

E (%) 109,31 116,42 103,77 102,41

CONCLUSO

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O mtodo proposto mostrou ser linear e possuir sensibilidade de quantificao, entretanto os valores de quantificao e deteco no se encontram de acordo com os valores especificados pela ANVISA, sugerindo que mais estudos devem ser realizados para a utilizao do mtodo no controle de qualidade. Os resultados de preciso e exatido obtidos apresentaram confiabilidade em conformidade com as diretrizes da ANVISA. flavonides de Bauhinia cheilantha (Bongard) Steudel. Rev. Bras. Cienc. Farm., vol. 44, n. 4, out./dez., 2008.

6. Pereira, A.; Scheshowitsch, K.; Cruz, A.; Silva,


M. A. S. & Stulzer, H. K. Validao de metodologia analtica para quantificao de piroxicam em cpsulas de gelatina por espectrofotometria ultravioleta (UV). Viso Acadmica, Curitiba, v.8, n.2, Jul. Dez./2007.

7. Silva, R. M. F. da; Oliveira, F. H. C. de; Rolim,


C. M. B.; Pimentel, M. F.; Medeiros, F. P. M. de; Albuquerque, M. M. de; Neto, P. J. R. Cpsulas de sulfato de indinavir: desenvolvimento farmacotcnicoindustrial, desenvolvimento do mtodo de dissoluo e avaliao. Rev. Bras. Cienc. Farm., vol. 43, n. 3, jul./set., 2007.

8. Silva, R. M. F. da; Oliveira, F. H. C. de; Rolim,


C. M. B.; Sttratmenn, R. R; Pimentel, M. F.; Medeiros, F. P. M. de; Albuquerque, M. M. de; Neto, P. J. R. Desenvolvimento e Validao da Metodologia Analtica para Doseamento da Matria-Prima e Cpsulas de Sulfato de Indinavir por Cromatografia Lquida de Alta Eficincia. Acta Farm. Bonaerense vol. 25 n 4, 2006.

REFERNCIAS BIBIOGRFICAS

1. Baby, A. R.; Filho, C. A. H.; Sarruf, F. D.;


Tavante, C. R. J.; Pinto, C. A. S. de O.; Zague, V.; Aras E. P. G.; Kaneko, T. M. & Velasco, M. V. R. Estabilidade e estudo de penetrao cutnea in vitro da rutina veiculada em uma emulso cosmtica atravs de um modelo de biomembrana alternativo. Rev. Bras. Cienc. Farm. v.44 n.2 So Paulo abr./jun. 2008. 2. FIGURA 1. Imagem disponvel em: <http://www.diasdacruz.com.br/artigo.php? ida=11> Acesso em: 19.05.2011.

9. Randau, K. P.; Meira, J. L.; Farias Braga, J. M.


de; Monteiro, D. B.; & Rolim Neto, P. J. Desenvolvimento e Validao de Metodologia Analtica para Anti-Retroviral Zidovudina (AZT)-Matria-Prima. Acta Farm. Bonaerense vol. 24 n 1, 2005.

3. Brasil (2003) Diretoria Colegiada da Agncia


Nacional de Vigilncia Sanitria, Resoluo RDC n 899.

4. Prado, J. N. do, Pissatto, S., Morais, E. C. de,


Foppa T., Murakami F. S. & Silva, M. A. S. Validao de Metodologia Analtica por Cromatografia Lquidade Alta Eficincia para Doseamento de Cpsulas de Fluoxetina. Acta Farm. Bonaerense vol. 25, n. 3, 2006.

5. Peixoto, T. J. da S. S.; Silva, C. H. T. P. da;


Nascimento, J. E. do; Monteiro, J. M.; Albuquerque, U. P. de, & Amorim, E. L. C. de. Validao de metodologia espectrofotomtrica para quantificao dos