FUNDAMENTOS DE BIOTECNOLOGA

VOLUMEN I

VICTORIA ISABEL MEDINA DE P.

TRABAJO DE AO SABTICO

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE MEDELLN FACULTAD DE MINAS ESCUELA DE PROCESOS Y ENERGA

2004

TABLA DE CONTENIDO

Pgina VOLUMEN I viii NOMENCLATURA INTRODUCCIN CAPTULO 1 LA BIOTECNOLOGA Y SUS DESARROLLOS 1.1 1.1.1 1.1.2 1.1.2.1 1.1.2.2 1.1.2.3 1.1.2.4 1.1.2.5 1.1.2.6 1.1.2.7 1.1.3 1.1.4 1.2 1.3 1.3.1 1.3.2 1.3.3 1.3.4 1.3.5 1.3.6 1.3.7 1.3.8 1.4 1.4.1 1.4.2 CARACTERSTICAS DE LA BIOTENOLOGA Multidisciplinaria. Emplea diferentes tcnicas. ADN recombinante. Hibridomas. Fusin de protoplastos. Fermentacin y escalado de procesos. Tecnologa de enzimas. Cultivo de tejidos vegetales. Ingeniera de tejidos. Conviven diferentes estados de desarrollo. Multisectorial. DESARROLLO HISTRICO DE LA BIOTECNOLOGA PRODUCTOS BIOTECNOLGICOS EN LOS DIFERENTES SECTORES Alimentos. Agropecuario. Farmacutico y salud. Qumico. Energa. Minera. Tratamiento de la contaminacin ambiental. Armas biolgicas OPERACIONES BIOTECNOLGICAS Eleccin del cultivo: seleccin, mejora, o en su caso creacin del organismo o la poblacin celular ms adecuada. Cultivos en masa. ii 2 2 2 2 2 4 4 5 5 5 6 6 7 ix

8 8 12 15 18 19 19 20 21 22 22 22

1.4.3 1.4.4 1.4.5 1.5 1.6

Respuestas celulares. Operacin del proceso. Recuperacin de los productos. CONDICIONES DEL DESARROLLO BIOTECNOLGICO CENTROS Y EMPRESAS BIOTECNOLGICAS

22 22 23 24 27

CAPTULO 2 FUNDAMENTOS DE BIOQUMICA 2.1 2.2 2.3 2.3.1 2.3.1.1 2.3.1.2 2.3.1.3 2.3.2 2.3.2.1 2.3.2.2 2.3.3 2.3.4 2.3.5 2.3.5.1 2.3.5.2 2.3.5.3 2.3.5.4 2.3.5.5 2.3.5.6 2.3.5.7 2.3.5.8 2.3.5.9 2.3.5.10 2.3.5.11 2.3.6 2.3.7 2.3.7.1 2.3.7.2 2.3.8 2.3.9 BIOELEMENTOS, BIOMOLCULAS Y CLULAS LAS BIOMOLCULAS EN EL AGUA CARBOHIDRATOS Clasificacin de los carbohidratos. Monosacridos. Oligosacridos. Polisacridos. Isomerismo. Ismeros estructurales. Esteroisomeros. Estructura cclica de los carbohidratos. Monosacridos y derivados importantes. Propiedades de los monosacridos. Mutarrotacin. Enolizacin (transformacin de Lobry de Bruyn von Ekenstein). Deshidratacin. Oxidacin-reduccin (azcares reductores). Reduccin de monosacridos. Oxidacin de azcares. Formacin de glucsidos. Metilacin de monosacridos. Acetilacin de monosacridos. Formacin de N-glucosilaminas. Formacin de osazonas. Oligosacridos. Polisacridos. Polisacridos de reserva. Polisacridos estructurales. Paredes celulares de las plantas. Paredes celulares bacterianas. 32 41 44 45 45 45 45 45 46 48 52 57 57 58 59 59 60 61 62 63 63 63 64 64 67 67 69 73 73 75 75 75 iii

2.4 LPIDOS 2.4.1 Clasificacin de los lpidos. 2.4.1.1 Lpidos complejos.

2.4.1.2 2.4.2 2.4.3 2.4.4 2.4.5 2.4.6 2.4.7 2.4.8 2.5 2.5.1 2.5.1.1 2.5.1.2 2.5.1.3 2.5.2 2.5.3 2.5.3.1 2.5.3.2 2.5.3.3 2.5.3.4 2.5.3.5 2.6 2.6.1 2.6.1.1 2.6.1.2 2.6.1.3 2.6.2 2.6.3 2.6.3.1 2.6.3.2 2.6.3.3 2.6.4 2.6.5 2.7 2.7.1 2.7.2 2.7.3 2.7.3.1 2.7.3.2 2.7.3.3 2.7.3.4 2.7.4 2.7.4.1 2.7.4.2 2.7.4.3

Lpidos sencillos. cidos grasos. Acil glicridos. Ceras. Fosfolpidos. Esfingolpidos. Glucolpidos. Terpenoides y esteroles. AMINOCIDOS, PPTIDOS Y PROTENAS. Aminocidos. Clasificacin de los aminocidos. Propiedades generales de los aminocidos. Reacciones de los aminocidos. Pptidos. Protenas. Clasificacin de las protenas. Estructura proteica. Propiedades de las protenas. Desnaturalizacin de las protenas. Biomembranas. CIDOS NUCLEICOS Estructura de los nucletidos. Bases pirimidnicas y purnicas. Nuclesidos. Nucletidos. cido desoxirribonucleico (ADN). cido ribonucleico (ARN). ARN mensajero (ARNm). ARN de transferencia (ARNt). ARN ribosmico (ARNr). Propiedades de los cidos nucleicos. Traduccin. ENZIMAS Caractersticas de las enzimas como catalizadores. Clasificacin de las enzimas. Aplicaciones de las enzimas. Catalizadores en procesos industriales. En anlisis. En medicina. Otras aplicaciones. Propiedades de las enzimas. Estabilidad. Capacidad cataltica. Especificidad. iv

76 76 79 81 82 84 85 86 89 90 90 96 97 98 99 103 105 106 106 109 109 109 110 110 111 115 115 115 116 117 117 118 118 118 120 120 120 123 125 125 125 126 128

2.7.5 Actividad enzimtica y su medicin. 2.7.6 Produccin de enzimas. 2.7.6.1 Ventajas de los microorganismos como productores de enzimas. 2.7.6.2 Recuperacin de enzimas extracelulares e intracelulares. 2.7.6.2.1 Operaciones de separacin slido-lquido. 2.7.6.2.2 Operaciones de extraccin de enzimas intracelulares. 2.7.6.2.3 Concentracin del caldo de fermentacin. 2.7.6.2.4 Purificacin. 2.7.6.2.5 Formulacin de preparados enzimticos comerciales. 2.7.6.3 Enzimas inmovilizadas. 2.7.6.3.1 Matrices utilizadas como soporte de enzimas. 2.7.6.3.2 Seleccin de un soporte. 2.7.6.3.3 Tcnicas de inmovilizacin de enzimas. 2.7.6.3.4 Eleccin del mtodo de inmovilizacin. 2.7.6.4 Inmovilizacin de clulas. 2.7.7 Cintica enzimtica. 2.7.7.1 Cintica enzimtica en fase homognea. 2.7.7.2 Influencia del pH y la fuerza inica en la actividad enzimtica. 2.7.7.3 Influencia de la temperatura en la actividad enzimtica. 2.7.7.4 Inhibicin de las enzimas. 2.7.7.4.1 Inhibicin irreversible. 2.7.7.4.2 Inhibicin reversible.

129 130 130 131 132 133 134 137 139 140 141 142 143 145 146 146 146 148 148 148 148 149

CAPTULO 3 FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGA 3.1 TAXONOMA 153 155 155 155 156 156 156 157 158 161 161 163 163 168 169 v

3.2 MTODOS EN MICROBIOLOGA 3.2.1 Microscopios y microscopa. 3.2.1.1 Microscopios pticos. 3.2.1.2 Microscopios electrnicos. 3.2.2 Preparaciones para el examen por microscopa ptica. 3.2.2.1 Tcnica del montaje en hmedo y de gota pendiente. 3.2.2.2 Tcnicas de tincin. 3.3 3.4 3.5 3.6 3.6.1 3.7 3.8 TCNICAS DE CULTIVO PURO MANTENIMIENTO Y CONSERVACIN DE CULTIVOS PUROS TCNICAS DE CARACTERIZACIN BACTERIAS Caractersticas morfolgicas. CIANOBACTERIAS HONGOS

3.9 3.10 3.11 3.12 3.13

VIRUS NUTRICIN MICROBIANA MEDIOS DE CULTIVO CRECIMIENTO DE POBLACIONES EFECTO DE FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTO MEDICIN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

172 173 178 179

182 189

3.14

VOLUMEN II

CAPTULO 4 METABOLISMO CELULAR Y BIOENERGTICA 4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5 4.1.6 4.2 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.4 4.3 METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS Gluclisis y fermentacin alcohlica. Ciclo del cido tricarboxlico o ciclo de cido ctrico (Ciclo de Krebs) Ciclo del glioxilato. Ciclo de las pentosas fosfato o va del fosfogluconato. Va de Entner-Doudoroff. Sntesis de la glucosa (glucognesis). METABOLISMO DE LOS LPIDOS Oxidacin de los cidos grasos. Metabolismo del glicerol. Sntesis de los cidos grasos. Biosntesis de los triacilgliceroles. TRANSPORTE DE ELECTRONES Y FOSFORILACIN OXIDATIVA METABOLISMO DE LAS PROTENAS Metabolismo de los aminocidos. Almacenamiento de nitrgeno. Ciclo de la rea. TRANSPORTE EN LA MEMBRANA Y CONSUMO DE ENERGA BIOENERGTICA Rendimiento energtico del metabolismo de los carbohidratos. vi 200 200 204 206 207 208 209 209 210 212 212 213

214 220 221 223 224 226 230 233

4.4 4.4.1 4.4.2 4.4.3 4.5 4.6 4.6.1

4.6.2 4.7

Rendimiento energtico de la oxidacin de los cidos grasos. RELACIONES ENTRE LAS TRAYECTORIAS METABLICAS

234 236

CAPTULO 5 PROCESOS FERMENTATIVOS 5.1 5.1.1 5.1.2 5.1.3 5.1.4 5.1.5 5.2 5.2.1 5.2.2 5.3 5.3.1 5.3.2 5.3.3 5.3.4 5.3.5 5.4 5.4.1 5.4.2 5.4.3 5.4.4 5.4.5 5.5 5.5.1 5.5.2 5.5.3 5.5.4 5.5.5 5.6 5.6.1 5.6.2 5.6.3 5.6.4 5.6.5 5.7 ETANOL Agentes de la fermentacin. Medio de cultivo. Bioqumica del etanol. Proceso de produccin de etanol. Utilizacin del etanol. LA CERVEZA Materias primas. Fabricacin de la cerveza. CIDO CTRICO Agentes de la fermentacin. Medio de cultivo. Bioqumica del cido ctrico. Proceso de produccin de cido ctrico. Utilizacin del cido ctrico. CIDO ACTICO. Agentes de la fermentacin. Medio de cultivo. Bioqumica del cido actico. Proceso de produccin del cido actico. Utilizacin del cido actico. CIDO LCTICO Agentes de la fermentacin. Medio de cultivo. Bioqumica del cido lctico. Proceso de produccin del cido lctico. Utilizacin del cido lctico. PROTENA UNICELULAR (PUC) Agentes de la fermentacin. Medio de cultivo. Bioqumica de la produccin de PUC. Proceso de produccin de PUC. Utilizacin de la protena unicelular. DIGESTIN ANAEROBIA (BIOGS) vii 240 241 242 244 244 247 247 248 252 260 260 261 262 263 265 266 266 268 269 270 274 274 275 279 281 282 282 284 286 290 291 293 297 298

5.7.1 5.7.2 5.7.3 5.7.4 5.7.5 5.8 5.8.1 5.8.2 5.8.3 5.8.4

Agentes de la fermentacin. Medio de cultivo. Bioqumica del biogs. Proceso de produccin de biogs. Utilizacin del biogs. TRATAMIENTO BIOLGICO DE AGUA RESIDUAL Agentes del tratamiento biolgico. Utilizacin del tratamiento biolgico. Bioqumica del proceso. Procesos de tratamiento biolgico.

298 299 301 302 308 308 309 310 311 311 316

BIBLIOGRAFA

viii

NOMENCLATURA

A: ADN: AN: ARN: ADP: AMP: ATP: ATT: C: CTP: CoQ: dAMP: dGTP: dUTP: 5GMP: G: GDP: GTP: 5IMP: FDA: FAD: FADH2: FMN: LAB: NAD: NADH: NADP: NADPH: PEP: PUC: T: TPP: SIDA: U: UTP: Vmax: VHB: 5XMP:

adenina cido desoxirribonucleico. cido nucleico. cido ribonucleico. adenina difosfato. adenina monofosfato. adenina trifosfato. enzima -antitripsina. citosina. citosina trifosfato. ubiquinona (benzoquinona). desoxiadenina monofosfato. desoxiguanosina trifosfato. desoxiuridina trifosfato. cido guanidlico. guanina. guanina difosfato. guanosina trifosfato. cido isocnico. oficina de alimentacin y farmacia. dinucletido de flavina y adenina (forma oxidada). dinucletido de flavina y adenina (forma reducida). mononucletido de flavina. bacterias acido lcticas. dinucletido de nicotinamida y adenina (forma oxidada). dinucletido de nicotinamida y adenina reducido (forma reducida). dinucletido fosfato de nicotidamina y adenina (forma oxidada) dinucletido fosfato de nicotidamina y adenina reducido (forma reducida). fosfoenol piruvato. protena unicelular. timina. pirofosfato de tiamina. sndrome de inmunodeficiencia adquirida. uracilo. uridina trifosfato. velocidad mxima. hepatitis B. cido xantlico.

INTRODUCCIN

La biotecnologa es de naturaleza multidisciplinaria y, por lo tanto, requiere aportes de la bioqumica, la microbiologa, la biologa molecular, la gentica, la qumica, la ingeniera qumica, entre otras. Al ser multidisciplinaria, es esencial la buena comunicacin y la transmisin rpida de conocimientos. Adems, la investigacin y los desarrollos en biotecnologa, son muy dinmicos en el mundo y cada vez es mayor la poblacin, no slo de cientficos e ingenieros, que advierte el potencial de la biotecnologa. Con el presente trabajo se pretende que el estudiante de ingeniera, especialmente el de ingeniera qumica, adquiera los conocimientos bsicos, mnimos, que le permita interactuar con personas de otras disciplinas y profesiones que laboran en el campo de la biotecnologa. Es as, como se empieza por definir la biotecnologa; se analizan sus caractersticas, su desarrollo histrico y sus aplicaciones en los diferentes sectores (alimentos, agropecuario, farmacutico y salud, qumico, energa, minera, ambiental y armas biolgicas). Adems, se discuten las etapas de un proceso tpico de fermentacin. Se dan a conocer las reas prioritarias y los temas especficos de investigaciones en desarrollo, de los pases latinoamericanos. Se mencionan algunos de los centros y empresas que trabajan en biotecnologa. A continuacin, se sintetizan los temas ms importantes de bioqumica, de microbiologa, de metabolismo celular y de bioenergtica, que como ya se dijo, le permitan al estudiante hablar el mismo lenguaje y poderse entender con las personas de otras disciplinas que trabajan en los diferentes sectores de la biotecnologa. Finalmente, se discuten algunos procesos fermentativos como son la produccin de: etanol, cerveza, cido ctrico, cido lctico, cido actico, protena unicelular, biogs. Adems, se analiza el tratamiento biolgico de aguas. Se espera que el trabajo, sirva como texto gua para el curso de Fundamentos de Biotecnologa, que corresponde a la primera asignatura de la Lnea de Profundizacin en Biotecnologa. Adems, que proporcione las bases acadmicas para las asignaturas: Ingeniera Bioqumica y Tratamiento Biolgico de Aguas, que se dictan a continuacin.

CAPTULO 1 LA BIOTECNOLOGA Y SUS DESARROLLOS

La biotecnologa no es, en s misma, una ciencia, es un enfoque multidisciplinario que involucra varias disciplinas y ciencias. Como tal, la biotecnologa ha sido utilizada por el hombre desde los comienzos de la historia en actividades tales como la preparacin del pan y de bebidas alcohlicas o el mejoramiento de cultivos. Sin embargo, la biotecnologa en los ltimos aos ha cobrado gran importancia. Debido a que su aplicacin no es nueva, se identifican dos tipos de procesos y productos biotecnolgicos: aquellos en los que se utiliza la biotecnologa tradicional y los que emplean los logros generados con los descubrimientos cientficos, principalmente en biologa molecular, que conforman la biotecnologa moderna. La biotecnologa se ha definido de diversas formas, entre las que se tienen: La biotecnologa es la aplicacin controlada y deliberada de agentes biolgicos sencillos (clulas vivas o muertas, o componentes celulares) en operaciones tcnicamente beneficiosas, bien sea de fabricacin de productos o como operaciones de servicio ( Bulock et al., 1991). La biotecnologa es el conjunto de tcnicas que permiten manipular a los seres vivos o parte de ellos para producir bienes y servicios. En esta definicin se incluyen desde los microorganismos hasta las plantas, clulas animales y humanas y animales superiores (Quintero, 1990). La biotecnologa es una actividad multidisciplinaria que se sustenta en el conocimiento de frontera generado en disciplinas tales como biologa molecular, bioqumica, bioingeniera, biologa vegetal, microbiologa, etc. y cuyo objetivo es la utilizacin de este conocimiento para el desarrollo de tecnologa limpia, que sea tcnica y econmicamente competitiva, y que permita, mediante el uso racional de los sistemas y organismos vivos, sus productos o sus partes, la solucin de problemas socioeconmicos relevantes (Quintero et al.., 1993). La biotecnologa moderna es la aplicacin comercial de organismos vivos o sus productos, la cual involucra la manipulacin deliberada de sus molculas de ADN (Colciencias, 2004). La definicin de biotecnologa moderna implica una serie de desarrollos en tcnicas de laboratorio (ADN recombinante, anticuerpos monoclonales, cultivo de clulas y tejidos, entre otras) que, durante las ltimas dcadas, han sido responsables del tremendo inters cientfico y comercial en biotecnologa, la creacin de nuevas empresas y la reorientacin

de investigaciones y de inversiones en compaas ya establecidas y en universidades. La posibilidad que ofrece la biotecnologa moderna es que presenta sistemas radicalmente novedosos para alterar o modificar las propiedades genticas de los organismos en una forma totalmente dirigida. Esta capacidad ha dependido de los descubrimientos y avances de las tcnicas de biologa molecular, del mayor conocimiento del ADN como material de la herencia, del cdigo gentico, de los mtodos de leer el mensaje gentico por secuenciacin de los genes, del uso de las enzimas de restriccin con las cuales es posible cortar y unir fragmentos de ADN, en una forma dirigida y deliberada. Los organismos utilizados hoy en da en biotecnologa pueden ser complejos como el ganado vacuno, o tan simples como las levaduras utilizadas para la produccin de cerveza o del pan (Colciencias, 2004).

1.1 CARACTERSTICAS DE LA BIOTECNOLOGA Se abordan estas caractersticas como metodologa que permita aclarar los alcances de la biotecnologa (Montoya, 1990): 1.1.1 Multidisciplinaria. Requiere de la interaccin de diversos especialistas con conocimientos adecuados para comunicarse y vincularse recprocamente y entender los razonamientos de la ciencia bsica para ser expertos en su aplicacin. Entre los especialistas se encuentran los genetistas, bioqumicos, microbilogos, bilogos, bilogos moleculares, bilogos celulares, botnicos, ingenieros agrnomos, virlogos, qumicos analticos, ingenieros bioqumicos, ingenieros qumicos, ingenieros controladores, ingenieros electrnicos e informticos. 1.1.2 Emplea diferentes tcnicas. Entre las tcnicas utilizadas estn: 1.1.2.1 ADN recombinante. Permite transferir genes de un organismo a otro, utilizando para ello vehculos (plsmidos, csmidos, fagos, etc.) que hacen posible introducir un gen extrao a un microorganismo y obligar a este a producir algo que normalmente no produce; en pocas palabras, se construye un nuevo microorganismo con caractersticas especiales (Figura 1.1) (Montoya, 1990). Mediante este mtodo es posible dar a un microorganismo (levadura, bacteria) la informacin gentica para producir protenas costosas como interfern, hormona de crecimiento, insulina, enzimas de utilidad industrial. Tambin es posible dar informacin nueva a clulas vegetales o animales (genes de fijacin de nitrgeno atmosfrico, transmitidos a una planta que se cultiva). (Gasser et al., 1992). En la Figura 1.2 se presenta un esquema de la ingeniera gentica vegetal. 1.1.2.2 Hibridomas. Esta tecnologa inventada por Kohler y Milstein, consiste en combinar la habilidad de las clulas sanguneas, linfocitos B, para producir anticuerpos, con la inmortalidad de las clulas cancerosas. A diferencia de las clulas normales, las clulas hbridas se pueden cultivar en el laboratorio en condiciones apropiadas para dividirse y crecer de manera indefinida. La clula hbrida tiene propiedades de ambas clulas originarias: produce anticuerpos monoclonales y crece indefinidamente. 2

Figura 1.1. Insercin de un gen en un plasmidio de Eschirichia coli y clonacin de este gen en las clulas del cobacilo (Montoya, 1990)

Figura 1.2. Ingeniera gentica vegetal con los plsmidos inductores de tumor de la Agrobacterium tumefaciens (Perea, 1990) 3

1.1.2.3 Fusin de protoplastos. Se emplea con clulas de origen vegetal. Se disuelve la pared celular y el material gentico de dos clulas se colocan en contacto; despus de la fusin el cultivo se induce a formar de nuevo la pared celular y las clulas fusionadas pueden generar embriones o plntulas que finalmente formarn una nueva planta. Para la eliminacin enzimtica de la pared celular se utiliza mezclas de preparados comerciales de celulasas, pectinasas y hemicelulasas fngicas en una solucin de elevado potencial osmtico. A travs de la fusin de protoplastos se recombinan los genes de dos especies que no se aparean. La fusin permite tambin mejorar la recombinacin entre cepas de un organismo como Streptomyces, que raramente se aparea. Cuando se realiza la fusin de protoplastos, se obtiene una clula con dos (o ms) ncleos. Si los protoplastos proceden de diferentes tipos de clulas parentales se denomina heterocariontes y s se originan de clulas genticamente iguales homocariontes. El trmino hbrido se utiliza una vez se ha producido en el heterocarionte la fusin de ncleos. Las clulas producidas que poseen el ncleo de un tipo de protoplasto y los orgnulos de otro diferente se denominan cbridos, para distinguirlos de los hbridos nucleares. Estas diferentes combinaciones de la informacin gentica se muestran esquemticamente en la Figura 1.3.

Figura 1.3. La fusin de dos protoplastos genticamente diferentes puede dar lugar a hbridos completos, hbridos parciales y cbridos 1.1.2.4 Fermentacin y escalado de procesos. Las fermentaciones son los procesos ms conocidos y consisten en poner microorganismos, clulas animales o vegetales, en un medio de cultivo adecuado, con condiciones controladas para que este organismo sintetice un producto esperado. Las fermentaciones representan el proceso biotecnolgico industrial ms importante. Los principales productos determinados por esta va son: etanol, protena unicelular, cidos orgnicos, aminocidos, jarabes fermentados, polisacridos de origen microbiano y antibiticos, entre otros. 4

Los procesos de recuperacin y purificacin del producto son generalmente costosos y requieren un alto desarrollo. El escalado de procesos biotecnolgicos es indispensable, ya que en el laboratorio las condiciones son fcilmente controlables, la calidad de las materias primas es definida y poseen alto grado de pureza. Esta situacin cambia notablemente cuando se pasa a la produccin industrial, por esto se requiere un paso intermedio a escala piloto. 1.1.2.5 Tecnologa de enzimas. Esta tcnica permite llevar a cabo reacciones catalizadas por enzimas, fuera de la clula, lo cual abre un amplio panorama de aplicacin en la industria de alimentos, mdica, analtica, entre otras. Por medio de procesos biotecnolgicos se producen las enzimas y se utilizan como biocatalizadores en operaciones continuas haciendo circular el sustrato a travs del reactor en donde se tiene inmovilizadas las enzimas (o clulas con actividad enzimtica). Existen varios mtodos de inmovilizacin de enzimas: atrapamiento (en geles de alginato clcico, agar o agarosa, en fibras y microencapsulacin), unin a un soporte (adsorcin fsica, enlace inico, quelacin o unin metlica, enlace covalente), entrecruzamiento, inmovilizacin de enzimas solubles (Medina, 1995). Entre las enzimas producidas por microorganismos estn: glucosa-isomerasa (jarabe fructosado), -amilasa y -gluconasa (degradar polmeros en el proceso de la cerveza), glucosa-oxidasa (evitar fenmenos de oxidacin), -galactosidasa (hidrlisis de la lactosa), renina (cuajada), proteasa (hidrlisis del gluten), lipasas (hidrolizar los triglicridos), celulasas (hidrlisis celulosa), invertasa (hidrlisis de la sacarosa), pectinasa (hidrlisis de la pectina), (Medina, 1995). La reduccin de la lactosa de la leche con - galactosidasa, antes de su ingestin, es una de las formas ms comunes de aliviar la indigestin de la lactosa (Rao et al., 1997). 1.1.2.6 Cultivo de tejidos vegetales. El cultivo de tejidos vegetales, permite aumentar el rendimiento de cosechas, fertilizantes, etc., al mejorar las especies vegetales e incrementar su resistencia a enfermedades y condiciones climticas adversas. Permite obtener poblaciones importantes en tiempos relativamente breves y espacios limitados. A partir del meristemo de una planta pueden producirse miles de descendientes por cultivo in vitro; tambin puede lograrse del meristemo de una planta infectada variedades libres de infeccin. El cultivo de tejidos de plantas se ha utilizado para la produccin de metabolitos secundarios, como las hormonas, la vainilla (saborizante), la serotonina (amina biognica), la nicotina (alcaloide) (Havkin-frenkel et al., 1997), la serpentina, la ajmalicina y la catharantina (alcaloides tipo indol) (Habeych et al., 2002). 1.1.2.7 Ingeniera de tejidos. Se han dado los primeros pasos hacia la creacin de rganos semisintticos que sirvan de recambio de los naturales. La creacin de tejidos u rganos artificiales, se conoce como neoformacin de rganos. Se esta trabajando en los neorganos fabricados con clulas y fibras plsticas. Un ingeniero de tejidos inyecta o deposita en una herida o un rgano que requiera regeneracin, una molcula, por ejemplo, un factor de crecimiento. Esta molcula moviliza las clulas del paciente hacia la herida e insta su transformacin en un tipo celular concreto, que regenere el tejido. Ms ambicioso es el transplante de clulas, del propio paciente o de un donante, cultivadas de antemano e 5

incorporadas en una urdimbre tridimensional de polmeros biodegradables, como los que se utilizan para hacer suturas resorbibles. La estructura entera, clulas y urdimbre, se transplanta a la herida, aqu, las clulas se dividen y reorganizan para formar tejido nuevo. Al mismo tiempo se van desintegrando los polmeros artificiales, hasta que slo queda formado un producto completamente natural, un neorgano. Como productos de la ingeniera de tejidos se incluyen piel, cartlago, hueso, ligamento y tendn artificiales. Tambin podran producirse hgados, riones, mamas o intestinos, rganos grandes y complejos, dotados cada uno, de diferentes tipos de clulas. Las clulas de cultivo derivadas de embriones humanos (clulas capaces de dar origen a distintos tejidos) en un estadio temprano del desarrollo podran destinarse a la fabricacin de tejido de recambio en rganos afectados, por ejemplo, el corazn. En algunas partes se expende, ya el primer producto comercial de ingeniera de tejidos, se trata de un tipo de piel artificial, sintetizada por el hombre (Mooney et al., 1999), (Pedersen, 1999), (Lysaght et al., 1999), (Langer et al., 1999), (Parenteau, 1999). La ingeniera de tejidos en el sistema nervioso constituye la ciencia de disear, crear y realizar sistemas donde las clulas neurales son organizadas de una manera controlada (Bellamkonda et al., 1994). 1.1.3 Conviven diferentes estados de desarrollo. Los procesos tradicionales son factibles de mejorar y de optimizar, mediante la aplicacin de modernas tcnicas biotecnolgicas. Es as, como pueden coexistir las biotecnologas de primera, segunda y tercera generacin. Se denomina biotecnologa de primera generacin, aquella que se origina en la fermentacin de alimentos y bebidas. Los productos de las biotecnologas determinadas de segunda generacin incluyen: antibiticos, cidos orgnicos, glicerol, aminocidos, protena unicelular, etc. En general las aplicaciones de los productos de primera y segunda generacin pertenecen a las industrias qumicas, farmacuticas y de alimentos. Se considera que los productos de primera y segunda generacin estn en una madurez tecnolgica, aunque algunas de las nuevas tcnicas pueden contribuir a mejorar los rendimientos en procesos tradicionales. La biotecnologa moderna de tercera generacin est determinada por tres hechos trascendentales: Los descubrimientos de Stanley Cohen y Helbert Boyer en 1973, quienes demostraron que mediante el uso de enzimas especiales se poda cortar (endonucleasas de restriccin) y pegar (ligasas) el ADN y fabricar as microorganismos con informacin gentica que antes no posea, para producir determinadas sustancias. En 1975 Kohler y Milstein demostraron, por su parte, la produccin de anticuerpos monoclonales, fusionando linfocitos y clulas cancerosas. El incremento de los precios del petrleo (1973 y 1974), provoc una reaccin de los pases industrializados, orientada a financiar desarrollos de fuentes alternas de energa, incluyendo lignocelulosa y, con esto, el apoyo a la moderna biotecnologa. 1.1.4 Multisectorial. La biotecnologa se est moviendo a esferas muy importantes y de gran impacto. Despus de salud y farmacutico (los principales sectores de aplicacin) y las aplicaciones subsiguientes en agricultura y sector alimenticio, la proteccin y restauracin del ambiente, pueden convertirse en un logro prioritario de las ciencias y tecnologas de la vida. La biotecnologa afecta adems el sector qumico, energtico y de la minera. 6

1.2 DESARROLLO HISTRICO DE LA BIOTECNOLOGA Los registros que se tienen se presentan a continuacin (Montoya, 1990), (Angarita, 1991), (Bud, 2001), (Valderas, 2002), (Cuesta et al., 2003): Ao 8000 a 6000 AC. 4000 AC. 2000 AC. 1800 AC. 1400 1869 1870 1876 1900 1916 Acontecimientos Obtencin de bebidas fermentadas de cereales (Babilonia y Egipto). Pan valindose de procesos fermentativos (Egipto) Vino, pan, fermentacin productos lcteos, fermentacin alcohlica. Rotacin en los campos agrcolas. Destilacin de los medios en que se cultivaba la levadura (China y/o Medio Oeste). Meischer descubri el ADN. Produccin de vacunas. Pasteur descubri los procesos microbianos de fermentacin en cerveza y en otros productos fermentados. cidos orgnicos. Se invent el trmino gene en el estudio de la herencia. Se estableci la primera gran planta de digestin anaerobia y se uso la fermentacin para producir glicerina y acetona. Trabajos preliminares de Fleming sobre la penicilina. Produccin industrial de penicilina por Florey. Antibiticos, vitaminas. Modelo de doble hlice para el ADN. Fabricacin de cido glutmico en el Japn. Fabricacin de lisina en Estados Unidos. Aminocidos, enzimas y vacunas. Clonacin del primer gene por ingeniera gentica. Primer anticuerpo monoclonal. Creacin primera empresa de Biotecnologa. Aprobacin del uso de anticuerpos monoclonales para diagnstico. Insulina humana. Transformacin de vegetales por ingeniera gentica. Nueve productos de uso teraputico humano, doscientos sistemas de diagnstico utilizando anticuerpos monoclonales. Pruebas de campo con especies vegetales modificadas genticamente. Se aprob la quimosina para la manufactura de quesos. La FDA autoriz la comercializacin del primer alimento transgnico Se clon el primer animal adulto (la oveja Dolly). Cien nuevos productos de uso teraputico humano, semillas de cultivos bsicos transformadas genticamente, nuevos agroqumicos, nuevos materiales y productos qumicos. Mapa del genoma humano. Por lo menos 200 sustancias llegarn a la fase de ensayo clnico.

1929-1932 1941 1950 1953 1956-1957 1957 1960 1973 1975 1976 1981 1983 1988

1990 1994 1997 1990 - 2000

2000 2002

1.3

PRODUCTOS BIOTECNOLGICOS EN LOS DIFERENTES SECTORES

1.3.1 Alimentos. La biotecnologa puede utilizarse en dos formas en el campo de la industria de alimentos. En primer lugar usando microorganismos que transformen biomasa no comestible en alimentos para consumo humano o animal (protena unicelular, ensilajes) y en segundo lugar, usando microorganismos que permitan el procesamiento de alimentos, actuando directamente sobre stos (productos fermentados) o produciendo sustancias que puedan ser aadidas a los alimentos (aditivos, saborizantes, cuajo) (Angarita, 1991). El sector de los alimentos fue el primero en acoger las innovaciones biotecnolgicas a mediados de 1970. Al inicio de la dcada de 1990, las operaciones comerciales con aplicaciones de biotecnologa moderna, incluan: mtodos biotecnolgicos de pruebas y controles, bioconversin de almidn a productos endulzantes, saborizantes y productos para destacar el sabor, procesamiento de jugos de frutas, aminocidos y otros nutrientes especiales, pigmentos y vitaminas de microalgas, nuevos alimentos producto de la fermentacin, enzimas para produccin de quesos, productos lcteos libres de lactosa e hbridos de levadura. Ms recientemente se estn aplicando tcnicas moleculares muy exactas, sensibles y reproducibles para diagnstico y control de la calidad (Colciencias, 2004). Los microorganismos se han utilizado en la fabricacin de alimentos como el: Queso: el crecimiento de los mohos en los quesos genera los compuestos de aroma y sabor que distingue a cada tipo. La renina microbiana (antes cuajo obtenido del cuarto estmago de terneras destetadas), permite la formacin de la cuajada en la fabricacin del queso (Rose, 1981), (Garca et al., 1993). Yogur: leche entera fermentada con bacterias lcticas ( Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus). Desde hace muchos aos, se han atribuido a los productos lcteos fermentados, especialmente al yogur, algunas propiedades nutritivas, medicinales y teraputicas. Los microorganismos utilizados en la fermentacin del yogur tienen una accin beneficiosa sobre la flora intestinal (Amiot, 1991), (Garca et al., 1993), (Bourgeois et al., 1995). Kefir: leche entera o parcialmente desnatada fermentada con los granos de kefir durante 12 a 24 horas. El filtrado del producto de la fermentacin tiene un aspecto parecido al de la leche pero con burbujas y espuma como la cerveza. Adems, de bacterias lcticas contiene levaduras que fermentan el azcar, en una menor proporcin a alcohol y CO2 (Amiot, 1991), (Garca et al., 1993). Bebidas alcohlicas: obtenidas por la fermentacin de azcares por la S. cerevisiae. Las bebidas alcohlicas se dividen en tres categoras: vinos y cervezas, que se fabrican por fermentacin con levaduras de un zumo de fruta o de un extracto azucarado de un grano; vinos encabezados, en los que se aade brandy al vino y destilados, que se obtienen por destilacin de vinos o cervezas (Bourgeois et al., 1995).

En la fabricacin de cerveza se maltea la cebada, a fin de que el grano germine brevemente y produzca enzimas que catalicen la rotura o degradacin del almidn. La malta se tritura y mezcla con agua caliente, antes de depositarla en los tanques de fermentacin, se macera durante unas horas para que las enzimas rompan las largas cadenas de almidn en hidratos de carbono de molculas ms pequeas. El extracto acuoso (mosto) se cuece con lpulo para conferirle el sabor tpico a la cerveza. Se elimina el lpulo. Se pone a fermentar el mosto con Saccharomyces cerevisiae. Luego pasa a maduracin, pasteurizacin y embotellado. Pan: la levadura Saccharomyces cerevisiae, degrada los azcares de la masa originando una mezcla de alcohol y burbujas de CO2, la cual queda retenida en la masa. Cuando sta se hornea, despus del perodo de fermentacin, se elimina el alcohol; en cambio, las burbujas de CO2 permanecen y dan textura al pan (Rose, 1981), (Bourgeois et al., 1995). Alimentos fermentados. Tempeh: pastel compacto de un producto vegetal (soja, cacahuete, coco) completamente cubierto y atravesado por un micelio blanco de especies de mohos del gnero Rhizopus. Contiene un 40 % de protena, se consume ampliamente en Indonesia. Natto: soja fermentada por el moho Aspergillus oryzae, se come en el Japn. Sufu: fermentado de soja cuajada con una variedad de mohos, principalmente especies de Mucor; se consume en la China. Ang-kak: fermentado de arroz con el moho Monascus purpureus, no se altera el sabor del arroz sino que se colorea de rojo; se consume en la china. Salsa de soja, fermentado de soja. Koji: fermentado de una mezcla de salsa de soja y trigo con el moho Aspergillus oryzae. Moromi, fermentado de una mezcla de koji con una igual cantidad de solucin de sal (Rose, 1981), (Bourgeois et al., 1995). Conservacin de los vegetales por fermentacin. Col cida (sauerkraut o choucroute) por mtodo de salado en seco. Se genera una salmuera por el gradiente osmtico alcanzado por la interaccin de la sal y los fluidos naturales de la col. En la salmuera, las bacterias lcticas que proceden de la col fresca llegan predominar sobre la flora restante a lo largo de todo el proceso de fermentacin. Otros vegetales acidificados son: los pepinos y pepinillos, las judas verdes, las zanahorias, las cebollas, la remolacha, la coliflor, el apio, los esprragos, las aceitunas verdes y negras. (Arvalo, 1991). Las bacterias acidolcticas (LAB) se han utilizado en la conservacin de muchos alimentos, incluyendo frutas y vegetales y en el ensilado de piensos (forraje) (Rose, 1981), (Breidt et al., 1997), (Bourgeois et al., 1995). Protena unicelular (PUC).Una de las principales ventajas que conlleva el crecimiento microbiano en alimentos, tipo tempeh, es la de aumentar el contenido proteico. Extensin lgica de esta idea es el desarrollo, a gran escala, de microorganismos apropiados como fuente directa de alimentos para el hombre y de piensos para animales. Alemania durante la primera guerra mundial, debido a la escasez de vveres, produjeron S. cerevisiae a gran escala, reemplazando un 60 % de los alimentos que importaba antes del conflicto. La levadura se aada principalmente a sopas y embutidos. Durante la segunda guerra mundial varias fbricas se aprestaron a desarrollar cepas especiales de levaduras (Candida arborea y Candida utilis) para cubrir necesidades alimentarias. Ms 9

tarde en la dcada de los 60, esa estrategia ocupa un primer plano a la hora de idear recursos para los pases subdesarrollados; se disearon procesos para desarrollar cepas de Candida lipolytica, que obtenan el carbono y la energa para el crecimiento de los alcanos (molculas de hidrocarburos de cadena lineal) del petrleo. Fue entonces cuando se acuo el trmino protenas unicelulares para describir el nuevo campo de alimentos y piensos microbianos (Rose, 1981), (Phaff, 1981), (Medina et al., 1996), (Medina, 2003). Enzimas. La aplicacin de enzimas en la industria de alimentos es muy variada. Para la coagulacin enzimtica de la leche se usa el cuajo microbiolgico proveniente de los mohos Endothia parastica, Mucor pusillus y Mucor miehie (Angarita, 1992). Con el uso de enzimas pectolticas en la produccin de pulpas de fruta, se logra aumentar la produccin de pulpa, disminuir la viscosidad, mejorar la estabilidad del nctar, aumentar la eficiencia de evaporacin, etc. (Pinzn, 1991). Para la produccin de leche con lactosa hidrolizada se usa la -galactosidasa (lactasa) que hidroliza la lactosa en galactosa y glucosa. Adems, la hidrlisis de la lactosa disminuye los riesgos de recristalizacin de sta en los productos lcteos y aumenta su poder endulzante (Angarita, 1992). Para la produccin de glucosa a partir de almidn se usan las amilasas y amiloglucosidasas. Tambin se ha utilizado la glucosa-isomerasa para la produccin de fructosa a partir de glucosa (Crueger et al., 1993). La invertasa al hidrolizar la sacarosa forma jarabes ms dulces, constituidos por monosacridos ms solubles que la sacarosa que no cristalizan al ser concentrados. Las amilasas que existen naturalmente en la levadura y la harina de trigo contribuyen principalmente a la produccin de dixido de carbono durante la fermentacin y coccin, los dos procesos responsables del desarrollo del sabor y la subida de la masa para obtener un pan suave y sabroso (Medina, 1995). Aminocidos. Los aminocidos tienen amplias aplicaciones industriales (alimentos, aditivos de piensos, medicina y cosmtica y como material de partida en la industria qumica). En la industria de alimentos los aminocidos se utilizan solos o en combinacin para aumentar el sabor. El glutamato sdico, el aspartato sdico y la D, L-alanina, se aaden a los jugos de frutas para mejorar el sabor y la glicocola se adiciona a los alimentos que contienen edulcorantes. La L-cistena mejora la calidad (textura) del pan durante el proceso de coccin y acta como un antioxidante en los jugos de frutas. El L-triptfano, combinado con L-histidina, acta tambin como antioxidante y se utiliza para evitar que la leche en polvo se enrancie. El aspartame (L-aspartil-L-fenilalanina metil ster) se utiliza como edulcorante de bajas caloras en las bebidas no alcohlicas. Las protenas de las plantas son frecuentemente deficientes en aminocidos esenciales como la L-lisina, la Lmetionina, la L-treonina o el L-triptfano, por lo tanto, algunos de stos son adicionados a los alimentos de humanos y de animales para aumentar su valor nutritivo (Crueger et al., 1993), (Garca et al., 1993). Potenciadores del sabor (nuclesidos, nucletidos y compuestos relacionados). Todos los ribonuclesidos 5- monofosfatos de purinas incrementan el sabor. En orden descendiente de efectividad es: cido guanidlico (5-GMP), cido isocnico (5- IMP) y cido xantlico (5- XMP). Cantidades pequeas de estos nucletidos (0,005 0,01 %) se usan para aumentar el sabor de las sopas y las salsas; adems, la adicin de stos ayuda a 10

eliminar propiedades indeseables, como el sabor metlico de las latas. En la produccin de estos nucletidos se utiliza la fermentacin o la degradacin hidroltica del ARN. Adems, de su uso en la industria de alimentos, estos compuestos estn siendo estudiados con propsitos teraputicos (Crueger et al., 1993), (Garca et al., 1993). Aromatizantes y saborizantes. Adems, de los estimuladores del sabor que ya se han mencionado (algunos aminocidos y 5nucletidos), se pueden producir por fermentacin un conjunto de agentes saborizantes especficos. Un ejemplo, es la produccin de ingredientes saborizantes complejos adecuados para la produccin de quesos. Las sustancias saborizantes ms importantes del queso son metil-cetonas (2-heptanona, 2nonanona, 2- pentanona), cidos grasos (cido butrico, cido propinico) y alcoholes secundarios con 5 11 tomos de carbono. Entre los productos aromticos especficos estn diacetilo (sabor a mantequilla en la mazada), acetaldehdo (aroma en naranjas y yogur), -decalactona (sabor a melocotn), ster (aroma a frutas), pirazina (aromas a nuez y a tostado), isotiocianato (olor picante en el rbano y la mostaza) (Crueger, et al., 1993). El cido butrico es el compuesto ms importante tanto en la intensidad como en las caractersticas del sabor de los quesos Romano y Provolone. Ciertas lipasas microbianas producidas por el Aspergillus niger pueden ser usadas para sintetizar steres de terpenos tales como propionatos, butiratos y caproatos de los alcoholes primarios de terpenos, geraniol y citronelol (Gatfield, 1988), (Garca et al., 1993), (Bourgeois et al., 1995), (Whitehead, 1998). Vitaminas. Los microorganismos pueden ser utilizados en la produccin comercial de ciertas vitaminas como la tiamina, la riboflavina, el cido flico, el cido pantotnico, el piridoxal, la vitamina B12 y la biotina. Los microorganismos tambin sintetizan caroteno, que es la provitamina A y el ergosterol (provitamina D2). A escala mundial slo tienen un valor econmico importante la produccin de vitamina B12, riboflavina y cido ascrbico. La mayor parte de la vitamina B12 que se produce se usa en la industria de alimentacin animal. Polisacridos extracelulares. Los polisacridos se usan comercialmente para obtener geles y para espesar y estabilizar los alimentos, las medicinas y los productos industriales. Entre los exopolisacridos microbianos ms importantes que se producen comercialmente, estn: el xantano, el dextrano, el alginato, el curdlano, el escleroglucano, el pululano (Phaff, 1981), (Crueger et al., 1993), (Garca et al., 1993). cidos orgnicos. El uso de compuestos acidulantes en la conservacin y mejora de propiedades organolpticas en alimentos es extenso. Estos cidos, genricamente denominados cidos orgnicos, son intermediarios o productos terminales de ciclos metablicos bsicos, por lo cual ocurre en una gran variedad de organismos vivientes. Tales compuestos incluyen los cidos ctrico, actico, lctico, mlico, tartrico, fumrico y glucnico. El cido ctrico se utiliza en la industria de alimentos y bebidas. El sabor de los jugos de frutas, extractos de jugos de fruta, caramelos, helados y mermeladas se aumenta o se preserva por adicin de cido ctrico (Phaff, 1981), (Bulock et al., 1991), (Crueger et al., 1993), (Garca et al., 1993). 11

 Colorantes. El color es el atributo del primer impacto de los alimentos. La industria alimentaria dependi en el pasado de productos de sntesis qumica que poco a poco estn siendo desplazados por productos naturales. En el rea de alimentos, los colorantes se usan como aditivos. La obtencin de colorantes a partir de vas biotecnolgicas tiene una serie de ventajas, ya que la obtencin de los pigmentos se realiza sin problemas de espacio, su produccin no depende de las condiciones ambientales, sociales, culturales, etc; no presenta problemas en cuanto a la disponibilidad del producto o variabilidad, entre otros aspectos. Por esto se ha centrado el inters de investigadores e industriales en la produccin de colorantes naturales, fundamentalmente en tres estrategias biotecnolgicas: fermentacin, cultivo de tejidos y utilizacin de enzimas (Phaff, 1981), (Garca et al., 1993). Edulcorantes. Los azcares representan la forma ms comn y conocida de los edulcorantes, ampliamente distribuidos en la naturaleza. Se encuentran en frutas, vegetales, miel y leche. Son tambin las unidades de que estn constituidos los carbohidratos ms complejos (polisacridos) como el almidn, la celulosa, la pectina, el glucgeno, entre otros. Aparecen igualmente en molculas orgnicas simples y complejas como el ADN, los alcoholes, las glicoprotenas, etc. Los edulcorantes no calricos, cuyo consumo se ha incrementado considerablemente en los ltimos aos, responden a la necesidad de disminuir el consumo de edulcorantes calricos, sacarosa principalmente, por dietas controladas o bien por programas de prevencin de la carie dental, diversas enfermedades (diabetes), demanda en productos farmacuticos, etc. Los edulcorantes obtenidos por va biotecnolgica se producen mediante procesos enzimticos o fermentativos. Por proceso enzimtico se obtienen el azcar invertido, fructosa, jarabes fructosados (55 %), jarabes fructosados (90 %), jarabes maltosados (45 60 %), jarabes maltosados (70 85 %), xilitol, jarabes de glucosa (92 96 %), jarabes de suero de leche, alitamo, neoazcares. Por fermentacin se obtiene taumatina (protena), iso-maltulosa (palatinosa o lilosa) a partir de sacarosa y cido asprtico para la produccin de aspartamo. La palatinita es obtenida por hidrogenacin qumica de la iso-maltulosa. Por proceso enzimtico-qumico se puede obtener el maltitol por la hidrogenacin de la maltosa, el iso-maltitol por isomerizacin del maltitol y la maltulosa por isomerizacin qumica de la maltosa (Garca et al., 1993), (Botero et al., 1993), (Roberto et al., 1995), (Garca et al., 1997), (Oh et al, 1998), (Kim et al., 1999), (Agudelo et al., 2002) Existe tambin inters en la produccin de materias primas a partir de aguas residuales de plantas procesadoras de alimentos. Estas aguas poseen una alta demanda biolgica de oxgeno que involucra altos costos de disposicin, pudindose convertir microbiolgicamente a productos, tiles, como protena unicelular. As mismo, muchos de los residuos slidos que se producen en el procesamiento de los alimentos, pueden tratarse y modificarse para aprovecharlos como sustratos en la formulacin de alimentos para animales y de productos de mayor valor agregado (Roberto et al., 1995), (Medina et al., 1996), (Medina, 2003). 1.3.2 Agropecuario. La aplicacin de la biotecnologa al sector agrcola ha sido considerada desde los inicios de los aos ochenta como un rea de gran importancia e impacto, puesto que permite potencialmente aumentar la produccin primaria, disminuir el deterioro ambiental causado por el uso de agroqumicos y obtener variedades mejoradas en perodos ms cortos que si se aplicasen las tcnicas tradicionales (Quintero et al., 1993). La 12

biotecnologa crea plantas que resisten plagas y frutos que no se deterioran. La investigacin experimental confirma la inocuidad de las mismas para el ambiente y su rentabilidad (Gasser et al., 1992). En junio de 1992, el primer producto agrobiotecnolgico, tomate de madurez retardada, fue aprobado para consumo y comercializacin en Estados Unidos. A partir de este momento, cerca del centenar de vegetales con genes extraos insertados, se encuentran en distintas etapas de su comercializacin. Entre stos estn: la zanahoria, la coliflor, el apio, el algodn, el pepino, el lino, la alfalfa, el maz, la colza, el lamo, la papa, el centeno, el tomate, el tabaco, el trbol, el nogal, el caf, el meln, la uva (Quintero et al., 1993), (Cuesta et al., 2003). Una superficie cada vez mayor de cultivos transgnicos (algodn, canola, maz, soya y papa, entre otros) se esta cultivando para uso y consumo humano y animal. En 1997, el algodn transgnico representaba el 18 %, la soya transgnica el 13 % y el maz transgnico el 9 %, de la superficie cultivada en los Estados Unidos; mientras que el 25 % de la canola cultivada en Canada era transgnica (Colciencias, 2004). Las principales tendencias en investigacin y aplicacin de la biotecnologa agrcola son: Plantas transgnicas resistentes a plagas: virus, bacterias, hongos, insectos y herbicidas. Plantas transgnicas resistentes a factores abiticos: sequa, salinidad, calor y metales pesados. Plantas transgnicas con caractersticas mejoradas y/o nuevas: incremento del contenido de protena, aumento del contenido de almidn, modificacin del contenido de aceite, plantas con maduracin retardada, etc. Clulas y plantas transgnicas como sistemas de produccin de: metabolitos secundarios, protenas de uso teraputico, anticuerpos monoclonales, enzimas, plstico biodegradable, etc. Mapas genmicos de los principales cultivos con el propsito de hacer ms eficiente y rpido el fitomejoramiento tradicional. Reemplazo de agroqumicos por productos de origen biolgico: biofertilizantes, bioinsecticidas, bioherbicidas, control biolgico de plagas, etc.

Durante el crecimiento de la planta, sta interacta ntimamente con los microorganismos y su ambiente. Estas interacciones pueden ser beneficiosas, neutrales o perjudiciales dependiendo del tipo de planta y ambiente donde se desarrolla. Dentro de microorganismos beneficiosos existen tres tipos generales. La primera clase la forman aquellos microorganismos que pueden incrementar el suplemento de nutrientes minerales esenciales para el crecimiento tales como nitrgeno y fsforo; stos son los responsables de la biofertilizacin. La segunda clase de microorganismo comprende a aquellos que estimulan el crecimiento de las plantas de forma indirecta mediante la prevencin del crecimiento o accin de organismos patgenos a las plantas. Esta forma de prevencin de enfermedades es algunas veces llamada biocontrol, para diferenciarla del uso de pesticidas qumicos. La tercera clase de microorganismos beneficiosos para las plantas incluye aquellos que son responsables directamente del crecimiento biolgico de la planta, por ejemplo, por la produccin de fitohormonas (giberelinas, auxinas y citoquininas), reguladoras del crecimiento (Klibansky et al., 1996), (Colciencias, 2004). 13

Existen microorganismos del suelo de la familia Rhizobiaceae (Rhizobium, Bradyrhizobium y Azorhizobium), los cuales forman una asociacin simbitica con distintas especies de plantas y durante la simbiosis son capaces de llevar a cabo la fijacin de nitrgeno molecular. En la simbiosis las bacterias se encuentran en las races de las plantas dentro de estructuras llamadas ndulos. Ni la planta, ni estas bacterias aisladamente, fijan el nitrgeno diatmico para convertirlo en amonio. La simbiosis es inhibida si existe un exceso de nitrato o amonio en el suelo. Dentro de los ndulos las bacterias se convierten en bacteriodes, clulas ms grandes que los Rhizobium, que se encuentran en el suelo y que llevan a cabo la fijacin de nitrgeno porque son capaces de producir la enzima nitrogenasa, que es la responsable de la conversin del nitrgeno molecular en amonio, en la simbiosis entre Rhizobium y leguminosas. Debido a esta simbiosis la planta recibe nitrgeno que puede utilizar para s misma, mientras que las bacterias utilizan molculas que les proporciona la planta (Bauer, 2003). La fijacin simbitica de nitrgeno no es exclusiva del gnero Rhizobium. Ni tampoco todas las bacterias fijadoras de nitrgeno tienen necesariamente que asociarse con las leguminosas (Brill, 1981), (Prez, et al., 2003). Con el fin de alcanzar mayor rendimiento en la fijacin biolgica del nitrgeno, se trabaja en la modificacin gentica de las cepas de Rhizobium (Matnez et al., 1998). Los hongos del suelo denominados micorrizas colonizan las races de las plantas, constituyendo una verdadera extensin o ampliacin del sistema radical. Consiguen fosfato asimilable para las plantas en suelos deficitarios de aquella sustancia, convirtiendo el fosfato en formas solubles y transportndolo hasta las races. Las micorrizas acarrean tambin agua hasta la planta desde puntos donde no llegan las races (Brill, 1981), (Klibansky et al., 1996), (Barca, 1998). La habilidad para transferir o insertar un nuevo ADN en clulas de plantas, existe ahora para la mayora de cultivos, incluyendo tomate, maz, soya, trigo, calabaza, papaya, papa, zanahoria, algodn, arroz, tabaco. Esta tecnologa permite obtener plantas con mayor resistencia a los insectos y virus, mayor tolerancia a los herbicidas, incremento en el rendimiento de las cosechas, mejora de la calidad nutricional, incremento en la produccin de aceites, carbohidratos y protenas, el control de la maduracin de frutas y el ablandamiento de los tomates (Wilkinson, 1997), (Estruch, 1998), (Ronald, 1998), (Nieto et al., 1999), (Barcel et al., 2001), (Messeguer et al., 2003), (Cuesta et al., 2003). Una estrategia para aumentar la produccin y calidad de los productos agrcolas y evitar un deterioro del medio ambiente, es la sustitucin de pesticidas qumicos por pesticidas de origen biolgico. Los biopesticidas estn compuestos por bacterias que producen toxinas y actan como insecticidas, virus utilizados para inducir enfermedades en los insectos nocivos y hongos empleados para infectar insectos nocivos. La bacteria Bacillus thuringiensis, que normalmente se encuentra en el suelo, al esporular produce una protena que al ser ingerida por larvas de diferentes tipos de insectos, causa la muerte de ellas. De ah su denominacin de bioinsecticida (Quintero et al., 1993), (Bravo et al., 1996). Se han obtenido plantas con propiedades insecticidas capaces de controlar especies muy dainas, mediante la introduccin de genes que cifran endotoxinas. La insercin de genes en determinados insectos puede cortar de raz la transmisin de ciertas enfermedades infecciosas, proteger las cosechas e incluso producir nuevos materiales ( OBrochta et al., 1999). 14

Patgenos naturales contra plagas, entre los que se encuentran bacterias, virus y hongos, se usan como agentes de control biolgico. Los hongos del gnero Trychoderma tienen un gran potencial como agentes contra hongos patgenos del suelo. Actualmente hay inters en el posible uso de las bacterias cido lcticas como agentes de biocontrol para garantizar la seguridad de alimentos refrigerados mnimamente procesados, los cuales no son acidificados, especialmente con frutas y vegetales (Quintero et al., 1993), (Breidt et al., 1997). Los mtodos usados con productos hortcolas estn basados en la manipulacin de la informacin gentica de las enzimas que producen etileno, el cual es el agente responsable de la sobremaduracin. Por medio de la transformacin gentica se producen plantas con frutos que no producen etileno o lo producen muy poco. La aplicacin de etileno exgeno restaura el patrn normal de maduracin. Esta estrategia es aplicable en potencia a cualquier fruto (Gmez-Lim, 1996). En el sector pecuario las aplicaciones iniciales se dirigieron principalmente a sistemas de diagnstico, nuevas vacunas y drogas, fertilizacin de embriones in vitro, uso de hormonas de crecimiento. La biotecnologa ha contribuido a la generacin de animales transgnicos con un crecimiento ms acelerado, con incremento en el tamao (peces) o produccin de leche (vacas) y en la calidad de la carne (cerdos). Esto se ha logrado a travs de la utilizacin de hormonas del crecimiento o somatostatina. La biotecnologa ha permitido que se generen productos de alto valor agregado, como la hormona de crecimiento, en la leche de animales transgnicos. Recientemente, se ha reportado la produccin de hemoglobina humana en cerdos transgnicos (Quintero et al.., 1993). Los animales transgnicos como el ratn oncognico han sido muy tiles en trabajos de laboratorio para estudios de enfermedades humanas. El cultivo de clulas vegetales individuales o de grupo de ellas, en grandes fermentadores, constituye una forma de obtener productos vegetales (frmacos, pesticidas, edulcorantes, aromatizantes). Adems, las clulas vegetales individuales constituyen un medio muy apropiado y eficiente para desarrollar nuevas variedades de plantas. Para la introduccin de un ADN forneo en clulas vegetales, se puede aprovechar el proceso natural de infeccin llevado a cabo por la bacteria Agrobacterium tumefaciems. Esta bacteria porta un plsmido (fragmento de ADN separado del cromosoma bacteriano) que produce tumores (conocidos como agalla del cuello o agalla en corona o cncer vegetal) en la mayora de las plantas dicotiledneas. El mecanismo de la infeccin bacteriana se basa en la insercin de un gen extrao en el plsmido inductor del tumor, que se utiliza para infectar plantas y producir una agalla de corona. . Todas las clulas vegetales de la agalla contienen dicho plsmido con su fragmento de ADN extrao. Se cultivan las clulas del callo en el laboratorio hasta que originen plntulas, que al crecer se podrn plantar en el suelo. Puesto que cada planta se produce de una sola clula portadora del gen extrao, todas las clulas de la nueva planta adulta sern portadoras del gen. (Brill, 1981), (Perea, 1990), (Nieto, et al., 1999). 1.3.3 Farmacutico y salud. La biotecnologa y en particular los procesos fermentativos, se han usado en la produccin de principios activos farmacuticos, distinguindose entre ellos los antibiticos (penicilinas, cefalosporinas, bleomicinas, antraciclinas, tetraciclinas, eritromicinas, estreptomicinas, rifamicina, bacitracina), los alcaloides, drogas 15

antitumorales, las vacunas bacterianas, las vacunas virales, las vitaminas, las enzimas y algunos esteroides que son transformados biolgicamente durante su proceso de produccin. Estos productos son de gran valor mdico y comercial en el mundo, pero puede decirse que tanto los principios activos como los procesos de produccin se desarrollaron antes de los aos 70 y por lo tanto, los esfuerzos actuales se dirigen hacia un aumento de productividad y rendimiento con el objeto de disminuir costos de produccin. A pesar de que los antibiticos poseen una amplia variedad de estructuras qumicas y muy diversos lugares de accin, todos satisfacen el principio de toxicidad selectiva. Dicho principio mantiene que un agente quimioteraputico eficaz no debe afectar a los tejidos humanos y si ser txico para el agente infectante. Las penicilinas y cefalosporinas obstruyen la formacin de la pared celular bacteriana; las bleomicinas y antraciclinas interfieren la replicacin del ADN; las eritromicinas, tetraciclinas y estreptomicinas inutilizan el complejo ribosmico y las rifamicinas interrumpen la transcripcin de ADN en ARN mensajero (Aharonowitz et al., 1981). Las nuevas tecnologas biolgicas, establecidas a partir de 1973, particularmente la ingeniera gentica (o tecnologa de ADN recombinante) aun cuando existen otras tcnicas de gran uso y potencialidad, han permitido que el hombre pueda producir protenas humanas en otro tipo de seres como son las bacterias, levaduras y en algunos casos animales superiores. Una vez entendido como los seres vivos procesan la informacin gentica y como obtener de ella protena, slo falt que un grupo de investigadores y de empresarios pudiese percibir el valor teraputico y econmico, para iniciar la generacin de un grupo muy importante de nuevas protenas que hasta ese momento era muy difcil conseguir y en otros casos era prcticamente imposible obtenerlas. El conocimiento sobre el sistema inmunolgico humano ha permitido identificar un grupo muy importante de protenas y establecer nuevos sistemas de produccin. Entre estas protenas se encuentran los interferones, las interleukinas, los factores estimulantes de crecimiento, el factor de necrosis tumoral, etc. Adems, se han podido generar nuevas y mejores vacunas (viruela, poliomelitis, tifus, ttanos, sarampin, hepatitis A, hepatitis B, rotavirus y malaria) (Daz-Betancourt, 1996), (Rappuoli et al., 1997), (Weiner et al., 1999), (Langridge, 2000). Las principales tendencias en la investigacin y aplicacin de la biotecnologa en el sector salud, son: Produccin de protenas de inters teraputico. Desarrollo y produccin de vacunas. Desarrollo y produccin de sistemas de diagnstico. Diseo, produccin y mtodos de administracin de frmacos. Biologa molecular del genoma humano y medicina molecular.

Protenas recombinantes. Gracias a la biotecnologa se pueden fabricar protenas animales y humanas, para fines medicinales. Con la ayuda de los cultivos industriales de bacterias o de clulas superiores se pueden producir grandes cantidades de protenas. 16

Todos los seres vivos compartimos el mismo cdigo gentico, el lenguaje en el que se especifican las instrucciones precisas para la sntesis de protenas. Esto significa que se puede introducir material gentico forneo en una clula. Si se inserta el gen humano en el material gentico de una bacteria, sta fabricar la protena correspondiente, siempre y cuando la informacin fornea contenga tambin los elementos necesarios para la expresin del gen. La eleccin de una clula productora viene determinado no slo por criterios econmicos, sino tambin por las normas reguladoras de los pases. En la prctica slo son tres los organismos o clulas ms utilizadas en la sntesis de protenas teraputicas: Eschericchia coli, Saccharomyces cerevisiae y clulas de ovario de Hamster. Por recombinacin gentica se produce: insulina humana, los interferones, el activador del plasmingeno tisular, la albmina humana, la hormona del crecimiento o somatostatina, la hormona eritropoyetina (Ahatonowitz et al., 1981), (Stiegler et al., 1997). La mayora de los interferones se agrupan, de acuerdo con la secuencia aminocdica de sus estructuras proteicas en tres clases: alfa, beta y gama. Los interferones actan en primera lnea de defensa contra infecciones vricas y parasitarias. Hoy en da los interferones son el segundo producto biotecnolgico ms vendido en el mundo (Johnson et al., 1994), (Gil et al., 2001). Farmacia de granja. Una fuente alternativa de sntesis de protenas recombinantes con finalidad teraputica la ofrecen los animales y plantas transgnicas. Se han introducido genes humanos en embriones femeninos de cabras, cerdos, ovejas y vacas. Estos genes llevan asociado un interruptor que faculta nicamente a las clulas de las mamas para producir la molcula. El producto se recoge directamente de la leche del animal. De la farmacia de granja han salido la enzima -antitripsina (AAT), extrada en leche de oveja. Esta enzima facilita la respiracin en pacientes con enfisema pulmonar (Stiegler et al., 1997), (Wilmut, 1999). La protena C humana, el factor VIII y factor IX, el activador tisular del plasmingeno (Velander et al., 1997). La hormona de crecimiento humana a partir de leche de vacas transgnicas clonadas para el tratamiento contra el enanismo (BioPlanet-Breves, 2004). Anticuerpos monoclonales. Se estn utilizando tanto en terapia para enfermedades como para diagnstico. Las inmunoglobulinas son producidas en un hibridoma, producto de la fusin de una clona de linfocito B y una lnea inmortal. Estas inmunoglobulinas reconocen y unen con una alta afinidad, nicamente un determinado antgeno. Los anticuerpos son macromolculas en forma de Y. Tienen por misin luchar contra los invasores. Los anticuerpos monoclonales estn sintetizados por copias idnticas, o clones de un mismo linfocito B, por cuya razn atacan una sola diana especfica. Hay en el mercado una de decena de anticuerpos monoclonales. Cubren desde la prevencin del rechazo de un rgano transplantado hasta la oncoterapia. Otros tres monoclonales esperan la aprobacin de la Oficina de Alimentacin y Farmacia (FDA). Aunque la produccin de anticuerpos monoclonales suele corresponder a los hibridomas, unas clulas de mamferos, se est trabajando en su obtencin a partir de la leche de animales sometidos a ingeniera gentica y a partir de plantas transgnicas (Ezell, 2001). Probiticos. Estn definidos como microorganismos vivos que son ingredientes de los

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alimentos y que tienen un efecto benfico en la salud humana. Muchas cepas probiticas han sido identificadas, estudiadas y comercializadas: Lactobacillus acidofillus, Lactobacillus casei, Lactobacillus fermentun, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus lactis, Bifidobacterium lactis, longum, Bifidobacterium breve. Los probiticos disminuyen los riesgos de cncer, mejora la funcin del tracto intestinal y la inmune, moderan la respuesta alrgica, inhiben la infeccin por la Helicobacter pylori (salud estomacal), inhiben infecciones del tracto urogenital en las mujeres, disminuyen el nivel de colesterol y la hipertensin (Sanders, 1999), (Salminen, 1999). Desarrollo y produccin de sistemas de diagnstico. Los nuevos sistemas de diagnstico son aquellos que utilizan anticuerpos monoclonales y sondas de cidos nucleicos, debido a la alta especificidad de los reactivos, as como a la simplicidad de las pruebas. Otro sistema que tambin tiene importancia es el de los biosensores que se basa en la utilizacin de enzimas o anticuerpos acoplados a dispositivos electrnicos. Ejemplos de stos, son los electrodos enzimticos para analizar el colesterol, los aminocidos, el cido rico, la penicilina, la urea, el etanol y la glucosa (Schultz, 1991), (Quintero et al., 1993), (Illanes, 1994). Desarrollo y produccin de vacunas. La manera ms efectiva de controlar la hepatitis B (VHB) es mediante la vacunacin. En los ltimos aos se han desarrollado dos tipos de vacunas contra la VHB: la plasmtica, mediante el aislamiento del virus del plasma de portadores asintomticos y purificacin del antgeno de superficie (HbsAg) y la recombinante, mediante el clonaje y expresin de este antgeno en una clula eucaritica. El Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa, de la Habana, Cuba, se dio a la tarea de desarrollar una vacuna contra la hepatitis B por va recombinante. Los primeros clones obtenidos en S. cerevisiae llegaron a los fermentadores en 1986. En 1988 se probaron las cepas de la levadura Hansenula polymorpha y Pichia pastori, logrndose muy buenos resultados. A principios de 1990 comenz la produccin a escala piloto y un ao despus se inaugur una nueva instalacin, con dos fermentadores de 3 000 L y se comenzaron los trabajos de puesta en marcha y validacin. A principios de 1992 se comenz la produccin a escala de 3000 L. En 1994 comenzaron las negociaciones para la transferencia de esta tecnologa a otros pases, mientras que en Cuba se inauguraba una segunda planta de produccin del principio activo, con una capacidad 1,5 veces superior a la primera (DazBetancourt, 1996). Actualmente se esta trabajando en la creacin de vacunas comestibles mediante la bacteria Agrobacterium tumefaciens, que permite introducir en las clulas vegetales los genes de antgenos bacterianos o vricos. Entre los alimentos que se estn investigando como opcin alternativa a las vacunas inyectables se tienen los pltanos, las papas, los tomates, la lechuga, el arroz, el trigo, la soya y el maz (Langridge, 2000). Las vacunas con material gentico, ya sea ADN o ARN, pueden que consigan prevenir el SIDA, el paludismo y la hepatitis C, para las que no existen vacunas eficaces (Weiner, 1999). 1.3.4 Qumico. En la actualidad, la contribucin de los procesos biolgicos a la industria qumica (excluyendo la industria farmacutica) est limitada a: modificacin de esteroides por va enzimtica, produccin de cido itacnico. (termoplsticos), etanol (disolvente, extractor, anticongelante, materia prima de otros compuestos orgnicos y combustible), 18

acetona (disolvente, explosivos), n-butanol (disolvente, plastificantes, lquido para frenos, aditivos para la gasolina, resinas de urea-formaldehido, extractores, cubiertas protectoras, glicerol (disolvente, lubricante en numerosos productos, emoliente, demulgente, como steres de glicerol en los explosivos), cido glucnico (detergentes, evita la precipitacin de sales de calcio y magnesio), cido actico (goma, plsticos, fibras de acetato, colorantes, insecticidas, materiales fotogrficos, productos farmacuticos), cido lctico (acidulante, mordiente en tejidos, plateado elctrico, plsticos), cido butrico, isopropanol (solvente, obtencin de acetona y sus derivados, glicerol, isopropil acetato), cido kjico (insecticida), xidos de alqueno (xido de propileno, plstico polipropileno; xido de etileno, plstico polietileno), cido fumrico (sntesis orgnicas, resinas, mordiente), cido propinico (perfumes, funguicidas, enzima -amilasa y celulasa (textil), enzima proteasa alcalina (detergentes), enzima pancreatina (curtimbre), enzima piranosa-2-oxidasa, haloperoxidasa, epoxidasa (obtencin de xidos de alqueno a partir de alquenos), aminocidos L-arginina y L-serina (cosmticos) y aminocido L-cistena (antioxidante) (Eveleigh, 1981). Las principales tendencias en la investigacin y aplicacin de la biotecnologa en el sector industrial, son (Quintero et al., 1993): Obtencin de cepas mejoradas de microorganismos productores de metabolitos primarios y secundarios: aminocidos, antibiticos, etc. Diseo y sobreproduccin de enzimas con propiedades especiales. Desarrollo de nuevos bioprocesos: enzimas inmovilizadas, biosensores, biorreactores. Produccin de metabolitos por cultivos in vitro de clulas vegetales.

1.3.5 Energa. La biotecnologa trabaja en la bsqueda de alternativas energticas utilizando recursos naturales renovables. Entre los combustibles obtenidos biotecnologicamente estn: gas metano, etanol (gasol), hidrgeno (biofotolisis del agua, basada en la combinacin de fotosistemas de vegetales, enzimas hidrogenasas de origen bacteriano y luz), clulas de combustibles. 1.3.6 Minera. La lixiviacin microbiana es el proceso por el que utilizando microorganismos, se extraen los metales a partir de las rocas que los contienen. En el presente no pueden ser procesadas econmicamente algunas menas por mtodos qumicos debido a su bajo contenido en metal. Para muchos metales existen actualmente mtodos que permiten su extraccin a partir de sulfuros metlicos (hierro y cinc) u otros minerales. Los metales (como el cobre, cobalto, molibdeno, cadmio, arsnico, nquel, titanio, uranio) pueden ser removidos de las rocas por un sistema redox con una solucin de sulfrico cido/Fe3+. (Crueger et al., 1993). Se ha estudiado la biolixiviacin de ndulos de manganeso por bacterias sulfo-oxidantes (Konishi et al., 1997), de sulfuro de cinc concentrado por Thiobacillus ferrooxidans (Konishi et al., 1992). En muchos casos, es posible utilizar bacterias para lixiviar el mineral deseado de profundidades mayores, sin necesidad de remover los depsitos, con lo cual se economizan los costos de mover grandes toneladas de menas y rocas de desecho a la superficie. Adicionalmente, muchos procedimientos convencionales consumen grandes cantidades de energa; por lo tanto, la biolixiviacin de menas y concentrados puede suministrar una alternativa para economizar energa. Por otro lado, un problema frecuente y de larga data en operaciones mineras ha 19

sido la liberacin incontrolada de metales y cidos. La lixiviacin controlada puede dar como resultado tanto la recuperacin de metales valiosos, como la proteccin del ambiente (Colciencias, 2004), (Noriega et al., 2002). 1.3.7 Tratamiento de la contaminacin ambiental. La biotecnologa ambiental tampoco es un campo nuevo: la elaboracin de compost (compostaje) y las tecnologas de aguas residuales son ejemplos conocidos de la antigua biotecnologa ambiental. Desarrollos recientes en biologa molecular, ecologa e ingeniera ambiental, ofrecen actualmente la oportunidad de modificar genticamente organismos, de tal manera que los procesos biolgicos bsicos, sean ms eficientes y capaces de degradar compuestos qumicos ms complejos; as, como mayores volmenes de materiales de desecho. El potencial de la biotecnologa moderna en este sector es muy amplio, ya que permite la aplicacin de sta al tratamiento de efluentes acuosos, gaseosos y slidos; as como a la contaminacin del aire o del suelo. El tratamiento de efluentes tradicionalmente incluye cuatro operaciones bsicas. Los procesos biolgicos inciden en el tratamiento secundario, siendo los microorganismos los responsables de la degradacin de la materia orgnica en procesos aerobios o anaerobios. Tambin se incluye la digestin anaerobia del lodo de los tratamientos primario y secundario (Borja et al., 1992), (Crueger et al.., 1993), (Ortiz et al., 1997), (Colciencias, 2004). La seleccin de procesos de depuracin de tipo biolgico para efluentes industriales depende del xito que se tenga en los ensayos previos para determinar su biodegradabilidad. El xito del ensayo depende en muchos casos de disponer del fango especfico para biodegradar el efluente, as como de que el ensayo se realice a las condiciones adecuadas (Farre, 1994). Tratamiento de aguas residuales. El tratamiento aerobio de las aguas residuales puede llevarse a cabo en tres grandes sistemas: el de lodos activados, el de lagunas o estanques de aireacin y el de filtro de precolacin o percolador. Para el tratamiento anaerobio existen cuatro diseos bsicos de reactores: lecho fijo anaerobio de flujo ascendente, lecho fluidizado anaerobio, filtro anaerobio y reactor anaerobio de mezclado con recirculacin. La biorremediacin es la degradacin, por microorganismos, de productos xenobiticos (compuestos sintticos ajenos a la biosfera). Es una alternativa y una estrategia cada vez ms utilizada e importante para contrarrestar la contaminacin por compuestos qumicos. Los procesos de biorremediacin han sido empleados para tratar residuos o derrames de hidrocarburos (gasolina, diesel, petrleo crudo) y residuos de refinera (naftaleno, estireno, antraceno, tetrahidrofurano, etc.; pesticidas y sus derivados (herbicidas de fenoxiacetato, carbamatos y organofosforados); solventes clorados y compuestos derivados de la manufactura de hidrocarburos alifticos clorados (cloroformo, cloruro de metileno, tricloetileno, tetracloruro de carbono, etc.); hidrocarburos aromticos hidrogenados (pentaclorofenol, bencenos clorados) y solventes no halogenados (tolueno, benceno, fenol, etilbenceno, xileno, etc.). Los procesos microbianos tambin pueden ser empleados para la transformacin y recuperacin de metales tales como arsnico, plomo, cadmio, mercurio, cromo, nquel, bario, uranio, etc. (Dvorak et al.., 1992), (Lee et al., 1993), (Crueger et al., 1993), (Allsop et al., 1993), (Grosso et al., 1995), (Macarie et al., 1996), (Mogolln et al., 20

1996), (Basnakova et al., 1997), (Hu et al., 1997), (Macaskie et al., 1997), (Duong et al., 1997). El problema de la contaminacin ambiental es una de las principales preocupaciones del hombre de cara al siglo XXI. En particular, el petrleo constituye una de las principales fuentes de polucin del medio ambiente, ya que la mayor parte de sus componentes son recalcitrantes a la biodegradacin. Sin embargo, existe un grupo numeroso de microorganismos heterotrficos capaces de utilizar los hidrocarburos del petrleo como fuente de carbono y energa para su crecimiento, produciendo dixido de carbono, agua, biomasa y otros productos parcialmente oxidados que no son txicos (Eweis, et al., 1999), (Daz, 1999). (Gonzlez et al., 2002). Existe el producto AquaBact para la biorremediacin de suelos contaminados con petrleo, constituido por un cultivo mixto de cepas de microorganismos que se presentan en forma natural en el medio ambiente, reforzado con un suministro de nutrientes balanceados, que permiten acelerar la biodegradacin de hidrocarburos del petrleo. Tratamiento de gases. Existen dos tipos de procesos: aerobios y anaerobios. El primero permite tratar corrientes de aire contaminadas, mientras que el segundo puede aplicarse a sistemas tal como el gas natural o las corrientes de la digestin anaerobia. Existen dos tipos de tecnologas para el tratamiento de gases: biolavadores, en donde los contaminantes se extraen en un lquido, generalmente agua, los cuales a su vez son sometidos a oxidacin por sistemas clsicos utilizados en el tratamiento de efluentes y biofiltracin, donde se pasa la corriente gaseosa por un lecho hmedo, en el cual se encuentran los microorganismos oxidantes (Zhil et al., 1993), (Crueger et al., 1993), (Kennes et al., 1996). 1.3.8 Armas biolgicas. El arsenal biolgico ha despertado un inters creciente en los estados y en las bandas terroristas; siendo necesarios controles ms estrictos sobre este tipo de armamento para evitar su empleo. A diferencia de cualquier otro tipo de armamento, el biolgico incrementa su peligrosidad con el tiempo. Unos agentes biolgicos incapacitan a la victima; otros, la matan. El virus Ebola acaba con el 90 % de sus victimas, en poco ms de una semana; no se conoce tratamiento alguno. La bacteria Yersinia pestis produce la peste bubnica; existen las vacunas que proporcionan inmunidad y los antibiticos suelen ser eficaces si se administran precozmente. La toxina botulnica, liberada por la bacteria Clostridium botulinum, produce botulismo, que conlleva a menudo a la muerte; la antitoxina detiene a veces el proceso. El Bacillus anthracis produce ntrax o carbunco, que puede ser fatal; la vacuna y los antibiticos ofrecen proteccin suficiente, a menos que la exposicin sea alta (Cole, 1997). La suelta intencionada de organismos que devoren las cosechas del enemigo, es un arma desvastadora en tiempos de guerra o en manos terroristas (Rogers et al., 1999). Bilogos e ingenieros estn desarrolando detectores consistentes en chips de anticuerpos o ADN que detectan patgenos. Trabajan tambin en la creacin de dispositivos que detectan los olores emitidos por los microorganismos o aditivos introducidos para convertirlos en armas (Casagrande, 2002).

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1.4 OPERACIONES BIOTECNOLGICAS. Operacionalmente se pueden distinguir cinco aspectos fundamentales en cualquier proceso biotecnolgico, que en la mayor parte de los casos corresponde a etapas de su desarrollo: 1.4.1. Eleccin del cultivo: seleccin, mejora, o en su caso creacin del organismo o la poblacin celular ms adecuada. Esto puede implicar el descubrimiento y la seleccin de las cepas ms adecuadas de entre la enorme variedad de especies naturales de microorganismos, y luego mejorar sus caractersticas hereditarias. Tal seleccin generalmente requiere un conocimiento biolgico general, para conocer donde mirar y que clase de organismo buscar para que, combinado con tcnicas qumicas y bioqumicas se encuentre como detectar mejor lo que se esta buscando. Otras situaciones pueden implicar la seleccin de la poblacin mixta ms apropiada. Un conjunto de posibilidades alternativo, se tiene con las tcnicas que permiten la construccin deliberada del tipo de clula ms adecuada, mediante manipulacin gentica de padres que pueden proporcionar las caractersticas hbridas deseadas. 1.4.2 Cultivo en masa. Para las aplicaciones biotecnolgicas es esencial poder conservar los organismos durante tanto tiempo como se necesiten y a continuacin multiplicarlos a voluntad a una escala adecuada, que puede ser muy grande. Se debe disponer de una cantidad de cultivo suficiente para inocular el medio del fermentador, adems debe ser metablicamente activo, estar libre de contaminantes y ser capaz de producir el producto que se pretenda obtener en el cultivo subsiguiente. Sin embargo, si, por ejemplo, el fermentador produjera 100 000 L, el volumen del inculo debe estar entre 3000 y 10000 L. Este volumen tiene que prepararse a partir de un cultivo de unos pocos mL, lo que conlleva un gran nmero de fermentaciones sucesivas a una escala cada vez mayor (por ejemplo, en la produccin de cido clavulnico, en un fermentador de 1000 L con 600 L de medio de fermentacin, se toma el microorganismo del agar inclinado y se lleva a 30 mL, luego a 300 mL, 15 L y 60 L) (Trevan et al., 1990). 1.4.3 Respuestas celulares: la eleccin de las actividades deseadas. Los productos o los agentes activos por los que se cultivan las clulas slo se producen ms abundantemente bajo condiciones especficas. En general estas condiciones no son las mismas que las que se requieren para obtener la multiplicacin ms abundante de la biomasa. El conocimiento bsico necesario procede de experimentos en pequea escala. 1.4.4 Operacin del proceso. Un proceso biotecnolgico no se reduce en general a una sola etapa operativa. La ejecucin satisfactoria de todas las etapas que se requieren, completamente optimizado en cuanto a seguridad, reproductibilidad, control y eficiencia es en su mayor parte un asunto de diseo de la ingeniera del proceso, aplicado con un completo entendimiento de los factores biolgicos, qumicos y socioeconmicos. 1.4.5 Recuperacin de los productos. La eficiencia de recuperacin del producto no slo se refleja en los costos, sino que se requiere adems, formas efectivas y ambientalmente aceptables de recuperacin de los productos marginales. Para la recuperacin y purificacin de biomolculas intracelulares se requieren las etapas de: 22

fermentacin, concentracin, ruptura celular, separacin slido lquido, concentracin y aislamiento del producto final. Para la recuperacin y purificacin de biomolculas extracelulares se requieren las etapas de: fermentacin, separacin slido-lquido, concentracin y aislamiento del producto final. Las tcnicas consideradas para la etapa de separacin slido lquido son la filtracin tradicional, la ultrafiltracin, la centrifugacin y la sedimentacin.. Los mtodos usados para la etapa de concentracin son la evaporacin, la smosis reversa, la ultrafiltracin, el secado y la liofilizacin. De los mtodos de ruptura celular, los ms usados a escala de operacin son la agitacin en lquido y la abrasin. En la etapa de aislamiento o purificacin se tiene como etapa primaria la dilisis y electrodlisis, la ultrafiltracin, el intercambio inico, la cromatografa y la cromatografa de alta resolucin (HPLC) y como etapa final se tiene la precipitacin, la extraccin lquidolquido, la cromatografa de intercambio inico y la cromatografa de afinidad.(Fair, 1989).

A: entrada de aire estril. B: salida de aire C: entrada del agua de enfriamiento. D: salida de agua. E: adicin de cido, lcali y antiespumante. F: biomasa (micelio). G: destilacin. H: solvente. I: solucin.

1: cepa productora congelada. 2: crecimiento slant. 3: matraz agitado de cultivo. 4: fermentador de semilla. 5: fermentador principal. 6: filtro rotatorio. 7: centrfuga. 8: cristalizador. 9: secador. 10: empaque del producto.

Figura 1.4. Etapas de un proceso tpico de fermentacin (Quintero, 1990) 23

1.5 CONDICIONES DEL DESARROLLO BIOTECNOLGICO El desarrollo de la biotecnologa no se ha dado como una propuesta a necesidades del mercado, sino como un proceso de acumulacin continua de conocimientos de ciencias bsicas (biologa molecular, gentica, bioqumica, microbiologa, etc.) y por la modernizacin e innovacin de las ingenieras orientadas a establecer cambios cualitativos en la tecnologa. Los pases que liberan el mercado biotecnolgico, Estados Unidos y Japn, se han destacado por su tradicin e investigacin bsica. Japn estudia desde 1968 las fermentaciones aplicadas a bebidas y alimentos fermentados, por su antiqusima tradicin en el consumo de productos obtenidos a travs de estos procesos. En 1980 el Japn posea la totalidad de las licencias de fabricacin de los 20 aminocidos, alrededor de los cuales se investigaba desde 1908. En 1979, de los 11 nuevos antibiticos comercializados en el mundo, 7 se haban sintetizado en laboratorios japoneses (Montoya, 1990). Estados Unidos tiene una tradicin de grandes desarrollos en ciencias bsicas. Sus avances, se presentan en la moderna biotecnologa, inicialmente en recombinacin gentica. Segn la OTA (Office of Technology Assystment), el nmero de empresas de ingeniera gentica no era superior a 14 a finales de 1979; y en 1982 se contaba con 155 compaas. Europa Occidental tena en 1981 aproximadamente 200 equipos y ms de un millar de proyectos de investigacin sobre recombinaciones genticas. Cerca de 70 compaas miraban con inters la biotecnologa, 20 de ellas trabajaban en recombinaciones genticas, en empleo de enzimas inmovilizadas y en cultivos de clulas. En el Japn durante 1998, las ventas de productos y servicios basados en ADN recombinante, cultivo de clulas y otros sectores relacionados sumaron US$ 10 billones y el nmero de empleados en la bioindustria era de aproximadamente 35 000. se espera que el ao 2010 el nivel de empleo en esta rea haya aumentado a los 150 000 y el mercado haya crecido a US$ 210 billones (Aroca, 2004). En general, los ltimos aos, el hombre enfrenta nuevas situaciones y retos por la investigacin en biotecnologa y como consecuencia la liberacin al medio ambiente de seres transgnicos (microorganismos, plantas y animales) con caractersticas nuevas y cuya modificacin gentica aporta beneficios. Sin embargo, no se puede descartar totalmente los riesgos potenciales. Por ejemplo, si las plantas transgnicas se establecen plenamente en la agricultura, esto podra derivar en una mayor prdida de la biodiversidad. Por otro lado, no se sabe que efecto tendrn estos seres transgnicos en nichos especficos (Quintero et al., 1993). Al igual que en casi todos los campos, a Amrica Latina la biotecnologa le llega, en la mayora de los casos, a travs de publicaciones y de recursos humanos formados en pases industrializados. La industria en estos pases no tiene tradicin de investigacin; por lo tanto, dispone de escaso personal capacitado para crear y adaptar conocimientos, y no tiene relacin con los centros de investigacin de las universidades. La poca industria se concentra, en consecuencia, en vinos y cervezas, que utilizan biotecnologa tradicional, cuyo desarrollo no ofrece diferencias significativas con el alcanzado en otros pases. En cuanto a la produccin de antibiticos, enzimas, aminocidos y agroqumicas, la tecnologa utilizada proviene de pases industrializados, salvo excepciones como en el caso de Mxico, Brasil y Argentina (Montoya, 1990). 24

La nueva biotecnologa se realiza bsicamente en centros de investigacin; existe tambin heterogeneidad en la cantidad y calidad de recursos humanos y materiales disponibles en Amrica Latina. Pases como Brasil, Mxico, Argentina y Cuba, han definido la biotecnologa como rea prioritaria de investigacin y desarrollo. Los dos ltimos son lderes en tecnologa endgena. Brasil ha logrado mayor independencia en el campo energtico y en fertilizantes a travs de la biotecnologa. La produccin de alcohol le permiti modificar su consumo interno de gasolina, gracias al etanol obtenido por fermentacin. En relacin con la actividad agrcola, hay programas de fijacin de nitrgeno en diversos centros universitarios brasileos, mexicanos y venezolanos. En el rea agroalimentaria, se destaca el importante desarrollo logrado en Cuba en la produccin de protena unicelular, utilizando melazas de la industria azucarera. En Cuadro 1.1 se muestran las prioridades de aplicacin e inters por sector, para varios pases de la regin y el Cuadro 1.2, se presentan los temas de investigacin en desarrollo en biotecnologa (Quintero et al., 1990). Cuadro 1.1. reas prioritarias de pases latinoamericanos

El impulso de la biotecnologa en Amrica Latina tiene que superar los problemas comunes en dichos pases, entre otros: Dificultad de definir proyectos. 25

Nmero insuficiente de investigadores y personal calificado. Infraestructura inexistente o incompleta para realizar proyectos en biotecnologa. Carencia de experiencia en el desarrollo tecnolgico. Presupuestos exiguos y muy diversificados en lo referente a ciencia y tecnologa. Falta de industria nacional que apoye nuevas tecnologas.

Por ello resulta imprescindible, para los pases en desarrollo, planificar una infraestructura cientfica, que permita estudiar cambios y avances cientficos rpidos y evitar la importacin indiscriminada de tecnologa. Cuadro 1.2. Temas especficos de investigacin en desarrollo en pases Latinoamericanos

Segn expertos, para los pases del Tercer Mundo la biotecnologa presenta buenas oportunidades, especialmente a travs de: La aplicacin del ADN recombinante, para la produccin de vacunas contra enfermedades infecciosas propias de nuestros pases. Reactivos de diagnstico, mediante sondas moleculares y anticuerpos monoclonales. El desarrollo de variedades de plantas resistentes a condiciones extremas y a plagas, por medio de cultivo de clulas vegetales. La utilizacin de desechos lignocelulsicos para produccin de energa o alimento animal o humano. Fermentaciones en medio lquido o slido para la produccin de materias primas, mediante procesos que pasen del laboratorio a la industria con relativa facilidad, 26

y que contribuyan a solucionar problemas de importaciones. En Colombia existe un gran potencial de aprovechamiento de recursos naturales mediante procesos biotecnolgicos. El pas puede contribuir a resolver problemas de salud, a desarrollar la produccin de materias primas para la industria, a producir alimentos cada vez ms escasos y aportar soluciones a la contaminacin que la produccin agrcola e industrial genera. El grupo de Biotecnologa de la Universidad Nacional realiz a finales de 1984, un proyecto de Diagnstico de la Biotecnologa en Colombia, bajo el auspicio de Colciencias y de la UNAL. Se realizaron 164 encuestas acopiadas en 54 industrias, 23 universidades y 11 centros de investigacin. Se identific investigacin en Biotecnologa en las siguientes reas: Ingeniera gentica, cultivo de tejidos vegetales (solucin de problemas alimentarios, floricultura), desarrollo de productos biolgicos, aprovechamiento de residuos agroindustriales, control de la contaminacin, biotransformaciones con aplicaciones en la industria qumica (farmacutica, alimentos, alcohol, cido ctrico y lixiviacin bacteriana), biogs (fermentacin metnica), etc. Las industrias que utilizan biotecnologa se ubican en cuatro sectores: productos biolgicos (vacunas, sueros, etc.); industria alimenticia (quesos y leches cidas); produccin de bebidas alcohlicas (cerveza, etanol) en industrias licoreras y produccin de materias primas (cido ctrico) (Montoya, 1990). En Colombia las investigaciones en biotecnologa deben apuntar hacia (Angarita, 1991): La reduccin del empleo de plaguicidas y de abonos nitrogenados. El mejoramiento de genotipos. La propagacin vegetativa de especies de importancia social y econmica. Obtencin de reactivos biolgicos. Desarrollo de vacunas sintticas. Desarrollo de sistemas para el diagnstico y control de enfermedades infecciosas. Recuperacin del medio ambiente. Valorizacin de la biomasa disponible mediante procesos biotecnolgicos que permitan la obtencin de productos de mayor valor agregado.

Complementar con la lectura de los artculos de Montoya, (1994), Quintero, (1998) y Aramendis et al., (2000).

1.6 CENTROS Y EMPRESAS BIOTECNOLGICAS Las industrias biotecnolgicas en Estados Unidos, por ejemplo, incluyen firmas que generan productos genticamente alterados para servicios de salud (terapia y diagnstico), agricultura, qumica y usos del ambiente. Las compaas del sector salud dominan financieramente la industria biotecnolgica en Estados Unidos. Incluyen un 87 % en la biotecnologa domstica, en tratamientos de enfermedades y diagnstico Las compaas biotecnolgicas del sector agrcola, corresponden a un 5 % del mercado. Realizan modificacin gentica de cosecha y ganado. El sector qumico y el sector del medio ambiente representan un 3 % en el mercado; proveen metabolitos (ej. enzimas) y tcnicas 27

biolgicas afines para la industria y aplicaciones ambientales. Proveedores biotecnolgicos, representan otro 5 % en el mercado; ofrecen servicios de soporte a industrias, dispositivos y sofware biolgicos (ICAF, 2004). La distribucin de 74 grupos de investigacin en biotecnologa en Colombia, por campo de aplicacin, presenta un 57 % en vegetal y agrcola, un 17 % en salud humana, un 14 % en ambiental, un 7 % en animal y un 5 % en industrial. As, mismo la distribucin de estos grupos por tipo de institucin, da un 35 % en universidades, un 33 % en el sector productivo, 27 % en los centros de investigacin y un 5 % en otros (Colciencias, 2004). A continuacin se presentan algunos, centros y empresa que trabajan en los distintos sectores de la biotecnologa. Adicionalmente, se puede consultar en la pgina de Colciencias las direcciones de algunas instituciones biotecnolgicas en Amrica Latina y el Caribe, en los diferentes sectores (www.colciencias.gov.co/simbiosis/directorios):

ABC Biokits S.A.S. Abgenix Ace Biosciences cidos orgnicos La Florida S.A.

Francia USA Dinamarca USA

Acs Medio Ambiente, S.A. de C.V. Mxico Actigen S.A. Chile Addavita Ltd. Advanced biotechnologies (ABI) AdvancedCell Agatsya Agresearch International AgroBiot Agroceres AgroGene Agromod Ajinomoto Interam. Indust. e Com. Aiba American Biotek Labs, Inc. Amgen Inc. Amgen Aquaquim, S.A. de C.V. Astrazeneca Inc. Aventis Aventis Pasteur Babaria S.A. Bayer

USA USA

www.abcbiokits.com www.abgenis.com www.biotech.about.com www.colciencias.gov.co/simbiosis/ directorios/empresasalimentos www.acsmedioambiente.com www.uni-leipzig.de/sept/facts/pdf/ biotech_chile_spanish.pdf www.addavita.demon.co.uk/ www.biotech.about.com www.advandcedcell.com www.agastyamicrotek.com. www.biotech.wisc.edu/Companies/ CompDir/ www.agroceres.com www.agrogene.com www.agromod.com.mx www.aibaonline.com/propects.htm www.biotech.wisc.edu/Companies/ CompDir/ www.amgen.com www.amgen.es www.aquaquim.com www.astrazeneca-us.com www.aventis.com www.aventispasteur.com www.bayer.cl/noticias/temas/ tema01.asp

Costa Rica Francia Mxico Brasil India

USA Espaa Mxico Alemania Colombia

28

Bejozaden Biobras Biocen Bio Gestion Bioiberica Biokit Bilogos, Inc. Bio Products Inc. Biotecnologa Ambiental S.A. Biotecol Bios-Chile S.A. Bio-Sidus Biosigma S.A. Bio Sonda S.A. Biosource Biotransplant Biotek Instruments Bthek Biosource International Calgene Cambia Canifarma CellFor Celltech Celtek Tecnologas C.A. CENICAFE Centro de Biotec. Sabritas S.A. Cergen CIB (Corp. Invest. Biol.) CIAT (Centro Int. ee Agric. Trop.) CID (Centro Desarr. Intern.) CIGB (Centro Ing. Gen.y Biotec.) Cim CIPAV CORPOICA Diagnotec S.A. Divega Biotecnologa S.A. DLF Trifolium Ecogen

Brasil

Colombia Espaa USA USA Mxico Colombia Chile Argentina

www.bejo.com www.uni-leipzig.de/sept/facts/pdf/ biotech_chile_spanish.pdf www.biocen.cu/estruct/producc.htm www.biogestion.unal.edu.co www.bioiberica.com www.biokit.com

www.biotecnologa.com.mx/biotec.html www.bioschile.cl/home.html www.uni-leipzig.de/sept/facts/pdf/ biotech_chile_spanish.pdf www.editec.cl/mchilena/julio2002/ Noticias.html www.uni-leipzig.de/sept/facts/pdf/ biotech_chile_spanish.pdf www.biodiverdadla.org/prensa/ Prensa100.htm

Chile

USA Brasil USA USA Australia Mxico Canada

Venezuela Colombia Mxico Argentina Colombia Colombia USA Cuba Cuba Colombia Colombia Chile Chile USA 29

www.bthek.com.br www.biosource.com www.bioscorpio.com/calgene_inc.htm www.cambia.org.au www.canifarma.org.mx www.cellfor.com www.celltech.com/resources/ producttshelf.asp www.celtek.com.ve www.colciencias.gov.co/simbiosis/ directorios/empresasalimentos.htm www.cergen8m.com www.ciat.cgiar.org/inicio.htm www.cid.harvard.edu/cidbiotech/links www.cigb.edu.cu www.cim.sld.cu

www.uni-leipzig.de/sept/facts/pdf/ biotech_chile_spanish.pdf www.geocities.com/divega_biotech www.dlf.dk/rddk03.shtml www.ecogenic.com

Eco-Pest Eibol Embrabio Embrapa Embryo Genetics Enmex, S.A. de C.V. Enviromental Dynamics Inc. Florigene Florinsa Frito-Lay, Inc. Fundacin Ciencia para la vida Gala Biotech Genetech Inc. Genetic Testing Institute, Inc. Genitope Gentech Geron Gis Brocades IBUN (Inst. Biotec. UNAL) Industrias Agro Biolgicas S.A. Inst Biotecnol.-UNAM Inst. Inmun. Hosp.. Sn Juan Dios Internac.Ag-Tcnico Americ. Ltda John Innes Centre (JIC) Kazusa DNA Research (KDRI) Kirin Brewery Laboratorios Mixin Lesaffre Levapan S.A. Lexicon Genetics Maxygen Medares Meristem Therapeutics Mexama Monsanto Nautilus Biotech

Espaa Brasil Brasil Mxico

USA

Ecuador

Chile USA

Francia USA Holanda Colombia Espaa Mxico Colombia

www.ecopest-sl.com www.eibol.com www.bdt.fat.org.br/iScan?160+ Biotech+1+0+index www.embrapa.com.br www.embrapa.br/espagnol www.geocities.com/wallstreet/ exchanger/8492/embryo.html www.colciencias.gov.co/simbiosis/ directorios/empresasalimentos.htm www.wastewater.com/espanolhome. html www2.austrade.gov.au/AOD/ Page18158.asp www.treemail.nl/eurobio/press/ press4.htm www.fritolay.com/company.html www.cienciavida.cl/news.htm www.gala.com www.gene.com www.biotech.wisc.edu/Companies/ CompDir/ www.biotech.wisc.edu/Companies/ CompDir/ www.gentech.fr www.geron.com www.ibun.unal.edu.co www.inagrosa.es www.ibt.unam.mx

www.ag-tec.com/ Reino Unido www.jic.bbsrc.ac.uk Japn www.kazusa.or.jp/en Japn www.kirinbrewery.jp/english www.colciencias.gov.co/simbiosis/ directorios/empresasalimentos.htm Francia www.lesaffre.com/default_sp.asp Colombia USA www.lexgen.com/intro.htm USA www.maxygen.com USA Francia www.meristem-therapeutics.com Mxico www.nodo5.com.mx/galeria/mexama/ fquienes.html Espaa www.monsanto.es www.nautilusbiotech.com 30

Newbiotics Inc. USA Norbiotech North American Bioindustries Corp. USA Novo Nordisk Dinamarca Perfomance Plants Canada Pharmamar Espaa Pharmagen Espaa Pharmagenesis USA PIC international Group Plant Genetyc Sistems Polar Probical S.A. Protecdr Protein Design Labs Inc. Puleva Biotech Pulsar Quimir Rhom and Haas Ross Breeders SemBioSys Genetics Sistemas Genmicos Sucromiles Tecnocolibri Tepual S.A. Tecnologic Farm S.A. Transgene Tranxenogen Valle Vecol S. A. Vetrepharm Zeltek SRL USA Blgica Venezuela Chile Mxico USA Espaa Mxico Mxico Alemania USA Canada Espaa Colombia Mxico Chile Chile Francia USA Brasil Colombia Canada Argentina

www.newbiotics.com www.norbiotech.cl/norbiotech.html www.northamericanbio.com www.perfomanceplants.com www.pharmamar.es www.pharmagen.es www.portaley.com/biotecnologia/ bio2.shtml www.pic.com www.uni-leipzig.de/sept/facts/pdf/ biotech_chile_spanish.pdf www.uni-leipzig.de/sept/facts/pdf/ biotech_chile_spanish.pdf www.protecdr.com www.biotech.about.com www.pulevabiotech.com www.uni-leipzig.de/sept/facts/pdf/ biotech_chile_spanish.pdf www.quimir.com.mx www.rossbreeders.com www.sembiosys.ca www.sistemasgenomicos.com www.coltejer.com.co/Internet/OAL/ sucromil.htm www.tecnocolibri.com www.uni-leipzig.de/sept/facts/pdf/ biotech_chile_spanish.pdf www.uni-leipzig.de/sept/facts/pdf/ biotech_chile_spanish.pdf www.transgene.fr www.tranxenogen.com/index2.html www.uni-leipzig.de/sept/facts/pdf/ biotech_chile_spanish.pdf www.vetrepharm.com www.uni-leipzig.de/sept/facts/pdf/ biotech_chile_spanish.pdf

31

CAPITULO 2 FUNDAMENTOS DE BIOQUMICA

2.1 BIOELEMENTOS, BIOMOLCULAS Y CLULAS De los ms de 100 elementos qumicos, slo cerca de 29 se hallan en forma natural en los organismos vivos. Los cuatro elementos ms importantes en los organismos vivos son el oxgeno, el carbono, el hidrgeno y el nitrgeno (Tabla 2.1). Estos bioelementos son esenciales en la nutricin de una o ms especies, pero no todos son esenciales para cada especie. Tabla 2.1. Bioelementos Elementos de la materia orgnica: O, C, N, H, P, S. Iones monoatmicos: Na+, K+, Mg+, Ca+, Cl-. Trazas de elementos: Mn, Fe, Co, Cu, Zn, B, Al, V, Mo, I, Si, Sn, Ni, Cr, F, Se, As, Br.

Los bioelementos fueron seleccionados segn su capacidad de realizar ciertas funciones estructurales o de aportar reactividades especficas. Por ejemplo, el carbono forma con facilidad enlaces covalentes muy fuertes, mediante reparto de pares de electrones, con otros tomos de carbono o con otros elementos como nitrgeno, hidrgeno, oxgeno o azufre. Esta caracterstica permite la construccin de largas cadenas de carbono y de anillos con grupos funcionales reactivos que contienen nitrgeno, oxgeno, hidrgeno y azufre, como los que se encuentran en las protenas, cidos nucleicos, lpidos y carbohidratos. (Lehninger, 1995), (Boyer, 2000). Las biomolculas de los organismos se hallan ordenadas en una jerarqua de complejidad creciente (Figura 2.1). Los precursores, de bajo peso molecular, se convierten por la materia viviente, a travs de secuencias de intermediarios metablicos, de tamao molecular creciente, en las biomolculas sillares estructurales, compuestos orgnicos de peso molecular intermedio. Estas unidades estructurales se unen unas a otras, covalentemente, para formar las macromolculas de la clula, que poseen pesos moleculares relativamente elevados. As, los mononucletidos son las unidades estructurales de los cidos nucleicos, los aminocidos lo son de las protenas, los monosacridos lo son de los polisacridos y los cidos grasos lo son de la mayor parte de los lpidos. (Lehninger, 1995).

CLULA ORGNULOS Ncleo Mitocondria Cloroplasto Cuerpos de Golgi Ribosomas Complejos enzimticos Sistemas contrctiles Microtbulos Membranas celulares Cromatina cidos nucleicos Protenas Polisacridos Lpidos Nucletidos Aminocidos Monosacridos cidos grasos Glicerina Piruvato Citrato Malato Gliceraldehdo 3-fosfato Dixido de carbono Agua Amonaco Nitrgeno

ASOCIACIONES SUPRAMOLECULARES

MACROMOLCULAS

UNIDADES ESTRUCTURALES

INTERMEDIARIOS

PRECURSORES

Figura 2.1. Jerarqua de la organizacin molecular en las clulas Macromolculas de diferentes clases se asocian para formar sistemas supramoleculares, como los ribosomas (complejos de ARN y protenas), membranas celulares (complejos de protenas y lpidos), cromatina (complejos de ADN y protenas). Por ejemplo, cada ribosoma de una clula bacteriana contiene 3 molculas distintas de cido ribonucleico y alrededor de 50 molculas diferentes de protena. En los complejos supramoleculares, las macromolculas que lo constituyen, no se hallan ligadas covalentemente unas a otras. Se mantienen unidas por accin de fuerzas no covalentes, relativamente dbiles, tales como los enlaces de hidrgeno, las interacciones hidrofbicas, enlaces inicos y las interacciones de van der Waals. Diversos complejos supramoleculares se ensamblan ulteriormente para 33

constituir orgnulos u organelos, donde los diversos componentes estn asociados mediante interacciones no covalentes. (Lehninger, 1995), (Boyer, 2000). Las molculas tienen la capacidad de reconocer e interaccionar de manera especfica con otras molculas; este fenmeno es comn y se describe con el trmino de reconocimiento molecular. La importancia de estas interacciones en la biologa estriba en que la combinacin de dos molculas o el plegamiento organizado de una sola lleva a una funcin biolgica que no tenan las molculas individuales o aquellas que estaban dispuestas en forma desordenada, no plegada. Todas las interacciones moleculares, base del reconocimiento molecular, comparten tres caractersticas: Las fuerzas de estas interacciones son relativamente dbiles y no covalentes, su magnitud vara entre 1 30 kJ/mol, en contraste con los cerca de 350 kJ/mol de un enlace sencillo de carbono-carbono, un enlace covalente tpico. Muchas veces no basta un solo enlace no covalente para que permanezcan unidas dos molculas. Las molculas de ADN, ARN y protenas, tienen muchos grupos funcionales que participan en interacciones no covalentes, la suma de muchas de estas interacciones, le dar mayor estabilidad a los complejos, bajo condiciones biolgicas. (Boyer, 2000). Las interacciones no covalentes son reversibles y se inician cuando las regiones de una molcula o molculas dispersas por el movimiento trmico entran en estrecho contacto. En el acercamiento inicial no siempre se forma un complejo, pero se pueden formar algunos enlaces dbiles; no obstante el movimiento trmico puede perturbarlos y hacer que las molculas se disocien. En consecuencia, continuamente se forman y se rompen enlaces hasta que se acumulan muchos y se logra un compuesto intermedio que, aunque es transitorio, dura el tiempo suficiente para que pueda iniciar un proceso biolgico especfico. En cierto momento, el movimiento trmico, hace que el complejo se disocie en las molculas individuales. De modo que no se da una situacin esttica o inmvil. Los procesos biolgicos que inicio el complejo deben tener un inicio y un final. La unin entre molculas es especfica. Las dos molculas deben ser compatibles o complementarias qumicamente para que las fuerzas estabilizadoras generadas logren mantener unidas las molculas. Por ejemplo, un donador de puentes de hidrgeno de una superficie debe interactuar con un aceptor de puentes de hidrgeno de la otra; s en una superficie hay una carga positiva, en la otra debe haber una carga negativa para neutralizarla. Se calcula que la bacteria Escherichia coli contiene unas 3 000 clases diferentes de protenas y 1000 tipos distintos de cidos nucleicos (Tabla 2.2). Organismos mayores y ms complejos (animales, plantas superiores), tambin estn constituidos por protenas y cidos nucleicos pero en mayor variedad. En el organismo humano puede haber hasta 5 000 000 de protenas diferentes en comparacin con las 3 000 distintas de la Escherichia coli. Ninguna de las molculas proteicas de la Escherichia coli es idntica a alguna de las protenas encontradas en el hombre, aunque varias acten de un mismo modo. De hecho, cada especie de organismo posee su propio conjunto de molculas proteicas y de cidos nucleicos qumicamente diferentes. 34

Tabla 2.2. Componentes moleculares de una clula de Escherichia coli Componente Porcentaje del peso total No. aproximado de especies moleculares

Agua 70 Protenas 15 3000 cidos nucleicos -ADN 1 1 -ARN 6 1000 Hidratos de carbono 3 50 Lpidos 2 40 Molculas sillares estructurales e intermediarios 2 500 Iones inorgnicos 1 12 _________________________________________________________________________ Los tipos principales de biomolculas ejercen idnticas funciones en todas las especies de clulas. Los cidos nucleicos actan universalmente almacenando y transmitiendo la informacin gentica. Las protenas son los productos directos y los efectores de la accin de los genes. Las protenas son las ms verstiles de todas las biomolculas, debido a que participan en la catlisis de reacciones bioqumicas, el transporte de molculas pequeas a travs de las membranas celulares o desde un sitio del organismo a otro, la proteccin del organismo contra agentes infecciosos, regulan la actividad cataltica, almacenan aminocidos como elementos nutritivos, son elementos esenciales en los sistemas mviles y contrctiles, actan como hormonas, toxinas y elementos estructurales. Los polisacridos pueden servir como elementos estructurales extracelulares o como reserva de combustibles que proporcionan energa para la actividad celular. Los lpidos, a su vez, tambin desempean el mismo papel en todas las clulas, bien como componentes estructurales principales de las membranas o como fuente de combustible rico en energa. En la Escherichia coli las protenas estn constituidas solamente por 20 aminocidos diferentes, los cuales estn ordenados en secuencias distintas, de modo que forman diferentes tipos de protenas. Anlogamente, los cidos nucleicos estn constituidos a partir de slo 5 mononucletidos diferentes. Adems, los 20 aminocidos distintos constituyentes de las protenas y los cinco nucletidos diferentes que integran los cidos nucleicos son idnticos en todas las especies vivientes. De manera semejante, los polisacridos estn integrados solamente por unas pocas molculas de azcares simples. A medida que los organismos vivos han evolucionado hacia formas ms complejas y altamente diferenciadas, se han desarrollado nuevas biomolculas de mayor complejidad y variedad. Entre ellas se encuentran pigmentos, aceites esenciales aromticos, hormonas, antibiticos, alcaloides, lignina, entre otras. Sin embargo, las investigaciones sobre la biognesis de tales sustancias complejas muestran, no obstante, que tambin derivan en ltimo trmino de alguna de las biomolculas primordiales. Por ejemplo, los terpenos (vitaminas, aceites esenciales, 35

pigmentos vegetales, caucho), proceden en ltimo trmino, del cido actico, producto principal de la degradacin de la glucosa y de los cidos grasos. Los aminocidos no slo actan como sillares de construccin de las molculas proteicas, sino tambin como precursores de las hormonas, los alcaloides, las porfirinas, los pigmentos y otras muchas biomolculas. Los mononucletidos no slo constituyen las unidades fundamentales de los cidos nucleicos, sino que actan como coenzimas y molculas transportadoras de energa. Las clulas se clasifican en dos grupos: los procariotas y los eucariotas; los trminos se derivan del griego Karyon que significa nuez, semilla o ncleo, por lo que procariota significa antes del ncleo y eucariota un ncleo bien formado. Los organismos procariticos (unicelulares), aunque son los menos desarrollados, son los ms abundantes y ampliamente distribuidos. Las clulas eucariticas estn representadas por organismos unicelulares o multicelulares. La clase eucariote incluye a las plantas, animales, mohos, protozoarios, levaduras y algunas algas; la cual debe su existencia a una transformacin en virtud de la cual bacterias diminutas y elementales se convirtieron en clulas grandes y dotadas de una organizacin compleja (Duve, 1996). La clula procariota con un tamao entre 1 y 10 m de dimetro, se caracteriza por tener (Pelczar, 1990):

Figura 2.2. Clula procaritica Pared celular. capa protectora resistente constituida por cadenas polisacridas entrecruzadas con cadenas peptdicas cortas. Su superficie exterior esta recubierta con lipopolisacridos. El constituyente principal es el cido murmico un peptidoglucano o mucopptido. La pared celular protege a las bacterias contra el hinchamiento en medios hipotnicos. Es porosa y permite el paso de la mayora de molculas pequeas. Cpsula: algunas clulas procariticas poseen una cpsula o capa mucosa, que consiste 36

en una cubierta mucilaginosa o mucosa en torno a la pared celular rgida, constituida por polisacridos. Membrana celular: debajo de la pared celular se localiza la membrana plasmtica, que delimita el compartimiento celular nico, el citoplasma. La membrana celular contiene aproximadamente 45 % de lpidos y un 55 % de protenas; los lpidos forman una fase no polar continua. La membrana es una zona selectivamente permeable que permite que la atraviesen libremente el agua, ciertos nutrientes e iones metlicos y desechos. Las enzimas responsables de la conversin de la energa de los alimentos en ATP, se hallan localizadas en la membrana. Pili: los pili que no se encuentran en todas las bacterias, son prolongaciones o extensiones de la pared celular. Algunos de los pili son huecos y pueden servir para transferir el ADN durante la conjugacin sexual. Flagelos: son prolongaciones de la pared celular. Los flagelos bacterianos son apndices largos y finos que se encuentran fijos a la clula por uno de sus extremos (anclados a la membrana celular) y libres por el otro extremo. El filamento del flagelo bacteriano est compuesto de subunidades de una protena denominada flagelina. Los flagelos son responsables de la movilidad de algunas bacterias. Mesosomas y discos ticaloides: repliegues o irregularidades de la membrana citoplasmtica hacia el interior de la clula. En algunas especies de bacterias la membrana plasmtica presenta dos tipos de invaginaciones, los discos tilacoides caractersticos de las cianobacterias, que contienen molculas de clorofila en su interior y los mesosomas los cuales pueden tener un rol en la replicacin del ADN. Citoplasma: el interior de la clula o citoplasma es una suspensin heterognea de biomolculas, de consistencia similar al gel, que incluye molculas pequeas, protenas y enzimas solubles, nutrientes y sales inorgnicas, ribosomas y ADN enrollado en la regin nucleoide. El citoplasma es la regin donde se efectan muchas reacciones metablicas. Regin nucleoide: la regin nucleoide contiene cromatina, un complejo de ADN cromosomal e histonas. El material gentico o genoma, es un cromosoma nico, constituido por una molcula de ADN duplo helicoidal, con enrollamiento compacto. El ADN es el portador de la informacin gentica. Durante la divisin cada hebra se replica originando dos molculas hijas duplo-helicoidades. La mayora de estos organismos contiene adems, una molcula de ADN mucho ms pequea en forma de asa cerrada, llamada plsmido. Algunas bacterias poseen uno o varios plsmidos y stos pueden permanecer independientes del genoma principal o recombinarse con l. Ribosomas: complejo de ARN y protena. Son los sitios de sntesis de protenas. Cada clula de Escherichia coli contiene cerca de 15 000 ribosomas; cada uno de ellos posee una subunidad principal y otra menor. Cada subunidad contiene cerca del 65 % de ARN y un 35 % de protena. 37

 Grnulos de reserva o inclusiones: cmulos de materiales de reserva como carbono, nitrgeno, azufre o fsforo. Estos cmulos se forman cuando estos compuestos se encuentran en exceso en el medio ambiente, con el fin de poder ser utilizados en situaciones de carencia. Son depsitos de molculas combustibles para energa del metabolismo. La Escherichis coli y muchas bacterias poseen grnulos de reserva que son polmeros de azcar. Algunas bacterias contienen grnulos de cido poli--hidroxibutrico. Cuando se necesitan combustibles estos polmeros se degradan enzimticamente produciendo glucosa o cido -hidroxibutrico libre. Las complejas clulas eucariticas con dimetros que van de 10 a 100 m, se caracterizan por tener (Pelczar, 1990), (Duve, 1996):

Figura 2.3. Clula eucaritica Membrana celular: esta formada por mucopolisacridos, cidos, glucolpidos y glucoprotenas. El espesor de la membrana plasmtica es de unos 9 nm y contiene aproximadamente las mismas cantidades de lpidos y protenas. Los lpidos van dispuestos en bicapas. Contiene una mayor variedad de lpidos que las membranas bacterianas. Las propiedades adhesivas de las cubiertas celulares son especficas y desempean un papel importante en el reconocimiento clula-clula y, por tanto, en la organizacin del tejido. La membrana plasmtica es selectivamente permeable para la entrada y salida de nutrientes y desechos. Contiene sistemas de transporte activo para Na+ y K+, glucosa, aminocidos y otros nutrientes, as, como cierto nmero de enzimas importantes. Retculo endoplasmtico y ribosomas: el retculo endoplasmtico es un extenso sistema de membranas que se extiende por todo el citoplasma y lo divide en compartimientos y canales. Parte del retculo endoplasmtico rodea el ncleo y forma la membrana nuclear. ste est constituido por vesculas aplanadas de una sola membrana de 38

lpido y protena, cuyos compartimientos internos, llamados cisternas, se interconectan formando canales a travs del citoplasma. Existe retculo endoplasmtico de superficie rugosa, conocido como ergastoplasma, y el de superficie lisa. La superficie rugosa del retculo endoplasmtico esta tachonada con los ribosomas, los cuales son mayores que los que se tienen en las clulas procariotas. Las protenas sintetizadas por los ribosomas adheridos atraviesan la membrana y aparecen en el espacio intercisternal, que forma un canal muy ramificado para el transporte intracelular hacia la periferia de la clula. La sntesis proteica por ribosomas no ligados se produce tambin, igual que en las procariotas. El retculo endoplasmtico sirve de barrera entre los diferentes orgnulos. Ncleo: el ncleo de unos 4-6 nm de dimetro, est rodeado de una envoltura perinuclear. El ADN del interior est combinado con histonas (protenas) formando cromatina y organizado en cromosomas. El nuclolo es rico en ARN. Durante la mitosis los cromosomas experimentan replicacin de su ADN y separacin en cromosomas hijos. Citoplasma: el citoesqueleto consta de protenas, molculas pequeas, protenas solubles, enzimas, nutrientes, sales en solucin acuosa. Los organelos de una clula eucaritica no flotan libremente en el citoplasma. Su ubicacin y su movimiento se encuentran restringidos por el citoesqueleto, o matriz filamentosa tridimensional extendida por todo el interior de la clula. Por lo tanto, el citoesqueleto le confiere forma y movimiento a la clula; adicionalmente gua el movimiento interno de los organelos. Los filamentos del citoesqueleto se forman principalmente de protenas. Los tipos importantes de filamentos son: los microtbulos (dimetro de 22 nm), que constan de tubulina, los microfilamentos (dimetro de 6 nm), constituidos de actina, los filamentos intermedios (dimetro de 7 11 nm). El principal componente proteico de los filamentos intermedios varia segn el tipo de clula (clulas de la piel tienen la queratina). En el citoplasma se llevan a cabo muchas reacciones metablicas. Mitocondrias: son de forma globular y poseen un dimetro a 1 m y ocupan cerca del 20 % del volumen citoplasmtico. Sus membranas externa e interna difieren en composicin lipdica. La matriz es rica en enzimas. Las mitocondrias son la fbrica de energa en la clula, donde los glcidos, los lpidos y los aminocidos se oxidan a CO2 y H2O por el oxgeno molecular, y la energa liberada se transforma en energa del ATP. Las enzimas del transporte electrnico y de la conversin de energa estn localizadas en la membrana interna. Lisosomas: se encuentran en las clulas de animales; son vesculas de membrana sencilla, de 0,25 a 0,5 m de dimetro, que contienen enzimas hidrolticas como ribonucleasa y fosfatasa. Los lisosomas actan en la digestin de materiales introducidos en la clula por fagocitosis o pinocitosis. Sirven tambin para digerir los componentes celulares despus de la muerte de las clulas. Complejo o aparato de Golgi: Consta de vesculas aplanadas de membrana sencilla, a veces apiladas, que por estrangulamiento producen otras menores. Algunas se convierten en vacuolas que concentran productos de secrecin. Constituido de lpidos, protenas y polisacridos. Esta estructura localizada en la regin del retculo endoplasmtico, 39

empaqueta y transporta protenas y polisacridos al exterior de la clula. Tambin colabora a formar la membrana del plasma y las membranas de los lisosomas. Las vesculas transportadoras abundan en las clulas. Algunas transladan protenas sintetizadas en el retculo endoplasmtico hasta el aparato de Golgi, donde sufren ulteriores modificaciones. Otras llevan protenas de un compartimiento a otro dentro del aparato de Golgi. Tres clases de vesculas son expedidas desde este aparato: una exporta protenas, al exterior de la clula (la vescula de almacenamiento) libera su contenido cuando recibe la seal oportuna. Una tercera introduce enzimas digestivas en los lisosomas, cmaras que degradan diversas molculas, incluidas las aportadas a la clula por otras vesculas (Rothman et al., 1996). Microcuerpos: son vesculas con membrana sencilla, de unos 0,5 m de dimetro. Contienen catalasa, D-aminocido-oxidasa, urato-oxidasa y otras enzimas de oxidacin, frecuentemente presentes en ordenacin cristalina. Los microcuerpos participan en la oxidacin de algunos nutrientes. El perxido de hidrgeno, producto de reduccin del oxgeno en estos orgnulos, se descompone y forma agua y oxgeno. En las clulas animales y vegetales, los microcuerpos se conocen como peroxisomas y glioxisomas, respectivamente. Pared celular: algunas clulas eucariticas poseen un recubrimiento externo de la membrana citoplasmtica. Su estructura consta de dos tipos principales de componentes: una red de microfibrillas que dan rigidez a la pared celular y una sustancia en la que estn incorporadas las microfibrillas. La composicin de estas materias vara con el tipo de organismo. La pared celular vegetal esta constituida por fibrillas de celulosa unidas por un cemento formado por polisacridos y protenas. Los protozoos no tienen paredes celulares, pero tienen un material que los cubre, denominado pelcula. Plastos o plastidios: corpsculos diminutos en el citoplasma de la clula vegetal, rodeados de membrana; algunos de los cuales poseen un ADN caracterstico. Los que almacenan almidn, aceite o protenas, se conocen como leucoplastos. Los que contienen clorofila se llaman cloroplastos. Los cloroplastos son de tamao relativamente grande comparado con las mitocondrias. Puede haber uno, varios o muchos cloroplastos por clula, segn las especies, y tener formas diversas. Los cloroplastos son los receptores de la energa luminosa, que convierten en energa qumica del ATP para la biosntesis de la glucosa y otras biomolculas orgnicas a partir de dixido de carbono, agua y otros precursores. El oxgeno se genera en las plantas durante la fotosntesis. Los cloroplastos son la principal fuente de energa. Vacuola: es un espacio limitado por una membrana dentro del citoplasma, que contiene soluciones diluidas de varias sustancias (azcares disueltos, sales de cidos orgnicos, protenas, sales minerales, pigmentos, oxgeno y dixido de carbono). Las vacuolas son caractersticas de las clulas vegetales; son pequeas en las clulas jvenes y aumentan mucho de tamao con la edad, lo que provoca que el citoplasma se comprima contra la pared celular.

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Los virus (Figura 2.4) son otro ejemplo de ensamblados supramoleculares. Bioqumicamente, muchos virus consisten en una sola molcula de ADN o ARN enrollado en un paquete de protenas. Los virus no pueden existir de manera independiente y por lo general no se les considera como una forma de vida, sino como parsitos, porque no tienen la capacidad de llevar a cabo el metabolismo o la reproduccin sin la ayuda de una clula husped. Cuando los virus infectan una clula, toman el control de su maquinaria metablica y la obligan a sintetizar cidos nucleicos y protenas para nuevas partculas virales.

Figura 2.4. Diagramas de tres tipos de virus: (a) virus de la influenza, (b) virus del mosaico del tabaco y (c) bacterifago 2.2 LAS BIOMOLCULAS EN EL AGUA El agua es la sustancia ms abundante en los seres vivos. Se encuentra tanto en las clulas como en el espacio intracelular. Asimismo, es el medio de transporte de nutrientes, hormonas y metabolitos, y participa en la catlisis enzimtica y en los procesos relacionados con la transferencia de energa qumica. El agua tiene muchas funciones en la clula y ejerce una gran influencia en la estructura y el comportamiento de todas las biomolculas. Proporciona el medio para las reacciones metablicas y, como solvente biolgico regula las condiciones ptimas de pH y temperatura para las clulas y el medio extracelular. En virtud de su elevada capacidad calorfica especfica, el agua funciona como amortiguador de la temperatura, al absorber, mucha de la energa, en forma de calor, 41

generada por las reacciones bioqumicas. El agua es una molcula dipolar, no lineal, puede formar grandes redes de puentes de hidrgeno, sea consigo misma o con otras molculas polares. En teora, cada molcula de agua puede formar puentes de hidrgeno con cuatro molculas de agua vecinas, que se alcanzan en los cristales de hielo; en estado lquido forma cuando menos tres puentes de hidrgeno, disminuyendo este nmero con el aumento de la temperatura. El trmino puente de hidrgeno se refiere a la interaccin de un tomo de hidrgeno, unido en forma covalente a un tomo electronegativo con los electrones de un segundo tomo electronegativo al que no est directamente unido en forma covalente. Los puentes de hidrgeno originan la estructura abierta (huecos) del hielo, que permite una densidad menor que la del agua lquida a 4 0C, razn por la que el hielo flota. La presencia de los puentes de hidrgeno se hace evidente en las propiedades del agua lquida, como altos puntos de fusin, de ebullicin y calor de vaporizacin en comparacin con otros lquidos. En los materiales biolgicos (protenas, cidos nucleicos), los dos tomos que ms comnmente participan en los enlaces de hidrgeno son el nitrgeno y el oxgeno (O H O, O - H N, N H O y N - H N). Los grupos funcionales que participan en la formacin de puentes de hidrgeno son tan diversos, como: grupos hidroxilo de alcoholes, cidos orgnicos y carbohidratos; grupos carbonilo de aldehdos, cetonas, cidos, amidas y steres y grupos N-H de amidas y aminas. Los puentes de hidrgeno se forman y se rompen mucho ms rpidamente en los sistemas acuosos que la mayor parte de enlaces covalentes. El puente de hidrgeno en agua lquida tiene una energa de enlace de slo casi 20 kJ/mol, la cual es muy pequea en comparacin con la del enlace covalente de O-H de 460 kJ/mol. (Hicks, 2001). El agua disuelve muchos tipos de biomolculas, incluidas las que son inicas, polares o neutras (no tienen carga). Las propiedades disolventes del agua derivan de su polaridad y de los enlaces hidrgeno. Muchas biomolculas sin carga se disuelven fcilmente en agua porque tienen grupos funcionales polares que forman interacciones dipolo-dipolo favorables (alcoholes, aminas, amidas, steres). En soluciones acuosas, las sustancias inicas y polares se rodean de molculas de agua y, por consecuencia, se atena el poder electrosttico de las primeras, al interaccionar con los puentes de hidrgeno y el tomo de oxgeno del agua. Se pueden formar extensas redes de puentes de hidrgeno cuando los tomos de grupos funcionales polares se combinan con molculas idnticas, semejantes y/o agua. (Boyer, 2000). Las molculas inicas y polares son hidroflicas y forman interacciones favorables con el agua. Los compuestos no polares son en esencia insolubles en agua; sin embargo, las molculas anfipticas, poseen un extremo hidroflico (polar) y uno hidrfobo (no polar), pueden formar micelas y bicapas (agregados moleculares), en los que su extremo polar se orienta hacia el agua; y el no polar hacia los extremos de similar caracterstica, dirigindose hacia el interior de la estructura conformada. Las asociaciones de regiones no polares de las molculas se conocen como interacciones hidrofbicas. Muchas biomolculas son anfipticas, como las protenas, ciertas vitaminas, pigmentos esteroles y fosfolpidos. 42

El agua tiende tambin a oponerse a la atraccin electrosttica entre los iones positivos y negativos. Por su constante dielctrica tan alta, el agua es el solvente ideal para mantener separados diversos iones en solucin. (Hicks, 2001). De todas las propiedades fisicoqumicas del agua, la tendencia ionizarse es de crucial importancia en la estructura y funcin de las biomolculas; por esto, se revisa el tpico de ionizacin en trminos de constante de equilibrio y pH. Un cido de Brnsted es una sustancia que puede donar protones y una base, aceptarlos. Al donar el cido un protn se considera como una base conjugada. El agua puede reaccionar como un cido cuando dona un protn para formar un oxidrilo (OH-), o como una base al aceptar un protn para generar un hidronio (H3O+, que se abrevia con H+). La potencia de un cido se indica por la magnitud de su constante de disociacin, K. La fuerza de un cido se define por su pK (pK = -log K). Los cidos dbiles tienen una constante de disociacin menor que el hidronio y se encuentran parcialmente disociados en solucin acuosa. La relacin entre pH, pK y las concentraciones de los miembros de sus cidos conjugados con su base correspondiente se expresa mediante la ecuacin de Henderson-Hasselbalch: pH = pK + log [A-]/[HA] El pK de un cido equivale al pH cuando son iguales las concentraciones del cido y de su base conjugada. Los valores de pK de los cidos se pueden determinar de manera experimental siguiendo un procedimiento de titulacin. La proporcin de las concentraciones de base conjugada y cido vara con el pH. Por ejemplo, una solucin de cido lctico a 25 0C (K = 1,38 x 10-4) y un pH de 5,0 contiene un 93 % de lactato y un 7 % de cido lctico; por el contrario, una solucin de cido lctico a la misma temperatura y un pH de 4,03 consta de 60 % de lactato y 40 % de cido lctico (Boyer, 2000), (Hicks, 2001). Muchos cidos y bases de importancia biolgica tienen dos o ms grupos ionizables (politrpicos) y consecuentemente, las curvas de titulacin son ms complejas que las de los cidos que solo tienen un grupo ionizable (monotrpicos). En la curva de titulacin del cido fosfrico (H3PO4), presente en los fluidos celulares de todos los organismos, se diferencian tres regiones (Figura 2.5), las cuales corresponden a las disociaciones de las especies: H3PO4, H2PO4- y HPO4-2, cuyos valores de pK a 25 0C son 2,12, 7,21 y 12,67, respectivamente. Por clculos con la ecuacin de Henderson-Hasselbalch se puede demostrar que a pH 7,0, la especie de fosfato mayoritaria es la H2PO4- (Hicks, 2001). Un amortiguador cido-bsico es la mezcla de un cido dbil y su base conjugada en una solucin con un pH cercano al pK de este cido. Los amortiguadores son eficaces slo en el pH dentro del intervalo pK 1; siendo mxima cuando el pH es igual al pK. Fuera de este intervalo, el pH de la solucin cambia rpidamente por la adicin de cidos o bases fuertes. Las reacciones metablicas generan altas concentraciones de cidos orgnicos que podran cambiar el pH de muchos fluidos sino existieran los agentes amortiguadores. La capacidad de una disolucin para minimizar los cambios de pH producidos por la adicin de un cido o de una base se llama capacidad de amortiguacin. Los fluidos intracelulares y extracelulares poseen esta capacidad y permiten mantener el pH constante; mediante sistemas amortiguadores naturales. Ejemplos de sistemas amortiguadores importantes son el cido carbnico-bicarbonato, H2CO3 HCO3-, (pH 5,4 7,4) y 43

dihidrgeno fosfato-momohidrgeno fosfato, H2PO4- - HPO4-2 (pH 6,2 8,2). La molcula del agua y sus productos de ionizacin (H+ y OH-) influyen de manera definitiva en la forma de ensamble y en las propiedades de los componentes celulares, incluyendo enzimas, cidos nucleicos, protenas, lpidos y carbohidratos (Boyer, 2000).

Figura 2.5. Titulacin de una disolucin de cido fosfrico 0,1 M con hidrxido potsico 0,1 M a 25 0C

2.3 CARBOHIDRATOS Los carbohidratos pueden definirse como polihidroxialdehdos o polihidroxicetonas y sus derivados. Actualmente se conoce, que algunos carbohidratos contienen nitrgeno y azufre; adems, de carbono, hidrgeno y oxgeno. Los carbohidratos desempean diversas funciones biolgicas: Se utilizan en el metabolismo energtico. Algunos desempean un papel estructural en las paredes de clulas de bacterias, hongos filamentosos y plantas. La ribosa y desoxirribosa desempean un papel estructural en el ARN y ADN. Se combinan con las protenas y lpidos en las superficies celulares: all instalados, influyen en las comunicaciones intercelulares, el funcionamiento del sistema inmunitario, la capacidad patognica de agentes infecciosos y la metstasis. Contribuyen a la identificacin celular y al control del trfico de las clulas mviles por todo el organismo (Maeder, 2002).

Los carbohidratos constituyen las tres cuartas partes del mundo biolgico y alrededor del 80 % del aporte calrico de la humanidad. Son los principales componentes de casi todas las plantas, comprenden del 60 - 90 % de su peso seco. Tambin se encuentran en los tejidos de los animales. Los vegetales sintetizan sus propios carbohidratos a partir del dixido de carbono y del agua por la fotosntesis. Los vegetales utilizan los carbohidratos como fuente de energa, as como tejido de sostn. La mayora de los microorganismos utilizan los carbohidratos como fuente de carbono y de energa. 44

2.3.1 Clasificacin de los carbohidratos. Pueden clasificarse en tres grupos principales: monosacridos, oligosacridos y polisacridos. 2.3.1.1 Monosacridos. Estn constituidos por una sola unidad de polihidroxialdehdo o polihidroxicetona. Son los que por hidrlisis no pueden fragmentarse en molculas ms pequeas. Pueden subdividirse en triosas, tetrosas, pentosas, hexosas, heptosas u octosas, segn el nmero de tomos de carbono que posean y en aldosas y cetosas, segn contengan el grupo aldehdico o el cetnico. Los monosacridos se presentan en la naturaleza slo en pequeas cantidades. Ms que como azcares libres, estn presentes siempre como unidades de los polisacridos. Un pequeo porcentaje existe en forma de disacrido, y una cantidad todava menor formando parte de otros oligosacridos. 2.3.1.2 Oligosacridos. Son los compuestos que por hidrlisis dan de dos a diez molculas de monosacridos. En su mayor parte los monosacridos y los oligosacridos son compuestos slidos, cristalinos, blancos, solubles en agua pero insolubles en los disolventes no polares, con frecuencia de sabor dulce. (Lehninger, 1995). 2.3.1.3 Polisacridos. Son aquellos carbohidratos, que dan al ser hidrolizados ms de diez molculas de monosacridos. Son cadenas muy largas o polmeros de los monosacridos, que pueden exhibir una estructura lineal o ramificada. Si el polmero est construido con unidades de un mismo monosacrido, se le denomina homopolisacrido. Si est constituido por diferentes monosacridos, se le conoce como heteropolisacrido. Por lo general, los polisacridos son compuestos inspidos, amorfos, insolubles y de peso molecular elevado. Tienen funciones de almacenaje y estructurales. Algunos existen en la naturaleza como mezclas; por ejemplo, casi todos los almidones son una mezcla de glucanos lineal y ramificado, denominados respectivamente amilosa y amilopectina. La pectina comercial es tambin una mezcla de una gran parte de galacturonano con pequea cantidad de arabano y galactano. (Fenema, 1993). 2.3.2 Isomerismo. El estudio de los carbohidratos requiere entender el isomerismo o isomera, especficamente el estereoisomerismo La isomera se puede dividir en isomera estructural y en estereoisomera (Conn et al., 1996). 2.3.2.1 Ismeros estructurales. Tienen la misma frmula molecular pero diferentes estructuras. Los ismeros estructurales pueden ser de tres tipos: Ismeros de cadena. carbono. Los cuales muestran diferente posicin de sus tomos de

H H H H HCCCCH H H H H n-butano 45

H H H HCC C H H CH3 H iso-butano

Ismeros de posicin. Tienen la misma cadena pero difieren en la posicin del grupo sustituyente. H H H H H H H C C C Cl HCC C H H H H H Cl H n-cloruro de propilo cloruro de isopropilo Ismeros de grupo funcional. Los compuestos tienen diferentes grupos funcionales. H3C - CH2 - CH2OH n-propanol H3C - CH2 - O - CH3 ter metiletlico

2.3.2.2 Estereoismeros. Tienen la misma frmula molecular y la misma estructura, pero difieren en su configuracin; esto es, en la disposicin de sus tomos en el espacio. Se divide en dos grupos: Ismeros geomtricos. Son compuestos que poseen diferentes configuraciones debido a la presencia de una estructura rgida en la molcula. Para la misma frmula molecular slo hay dos ismeros geomtricos (cis - trans). En general, la isomera geomtrica est presente en los alquenos cuando cada carbono de un doble enlace tiene dos sustituyentes distintos. Cuando dos sustituyentes idnticos (o casi idnticos) se encuentran en el mismo lado del doble enlace, el compuesto es el ismero cis; el ismero trans es aquel en el que se hallan grupos semejantes en lados opuestos del doble enlace. Cl Cl Cl H

C = C H H cis-1,2-dicloroeteno

C = C H Cl trans-1,2- dicloroeteno

Ismeros pticos. Hacen girar el plano de la luz polarizada cuando sta incide sobre las molculas en solucin (actividad ptica). Este es el tipo de isomerismo que se encuentra comnmente en los carbohidratos; se observa por lo general, cuando una molcula contiene uno o ms tomos de carbono quirales (del griego kheir = mano) o asimtricos. Se tiene un centro quiral (o un tomo de carbono quiral) cuando cuatro grupos distintos estn unidos al carbono. Estos grupos pueden disponerse en el espacio de dos maneras diferentes, de modo que se forman dos compuestos distintos. Tal diferencia consiste en que no pueden sobreponerse entre s. Los ismeros pticos cuyas imgenes especulares no se superponen reciben el nombre de enantimeros. Los enantimeros poseen propiedades fsicas y qumicas idnticas, hacen girar la luz polarizada en un plano en un mismo nmero de grados, pero en direcciones opuestas; en el sentido de las manecillas del reloj, dextrgiro y en sentido opuesto, levgiro. Las dos formas del cido lctico existen en la naturaleza. Una forma aislada del tejido muscular, es idntica en todos los aspectos a la otra forma que se asla de la levadura, 46

pero la primera es dextrgira (rotacin especfica de +2,3 0) y la ltima es levgira (rotacin especfica de 2,3 0). No todos los compuestos que poseen un centro quiral son quirales, ni exhiben actividad ptica. Por otra parte, una molcula puede poseer quiralidad, exhibir actividad ptica y carecer de un centro quiral. Un mtodo conveniente para dibujar el enantimero de un compuesto pticamente activo es el de mantener la posicin de dos sustituyentes (de ordinario los ms grandes) alrededor del centro asimtrico e invertir la posicin de los otros dos. Resulta imposible decir que ismero es dextrgiro y cul levgiro, por simple observacin de la frmula estructural. La distincin slo puede hacerse midiendo la rotacin de cada compuesto en un polarmetro. Las molculas que poseen dos o ms carbonos asimtricos pueden existir en ms de dos formas estereoismeras. La regla de vant Hoff permite predecir el nmero total de posibles ismeros pticos para una molcula con ms de un carbono asimtrico. El nmero mximo de configuraciones diferentes es 2n, donde n es el nmero de carbonos asimtricos. Ejemplo: COOH COOH COOH COOH H C OH HO C H H C OH HO C H HO C H H C OH H C OH HO C H COOH COOH COOH COOH I II III IV Las estructuras I y II , III y IV representan pares de enantimeros, puestos que sus imgenes especulares no se superponen. Esto no resulta vlido para las estructuras I y III, II y III o II y IV. Todos se consideran ismeros pticos (ismeros porque tienen la misma frmula molecular, pticos porque hacen girar el plano de la luz polarizada), pero no son imgenes especulares. Estos pares de ismeros pticos son diaestereoismeros. Los diaestereoismeros son ismeros pticos cuyas imgenes especulares no se corresponden entre s. Los diaestereoismeros no poseen propiedades fsicas idnticas ni hacen girar la luz polarizada en un plano en la misma magnitud. Pueden exhibir el mismo tipo de propiedades qumicas, pero la velocidad con que reaccionen puede ser distinta. Se ha convenido en que si dos ismeros pticos no son enantimeros, son diastereoismeros. Cualquier par de azcares que difieran slo en la configuracin alrededor de un slo tomo de carbono asimtrico, se denominan epmeros. Las estructuras I y III, I y IV, II y III, II y IV son ejemplos de epmeros. Una mezcla que contenga cantidades iguales de los ismeros dextrgiro y levgiro ser pticamente inactiva, ya que la rotacin que causen las molculas de una forma ser cancelada por la rotacin que origina las molculas de la otra forma. Una mezcla que contenga cantidades iguales de un par de enantimeros recibe el nombre de mezcla racmica o racemato, se simboliza mediante la notacin (dl) o (). El monosacrido ms sencillo que posee un tomo de carbono asimtrico, la triosa glicerosa o gliceraldehdo, se ha seleccionado como compuesto de referencia o patrn. Como presenta un centro quiral puede existir en dos formas pticamente activas. El D y L, 47

se debe a que el grupo hidroxilo del carbono quiral aparece a la derecha o a la izquierda, respectivamente (cuando se escribe de manera que el grupo aldehdo quede en la parte superior). El (+) y el (-), significa que el enantimero es dextrgiro o levgiro, respectivamente. CHO H C OH CH2OH D-(+)-gliceraldehdo CHO HO C H CH2OH L(-)-gliceraldehdo

Desde el punto de vista de sus caractersticas e independientemente de sus propiedades fsicas, los carbohidratos pueden existir en dos formas isomricas denominadas D y L, por analoga con la estructura del gliceraldehdo. En los carbohidratos de ms de tres tomos de carbono, la posicin del oxhidrilo unido al carbono adyacente al alcohol primario, es la determina si la molcula es D o L. En la naturaleza se encuentran L-azcares pero no son tan abundantes como los D-azcares. Entre los ms importantes se encuentran la L-fucosa, L-ramnosa y L-sorbosa. Mediante sntesis de la cianhidrina (sntesis de Kiliani-Fischer) se puede aumentar la longitud de la cadena de una aldosa en un tomo de carbono, formndose dos nuevas aldosas (Conn y col., 1996). En las Figuras 2.6 y 2.7, se presentan las relaciones estructurales entre las D-aldosas y entre las D-cetosas, respectivamente. 2.3.3 Estructura cclica de los carbohidratos. En las Figuras 2.6 y 2.7 se presentan las estructuras de los carbohidratos como cadenas lineales. Esta forma de representacin es adecuada para algunos carbohidratos; sin embargo, las aldosas con cinco o ms tomos de carbono se encuentran la mayor parte del tiempo en solucin, formando estructuras cclicas. El anillo se forma por la reaccin del aldehdo en un extremo de la molcula con un grupo hidroxilo del otro extremo. A continuacin se muestra la reaccin entre un aldehdo y un grupo hidroxilo en la que se forma un hemiacetal: O R C H Aldehdo + ROH OH R C OR H Hemiacetal

Alcohol

Esta reaccin qumica se aplica a una D-ribosa de cadena lineal como se muestra en la Figura 2.8 (a), de la cual resulta una estructura hemiacetal cclica. El anillo de cinco miembros se denomina furanosa, porque se asemeja al anillo heterocclico furano (Figura 8 (b). La misma reaccin aplicada a la D-glucosa forma un anillo de seis miembros denominado piranosa por que es semejante al pirano (Figura 2.9). Las aldohexosas pueden existir en forma de aldofuranosas; sin embargo, puesto que el anillo de aldopiranosa es ms estable que el anillo de furanosa, aquel predomina en las disoluciones de aldohexosas. 48

Figura 2.6.

Familia de las D-aldosas con tres a seis tomos de carbono, vistas con sus frmulas estructurales de cadena abierta. 49

Figura 2.7. Familia de las D-cetosas con tres a seis carbonos, vistas con sus formas estructurales de cadena abierta 50

Figura 2.8. Ciclacin de la cadena abierta de la D-ribosa para formar una mezcla de dos hemiacetales cclicos, la -D-ribofuranosa y la -D-ribofuranosa. Las cetosas con un nmero de carbonos mayor de cuatro pueden reaccionar en forma similar: O OH R C R + ROH R C OR OR Acetona Alcohol Hemicetal Cuando se cierra el anillo para cada monosacrido, el carbono del carbonilo precedente (aldehdo o cetona) se convierte en un centro quiral; por consiguiente, son posibles dos molculas estereoismeras.. Estos ismeros son diastereoismeros, ms bien que enantimeros, puesto que slo difieren en la configuracin alrededor del carbono hemiacetlico o hemicetlico (C1 en las aldosas y C2 en las cetosas). Ms especficamente, estas formas se conocen con el nombre de anmeros, porque nicamente exhiben la mencionada diferenciacin. Se sugiri denominar anmero al que tiene el hidroxilo 51

Figura 2.9. Ciclacin de la cadena abierta de la D-glucosa para formar una mezcla de dos hemiacetales cclicos, la -D-glucopiranosa y la -D-glucopiranosa anomrico representado debajo del plano del anillo y anmero al que tiene el hidroxilo anomrico por arriba del plano del anillo (Figura 2.10). 2.3.4 Monosacridos y derivados derivados importantes, estn: importantes. Dentro de los monosacridos y sus

D-gliceraldehdo dihidroxiacetona. Son compuestos que se encuentran en las clulas clulas vegetales y animales y desempean un papel importante en el metabolismo de los carbohidratos. 52

Figura 2.10. Ciclacin de la cadena abierta de D-fructosa para formar una mezcla de dos hemiacetales cclicos, la -Dfructofuranosa y -D-fructofuranosa

CHO H C OH CH2OH D-gliceraldehdo

CH2OH C=O CH2OH Dihidroxiacetona

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 D-eritrosa. Es importante en el metabolismo de fotosntesis. CHO H C OH H C OH CH2OH D-eritrosa

los carbohidratos durante la

D- ribosa y la D-desoxirribosa. Se encuentran comnmente en la naturaleza. En la forma cclica, poseen la estructura furanosa. Ambos azcares se encuentran en la forma furanosa en los cidos nucleicos de todas las clulas vivas. Los ismeros y pueden existir en solucin, pero el ismero es el nico que se encuentra en los cidos nucleicos. La D-ribosa tambin es un intermediario en la ruta metablica de los carbohidratos y un compuesto de algunas coenzimas (ATP, NAD, NADP). CHO CHO H C OH HCH H C OH H C OH H C OH H C OH CH2OH CH2OH D(-)-ribosa D(-)-2-desoxirribosa

D(-)-ribosa

D(-)-2-desoxirribosa

D-xilulosa y D-ribulosa. Son importantes en el metabolismo de los carbohidratos durante la fotosntesis. Las formas metablicamente activas son los steres de fosfato en los que el grupo alcohol primario se esterifica con H3PO4, lo que evita su participacin en una estructura anular. La L-xilulosa es un intermediario en la va del cido urnico. CH2OH C=O HO C H H C OH CH2OH D-xilulosa 54 CH2OH C=O H C OH H C OH CH2OH D-ribulosa

 Glucosa. Es el azcar ms abundante en la naturaleza. La D-glucosa es el combustible principal para la mayor parte de los organismos y es tambin la unidad estructural bsica de los polisacridos ms abundantes, tales como el almidn y la celulosa. Se encuentra comnmente en frutas, en especial en uvas maduras. Se obtiene por hidrlisis del almidn, el azcar de caa, la maltosa y la lactosa, entre otros. Tambin se le conoce como dextrosa, nombre que se le da por el hecho de que la forma predominante del azcar es dextrgira. La mayora de los carbohidratos que asimila el cuerpo humano, al final se convierte en glucosa mediante una serie de rutas metablicas. La glucosa es el azcar circulante de los humanos y animales; la sangre contiene aproximadamente 0,08 % de glucosa y la orina normal puede contener, en todos los casos, desde trazas hasta 0,2 % de glucosa. Comercialmente, la glucosa se obtiene por hidrlisis del almidn. En Estados Unidos, se emplea almidn de maz en el proceso; en Europa, el almidn se obtiene de las patatas. El poder edulcorante de la glucosa es 25 % menor que el del azcar de mesa (sacarosa), pero tiene el mismo valor calrico. Galactosa. Se forma por hidrlisis de la lactosa, un disacrido constituido por una unidad de glucosa y una de galactosa. No se encuentra en la naturaleza en estado libre. La galactosa que requiere el cuerpo humano para la sntesis de la lactosa (en las glndulas mamarias) se forma por conversin de la D-glucosa en D-galactosa. Adems, la galactosa es un componente importante en los glucolpidos, que se encuentran en el cerebro y en la cubierta de mielina de los nervios. Es un constituyente de las glucoprotenas. Fructosa. Es la nica cetohexosa que se encuentra en la naturaleza, y se halla, predominantemente en forma de furanosa (como en la sacarosa y en la inulina). Este azcar tambin recibe el nombre de levulosa debido a su gran rotacin ptica levgira. Es el azcar ms dulce y se encuentra junto con la glucosa y la sacarosa, en frutas dulces y en la miel de abejas (40 %); manzana (6 %); uva (8 %). Se obtiene por hidrlisis del azcar de caa y de la inulina. Es ms dulce que la glucosa. L-ramnosa y L-fucosa. Son dos desoxiazcares que se encuentran en la naturaleza como componentes de las paredes celulares de las clulas bacterianas y del glucocliz de clulas procariticas. CHO H C OH H C OH HO C H HO C H CH3 L-ramnosa CHO HO C H H C OH H C OH HO C H CH3 L fucosa 55

 D-glucosamina y D-galactosamina. Son dos aminoazcares. La D-glucosamina se encuentra en muchos polisacridos de los tejidos de los vertebrados y es tambin componente principal de la quitina, polisacrido estructural que se encuentra en los insectos, hongos filamentosos y crustceos. La D-galactosamina es, a su vez, el componente de los glucolpidos y del polisacrido principal de los cartlagos (sulfato de condrotina). Ambas se encuentran en las glucoprotenas.

CHO H C NH2 HO C H H C OH H C OH CH2OH D-glucosamina

CHO H C NH2 HO C H HO C H H C OH CH2OH D-galactosamina

cido N-acetilmurmico y cido N-acetilneuramnico. Estos dos derivados de los azucares son importantes sillares de la construccin de los polisacridos estructurales; se encuentran en las paredes celulares de las bacterias y en las cubiertas celulares de las clulas de los animales superiores, respectivamente (Lehninger, 1995).

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 Fosfatos de azcares. Los fosfatos de monosacridos se encuentran en todas las clulas vivas, en las que actan como importantes intermediarios en el metabolismo de los glcidos o azcares.

D-sedoheptulosa: es importante durante la fotosntesis CH2OH C=O HO C H H C OH H C OH H C OH CH2OH D-sedoheptulosa

2.3.5 Propiedades de los monosacridos. 2.3.5.1 Mutarrotacin. Cuando la D-glucosa se disuelve en agua o en una solucin alcohlica al 70 % y se deja cristalizar (por evaporacin del disolvente o enfriando la solucin), se obtiene una forma designada como -D-glucosa. Si la glucosa se obtiene por cristalizacin de cido actico o piridina, se forma la -D-glucosa. Estas dos formas muestran el fenmeno de mutarrotacin, cambio gradual de la rotacin ptica con el tiempo hasta que se establece el equilibrio. Una solucin acuosa reciente de -Dglucosa tiene una rotacin especfica []20D = + 112,2 0 ; cuando la solucin se deja en reposo cambia a + 53 0. En cambio, una solucin reciente de -D-glucosa tiene un []20D de + 18,7 0, pero dejndola en reposo cambia y llega a + 52,7 0. Este valor no es el 57

promedio de las rotaciones de la y -glucosas. En lugar de una mezcla 50-50 de las dos formas, la condicin de equilibrio debe ser tal que predomine uno de los dos ismeros. Los porcentajes de y -glucosa en una mezcla en equilibrio puede calcularse mediante ecuaciones simultneas: 18,7 x + 112,2 y = 52,7 x+ y=1 x = fraccin del ismero y = fraccin del ismero

Obtenindose un 36,4 % del ismero y un 63,6 % del ismero La mutarrotacin es un fenmeno comn a todos los monosacridos (y para algunos disacridos) que pueden existir en las estructuras cclicas y . Existen suficientes evidencias para suponer que todos los monosacridos que experimentan mutarrotacin, pasan por la forma de cadena abierta. En consecuencia una traza de esta forma se encuentra presente en la mezcla de equilibrio (menos de 0,1 %). En la Tabla 2.3, se proporcionan los valores de rotacin especfica de los azcares ms comunes. Tabla 2.3. Rotaciones especficas de algunos mono y disacridos _________________________________________________________________________ Rotacin especfica (0) _____________________________________________ Azcar Mezcla en equilibrio _________________________________________________________________________ D-glucosa +112,2 +18,7 +52,7 D-fructosa -21 -133 -92 D-galactosa +151 -53 +84 D-manosa +30 -17 +14 D-lactosa +90 +35 +55 D-maltosa +168 +112 +136 _________________________________________________________________________

2.3.5.2 Enolizacin (transformacin de Lobry de Bruyn von Ekenstein). Las bases acuosas diluidas, a temperatura ambiente, inducen reordenaciones en torno al tomo de carbono anomrico y su carbono adyacente, sin afectar a los sustituyentes presentes en los dems tomos de carbono. Por ejemplo, el tratamiento de la D-glucosa con lcali diluido, rinde una mezcla de equilibrio de D-glucosa, D-fructosa y D-manosa. Cualquiera de estos azcares tratados con un lcali diluido produce as mismo una mezcla de glucosa y los otros dos monosacridos. Esta reaccin tiene lugar con la intervencin de formas enlicas, llamadas enodioles. A temperaturas altas o a concentraciones de lcali elevadas, los monosacridos se tornan inestables y se oxidan, se degradan y se polimerizan. La isomerizacin qumica de la 58

maltosa, en presencia de catalizadores bsicos (reaccin de Lobry de Bruyn), produce la maltulosa (edulcorante) (Garca et al., 1993).

2.3.5.3 Deshidratacin. Generalmente los monosacridos son estables en un medio de cido mineral diluido, aun cuando se los caliente. Sin embargo, cuando las aldohexosas se calientan con cidos de minerales fuertes, se deshidratan y se transforman en hidroximetil furfural. En iguales condiciones, las pentosas producen furfural. Los furfurales se condensan con los fenoles, tales como el -naftol u orcinol, para formar productos coloreados caractersticos, empleados frecuentemente para el anlisis colorimtrico de los azcares, mediante pruebas como la de Molisch o del Orcinol de Bial.

2.3.5.4 Oxidacinreduccin (azcares reductores) Los carbohidratos se pueden clasificar como azcares reductores o no reductores. Los azcares reductores, que son los ms comunes, actan como agentes de este tipo debido a que en su molcula estn presentes radicales aldehdicos o cetnicos, ya sean libres o potencialmente libres como en las formas hemiacetlicas cclicas. Las propiedades reductoras se ponen de manifiesto 59

mediante su capacidad para reducir iones metlicos, de preferencia cobre y plata, en solucin alcalina. La oxidacin de carbohidratos tambin puede ser enzimtica (Figura 2.11). La solucin de Benedict es un reactivo comn en la deteccin de los azcares reductores; en ella el Cu+2 se mantiene en solucin como un complejo de citrato alcalino. Cuando el Cu+2 se reduce, el in Cu+ resultante tiene carcter insoluble, y el Cu2O precipita de la solucin alcalina como un slido de color amarillo o rojo. El azcar reductor por su parte, se oxida. Con el reactivo de Tollens se forma un espejo de plata. En la reaccin de oxidacin de la glucosa catalizada por la enzima deshidrogenasa auxiliada por la coenzima NADP+, la glucosa acta como agente reductor y la coenzima como agente oxidante. El producto oxidado de la glucosa es una lactona. Consultar el mtodo del cido 3,5 dinitrosaliclico (DNS) para la determinacin de azcares reductores.

Figura 2.11. Reacciones de oxidacin de carbohidratos (a) Oxidacin del gliceraldehdo por el reactivo de Tollens. (b) Oxidacin de la terrosa por el in cprico. (c) Oxidacin de la glucosa catalizada por la enzima deshidrogenasa NADP+

2.3.5.5 Reduccin de monosacridos. Las funciones aldehdicas o 60

cetnicas de los

monosacridos se pueden reducir qumicamente (con H2 o NaBH4) o con enzimas, dando lugar a los alcoholes de azcar correspondientes. As, la D-glucosa, D-manosa, D-xilosa y el D-gliceraldehdo se reducen a D-sorbitol, D-manitol, D-xilitol y glicerina, respectivamente. CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH H C OH HO C H H C OH H C OH HO C H HO C H HO C H CH2OH H C OH H C OH H C OH H C OH H C OH CH2OH CH2OH CH2OH D-sorbitol D-manitol D-xilitol Glicerina El D-sorbitol se encuentra en las bayas de muchas plantas superiores, especialmente Rosaceae. Es un slido cristalino a temperatura ambiente, pero de bajo punto de fusin. El D-manitol existe en las algas y en los hongos. Ambos compuestos son solubles en agua y tienen un sabor dulce. Los polialcoholes o azcares-alcoholes son utilizados como agentes endulzantes por su poder edulcorante, reduccin calrica y/o no cariogenicidad. La glicerina es un importante componente de algunos lpidos. El mio-inositol es un derivado del inositol, es importante porque se encuentra en el lpido fosfatidil-inositol sino tambin en el cido ftico. La sal de calcio y de magnesio del cido ftico se conoce como fitina y abunda en el material extracelular de sostn en los tejidos de las plantas superiores. Tabla 2.4. Poder edulcorante de algunos polialcoholes comparados con l de la Sacarosa* _________________________________________________________________________ Polialcohol Poder edulcorante _________________________________________________________________________ Xilitol 90 Sorbitol 63 Galactitol 58 Maltitol 90 Isomaltitol 90 Manitol 50 Lactitol 35 Sacarosa 100 _________________________________________________________________________ *(Garca et al., 1993). 2.3.5.6 Oxidacin de azcares. El grupo aldehdico de las aldohexosas se oxida con 61

facilidad al cido carboxlico correspondiente. Esto sucede con un pH neutro y empleando agentes oxidantes suaves (hipoyodito de sodio) o bien enzimas. El cido monocarboxlico

que se produce se conoce con el nombre de cido aldnico (es decir, cido glucnico a partir de la glucosa). En presencia de un agente oxidante poderoso, del tipo del HNO3, se oxidan tanto el grupo aldehdico como la funcin alcohlica primaria, hasta constituir el cido dicarboxlico, o aldrico, correspondiente (es decir, cido glucrico). Uno de los productos de oxidacin ms importantes de los monosacridos es el cido monocarboxlico, el cual se obtiene de la oxidacin exclusiva de la funcin alcohlica primaria. Esta reaccin por lo general se lleva a cabo por medio de enzimas especficas. El producto es un cido urnico (es decir, cido glucurnico) Tales cidos son componentes de muchos polisacridos y son importantes biolgicamente.

Los cidos aldnicos y urnicos presentan una gran tendencia a establecer un ster interno y formar lactonas de cinco y seis miembros. El cido ascrbico (vitamina C) es una lactona (Hicks, 1999).

2.3.5.7 Formacin de glucsidos. Una de las ms importantes propiedades de los monosacridos es su habilidad para formar glucsidos o acetales.. ROH + ROH R-O-R (ter)

Cuando el grupo hidroxlico de una segunda molcula de azcar reacciona con el hidroxilo hemiacetlico (o hemicetlico) de otro monosacrido, en un medio cido moderado, anhidro, el glucsido resultante es un disacrido. El enlace entre los dos azcares se conoce como enlace glucosdico. Los polisacridos se forman por la unin de un gran 62

nmero de unidades de monosacridos, a travs de enlaces glucosdicos. El enlace glucosdico es estable frente a las bases, pero se hidroliza por ebullicin con cido, rindiendo el monosacrido y el alcohol libres. Los glucosidos son tambin hidrolizados por las enzimas llamadas glucosidasas (carbohidrasas), las cuales difieren en su especificidad, segn el tipo de enlace glucosdico ( o ) y la estructura del monosacrido y del alcohol componentes. (Lehninger, 1995). 2.3.5.8 Metilacin de monosacridos. El grupo hidroxlico anomrico de los azcares puede metilarse con facilidad, en presencia de cidos dbiles; sin embargo, la metilacin de las funciones hidroxlicas restantes requiere agentes metilantes mucho ms fuertes (yoduro de metilo o sulfato de dimetilo, en presencia de xido de plata), para producir el derivado pentametilado. Estos compuestos son muy tiles en la determinacin de la estructura anular (Conn et al., 1996). La metilacin de todos los grupos hidroxilo libres de un carbohidrato se llama metilacin exhaustiva; se emplea corrientemente para establecer las posiciones de los sustituyentes. (Lehninger, 1995). Ya que la formacin del metilglicsido convierte el grupo aldehdico en uno acetlico, el glucsido no es ms un azcar reductor, ni tampoco exhibe el fenmeno de la mutarrotacin. 2.3.5.9 Acetilacin de monosacridos. Los grupos hidroxilo libres de los monosacridos y de los disacridos pueden acilarse originando O-acil derivados, los cuales son tiles en la determinacin de estructuras. Cuando un -D-glucopiransido se trata con anhdrido actico, todas las funciones hidroxlicas se acetilan, obtenindose la penta-O-acetil--Dglucosa. Los steres resultantes pueden hidrolizarse de nuevo. Los steres de fosfato constituyen un tipo importante de los derivados de los carbohidratos, pues actan en el metabolismo intermediario. Con frecuencia estos compuestos se forman por la reaccin entre el carbohidrato y la adenosina trifosfato (ATP), en presencia de la enzima apropiada. Un ejemplo de ellos es la fructosa-1,6-difosfrico.

2.3.5.10 Formacin de N-glucosilaminas. Las aldosas y las cetosas reaccionan con las aminas en un disolvente apropiado formando N-glucosilaminas. En los nucletidos y en los cidos nucleicos, los tomos de nitrgeno de las bases purnicas y pirimidnicas forman enlaces N-glucosilamina con el C1 de la D-ribosa o de la 2-desoxi-D-ribosa.

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2.3.5.11 Formacin de osazonas. Los monosacridos en disolucin ligeramente cida a 100 0C reaccionan con un exceso de fenilhidracina y forman fenilosazonas, que son insolubles en agua y cristalizan con facilidad. Las osazonas se emplean para identificar a los azcares.

Fenilosazona de la D-glucosa

2.3.6 Oligosacridos. Los oligosacridos que ms existen en la naturaleza son los disacridos (que por hidrlisis rinden 2 moles de monosacridos). Entre los oligosacridos se encuentran: Maltosa. No se encuentra apreciablemente en estado libre en la naturaleza. Este azcar se obtiene como intermediario en la hidrlisis del almidn por las enzimas conocidas como amilasas. Es muy abundante en los granos en germinacin donde se forma por fragmentacin enzimtica (diastasa) del almidn. En la elaboracin de cerveza, se libera maltosa por la accin de la malta (cebada germinada) sobre el almidn. El hidroxilo anomrico libre le confiere la propiedad de la mutarrotacin y el disacrido es un azcar reductor. La hidrlisis cida o enzimtica de la maltosa, produce dos molculas de glucosa. Las molculas de glucosa estn unidas por un enlace glucosdico -1,4. La estructura de la maltosa se determina por medio del anlisis de los dos productos que se obtienen con la hidrlisis cida de su derivado octametlico. (Conn et al., 1996). 64

 Celobiosa. Es un estereoismero de la maltosa. Es un disacrido que se forma durante la hidrlisis parcial de la celulosa. Se compone de dos unidades de glucosa, unidas por un enlace glucosdico -1,4. Es un azcar reductor y experimenta mutarrotacin. Pasa a Dglucosa mediante la enzima emulsina. El tratamiento de este azcar con sulfato de dimetilo produce un azcar octametilado y la hidrlisis cida produce los mismos productos que se obtienen de la octametil maltosa (Conn et al., 1996).

Isomaltosa. Proveniente de la hidrlisis de ciertos polisacridos, es tambin similar a la maltosa, pero su enlace glucosdico es -1,6. Se puede obtener de la amilopectina. La metilacin exhaustiva seguida de hidrlisis cida produce 2,3,4,6-tetra-O-metil-D-glucosa y 2,3,4-tri-O-metil-D-glucosa (Conn et al., 1996)

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 Trealosa. Contiene dos molculas de D-glucosa, unidas mediante un enlace -1,1; constituyndose en un disacrido no reductor, en el que los tomos de carbono anomricos se hayan unidos. Se encuentra en los hongos filamentosos y levaduras. Es el principal azcar de la hemolinfa de los insectos. Lactosa. Es un disacrido que se encuentra en la leche (5%). Al hidrolizarla se obtiene un mol de D-galactosa y otro de D-glucosa. Presenta enlace -1,4. Es un azcar reductor y puede sufrir mutarrotacin. Comercialmente, se obtiene como subproducto en la elaboracin de quesos. Es uno de los azcares de ms bajo poder edulcorante. La forma del azcar es de importancia comercial como alimento para infantes y en la produccin de penicilina. La lactosa como tal no puede ser absorbida y es necesario hidrolizarla hasta sus monosacridos por la accin de la lactasa; enzima que es abundante en los lactantes pero tiende a desaparecer con la edad.

Sacarosa. Es el azcar comercial. Se encuentra ampliamente distribuida entre las plantas superiores. Mediante hidrlisis cida o enzimtica (invertasa) produce un mol de D-glucosa y otro de D-fructosa. Presenta un enlace -1,2. Las principales fuentes comerciales son el azcar de caa y de remolacha. Los jugos de la caa de azcar y de remolacha contienen del 14 al 20 % de azcar. Una mezcla de D-glucosa y D-fructosa, recibe el nombre de azcar invertido. No es un azcar reductor. La hidrlisis cida del derivado octametlico de la sacarosa produce 2,3,4,6-tetra-O-metil-D-glucosa y 1,3,4,6tetra-O-metil-D-fructosa. Es un producto importante de la fotosntesis de las plantas. La reaccin de inversin tiene varias aplicaciones prcticas. Como la sacarosa slo existe en una configuracin molecular, es uno de loa azcares que cristaliza con ms facilidad. El azcar invertido tiene una mayor tendencia a permanecer en solucin. La cristalizacin del azcar resulta inadecuada en jaleas y caramelos; as como en el enlatado de fruta; por lo tanto, en tales procesos se emplean condiciones que permitan la hidrlisis de la sacarosa. Adems, la fructosa es ms dulce que la sacarosa. 66

 Rafinosa. Es un trisacrido que se encuentra libre en la naturaleza. Esta constituido por una molcula de D-galactosa unida mediante un enlace -1,6 a una molcula de D-glucosa y esta ltima ligada mediante un enlace -1,2 a una molcula de fructosa. Se encuentra en abundancia en la remolacha azucarera y otras mechas plantas superiores. 2.3.7 Polisacridos. Los polisacridos que existen en la naturaleza pueden tener funciones estructurales o bien ser formas de reserva de energa. Todos los polisacridos pueden hidrolizarse por la accin de los cidos o por la de las enzimas, para dar lugar a monosacridos y a los derivados de ellos. Bioqumicamente, los tres polisacridos ms importantes son: el almidn, el glicgeno y la celulosa. Reciben el nombre de homopolmeros porque cada uno de ellos produce un slo tipo de monosacridos, por hidrlisis total. Los heteropolmeros pueden contener cidos sacridos, aminoazcares y otras sustancias que no son carbohidratos. Los polisacridos son carbohidratos no reductores, sin sabor dulce y no experimentan mutarrotacin. 2.3.7.1 Polisacridos de reserva. Estos polisacridos se encuentran almacenados en las clulas dentro de paquetes citoplasmticos, denominados grnulos. Por la gran cantidad que tienen de grupos hidroxilo, los polisacridos tienen asociada mucho agua a travs de enlaces de hidrgeno. Cuando hay exceso de glucosa, unidades de sta se unen enzimticamente a los extremos de las cadenas de glucgeno o de almidn; si existe necesidad metablica, entonces se liberan de nuevo, tambin por accin enzimtica y son empleadas como combustible. Entre los polisacridos de reserva se tienen: Almidn. Es el polisacrido de reserva de las plantas superiores, consta de la amilosa y la amilopectina. El almidn natural se compone aproximadamente del 10 al 20 % de amilosa y del 80 al 90 % de amilopectina. La amilosa consta de unidades de D-glucosa, unidas en forma lineal por enlaces -1,4. presenta una terminal reductora y otra no-reductora. La amilosa no es verdaderamente soluble en el agua pero forma micelas hidratadas que dan un color azul caracterstico con el yodo. En tales micelas la cadena polisacrida adopta una conformacin helicoidal (hlice enrollada). 67

La amilopectina es un polisacrido de cadena ramificada que se compone de unidades de glucosa, unidas principalmente, por enlaces glucosdicos -1,4, pero ocasionalmente tienen enlaces glucosdicos -1,6, a los cuales se deben las ramificaciones. Se ha estimado un nmero de 1000 unidades glucosa en la amilopectina y una ramificacin aproximadamente cada 20 o 30 unidades. Su estructura ramificada da lugar a que cada molcula de amilopectina tenga un extremo reductor y varios no reductores. La amilopectina produce disoluciones coloidales o micelares que dan una coloracin rojo violcea cuando se trata con yodo.

La hidrlisis completa del almidn (amilosa y amilopectina) produce en tres etapas sucesivas: dextrinas, maltosa y glucosa. La -amilasa hidroliza la cadena lineal al atacar los enlaces 1,4 al azar, producindose una mezcla de maltosa y de glucosa. La amilasa ataca la terminal no reductora y produce unidades de maltosa en forma sucesiva. La amilopectina tambin puede ser atacada por la y la -amilasa; pero stas no pueden hidrolizar los enlaces glucosdicos -1,4 que se encuentran cerca de un punto de ramificacin, ni los enlaces -1,6. La accin combinada de la -amilasa y -1,6 glucosidasa, produce una mezcla de glucosa y maltosa. Glucgeno. Es el polisacrido de reserva de los tejidos de los animales. Su estructura 68

es similar a la amilopectina, pero ms profusamente ramificado que sta. Sus puntos de ramificacin ocurren aproximadamente cada 8 - 10 unidades de glucosa. El glucgeno se hidroliza por la accin de la y amilasa para producir glucosa, maltosa y una dextrina lmite. Se encuentra en el hgado (10 %) y en el msculo esqueltico (1 2 %) Inulina. Es un carbohidrato de reserva que se encuentra en tubrculos y races de las dalias, alcachofas y diente de len. Consta de unidades de fructofuranosa unidas entre s por enlaces glucosdicos -2,1. Dextrinas. Polisacridos de D-glucosa, de tamao intermedio. Las y amilasas no pueden hidrolizar los enlaces -1,6 de los puntos de ramificacin de la amilopectina; por consiguiente, el producto final despus de la accin exhaustiva de stas sobre la amilopectina es un ncleo, grande y muy ramificado, llamado dextrina lmite (representa el lmite del ataque de las amilasas). Como las dextrinas son ms digestibles que el almidn se utilizan ampliamente en la preparacin comercial de alimentos para infantes. Dextrano. Se encuentra en las levaduras y bacterias. Se compone de residuos de glucosa formando una cadena principal mediante enlaces glucosdicos -1,6, con ramificaciones ocasionales formadas por enlaces glucosdicos -1,2, -1,3 y -1,4. Los dextranos forman disoluciones mucilaginosas de elevada viscosidad. Las bacterias que se desarrollan en los dientes, producen dextrano extracelular que se acumula y se convierte en un componente importante de la placa dental (Boyer, 2000) (Lehninger, 1995). Mananos. Son homopolisacridos de manosa hallados en las bacterias, las levaduras, los mohos y las plantas superiores. Xilanos y arabinanos. Son homopolisacridos presentes en los tejidos vegetales.

2.3.7.2 Polisacridos estructurales. Son sintetizados dentro de la clula y posteriormente expulsados fuera de ella para proveerla de una pared protectora o de una cubierta lubricante (Boyer, 2000). Muchos polisacridos sirven esencialmente de elementos estructurales en las paredes y en las cubiertas de las clulas, en los espacios intercelulares y el tejido conjuntivo, en donde dan forma y confieren elasticidad o rigidez a los tejidos animales y vegetales, as como proteccin y soporte a los organismos unicelulares. Las paredes y cubiertas celulares son importantes, no solamente para el mantenimiento de la estructura de los tejidos, sino porque contienen tambin centros especficos de reconocimiento clulaclula, elementos de proteccin (anticuerpos), entre otros. (Lehninger,1995). Celulosa. Es el principal componente estructural de la madera y de las plantas fibrosas. Es el polisacrido natural ms abundante de la naturaleza, constituyendo ms del 50 % de la materia orgnica de la biosfera. Es un homopolisacrido lineal compuesto de unidades de D-glucosa ligadas entre s por enlaces 1,4. Las cadenas extendidas de celulosa se pueden asociar en haces de cadenas paralelas denominadas fibrillas. Estas redes fuertes y rgidas, que proporcionan el andamiaje para las paredes celulares vegetales, se mantienen unidas mediante puentes de hidrgeno intra e intermoleculares. Aunque la celulosa posee elevada afinidad por el agua, es completamente insoluble en ella. Se ha 69

calculado que el peso molecular mnimo de la celulosa de diversa procedencia vara de 50 000 a 2 500 000, que es el equivalente de 300 a 15 000 restos de glucosa. Los enlaces -1,4 de la celulosa son altamente resistentes a la hidrlisis cida; es necesario emplear un cido mineral fuerte para producir D-glucosa. Una hidrlisis parcial da lugar al disacrido reductor celobiosa. Las enzimas que se requieren para hidrolizar la celulosa se conocen como celulasas. Los caracoles, los hongos filamentosos y algunas bacterias que producen la putrefaccin de la madera, secretan celulasas. El hombre y los animales no secretan estas enzimas a excepcin de los rumiantes (ganado vacuno, ovejas, cabras, camellos y jirafas).

Hemicelulosa. Polisacrido de las pentosas, sobre todo D-xilanos, los cuales son polmeros de la D-xilosa con enlaces -1,4, que poseen cadenas laterales de arabinosa y otros azcares (manosa, galactosa). Esta presente en las clulas vegetales. Pectina. Es otro componente polisacrido importante de las paredes de las clulas vegetales. Constituido por cido D-galacturnico, arabinosa y galactosa. Se emplea para gelatinizar las mermeladas y jaleas. cido pctico. Es un homopolmero del ster metlico del cido D-galacturnico.

cido hialurnico, Pertenece a los mucopolisacridos que proveen a las clulas de una cubierta viscosa y delgada, de consistencia gelatinosa. Es un heteropolisacrido compuesto de unidades alternadas de cido D-glucurnico y N-acetil-glucosamina. Estos dos diferentes monosacridos se unen mediante enlaces -1,3 para constituir un disacrido que, a su vez se liga, por medio de un enlace -1,4, a la siguiente unidad que se repite. Se 70

encuentra en la cubierta celular de las clulas animales y bacterianas. Adems, en el humor vtreo de los ojos y en el cordn umbilical.

Quitina. Es un polisacrido estructural que constituye el caparazn de los crustceos (cangrejos, langostas) y la epidermis de los insectos. Este polmero tambin se encuentra en menor proporcin en las paredes celulares de las levaduras, hongos filamentosos y algas. Es un homopolmero, no ramificado, constituido por la N-acetil -D-glucosamina (derivado de la D-glucosa), que se une mediante enlaces glucosdicos -1,4. Al igual que la celulosa, la quitina se encuentra en forma de cadenas extendidas que estn asociadas en fibras por medio de puentes de hidrgeno intra e intermolecular (Ruiz-Herrera, 1993).

Condroitina, Pertenece a los mucopilisacridos cidos. Componente secundario del material extracelular. Tiene una estructura similar a la del cido hialurnico, pero el aminoazcar es la N-acetil-galactosamina. Sus derivados del cido sulfrico, el 4-sulfato de condroitina (condroitina A) y el 6-sulfato de condroitina (condroitina C), son componentes estructurales principales de las cubiertas celulares, del cartlago, de los huesos, de la crnea y de otras estructuras del tejido conjuntivo en los vertebrados.

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 Pptidoglucano (Muropptido). Es un heteropolimero lineal de cido N-acetilmurmico (NAMA) y N-acetil-D-glucosamina (NAG) alternados. Las unidades monomricas estn ligadas en un esqueleto extendido por medio de enlaces glucosdico -1,4. La resistencia y rigidez de las paredes celulares bacterianas se debe a una red de pptidos entrecruzados entre las hebras de los polisacridos lineales. La composicin y secuencia de aminocidos de los pptidos enlazantes vara entre cada tipo de bacteria. El cido N-acetil-murmico tiene su grupo hidrxilico del C3 asociado por una unin ter a la funcin -hidroxlica del cido lctico. A su vez, el grupo carboxlico del cido lctico se encuentra enlazado a cadenas laterales tetrapeptdicas, cada una de las cuales contiene Lalanina, D-alanina, cido D-glutmico o D-glutamina, meso-diaminopimlico, L-lisina, Lhidroxilisina u ornitina, segn la especie bacteriana que se trate. La estructura del peptidoglucano de la pared celular bacteriana, es resistente a la accin de las enzimas que hidrolizan los pptidos, las cuales no atacan a los pptidos que contienen D-aminocidos. Sin embargo, la enzima lisozima provoca la lisis de muchas bacterias, al hidrolizar los enlaces glucosdicos -1,4.

Glucoprotenas. Las protenas que llevan unidades de carbohidratos unidos por 72

enlaces covalentes se denominan glucoprotenas. La porcin de carbohidrato de una glucoprotena a menudo constituye del 1 al 30 % de su peso total, aunque algunas de stas pueden contener hasta un 50 % o 60 % de carbohidrato. Los monosacridos ms comunes que se encuentran en las glucoprotenas son: glucosa, manosa, galactosa, arabinosa, fucosa, N-acetilglucosamina, N-acetilgalactosamina y cido silico (N-acetilneuramnico). Los azcares se unen con las protenas a travs de dos tipos principales de enlaces: enlaces Oglucosdicos que utilizan los grupos hidroxilo de los residuos de serina o treonina o hidroxilisina de las protenas para reaccionar con los carbohidratos y enlaces Nglucosdicos que usan el nitrgeno amida de la cadena lateral del residuo de aminocido asparagina para unir los carbohidratos (Boyer, 2000). Ejemplo de las glucoprotenas es la extensina, la cual esta constituida por hidroxiprolina, arabinosa y galactosa; se halla unida covalentemente a las fibrillas de celulosa. Las glucoprotenas estn implicadas en muchas funciones biolgicas, entre las que figuran: la proteccin inmunitaria, el reconocimiento celular, la coagulacin sangunea y las interacciones patgeno husped (Boyer, 2000), (Maeder, 2002). 2.3.8 Paredes celulares de las plantas. Puesto que las clulas vegetales deben ser capaces de soportar las grandes diferencias de presin osmtica entre los compartimientos fluidos extra e intracelulares, necesitan paredes celulares rgidas que impidan su hinchamiento. En las plantas grandes y en los rboles, las paredes celulares no solamente deben aportar su fuerza fsica o rigidez a los tejidos de los tallos, de las hojas y de las races, sino que adems deben ser capaces de soportar grandes pesos. En las paredes celulares de las plantas, las fibrillas de celulosa, muy densamente empaquetadas y dispuestas en haces paralelos rodean a la clula frecuentemente, formando capas cruzadas. Estas fibrillas se hallan aglutinadas por una matriz de otros tres materiales polimricos: la hemicelulosa, la pectina y la extensina (glucoprotena). La madera contiene otra sustancia polimrica, la lignina, que constituye casi el 25 % de su peso seco; es un polmero de alcoholes aromticos. Otros polisacridos que desempean el papel de la estructura y de la pared celular de las plantas son: el agar de las algas marinas, que contiene restos de D y L galactosa, algunos esterificados con cido sulfrico; el cido algnico de las algas, que contiene unidades de D-manurnico y la goma arbiga, goma vegetal que contiene restos de D-galactosa, arabinosa, ramnosa y cido D-glucurnico. 2.3.9 Paredes celulares bacterianas. Las paredes celulares de las bacterias son rgidas y porosas proporcionando proteccin fsica a la clula. Debido a que las bacterias tienen una presin osmtica interna muy alta y se encuentran frecuentemente expuestas a condiciones ambientales externas completamente variables, e incluso a veces, a un entorno hipotnico, por fuerza han de poseer una pared celular rgida para impedir el hinchamiento y ruptura de la membrana celular. Las bacterias han sido divididas en organismos Gram-positivos y Gram-negativos, de acuerdo con la reaccin a la tincin diferencial de Gram. Las bacterias Gram-positivas contienen en su pared celular menos lpidos que las bacterias Gram-negativas. La pared celular en ambos tipos de bacterias est constituida por cadenas paralelas de peptidoglucano o murena unidas covalentemente de manera cruzada con cadenas 73

peptdicas. El resto de D-Alanina terminal de la cadena lateral de una cadena polisacrida se une covalentemente con la cadena peptdica lateral de una cadena polisacrida adyacente, bien directamente, como en la Escherichia coli, o a travs de un pptido de conexin corto, por ejemplo la pentaglicina en el Staphylococcus aureus. Los productos de la accin de la enzima lisozima (presente en las secreciones lagrimales y nasales, saliva, sudor y en la clara de huevo), son la N-acetil-D-glucosamina y el cido Nacetilmurmico, a los que todava se hallan unidas las cadenas laterales peptdicas. Despus de la hidrlisis, la clula se hincha con ruptura de la membrana y prdida del contenido celular. Sin embargo, cuando las bacterias Gram-positivas son tratadas con lisozima en presencia de concentraciones elevadas de sacarosa 0,8 M, soluto no permeable, la clula queda protegida del hinchamiento osmtico despus de la eliminacin de la pared. La clula bacteriana desnuda, rodeada solamente por su membrana recibe el nombre de protoplasto. stos son muy frgiles y permanecen intactos slo mientras el medio es isotnico, para impedir el hinchamiento y la ruptura subsiguiente de la membrana. (Lehninger, 1995). Adems, del entramado del peptidoglucano, las paredes celulares bacterianas contienen cierto nmero de polmeros accesorios que ascienden casi al 50 % de la pared. stos componentes difieren de una especie a otra. Existen tres tipos de polmeros accesorios: los cidos teicoicos, los polisacridos y los polipptidos o protenas. Los cidos teicoicos (Figura 2.12), que constituyen entre el 20 y el 40 % del peso seco de la pared celular de las bacterias Gram-positivas, son cadenas polimricas de molculas de glicerina o de ribitol unidas entre s por puentes fosfodister.

Figura 2.12. Segmentos de un cido teicoico que contiene restos alternativos de D-alanina y de N-acetilglucosamina 74

En un tipo de cido teicoico los grupos hidroxilo libres alternativos del esqueleto de fosfato de glicerilo se hallan ocupados por D-alanina y por restos de D-glucosa o N-acetil-Dglucosamina. Los polisacridos accesorios contienen ramnosa, glucosa, galactosa o manosa (o sus aminas). Segn las especies pueden ser mucilaginosos o bien formar cpsulas resistentes y duras. Las paredes de las clulas Gram-negativas son mucho ms complejas que las de las clulas Gram-positivas, sus componentes accesorios estn constituidos por polipptidos, lipoprotenas y un lipopolisacrido. Este ltimo est constituido por un esqueleto trisacrido, unidad que se repite y que esta constituida por dos heptosas y cido octulosnico (azcar-cido de ocho carbonos). A este esqueleto se hallan unidas cadenas laterales oligosacardicas y el cido graso -hidroximiristico.

2.4 LPIDOS Los lpidos se caracterizan por su escasa solubilidad en el agua y considerable solubilidad en disolventes orgnicos no polares (cloroformo, tetracloruro de carbono, ter, benceno), propiedades fsicas que reflejan la naturaleza hidrfoba de sus estructuras. Los lpidos desempean diversas funciones biolgicas importantes, actuando como: Componentes estructurales de las membranas. Formas de transporte y almacenamiento del combustible catablico. Cubierta protectora sobre la superficie de muchos organismos. Componentes de la superficie celular relacionados con el reconocimiento de las clulas, la especificidad de especie y la inmunidad de los tejidos. Aislamiento para los rganos vitales, protegindolos de los golpes y manteniendo la temperatura ptima del cuerpo.

2.4.1 Clasificacin de los lpidos. A diferencia de los polisacridos y protenas, los lpidos no son polmeros (no poseen una unidad monomrica repetitiva). Sin embargo, al igual que los carbohidratos pueden clasificarse con base a sus productos de hidrlisis y segn su semejanza en cuanto a estructura molecular, en: 2.4.1.1 Lpidos complejos: que se caracterizan porque contienen cidos grasos y por lo tanto son saponificables, es decir, producen jabones por hidrlisis alcalina.. A esta clasificacin pertenecen: Acilglicridos: producen por hidrlisis cidos grasos y glicerol. Ceras: producen por hidrlisis cidos grasos y alcoholes no polares de cadena larga. Fosfolpidos: producen por hidrlisis cidos grasos, glicerol, cido fosfrico y un alcohol nitrogenado. Glucolpidos: producen por hidrlisis cidos grasos, esfingosina o glicerol y un carbohidrato. Esfingolpidos: producen por hidrlisis cidos grasos, esfingosina, cido fosfrico y un compuesto alcohlico. 75

2.4.1.2 Lpidos sencillos: no contienen cidos grasos y por lo tanto, no son saponificables. Se forman a partir de una unidad simple que se repite: la unidad isoprenoide. Esta unidad por condensaciones, crece hasta formar compuestos tales como el hule, los carotenoides, los esteroides y muchos terpenos ms simples. 2.4.2 cidos grasos. Los cidos grasos se encuentran en cantidades muy grandes como componentes fundamentales de los lpidos saponificables, en las clulas y en los tejidos; en estado libre aparecen solamente en trazas. Todos ellos contienen un grupo funcional carboxilo (COOH, polar, corresponde al C1) enlazado con una cadena aliftica lineal (no polar). El nmero de tomos de carbono en los cidos grasos puede ir desde 4 (mantequilla) hasta 36 (los que se encuentran en el cerebro), aunque la mayora de los cidos grasos que se encuentran en la naturaleza contienen entre 12 y 24 tomos de carbono, predominan los que contienen 16 y 18. Como los cidos grasos son sintetizados por la combinacin de unidades de dos tomos de carbono del cido actico (CH3COOH), casi todos tienen un nmero par de tomos de carbono. Los cidos grasos con un nmero impar aparecen slo en cantidades mnimas en los animales terrestres, pero en muchos organismos marinos se presentan en cantidades importantes (Lehninger, 1995). La cadena hidrocarbonada, que por lo general carece de ramificaciones, puede estar unida exclusivamente por enlaces sencillos carbonocarbono (saturados) o tener uno o ms dobles enlaces carbono-carbono (insaturados). En los cidos monoinsaturados (monoenoicos), el doble enlace se presenta casi siempre entre los carbonos 9 y 10. En la mayora de los cidos grasos poliinsaturados (polienoicos), los dobles enlaces adicionales al que se encuentra entre los carbonos 9 y 10, estn situados, generalmente, entre el doble enlace 9 y 10 y el extremo metilo (terminal de la cadena). En la mayor parte de cidos poliinsaturados los dobles enlaces mltiples no estn conjugados (-CH2-CH=CH-CH=CHCH=CH-CH2-) sino que estn separados por un grupo metileno (-CH2-CH=CH-CH2CH=CH-CH2-). El sistema de enlaces conjugados es mucho ms reactivo. Los cidos grasos que presentan dobles enlaces conjugados experimentan una gran polimerizacin (pinturas). Tanto el retinol como los carotenos, son ejemplos de sistemas conjugados importantes en las biomolculas (Conn et al., 1996). Los cidos grasos insaturados predominan sobre los saturados, especialmente en las plantas superiores y en los animales que viven a temperaturas bajas. Los cidos grasos de origen animal tienen una estructura bastante simple, es decir, estas molculas son de cadena recta (principalmente de 16 a 22 carbonos) y pueden tener de 0 a 6 dobles enlaces. Los cidos grasos bacterianos, un poco ms variados, pueden ser saturados (C12-C18), monoinsaturados (C16-C18), de cadena ramificada o pueden tener incluso un anillo de ciclopropano (en el cido lactobaclico). Los cidos grasos de origen vegetal son considerablemente ms variados y tienen enlaces acetilnicos, grupos epoxi, hidroxi y ceto o bien anillos de ciclopropeno y ciclopenteno (Conn et al., 1996), (Hicks, 2001). Los mamferos pueden sintetizar cidos grasos saturados y monoinsaturados a partir de otros precursores pero son incapaces de fabricar cido linoleico y -linolnico (cidos grasos esenciales). Estos cidos grasos tienen que obtenerse de fuentes vegetales, donde son muy abundantes. El cido linoleico es un precursor necesario en los mamferos, para la biosntesis del cido araquidnico, que no se encuentra en las plantas. 76

Las propiedades fsicas de los cidos grasos y de los compuestos que los contienen dependen de la longitud y grado de instauracin de la cadena de hidrocarburos: Los cidos grasos son solubles en solventes orgnicos como alcoholes, hexano y ter dietlico. La solubilidad en agua disminuye con el incremento de la cadena. A una cadena larga y pocos enlaces dobles corresponde una baja solubilidad en agua. El punto de fusin baja con la introduccin de dobles enlaces. Los cidos grasos saturados poseen puntos de fusin ms altos que los insaturados de igual longitud de cadena. Todos los cidos grasos saturados de menos de diez carbonos son lquidos oleosos a temperatura ambiente. A 25 0C, los cidos grasos saturados de 12:0 a 24:0 tienen una consistencia cerosa; mientras que los insaturados con una longitud de cadena similar son aceites lquidos. Cuanto mayor sea el grado de insaturacin de un cido graso, menor ser su punto de fusin Los cidos grasos saturados tienen una gran capacidad de rotacin entre cada enlace carbono-carbono, lo cual confiere a estas molculas una gran flexibilidad. Estas molculas pueden empaquetarse juntas, con estrechez, casi como un arreglo cristalino, con los tomos a todo lo largo de la cadena estableciendo un contacto de van der Waals con las molculas vecinas. En los cidos grasos insaturados, los dobles enlaces en la posicin cis, obligan a que la cadena de hidrocarburos no mantenga la estructura totalmente extendida y se doble en cada enlace insaturado que posea. Estos cidos no pueden empacarse de manera similar a los saturados. Los cidos grasos son molculas anfipticas, debido a que estn formadas por un componente hidrfobo (cadena hidrocarbonada) y un componente hidroflico (grupo carboxlico). En ellos el componente hidrfobo interacciona uno con otro y el componente hidrfilo interacciona con el ambiente acuoso circundante. Una consecuencia de esta propiedad de los cidos grasos, es la de asociarse en una forma definida, formando micelas.

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Tabla 2.5. Estructura de cidos grasos comunes * _________________________________________________________________________ Nombre comn Estructura Smbolo Temperatura abreviado de fusin (0C) cido actico CH3COOH 2:0 - 22 3:0 - 16 cido propinico CH3CH2COOH cido butrico CH3(CH2)2COOH 4:0 - 7,9 6:0 - 3,4 cido caproico CH3(CH2)4COOH cido decanoico CH3(CH2)8COOH 10:0 32 12:0 44 cido larico CH3(CH2)10COOH 14:0 54 cido mirstico CH3(CH2)12COOH cido palmtico CH3(CH2)14COOH 16:0 63 cido esterico CH3(CH2)16COOH 18:0 70 20:0 75 cido araqudico CH3(CH2)18COOH cido behnico CH3(CH2)20COOH 22:0 80 24:0 84 cido lignocrico CH3(CH2)22COOH cido palmitolico CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7COOH 16:1(9) - 0,5 cido oleico CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH 18:1(9) 13 cido cis-vaccnico CH3(CH2)5CH=CH(CH2)9COOH 18:1(11) 44 cido linoleico CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH 18:2(9,12) -5 (CH2)7COOH cido -linolnico CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH= 18:3(9,12,15) -10 CH(CH2)7COOH cido araquidnico CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CHCH2CH= 20:4(5,8,11,14) -50 CHCH2CH=CH(CH2)3COOH c. -elaeosterico CH3(CH2)3CH=CHCH=CHCH=CH 18:3(9,11t,13t) -10 (CH2)7COOH cido tarrico CH3(CH2)10CC(CH2)4COOH 18:1(6) 51 cido isnico CH2=CH(CH2)4CC-CC(CH2)7COOH 18:1(17) 39 CH2 cido lactobaclico cido vernlico CH3(CH2)5CH - CH(CH2)9COOH CH3(CH2)4CH - CHCH2CH=CH(CH2)7COOH 16:1(9 t) 18:1(9 t) 28

O A. trans-hexadecenoico CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7COOH cido eladico CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH OH

Cerebrnico CH3(CH2)21CHCOOH *(Lehninger, 1995), (Conn et al., 1996),(Boyer, 2000), (Hicks, 2001) Cuando un doble enlace est en la cadena hidrocarbonada de un cido graso, ocurre isomerismo geomtrico. La mayora de los cidos grasos insaturados se encuentran en forma de ismeros cis menos estables, en lugar de ismeros trans ms estables. 78

 Los cidos grasos de cadena larga, insolubles en agua, se disuelven en soluciones acuosas diluidas de NaOH o KOH, debido a que toma lugar una reaccin cido-base: CH3(CH2)10COOH + NaOH cido larico CH3(CH2)10COO-Na+ + H2O Laurato de sodio (jabn)

En condiciones fisiolgicas, los cidos grasos libres existen como sales carboxilato (iones) debido a que sus valores de pKa estn entre 4 y 5; por consiguiente, los nombres de los cidos grasos terminan con el sufijo ato (laurato, eleato, etc.) La reactividad qumica de las cadenas hidrocarbonadas de los cidos grasos depende de la instauracin. Las cadenas saturadas son relativamente no reactivas. Mientras las insaturadas exhiben la reactividad caracterstica de los dobles enlaces carbono = carbono; por ejemplo, pueden incorporar tomos de halgeno o de hidrgeno o ser atacados por el oxgeno (autooxidacin) (Boyer, 2000). 2.4.3 Acil glicridos. El acil glicerol ms abundante es el triacilglicerol, llamado tambin triglicrido o lpido neutro, el cual se compone de tres cidos grasos unidos al glicerol. Los diacil gliceroles y los monoacilgliceroles no existen en cantidades apreciables en la naturaleza, pero son intermediarios importantes en varias reacciones biosintticas. CH2OCOR1 CH2OCOR1 R2COOCH R2COOCH CH2OH CH2OCOR3 Triacilglicerol 1,2 - diacilglicerol CH2OCOR1 HOCH CH2OH 1- monoacilglicerol

RCOOCH CH2OH

CH2OH

2- monoacilglicerol

Los grupos hidroxilo polares del glicerol y el grupo carboxilo polar de cada cido graso estn ligados a travs de enlaces ster neutros, de ah que los triacilgliceroles sean molculas hidrfobas, no polares, insolubles en agua pero solubles en solventes no polares. Pueden existir en estado slido o lquido, segn la naturaleza de los cidos grasos constitutivos. La mayora de los triacilgliceroles vegetales tienen puntos de fusin bajos y son lquidos a la temperatura ambiente, debido a que contienen una gran proporcin de cidos insaturados, del tipo de los cidos oleico, linoleico y linolnico. En contraste, los triacilgliceroles animales contienen una mayor proporcin de cidos grasos saturados, tales como los cidos palmtico y esterico, lo que se traduce en puntos de fusin ms elevados, dando lugar a que presenten carcter semislido o slido a la temperatura ambiente. Si los tres grupos hidroxilo del glicerol estn esterificados con el mismo cido, el ster resultante se llama triacilglicerol simple (trimiristina del aceite de nuez moscada), que raras veces se encuentran en la naturaleza. Todos los triacilgliceroles que se obtienen de grasas y aceites 79

naturales contienen dos o tres cidos grasos distintos y, por tanto, se les denomina triacilgliceroles mixtos. La funcin principal de los triacilgliceroles en los animales es servir de reservorio de energa ya que no son componentes de las membranas. Como combustible de reserva, los triacilgliceroles tienen dos ventajas significativas sobre los polisacridos (glucgeno, almidn): Los tomos de carbono de los cidos grasos estn ms reducidos que los de los carbohidratos. La oxidacin de los triacilgliceroles proporciona ms del doble de energa por gramo que la de los carbohidratos Tabla 2.6. Composicin de cidos grasos de algunas grasas de origen animal y vegetal _________________________________________________________________________ Saturados (%) Grasas animales Pescado Pollo Cerdo Res Mantequilla Monoinsaturados (%) Poliinsaturados (%)

28 40 40 54 59

29 38 46 44 37

43 22 14 2 4

Aceites vegetales Azafrn 11 11 78 Girasol 12 18 70 Maz 14 26 60 Sesamo 14 43 43 Soja (soya) 15 27 58 Cacahuata 20 45 35 Algodn 29 19 52 Coco 86 12 2 _________________________________________________________________________ Los lpidos pueden ser lquidos o slidos, no cristalinos a la temperatura ambiente. Las grasas y aceites puros son incoloros, inodoros e inspidos. Son ms ligeros que el agua (densidad = 0,8 g/cm3). Casi no conducen el calor y la electricidad y por tanto sirven como aislantes para el cuerpo. La hidrlisis de los triacilgliceroles puede efectuarse por varios procedimientos, los ms comunes utilizan cidos, lcalis o enzimas (lipasas). La hidrlisis cida es reversible mientras que la alcalina es irreversible. La hidrlisis alcalina recibe el nombre de saponificacin, debido a que uno de sus productos es un jabn (sales de sodio o de potasio 80

de los cidos grasos). Esta reaccin proporciona un mtodo analtico til para la determinacin de una constante, ndice de saponificacin, el cual es caracterstico de los lpidos complejos: triacilglicerol + base jabn + glicerol

El ndice de saponificacin se define como el nmero de miligramos de hidrxido de potasio necesarios para saponificar un gramo de grasa o aceite. Un ndice de saponificacin pequeo de una grasa o aceite indica una masa molecular elevada. Los cidos grasos insaturados en forma libre o combinados como steres en grasas o aceites, reaccionan con los halgenos adicionndose a los dobles enlaces (halogenacin). La cantidad de halgeno que absorbe un lpido puede emplearse como ndice del grado de insaturacin. El valor del ndice se llama ndice de yodo y se define como el nmero de gramos de yodo (o equivalentes de yodo) que se adicionan a 100 g de una grasa o aceite. Un valor alto del ndice de yodo indica un alto grado de insaturacin. Mediante la hidrogenacin los aceites vegetales se transforman en grasas slidas (endurecimiento). Si las condiciones de la reaccin se regulan en forma adecuada es posible preparar una grasa con una consistencia fsica conveniente (blanda y manejable). Si la hidrogenacin contina por un tiempo prolongado, se forman glicerol y alcoholes de cadena larga. El oxgeno del aire causa la rotura oxidativa de los dobles enlaces de los cidos grasos insaturados, lo cual produce aldehdos y cidos carboxlicos de cadena corta, en ocasiones de alta volatilidad. Las lipasas hidrolizan enzimticamente a los triacilgliceroles. 2.4.4 Ceras. Las ceras son steres slidos de los cidos grasos de cadena larga con alcoholes monohidroxlicos o con esteroles. Son insolubles en el agua. Los cidos y los alcoholes que normalmente componen las ceras poseen cadenas del orden de 12 a 34 tomos de carbono de longitud. Son slidos de fcil fusin, muy difundidas en la naturaleza y forman parte tanto de la materia vegetal como de la animal. Por su alta insolubilidad en agua y por sus cadenas hidrocarbonadas totalmente reducidas, son qumicamente inertes y suministran una barrera contra el agua. No se hidrolizan con tanta facilidad como los triacilgliceroles y, por tanto, resultan tiles como recubrimientos protectores. Las ceras vegetales se encuentran sobre las superficies de hojas y tallos y sirven para proteger a la planta de la deshidratacin, daos por abrasin y de la invasin de organismos dainos. (Ej: cera de carnauba, la mayor parte es cerotato de miricilo, C25H51COOC30H61). Las ceras de animales tambin sirven como recubrimientos protectores. Se encuentran en las superficies de plumas, piel y cerdas, y sirven para mantener dichas superficies blandas y manejables. La cera de abejas, constituida casi en su totalidad por palmitato de miricilo, C15H31COOC30H61, es secretada por las glndulas cerosas de la abeja. La lanolina o grasa de la lana es una mezcla de steres de los cidos grasos de los esteroles lanosterol y agnosterol (Lehninger, 1995). 81

2.4.5 Fosfolpidos. Estn constituidos por el sn-glicerol esterificado en los carbonos C1 y C2 con cidos grasos y en el C3 con cido fosfrico; este fosfato a su vez puede combinarse con otras molculas en la posicin que se indica como X en la siguiente figura: O O CH2 O C R1 2 R C O C H O CH2 O P OX OLos glicerofosfolpidos son molculas anfipticas con una regin no polar aliftica (cola) y otra polar, constituida por el grupo fosfato y un sustituyente en X (cabeza). Son los lpidos de mayor polaridad. Los cidos grasos saturados que con mayor frecuencia se esterifican en el C1 son palmtico y esterico y la posicin C2 es ocupada comnmente por un cido graso insaturado de 16 a 20 carbonos, como el oleico, linoleico y araquidnico. El ms simple glicerofosfolpido, en el que el sustutuyente X es un H, se llama cido fosfatdico, que se halla slo en pequeas cantidades en las membranas pero es un intermediario importante en la biosntesis de los fosfoglicridos. En los glicerofosfolpidos, que por lo general constituyen las membranas biolgicas, la regin polar o cabeza se forma por alcoholes polares (colina, etanolamina, serina, glicerol, fosfatidilglicerol, mioinositol). Los fosfoglicridos puros son slidos blancos de consistencia crea, pero por exposicin al aire se oscurecen y experimentan cambios complejos a causa de la tendencia de sus cidos grasos insaturados a peroxidarse por la accin del oxgeno atmosfrico. Son solubles en muchos solventes no polares que contengan cierta cantidad de agua y son extrados adecuadamente de las clulas y los tejidos mediante mezclas de cloroformo-metanol. No se disuelven fcilmente en acetona anhidra. Cuando los fosfolpidos se adicionan al agua se disuelven; sin embargo, solamente forman disolucin verdadera en cantidades muy pequeas, la mayor parte del lpido disuelto se halla en forma de micelas dispersas en el sistema acuoso. Se encuentran ampliamente distribuidos en bacterias y tejidos animales y vegetales, y sus estructuras generalizadas, sin importar su origen son bastantes similares. Son los componentes ms abundantes de las membranas biolgicas. Actan como agente emulsionante en las superficie de las membranas celulares. Desempean funciones importantes en la cadena respiratoria, el metabolismo de las grasas, procesos de secrecin y en el transporte de iones a travs de las membranas celulares. Una hidrlisis alcalina suave de los fosfoglicridos produce cidos grasos en forma de jabones, pero deja inalterado el esqueleto de la molcula, constituido por la glicerina-cido fosfrico-alcohol. En lcali concentrado origina la liberacin de ambos cidos grasos, del alcohol y del fosfato de glicerilo. Este ltimo puede escindirse mediante hidrlisis cida. 82

Los fosfoglicridos tambin pueden ser hidrolizados por la accin de fosfolipasas especficas: la fosfolipasa B, mezcla de las fosfolipasas A1 y A2, puede efectuar la separacin sucesiva de los dos cidos grasos; la fosfolipasa C hidroliza el enlace entre cido fosfrico y la glicerina; mientras que la fosfolipasa D elimina el grupo de cabeza polar, dejando cido fosfatdico (Lehninger, 1995). Los fosfoglicridos forman monocapas en las interfases aire-agua, as como bicapas para separar dos compartimientos acuosos Las bicapas se componen de dos monocapas o lminas de lpidos polares. Los extremos no polares de cada monocapa se combinan mediante interacciones hidrofbicas para excluir el agua de la regin central de la bicapa, la que proporciona el soporte estructural para el ensamblado de la membrana (Boyer, 2000). Los liposomas son estructuras bicapa vesiculares, completamente cerradas, que se forman por exposicin de suspensiones de fosfoglicridos en agua. Las bicapas como las membranas naturales, poseen la propiedad de autocerrarse (Lehninger, 1995).

Los fosfoglicridos ms abundantes en las plantas superiores y en los animales son: Cefalinas. Contienen el componente bsico nitrogenado etanolamina o serina unido a la porcin fosfato. Contienen los cidos grasos oleico y palmtico. Las cefalinas desempean un papel muy importante en el proceso de coagulacin de la sangre.

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 Lecitina. Contiene la sal de amonio cuaternaria, colina, HOCH2CH2N+(CH3)3, unida a un residuo de cido fosfrico mediante un enlace ster. Contiene los cidos grasos oleico y palmtico. Es un producto ceroso de color blanco que de inmediato se ennegrece cuando se expone al aire. En contraste con las grasas y aceites se dispersa en el agua en forma coloidal y es insoluble en acetona. Es abundante en la yema de huevo y en el frjol de soya. Cuando proviene de este ltimo se emplea en la industria de lcteos y de confitera.

Fosfatidil-glicrido, O-aminoacil-glicrido y cardiolpina. Son tres fosfoglicridos que se encuentran abundantemente en las membranas bacterianas (Lehninger, 1995). 2.4.6 Esfingolpidos. Todos los esfingolpidos contienen tres componentes bsicos caractersticos: una molcula de un cido graso, una molcula de esfingosina (aminoalcohol de cadena larga) o de uno de sus derivados, y un grupo de cabeza polar En los mamferos las bases principales de los esfingolpidos son la esfingosina (4esfingenina) y la dihidroesfingosina (esfinganina); en las plantas superiores y en las levaduras, la base principal es la fitoesfingosina (4-hidroxiesfinganina), mientras que en los invertebrados marinos son corrientes las bases doblemente insaturadas, tales como el 4,8esfingadieno. La base esfingosina se halla conectada por un grupo amino, mediante un enlace amida, a un cido graso saturado de cadena larga o a un monoinsaturado de 18 a 26 tomos de carbono. El compuesto resultante, que posee dos colas no polares se llama ceramida. Al grupo hidroxilo del C1 de la base esfingosina se hallan unidos diferentes grupos de cabezas polares. Se encuentran en los tejidos y las membranas de plantas y animales. El esfingolpido ms abundante en los tejidos de los animales superiores es la esfingomielina, que contienen fosforil-etalonamina o fosforil-colina como grupos de cabezas polares esterificados al grupo hidroxilo del C1 de la ceramida. 84

Existen los cerebrsidos (glucoesfingolpidos neutros), derivados de la esfingosina, los cuales contienen como grupo de cabeza polar un monosacrido unido mediante un enlace -glucosdico al grupo hidroxilo del C1 de la esfingosina. Los cerebrsidos se hallan principalmente en el cerebro (7 % de la materia slida) y en la cubierta de mielina de los nervios. Se ha sugerido que su funcin es la de transmitir los impulsos nerviosos. Los cerebrsidos del cerebro y del sistema nervioso contienen D-galactosa y por ello reciben el nombre de galactocerebrsidos; en los tejidos no neurales de los animales se encuentran los glucocerebrsidos. Un cido graso que es componente habitual de los cerebrsidos es el cido cerebrnico. A los glucoesfingolpidos neutros que poseen disacridos como cabeza polar se les llama dihexsidos. Se conocen tambin trihexsidos y tetrahexsidos, que poseen respectivamente trisacridos y tetrasacridos como grupos de cabeza. Las unidades monosacridas halladas en estos glucoesfingolpidos comprenden a la D-glucosa, D-galactosa, N-acetilglucosamina y la N-acetil-D-galactosamina. Los glucoesfingolpidos neutros son componentes importantes de la superficie celular de los tejidos animales. Sus colas no polares penetran en la estructura de la bicapa lipdica de las membranas celulares, mientras que las cabezas polares emergen al exterior de la superficie.

2.4.7 Glucolpidos. Son derivados anfipticos de carbohidratos y glicridos. Los glucolpidos o glucosildiacilglicridos contienen cidos grasos, glicerina y diversos carbohidratos. Son solubles en disolventes orgnicos no polares. 85

O O CH2 O C R1 R2 C O CH CH2 X

X : - (galactosa)1 o 2 - (glucosa)1 o 2 - (manosa)1 o 2 - (glucosa)(galactosa)

Los galactolpidos y los sulfolpidos se han encontrado principalmente en los tejidos con funciones fotosintticas (membrana de los cloroplastos). El galactosildiacilglicrido se ha hallado tambin en el tejido neural de los vertebrados y el dimanosildiacilglicrido en las bacterias.

2.4.8 Terpenoides y esteroles. Los terpenos estn constituidos por unidades mltiples del hidrocarburo de cinco tomos de carbono, isopreno (2-metil-1,3 butadieno). CH3 CH2 = C CH = CH2 Los terpenos que contienen una unidad de isopreno se llaman hemiterpenos, los que contienen dos unidades se denominan monoterpenos, los que contienen tres unidades se denominan sesquiterpenos y los que contienen cuatro, seis, ocho y diez unidades, reciben el nombre de diterpenos, triterpenos, tetraterpenos y politerpenos, respectivamente. Los terpenos pueden ser molculas lineales o cclicas y algunos de ellos contienen estructuras de ambos tipos. Los enlaces dobles en los segmentos lineales de muchos terpenos se hallan en la configuracin estable trans.

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En los vegetales se han identificado un nmero muy grande de terpenos, muchos de los cuales poseen sabores y olores caractersticos, y son componentes principales de los aceites esenciales obtenidos de tales plantas. As, los monoterpenos geraniol, limoneno, mentol, pineno y alcanfor, son los componentes principales del aceite de geranio, de limn, de menta, de trementina y de alcanfor, respectivamente. El farnesol constituye un ejemplo de sesquiterpeno. Entre los diterpenos se halla el fitol, que es un alcohol terpenoide lineal componente de la clorofila, un pigmento fotosinttico. Entre los triterpenos figura el escualeno, precursor importante en la biosntesis del colesterol. Entre otros terpenos superiores se incluyen los carotenoides, que son una clase de hidrocarburos tetraterpnicos, y sus derivados oxigenados. Un carotenoide importante es el -caroteno, fuente del color anaranjado y precursor de la vitamina A. Otro carotenoide importante es el licopeno, pigmento rojo de la piel del tomate. El cido giberlico es un terpeno no lineal que se encuentra en las plantas, como una hormona de crecimiento de stas. El caucho natural es un politerpeno, constituido por largas cadenas hidrocarbonadas que contienen centenares de unidades de isopreno en orden lineal regular. Entre los terpenos ms importantes hay tres miembros del grupo de las vitaminas liposolubles: vitamina A, E y K. Otro compuesto terpenoides que acta como coenzima es la ubiquinona o coenzima Q. Los esteroides se originan a partir del escualeno, triterpeno lineal que se cicla con facilidad. El primer producto esteroide importante de esta ciclacin es el lanosterol, que es el precursor del colesterol en los tejidos de animales. El colesterol y el lanosterol son miembros de un gran subgrupo de esteroides llamados esteroles. El colesterol aparece muy raramente en las plantas superiores las cuales contienen otros tipos de esteroles conocidos colectivamente como fitosteroles. Entre estos se halla el estigmasterol y el -sitosterol. Los mohos y las levaduras contienen adems otros tipos de esteroles, los micosteroles, figura entre ellos el ergosterol, que se convierte en vitamina D por irradiacin de la luz solar. Los esteroles no se encuentran en las bacterias.

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En los tejidos animales el colesterol es el precursor de otros muchos esteroides, se incluyen entre ellos los cidos biliares (cido clico), compuestos con carcter detergente que ayudan a la emulsin de los lpidos y a su absorcin intestinal; la testosterona, la hormona masculina fundamental, es la responsable del desarrollo de las caractersticas sexuales secundarias; los estrgenos hormonas sexuales femeninas, que regulan el ciclo de la ovulacin; la progesterona que es una hormona que se requiere para un embarazo normal y 88

las hormonas adrenocorticales (cortisona), que realizan el metabolismo de los alimentos, mantienen el balance adecuado de electrlitos (iones de sodio y potasio) y regulan las inflamaciones y alergias. Entre los esteroides se halla un grupo de compuestos que posee actividad de vitamina D.

El isopreno, que no se encuentra en la naturaleza tiene como contraparte real biolgicamente activa al isopentenil pirofosfato, que se forma a partir del cido mevalnico mediante una serie de etapas catalizadas enzimticamente. Luego el isopentenil pirofosfato experimenta otras reacciones para formar el escualeno que a su vez puede condensarse para formar colesterol.

2.5 AMINOCIDOS, PPTIDOS Y PROTENAS Las proptenas tienen como funcin bsica el desarrollo y mantenimiento del cuerpo. Adems, de carbono, hidrgeno y oxgeno, todas contienen nitrgeno y pueden estar constituidas por azufre, fsforo y otros minerales. Las protenas pueden definirse como compuestos de masa molar elevada constituidas en su mayor parte, o totalmente, de cadenas de aminocidos. pueden considerarse como polmeros anlogos a los polisacridos. 89

Sin embargo, en las protenas existen unas veinte unidades monmeras de diferente estructura, y stas son los aminocidos. 2.5.1 Aminocidos. Un aminocido es cualquier molcula orgnica que posea un grupo carboxilo (un cido orgnico) y un grupo amino (una base orgnica). Segn esta definicin general, existen cientos de aminocidos distintos. Los aminocidos que forman las protenas se caracterizan por tener un carbono central (carbono alfa) rodeado de un hidrgeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y una cadena lateral R. 2.5.1.1 Clasificacin de los aminocidos. La cadena lateral R hace que cada aminocido sea qumica y biolgicamente distinto. Los grupos R varan en tamao, polaridad, carga y reactividad qumica. Cada aminocido posee propiedades nicas debido a la variacin en la estructura de los grupos R. Segn la reactividad se clasifican en (Figura 2.14): Grupo I: aminocidos con cadenas laterales no polares. Esta familia contiene cinco aminocidos con grupos R que son hidrocarburos alifticos (alanina, leucina, isoleucina, valina y prolina), dos con anillos aromticos (fenilalanina y triptfano) y uno que contiene azufre (metionina); por consiguiente, son hidrofbicos. Estos aminocidos son menos solubles en el agua que los aminocidos con grupo R polares; el menos hidrfobo en esta clase es la alanina. Grupo II: aminocidos con cadenas laterales polares, sin carga elctrica en el pH fisiolgico. En las cadenas laterales de los aminocidos de este grupo se encuentran grupos polares neutros (sin carga), con un par de electrones disponibles para formar puentes de hidrgeno con el agua o con otras molculas. La polaridad de la serina, treonina y tirosina se debe a sus grupos hidroxilo; la de la asparagina y glutamina a sus grupos amdicos y la de la cistena a la presencia del grupo sulfidrilo (-SH). La glicocola, se clasifica a veces como no polar, pero su grupo R, que es un tomo de hidrgeno, es demasiado pequeo para que pueda influir en la elevada polaridad de los grupos -amino y -carboxilo. La cistena y la tirosina poseen las funciones ms polares de esta clase de aminocidos, a saber, los grupos tiol e hidroxilo fenlico, respectivamente. La cistena se encuentra con frecuencia en las protenas en su forma oxidada, la cistina. Grupo III: aminocidos con cadenas laterales cidas. Estos aminocidos (cido asprtico y glutmico) tienen un grupo carboxlico en la cadena lateral que les confiere sus propiedades cidas. En el pH fisiolgico (6 a 7), los tres grupos funcionales de estos aminocidos se encuentran ionizados en una especie de carga neta de 1. Grupo IV: aminocidos con cadenas laterales bsicas. Este grupo est constituido por la lisina, que contiene un segundo grupo amino en la posicin de la cadena aliftica; la arginina, que tiene un grupo guanidinio cargado positivamente y la histidina, que contiene la funcin imidazolio, dbilmente bsica. Adems, de estos 20 aminocidos, que son las unidades bsicas de todas las protenas, existen otros que se encuentran en contadas protenas: 4-hidroxiprolina, derivado de la prolina que se encuentra con cierta abundancia en la protena fibrosa colgeno y en algunas 90

Figura 2.14. Estructuras completas para los 20 aminocidos presentes en las protenas, al pH fisiolgico. Clasificacin de los aminocidos en cuatro grupos, basados en la reactividad qumica y en la polaridad de la cadena lateral R. 91

protenas de las plantas. La hidroxilina, que es el 5-hidroxiderivado de la lisina, est presente en el colgeno. La desmosina y la isodesmosina (derivados de la lisina), se hallan en la protena fibrosa elastina (Figura 2.15).

Figura 2.15. Algunos aminocidos poco frecuentes hallados en las protenas fibrosas Existen ms de 150 aminocidos en la naturaleza (particularmente en el reino vegetal) pero no forman parte de las protenas. Entre estos estn: la -alanina, precursor de la vitamina cido pantotnico; la homocistena y la homoserina son intermediarios en el metabolismo de los aminocidos; la citrulina y la ornitina son intermediarios en la sntesis de la arginina. Otros aminocidos no proteicos actan como agentes qumicos para la transmisin de los impulsos nerviosos, tal como ocurre con el cido -aminobutrico. Algunos aminocidos no proteicos poseen la configuracin D, por ejemplo, el cido D-glutmico, hallado en cantidades sustanciales en las paredes celulares de muchas bacterias (peptidoglucano), la D-alanina hallada en las larvas o pupas de algunos insectos la D-serina, que se encuentra en los gusanos de tierra. Los hongos y las plantas superiores contienen una variedad de aminocidos no proteicos. En las plantas se encuentran algunos como la canavanina, el cido dyenclico y la -cianoalanina, que son txicos para otras formas de vida (Figura 2.16). 2.5.1.2 Propiedades generales de los aminocidos. Puros son slidos cristalinos, incoloros, no voltiles.. 92

Figura 2.16. Algunos aminocidos de la naturaleza que no se hallan en las protenas Los aminocidos se encuentran y cristalizan a partir de disoluciones acuosas neutras en forma de iones dipolares, llamados tambin iones hbridos, en lugar de hacerlo en forma de molculas no disociadas. H R C COOH NH2 Forma no disociada H R C COO NH3
+

Forma dipolar o de ion hbrido

Funden con descomposicin a temperaturas mayores de 200 0C. Solubles en agua e insolubles en disolventes orgnicos no polares El carbono alfa tetradrico de cada aminocido con excepcin de la glicina, lleva unido 93

cuatro tomos o grupos qumicos distintos, por consiguiente, es un centro de quiralidad. Como resultado de este tipo de arreglo existen dos estereoismeros (enantimeros), llamados D y L aminocidos. Los ismeros D y L existen en forma natural; pero slo los ismeros L se utilizan para construir las protenas. La letra L de los -L-aminocidos se relaciona con la estructura del L-gliceraldehdo, que contiene el OH hacia la izquierda, posicin similar del grupo NH2 en los -L-aminocidos; mientras que, la letra D en los Daminocidos se vincula con la de la estructura del D-gliceraldehdo, en el cual el OH se encuentra orientado hacia la derecha. COO + H3N C H H C OH H -L-serina COO + H C NH3 HO C H H -D-serina

Siempre que un aminocido posea ms de un tomo de carbono asimtrico, se toma la configuracin del tomo de carbono alfa como base para la asignacin de la configuracin. Los aminocidos que poseen dos tomos de carbono asimtricos (treonina, isoleucina) presentan cuatro estereoismeros. La forma del aminocido que se asla del hidrolizado de protena se designa como forma L y su imagen especular es la forma D. Los otros dos estereoismeros son disteroismeros o formas alo; tambin son entre s como imgenes especulares uno del otro.

Las soluciones acuosas de aminocidos son conductoras de electricidad. La rotacin especfica de un aminocido vara con el pH de la solucin al que se mide. La rotacin especfica de un aminocido depende de la naturaleza de su grupo R. 94

 Todos los -L-aminocidos tienen como mnimo dos grupos qumicos que pueden ceder o aceptar protones (H+), es decir, que poseen dos grupos ionizables: el -amino y el -carboxilo. Los valores de pK para la disociacin de los grupos ionizables de los 20 aminocidos se dan en la Tabla 2.7. Los aminocidos, por ser dipolares, son sustancias anfotricas; son capaces de comportarse como cidos o bases. Cuando se disuelve en el agua un in hbrido cristalizado, como la alanina, puede actuar como cido (dador de protones) o como base (aceptor de protones). El grado de ionizacin y la carga de los aminocidos dependen del pH de la solucin. La curva de titulacin de la alanina se muestra en la Figura 2.17. En ella se observan dos puntos de inflexin, indicativos de dos valores de pK, uno de ellos define la disociacin del protn del grupo carboxilo (pK1 = 2,3) y el otro, la disociacin del protn del grupo amino (pK2 = 9,7). Los cambios qumicos se muestran en las reacciones:
+

H3NCH(CH3)COOH + OH+

H3NCH(CH3)COO- + H2O H2NCH(CH3)COO- + H2O

H3NCH(CH3)COO- + OH-

Tabla 2.7. Valores de pK de los 20 aminocidos que se encuentran en las protenas Nombre pK1 pK2 pK3

Glicina 2,4 9,8 Alanina 2,3 7,9 Valina 2,3 9,6 Leucina 2,4 9,6 Isoleucina 2,4 9,7 Metionina 2,3 9,2 Fenilalanina 1,8 9,1 Prolina 2,0 10,6 Serina 2,1 9,2 Treonina 2,6 10,4 Cistena 1,8 10,8 8,3 Asparagina 2,0 8,8 Glutamina 2,2 9,1 Tirosina 2,2 9,1 10,9 Triptfano 2,4 9,4 cido asprtico 2,0 10,0 3,9 cido glutmico 2,2 9,7 4,3 Histidina 1,8 9,2 6,0 Lisina 2,2 9,2 10,8 Arginina 1,8 9,0 12,5 _________________________________________________________________________ Cuando el pH de la solucin es de 2,3, 50 % de la alanina estn en la forma A y 50 % en la forma B. A medida que se aade ms base, la forma B disocia otro protn (NH3+) para 95

producir la forma C. Cuando el pH de la solucin llega a 9,7, 50 % de las molculas de alanina estn en la forma B y 50 % en la forma C. La curva de titulacin de todos los aminocidos son semejantes, con excepcin de aquellos aminocidos que tienen un grupo funcional cido o bsico, en la cadena lateral R. Cuando el pH es 6,02 existe un punto de inflexin entre las dos ramas separadas de la curva de valoracin de la alanina. A este pH la molcula no posee carga elctrica neta y no se desplazar en un campo elctrico. Este punto es el pH isoelctrico (pHI). Cada aminocido posee su pH isoelctrico caracterstico. El pH isoelctrico de los aminocidos neutros es el promedio de los valores del pK del grupo -carboxilo y el -amino. El pH isoelctrico de los aminocidos cidos es el promedio de los valores de pK de los grupos carboxilo. El pH isoelctrico de los aminocidos bsicos es el promedio de los valores de pK de los grupos amino. 2.5.1.3 Reacciones de los aminocidos. Los aminocidos no slo actan como electrlitos, sino que intervienen tambin en reacciones que son caractersticas de los grupos orgnicos funcionales de las cadenas laterales de los aminocidos y de los grupos

Figura 2.17. Curva de titulacin cido-base del aminocido alanina -amino y -carboxilo. El conocimiento de estas reacciones es til en: la identificacin y anlisis de aminocidos en los hidrolizados de protenas; la identificacin de la secuencia de aminocidos en las molculas de protenas; la identificacin de los restos aminocidos especficos de las protenas nativas que se precisan para su funcin biolgica; modificacin qumica de los restos aminocidos en las molculas protenicas para alterar su actividad biolgica u otras propiedades y la sntesis qumica de los polipptidos. La mezcla compleja de aminocidos puede separarse, identificarse y determinarse mediante cromatografa sobre papel o de columna de intercambio inico o por electroforesis sobre 96

papel. Estos mtodos utilizan las diferencias de comportamiento cido-bsico y/o la solubilidad de los diferentes aminocidos. Para el anlisis de aminocidos se cuenta con varios compuestos qumicos que reaccionan con los aminocidos y forman derivados que se pueden detectar con tcnicas sensibles como la espectrofotometra de absorcin ultravioleta-visible (UV-VIS) y de fluorescencia. La ninhidrina reacciona con aminocidos formando un pigmento prpura (amarillo con prolina). El reactivo de Sanger,1-fluoro-2,4-dinitrobenceno, (FDNB), reacciona con el grupo amino de los -aminocidos y forma derivados de color amarillo. La fluorescamina y el cloruro de dansilo (cloruro de 5-dimetilamino-naftaleno-1-sulfonil) forman derivados fluorescentes de aminocidos; estos reactivos qumicos permiten detectar niveles de aminocidos del orden de nanomoles (10-9 moles) a picomoles (10-12 moles). El bencilclorocarbonato rinde derivados benciloxicarbonlicos a partir de los aminocidos. El grupo -amino forma bases de Schiff con los aldehdos y carbamil derivados con el canato. El grupo tiol (-HS) de la cistena se oxida con facilidad para dar cistina que, a su vez, puede reducirse para dar cistena. Tales reacciones son extremadamente tiles para la identificacin y anlisis de los aminocidos (Lehninger, 1995), (Conn et al., 1996), (Boyer, 2000). 2.5.2 Pptidos. Los pptidos, se forman por uniones de aminocidos mediante enlaces peptdicos. En la formacin de un enlace peptdico se da una reaccin de condensacin (prdida de una molcula de agua) entre el grupo carboxilo de un aminocido y el grupo amino del otro. Son compuestos de complejidad estructural intermedia entre los aminocidos y las protenas. A cada uno de los aminocidos incorporados en el pptido se le denomina residuo. Un pptido con menos de 10 residuos se conoce como un oligopptido y los que tienen entre 10 y 100 aminocidos como polipptidos. Al igual que un -aminocido, un pptido tiene un grupo -amino y un grupo -carboxilo. En un pptido pequeo el grupo -carboxilo tiene por lo general un pK en el intervalo de 3 a 4, lo que indica que es menos cido que el grupo -carboxilo de un aminocido libre (pK entre 1,7 y 2,4). De manera similar, el grupo -amino de un pptido se convierte en una base dbil, con un pK dentro de los lmites de 7,5 a 8,5; valores que estn por fuera del intervalo de 9 a 11 observado en los grupos -amino de los aminocidos libres. Por convencin, los pptidos se escriben y se numeran desde el extremo amino o primer residuo (a la izquierda) hacia el carboxilo terminal (a la derecha). Los pptidos funcionan como hormonas, antibiticos, toxinas e intermediarios metablicos. Ejemplos de pptidos, son: Glutatin (-glutamilcisteimilglicina): es un tripptido que se encuentra en todas partes en la naturaleza y que en los mamferos es necesario para evitar el dao oxidativo de los eritrocitos. El grupo -carboxilo es el que se une en el enlace peptdico; diferente a lo que se presenta cuando el cido glutmico forma parte de las protenas, donde el grupo -carboxilo es el que interviene en el enlace peptdico. Vasopresina:y oxitocina: son hormonas que se forman en la glndula pituitaria. Son

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nanopptidos que puede asumir una estructura cclica formando puentes disulfuro entre la cistena amino terminal y una cistena del interior del pptido. Siete de los nueve aminocidos son idnticos. Sin embargo, los efectos fisiolgicos son bastante distintos: la vasopesina aumenta la presin sangunea al constreir los vasos sanguneos perifricos; mientras la oxitocina causa la contraccin del msculo liso. Tirocidina y penicilina G: son antibiticos. La penicilina G posee los residuos de aminocidos valina y cistena, pero stos no estn unidos por enlaces peptdicos; en su lugar se encuentra un anillo de azufre y una estructura anular tensa de cuatro miembros. Aspartame (L-aspartil-L-fenil-metil-ster): es un pptido sinttico que muestra actividad biolgica. Es aproximadamente, 200 veces ms dulce que la sacarosa y se considera que carece del sabor desagradable asociado con otros edulcorantes artificiales. Tiene menos kilocaloras que la sacarosa (1/16). Se utiliza en las bebidas gaseosas dietticas y en los productos alimenticio de bajas caloras. Insulina: es una hormona que regula el metabolismo de los carbohidratos, contiene 51 aminocidos. 2.5.3 Protenas. Las protenas son biopolmeros de tamao muy variado, compuestas de 20 -aminocidos distintos. Su peso molecular vara desde aproximadamente 5000 hasta varios millones de daltons. A pesar de esta complejidad, se ha determinado la secuencia aminocida de cierto nmero de protenas, mediante mtodos que se explican Lehninger, (1995) y Boyer, (2000). Las protenas que constan de una sola cadena polipeptdica se denominan monomricas y las que tienen dos o ms cadenas polipeptdicas se denominan oligomricas. (Tabla 2.9) Tabla 2.9. Propiedades moleculares de algunas protenas _________________________________________________________________________ Protena Peso molecular Nmero de residuos de Nmero de aminocidos cadenas Insulina (bovina) 5 733 51 2 Citocromo c (humano) 13 000 104 1 Ribonucleasa A (pncreas bovino) 13 700 124 1 Lisozima (clara de huevo) 13 930 129 1 Mioglobina (corazn equino) 16 890 153 1 Quimotripsina (pncreas bovino) 21 600 241 3 Hemoglobina (humana) 64 500 574 4 Albmina srica (humana) 68 500 550 1 Inmunoglobulina G (humana) 145 000 1 320 4 ARN polimerasa (E. coli) 450 000 4 100 5 Ferritina (bazo equino) 450 000 4 100 24 Glutamato deshidrogenasa (hgado bovino) 1 000 000 8 300 40 Virus mosaico del tabaco 40 000 000 2 130 _________________________________________________________________________ 98

2.5.3.1 Clasificacin de las protenas: usando como criterio de clasificacin el ordenamiento de la cadena polipeptdica en el espacio (forma), las protenas se clasifican en fibrosas y globulares. Las fibrosas estn compuestas de cadenas polipeptdicas filamentosas alargadas, separadas unas de otras, las cuales se unen lateralmente mediante varios tipos de enlaces transversales (covalentes o de hidrgeno), para constituir una estructura bastante estable e insoluble en agua o en las disoluciones acuosas salinas diluidas y en casi todos los solventes. Toda su 99

estructura es hlice o lmina plegada (Figura 2.18) Las protenas fibrosas son los elementos bsicos estructurales en el tejido conjuntivo de los animales superiores, tales como el colgeno de los tendones y la matriz de los huesos; la -queratina (ricas en restos de cistina) del cabello, cuernos, cuero, uas y plumas; la -queratina (rica en restos de glicocola, alanina y serina) de las fibras hiladas por las araas y los gusanos de seda, escamas, garras y picos de reptiles y pjaros y la elastina del tejido conjuntivo elstico.

Las globulares estn plegadas en formas esfricas o globulares compactas y con las cadenas polipeptdicas enrolladas. Ciertas regiones no son hlice o lmina plegada. Solubles en agua o en las disoluciones acuosas salinas. Generalmente desempean una funcin mvil o dinmica en la clula. Estas protenas se disuelven en los fluidos biolgicos como la sangre y el citoplasma, de modo que se espera que tengan un contenido relativamente alto de residuos de aminocidos con grupos polares y grupos R con carga. De las 2000 enzimas conocidas casi todas son globulares, como tambin lo son los anticuerpos, algunas hormonas y muchas protenas que desempean una funcin de transporte, tales como las seroalbmina y la hemoglobina.

Algunas protenas se hallan situadas entre los dos tipos, fibroso y globular, debido a sus largas estructuras cilndricas y a su solubilidad en soluciones acuosas salinas. Se encuentran entre ellas la miosina, elemento estructural importante del msculo y el fibringeno, precursor de la fibrina, elemento estructural de los cogulos sanguneos. 100

Si se utiliza como criterio de clasificacin la ausencia o presencia de componentes no peptdicos, las protenas pueden ser simples o complejas. Las simples se forman nicamente por la cadena polipeptdica y por ende, producen por hidrlisis -aminocidos. Se dividen en: Albminas: solubles en agua y en soluciones salinas diluidas. Ejemplos de ellas son la albmina de huevo y la seroalbmina. Globulinas: escasamente solubles en agua. Solubles en soluciones salinas diluidas. Se encuentran ampliamente distribuidas en forma de anticuerpos en el suero sanguneo y como fibrgeno sanguneo. Protaminas: solubles en etanol (70 80 %). Insolubles en agua y etanol absoluto.

Histonas: solubles en agua y en hidrxido de amonio diluido. Son protenas bsicas, ya que contienen una elevada proporcin de aminocidos bsicos (lisina y/o arginina). Escleroprotenas: insolubles en agua y en casi todos los disolventes. Tienen funciones estructurales y de proteccin. Ejemplos de ellas son la queratina (pelo, piel y uas); el colgeno (huesos, tendones y cartlagos) y la elastina (fibras elsticas y tejido conectivo). Las complejas o conjugadas: por hidrlisis producen -aminocidos y un material no proteico (grupo prosttico). En general, el par grupo prosttico-protena tiene ms efectividad biolgica que la protena simple. Se dividen en: Fosfoprotenas: por hidrlisis se obtiene cido fosfrico y aminocidos. La casena, que se encuentra en la leche es un ejemplo importante de esta clase. Glucoprotenas: contienen carbohidrato o derivado de carbohidrato como grupo prosttico. La mucina un componente de la saliva, es una glucoprotena; as como, la globulina. Cromoprotenas: grupo prosttico pigmentado que se encuentra unido a una protena simple. Un ejemplo, es la hemoglobina, la cual posee el pigmento hemo que contiene hierro coordinado a la porcin de protena simple, la globina. Metaloprotenas: tienen como grupo prosttico un metal como el Fe y Cu, Fe(OH), Zn o Mo y Fe. La enzima deshidrogenasa alcohlica de levadura es una protena tetramrica que tiene asociado un tomo de zinc a cada subunidad. Nucleoprotenas: son sustancias complejas que se encuentran en abundancia en los ncleos de las clulas animales y vegetales, en los ribosomas y en el virus mosaico del tabaco. Los grupos prostticos son los cidos nucleicos ADN y ARN. Lipoprotenas: suelen clasificarse como lpidos compuestos. Estn formadas por 101

steres de colesterol y fosfolpidos unidos a molculas de protena. Se encuentran en la yema del huevo, ncleos celulares, ribosomas, en la envoltura mielina de los nervios, -lipoprotenas del plasma y en el sistema de transporte electrnico en las mitocondrias. De acuerdo a sus funciones biolgicas las protenas se clasifican en: Protenas estructurales: proporcionan soporte mecnico a las clulas y a los organismos. Ejemplos de stas son el colgeno, elastina glucoprotenas, esclerotina, fibrona y -queratina Enzimas: catalizan todas las reacciones qumicas que se dan en los organismos. Ejemplos de ellas son la -amilasa, -amilasa, lactasa, ADN-polimerasa, lisozima, ribonucleasa, entre otras. Transporte: muchas de las biomolculas deben ser transportadas por protenas por todo el organismo para poder utilizarse en el metabolismo energtico y en la construccin de los componentes celulares. Ejemplos de ellas son la hemoglobina, hemocianina, mioglobina, seroalbumina, -lipoprotenas, globulina que liga hierro, citocromo c y ceroplasmina. Reserva: muchos organismos utilizan protenas para almacenar nutrientes para uso posterior; las plantas y los animales almacenan el hierro, en la protena ferritina; las semillas de las plantan almacenan protenas como el gluten, fuente de energa para la germinacin. Otras protenas de este tipo son la casena, ovoalbumina, gliadina y ceina. Contraccin muscular y movimiento: las protenas actina y miosina son componentes funcionales del sistema contrctil del msculo esqueltico. Por su parte la protena dinena participa en el movimiento de los espermatozoides y protozoarios como componente de flagelos y cilios. Protenas del sistema inmunolgico: diversas plantas y animales utilizan protenas para defenderse. Los anticuerpos, como la inmunoglobulina, son protenas que producen los organismos superiores que se unen en forma selectiva y neutralizan (destruyen) muchas sustancias extraas como virus y bacterias, dainos para el organismo. Algunos venenos de serpiente, la toxina diftrica, la toxina del Clostridium botulinum, la ricina y la gosipina son protenas. Protenas reguladoras y protenas receptoras: son muchas las protenas que regulan la actividad fisiolgica y celular. Algunos ejemplos son las hormonas insulina, prolactina y tirotropina; otro grupo importante lo constituyen las protenas G que transmiten seales hormonales dentro de las clulas y las protenas de unin al ADN que ayudan en la replicacin y la regulacin de sntesis de protenas (traduccin). Muchas protenas receptoras localizadas en las membranas celulares sirven para transmitir impulsos nerviosos y seales hormonales al interior de la clula. Cuando las molculas pequeas de seal como la acetilcolina o la adrenalina se unen con protenas receptoras en la superficie de las 102

membranas de las clulas nerviosas, se transmite un mensaje regulador al interior de la maquinaria celular (Calvete et al., 2003). 2.5.3.2 Estructura proteica. La actividad funcional de una protena en las condiciones celulares depende de su plegamiento en una estructura tridimensional nica denominada conformacin nativa. Dicha conformacin y organizacin de la protena se puede establecer en cuatro niveles (Figura 2.18): Estructura primaria. Se define como la secuencia (orden) de residuos de aminocidos de una protena; los residuos se unen mediante enlaces peptdicos covalentes. Estructura secundaria. Se presenta cuando determinadas regiones de la secuencia primaria se pliegan en una estructura regular repetida, tal como una hlice o una lmina o conformacin , como se muestra en la Figura 2.18. La hlice y la lmina -plegada se estabiliza mediante la presencia de enlaces de hidrgeno entre los grupos carbonilo e imido de los enlaces peptdicos. Estructura terciaria. Se presenta cuando los elementos de la estructura secundaria interactan y se repliegan como una unidad globular compacta. La forma tridimensional nica que adquiere la protena se relaciona con la funcin biolgica, porque le permite la interaccin especfica con otras molculas. La estructura terciaria depende de la secuencia de los residuos de aminocidos, es decir, de la estructura primaria de la protena, ya que los residuos de los aminocidos pueden interactuar para generar los enlaces o fuerzas estabilizadoras de la estructura terciaria de las protenas: enlaces covalentes disulfuro (doblan o pliegan la cadena), puentes de hidrgeno (en las regiones hlice y lmina , entre grupos R, entre grupos R y el agua), interacciones hidrfobas (entre grupos R no polares) e interacciones electrostticas. Estructura cuaternaria. Define la asociacin de dos o ms cadenas polipeptdicas para formar una protena de varias subunidades. Las subunidades se encuentran unidas por las interacciones dbiles no covalentes como los puentes de hidrgeno, enlaces inicos, interacciones hidrfobas e interacciones de van der Waals. Existe la estructura cuaternaria homognea, que se presenta cuando se unen subunidades de protenas idnticas y la estructura cuaternaria heterognea, que se da cuando se unen subunidades de protenas diferentes (protmeros). Una protena constituida por protmeros es una protena oligomrica, que tiene una estructura cuaternaria heterognea. Cierto tipo de aminocidos y secuencias favorecen determinadas estructuras secundarias, terciarias y cuaternarias y, como cabe esperar lo que ms influye es la identidad y la secuencia de las cadenas laterales de los aminocidos, ya que stas son las que distinguen a las protenas. La influencia de las cadenas laterales es ms notoria en el plegamiento de las protenas globulares, que de forma natural tienden a plegarse en un medio acuoso, envolviendo los residuos de aminocidos no polares en un centro hidrofbico con una superficie hidroflica de residuos aminocidos polares. Esta distribucin asla del agua los residuos de aminocidos no polares y expone en la superficie los residuos de aminocidos cargados y polares para que interacten con el agua. 103

Figura 2.18. Relacin entre los cuatro niveles de la estructura proteica: (a) estructura primaria o covalente, (b) estructura secundaria, (c) estructura terciaria, (d) estructura cuaternaria 104

Figura 2.19. Esquemas de las estructuras de algunas protenas. (a) mioglobina, (b) hemoglobina, (c) virus de la poliomielitis, (d) virus del mosaico del tabaco 2.5.3.3 Propiedades de las protenas. Son sustancias anfteras. Se comportan como cidos y como bases. El pHI (q = 0) es caracterstico de una protena dada (Tabla 2.10). Depende del nmero, tipo y distribucin de los grupos cidos y bsicos de la molcula. Cuando una protena tiene una proporcin mayor de aminocidos bsicos presenta pHI alto; cuando la tiene menor, su pHI es bajo. La solubilidad de las protenas depende del pH. Son menos solubles a su pHI a este pH tienden a aglutinarse (coagularse) y precipitan de la solucin. Tabla 2.10. pHI de algunas protenas ______________________________ Protena pHI ______________________________ Pepsina < 1,1 Pepsingeno 3,7 Casena 4,6 Albmina de huevo 4,7 Albmina de suero 4,8 Ureasa 5,0 Insulina 5,3 Fibringeno 5,5 Catalasa 5,6 Hemoglobina 6,8 Ribonucleasa 9,5 Citocromo c 10,0 Lisozima 11,0 ________________________________ 105

2.5.3.4 Desnaturalizacin de las protenas. Se define como todo cambio que altere la configuracin tridimensional nica de una molcula de protena, sin causar una ruptura simultnea de los enlaces peptdicos. Junto con la destruccin de la estructura cuaternaria (si existe), terciaria y secundaria, tienen lugar cambios drsticos en la naturaleza fsica y bioqumica de la molcula. Entre las causas de la desnaturalizacin estn factores fsicos (calor, congelacin y radiacin ultravioleta); qumicos (oxidacin, reduccin, disolventes orgnicos, iones metlicos, fuerza inica y pH) o biolgicos (protelisis, modificacin y degradacin enzimtica). Entre los disolventes orgnicos y los iones metlicos pesados que causan la desnaturalizacin de las protenas, estn el etanol e isopropanol y el Hg+2, Ag+ y Pb+2, respectivamente. Los reactivos para alcaloides (cido pcrico y tnico), causan tambin la desnaturalizaci. Algunos de los efectos de la desnaturalizacin son: el descenso de la solubilidad, modificacin de la capacidad de fijacin de agua, prdidas de actividad biolgica (enzimtica, inmunolgica), incremento de la susceptibilidad al ataque por las proteasas a causa del desenmascaramiento de los enlaces peptdicos, incremento de la viscosidad (Medina, 1995), (Plou et al., 1999), (Viguera, 2003). 2.5.3.5 Biomembranas. Todas las clulas biolgicas se hallan rodeadas de una capa limtrofe denominada membrana plasmtica. Los organelos de las clulas eucariticas, como el ncleo las mitocondrias y los cloroplastos tienen su propio sistemas de membranas con estructura y funcin semejante a las de las membranas plasmticas. Papel biolgico de las membranas. Como barrera fsica, la membrana proporciona integridad estructural a la clula, dndole su aspecto y forma, empaquetando literalmente los componentes celulares. Su estructura es la responsable de la organizacin y separacin en compartimientos de las actividades bioqumicas que suceden dentro de los tejidos y las clulas. Sin embargo, como una clula no puede vivir en un estado totalmente aislado, la membrana tambin debe actuar como un filtro de selectividad dejando entrar a los nutrientes necesarios para su crecimiento y desarrollo, y permitiendo que salgan los productos de desecho. La clula tambin debe comunicarse con el medio que la rodea. Insertadas en el lado externo de las membranas plasmticas estn las protenas receptoras que unen hormonas como la adrenalina y la insulina, donde transmiten una seal qumica que regula los procesos metablicos del interior de la clula. En esta forma, los estmulos qumicos del lado externo de la clula pueden influir en la bioqumica intracelular. Por ltimo, algunas membranas especializadas contienen ensamblados proteicos que actan como sistemas de transduccin de energa. Las membranas mitocondriales contienen enzimas y otras protenas que convierten la energa liberada por la oxidacin de grasas y carbohidratos a la forma qumica de ATP. En los organismos fotosintticos, la energa luminosa es atrapada por pigmentos y transformada en energa qumica por protenas de las membranas de los cloroplastos. Componentes y estructura de la membrana. Las biomembranas son ensamblados supramoleculares de lpidos, protenas y carbohidratos. La proporcin de estos componentes vara segn la fuente de la membrana. Cada tipo de clula y organelo tienen funciones particulares que dependen de las propiedades de las membranas. La diversidad en la composicin de la membrana puede dar lugar a que sta desempee funciones muy 106

especficas que son necesarias para la individualidad de la clula. En la Tabla 2.11 se compara la composicin de diversos tipos de membranas. Tabla 2.11. Composicin de lpidos y protenas en varias membranas Fuente de membrana Lpidos (%) Protenas (%)

Mielina 80 18 Hgado de ratn 52 45 Extracto humano (plasma) 43 49 Hojas de maz 45 47 Mitocondria (externa) 48 52 Mitocondria (interna) 24 76 Excherichia coli 25 75 _________________________________________________________________________ La proporcin de protena a lpido puede ir desde 80:20 hasta 20:80. Las membranas poseen muchas caractersticas comunes a pesar de su composicin tan variada. En ellas no existen carbohidratos libres, estn unidos covalentemente con las molculas de lpidos y protenas. El contenido de carbohidratos, normalmente es de 5 % o menos y esta representado en los glucolpidos y las glucoprotenas. Entre los principales estn la galactosa, manosa, L-fucosa, glucosa, glucosamina, galactosamina y cido silico. Las colas de carbohidrato desempean funciones importantes como sitios de reconocimiento celular. La estructura general de la mayora de las membranas biolgicas consta de una bicapa lipdica constituida por fosfolpidos; que se mantiene unida mediante interacciones hidrofbicas, no covalentes. La parte hidrofbica del fosfolpido apunta hacia el interior, mientras que las porciones hidroflicas son las expuestas a la fase acuosa. En esta bicapa lipdica existen protenas parcial o totalmente embebidas. Las principales protenas poseen una regin altamente hidrofbica que es la que interacciona con las zonas muy apolares de las cadenas de cidos grasos. Algunas de estas atraviesan las membranas y ejercen dominio tanto en el interior como en el exterior de esta estructura. La estructura global de la membrana plasmtica se estabiliza mediante el establecimiento de puentes de hidrgeno y de interacciones hidrofbicas. Adems, cationes como el Mg+2 y el Ca+2 tambin contribuyen a la estabilizacin de la membrana a travs de las interacciones inicas con los grupos polares de carga negativa presentes en los fosfolpidos (Lehninger, 1995). Las propiedades dinmicas de la membrana celular, las llevan a cabo las protenas de la membrana. Dichas protenas son de distintos tipos funcionales, incluidas las enzimas, las protenas receptoras y las protenas de transporte. Las protenas de la membrana pueden clasificarse en dos categoras: protenas extrnsecas o perifricas que se hallan unidas a la superficie de la membrana; son relativamente polares y muy solubles en agua. Las protenas intrnsecas o integrales, que constituyen el 70 % o ms de la protena total de la membrana, estn unidas muy fuertemente a la porcin lipdica; siendo insolubles en 107

sistemas acuosos neutros. Estas solo pueden liberarse rompiendo la bicapa lipdica e interfiriendo con las interacciones hidrfobas que existen entre protenas y lpidos. Las protenas perifricas normalmente se encuentran normalmente unidas por interacciones inicas, no covalentes y por puentes de hidrgeno entre sus residuos de aminocido y residuos de aminocidos complementarios de las protenas integrales que estn expuestas sobre la superficie de la membrana. La mayor parte de las protenas perifricas probablemente funcionan como receptoras y enzimas. Las protenas integrales contienen grandes porciones de residuos de aminocidos hidrfobos que les permiten ocultarse en la regin no polar de la bicapa de lpido. Como estas protenas, por lo general, atraviesan la membrana, funcionan principalmente como protenas de transporte, facilitando el paso de molculas de soluto desde un lado de la membrana hacia otro. La membrana mitocondrial interna es una de las ms complejas; contiene aproximadamente 100 clases diferentes de cadenas polipeptdicas (Lehninger, 1995), (Cavarrubias et al., 2002). Se han propuestos varios modelos de estructura de membrana. La evidencia dada por los experimentos apoya el modelo de mosaico fluido, el cual afirma que los fosfolpidos de las membranas se hallan ordenados en bicapas formando una matriz o nima fluida de cristales lquidos, en la que penetran las protenas globulares parcial o completamente (Figura 2.20). En esta bicapa, las molculas lipdicas individuales pueden moverse lateralmente, dotando a la bicapa de fluidez, flexibilidad y adems de una resistencia elctrica elevada y de relativa permeabilidad respecto a las molculas muy polares. El modelo de mosaico fluido postula que las protenas de la membrana son globulares, para interpretar su alto contenido en hlice . Algunas de las protenas incrustadas estn en la superficie (protenas perifricas) y otras atravesando la bicapa completa (protenas integrales). Este modelo propone que existe un contacto ntimo entre lpidos y protenas. Las protenas flotan con cierta libertada dentro y sobre la bicapa, creando un patrn de mosaico fluido.

Figura 2.20. Modelo de mosaico fluido de las membranas biolgicas. Este modelo se compone de una bicapa de lpido en la que estn insertadas protenas integrales y perifricas. Los lpidos proporcionan el armazn estructural y las protenas funcionan como enzimas o como protenas de transporte 108

Las propiedades dinmicas de transporte tambin pueden explicarse con este modelo. Las molculas no polares, posiblemente difunden a travs de la membrana por la naturaleza hidrfoba de la regin central. Las molculas polares, hidroflicas, deben ser transportadas con ayuda de protenas especficas localizadas en la membrana.

2.6 CIDOS NUCLEICOS Son biopolmeros de elevado peso molecular, constituidos por unidades de mononucletidos. Aparecen en todas las clulas vivientes, en donde no slo almacenan y transmiten la informacin gentica, sino que tambin traducen esta informacin para realizar la sntesis precisa de las protenas caractersticas de cada clula individual. Rigen la actividad metablica de la clula. Cada tipo de cido nucleico se distingue por la secuencia de las bases heterocclicas caractersticas de sus monmeros nucleotdicos. 2.6.1 Estructura de los nucletidos. Cada nucletido contiene tres componentes caractersticos: una base nitrogenada heterocclica, que es un derivado de la purina o de la pirimidina; una pentosa y una molcula de cido fosfrico. 2.6.1.1 Bases pirimidnicas y purnicas: son derivados sustituidos de los compuestos pirimidina y purina (amina heterocclica que se compone de un anillo de pirimidina fusionado a un anillo de imidazol), respectivamente. Las bases nitrogenadas principales que se encuentran en los nucletidos, son tres derivadas de la pirimidina, el uracilo (U), la timina (T) y la citosina (C) y dos derivados de la purina, la adenina (A) y la guanina (G). Adems, de las anteriores existen en algunos cidos nucleicos pequeas cantidades de otros derivados de la purina y pirimidina como: 5-metilcitosina, 5-hidroximeticitosina, 6metiladenina y 2-metilguanina. En forma libre o no combinada estas bases se encuentran solamente en cantidades mnimas o trazas en las clulas, generalmente como productos de la hidrlisis enzimtica de los cidos nucleicos y de los nucletidos.

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Las bases pirimidnicas y purnicas libres son hidrfobas y relativamente insolubles en el agua con un pH cercano a la neutralidad como el de la clula. Tanto en pH cido como alcalino, estas bases se cargan y aumentan su solubilidad en el agua. Para la funcin biolgica de los cidos nucleicos son de crucial importancia no solamente las dimensiones de las bases sino tambin su capacidad para la formacin de enlaces de hidrgeno. 2.6.1.2 Nuclesidos. En los nuclesidos las bases de purina o de pirimidina se hallan unidas covalentemente mediante enlace -N-glucosilo al tomo de carbono 1 de la D-ribosa o de la 2-desoxi-D-ribosa. Existen dos series de nuclesidos: los ribonuclesidos, que contienen D-ribosa y los desoxirribonuclesidos, que contienen 2-desoxi-D-ribosa. Los nuclesidos libres slo se encuentran en cantidades mnimas en la mayora de las clulas, como productos de la hidrlisis qumica o enzimtica de los nucletidos. Los nuclesidos son mucho ms solubles en el agua que las correspondientes bases libres. Los nuclesidos purnicos se hidrolizan con cierta facilidad con los cidos para liberar la pentosa y la base libre. Sin embargo, los nuclesidos pirimidnicos son resistentes frente a la hidrlisis cida. Ambos tipos de nuclesidos se hidrolizan por nucleosidasas especficas.

6.1.3 Nucletidos. Son steres fosfato de los nuclesidos. Constituyen las subunidades fundamentales de los cidos nucleicos. Los ribonucletidos y los desoxirribonucletidos se encuentran libres en las clulas en cantidades significativas. Los nucletidos ms abundantes contienen fosfato unido mediante enlace ster al grupo 5hidroxilo de la 110

pentosa. Los nucletidos son compuestos bastante cidos debido a los residuos de cido fosfrico. En el pH fisiolgico, todos los protones estn disociados de los grupos fosfato, generando compuestos con varias cargas negativas. Los nucletidos celulares estn asociados con iones matlicos como Mg+2 y Mn+2 para neutralizar sus cargas. Todos los rinonuclesidos y desoxirribonuclesidos corrientes aparecen en las clulas no solamente en forma de 5-monofosfato, sino tambin en forma de 5-difosfatos y 5-trifosfatos (Tabla 2.12). Tabla 2.12. Abreviatura de los ribonuclesidos y desoxirribonuclesidos 5-fosfatos Ribonuclesidos 5-fosfatos Desoxirribonuclesidos 5-fosfatos Base MonoDiTriMonoDiTri_________________________________________________________________________ Adenina AMP ADP ATP dAMP dADP dATP Guanina GMP GDP GTP dGMP dGDP dGTP Citosina CMP CDP CTP dCMP dCDP dCTP Timina UMP UDP UTP dUMP dUDP dUTP _________________________________________________________________________ 111

Los nucleotidos sirven como sillares de los cidos nucleicos, pero tambin desempean otras funciones. El ATP es el principal transportador de energa qumica en la clula; la interconversin de ADP y ATP esta ligada a la transferencia de energa en el metabolismo: ATP + H2O ADP + Pi + energa Pi = HPO4-2

Otros nucletidos como guanosina trifosfato (GTP), uridina trifosfato (UTP), desoxiguanosina trifosfato (dGTP) y desoxiuridina trifosfato (dUTP); participan en menor grado en el metabolismo energtico pero son importantes en otros procesos biosintticos como la sntesis de cidos nucleicos. El UTP se requiere en la biosntesis de los carbohidratos y el CTP en la de los lpidos. Los nucletidos tambin tienen un papel importante como molculas de seal en la comunicacin celular. El GTP, AMP cclico y GMP cclico, son intermediarios transitorios que envan mensajes a travs de las membranas celulares mediante un sistema de transduccin de seales. El AMP cclico se obtiene a partir del ATP por accin de la enzima adeniciclasa que esta unida a la membrana celular. El AMP cclico es una hormona intracelular que transmite mensajes desde la membrana celular hacia el interior de la clula. Los nucletidos tambin son componentes de cofactores importantes tales como la coenzima A (CoA), la dinucletido de flavina y adenina (FAD) y de los dinucletidos de nicotinamida y adenina (NAD y NADP). 2.6.2 cido desoxirribonucleico (ADN). Es un cido nucleico que se encuentra casi exclusivamente en el ncleo celular. Para formar cidos nucleicos, los nucletidos se enlazan a travs de sus grupos fosfatos. As, el grupo 5-fosfato de un nucletido se une con el grupo 3-hidroxilo del siguiente nucletido; formando un enlace 3,5-fosfodister (Figura 2.21 (a)). En el ADN se encuentran enlazados muchos nucletidos, de ah que sea una molcula extremadamente larga con un tamao molecular definido y una secuencia que depende de la especie de origen. El ADN de las clulas procariticas simples como Escherichia coli (la cual tiene un solo cromosoma) es una molcula grande con una masa de 2,6 mil millones de daltons, 4,7 millones de pares de bases y una longitud aproximada 1,4 mm. El ADN eucaritico como el que se encuentra en los seres humanos tiene alrededor de 3 mil millones de pares de bases y una longitud total de la molcula extendida de por lo menos 1 2 m. El ADN nuclear de las clulas eucariticas est combinado con protenas bsicas denominadas histonas. Al igual que en la estructura de las protenas el ADN presenta una estructura primaria de los cidos nucleicos que corresponde a la secuencia de los nucletidos a lo largo de la cadena. La estructura secundaria del ADN se ha descrito como una doble hlice y la estructura terciaria corresponde a la forma que adopta el ADN nativo, intacto, siendo sta lineal y circular. En forma lineal las molculas de ADN existen en forma de barras extendidas con dos extremos. El ADN cromosomal de muchos microorganismos es, sin embargo, un circulo cerrado que se forma por la unin covalente de dos extremos de una doble hlice lineal. El ADN circular se ha descubierto en el virus 40 del simio (SV40), en fagos (X174), en bacterias (E. coli) y en varias especies animales. 112

La mayora del ADN celular se compone de dos hebras de polinucletido plegadas en una doble hlice (doble filamento). La doble hlice es estabilizada por dos tipos de fuerzas: puentes de hidrgeno entre bases complementarias de hebras opuestas e interacciones hidrfobas y de van der Waals.

Figura 2.21. Estructura qumica parcial del ADN (a) y del ARN (b). 113

Los dos filamentos se encuentran orientados uno frente a otro en tal forma que las bases nitrogenadas que se proyectan de cada uno quedan muy cercanas entre s y dirigidas hacia el interior de la doble hlice para proporcionar un medio hidrfobo. Los nucletidos de adenina y de timina pueden emparejarse estructuralmente, de manera que se establece un nmero mximo de dos enlaces de hidrgeno entre estas dos bases. Los de citosina y guanina pueden arreglarse espacialmente mediante la integracin de tres enlaces de hidrgeno. Estos enlaces hidrgeno intramoleculares explican la estructura secundaria del ADN y constituyen la fuerza fundamental que mantiene unidos a los dos filamentos de la molcula. Las porciones hidrfilas constituidas por la desoxirribosa y las cargas negativas de los oxgenos de los grupos fosfatos se presentan en el exterior de la doble hlice, lo cual facilita la interaccin con el agua. La proporcin cuantitativa de las bases en una macromolcula se adapta en ocasiones a las denominadas reglas de Chargaff, tales reglas se enuncian a continuacin (Hicks, 2001): La composicin de las bases del ADN generalmente vara de una especie a otra.

Las muestras del ADN aisladas de los diferentes tejidos de una misma especie se componen de las mismas bases. La composicin de las bases del ADN en una especie no cambia con la edad, el estado de nutricin o las modificaciones ambientales. En todos los ADN de diferentes especies el nmero de los residuos de adenina es igual al nmero de los residuos de timina (A = T) y el nmero de residuos de guanina es igual al nmero de citosinas (G = C); por ende A + G = T + C Las composiciones bsicas que se conocen varan notablemente de un organismo a otro. Esto se expresa claramente mediante lo que se conoce como relacin disimtrica (A + T)/(G + C). En otras palabras, la composicin bsica distinta entre los organismos se refleja en la variacin de su relacin disimtrica. Los organismos ntimamente relacionados suelen tener composiciones bsicas semejantes y, por tanto, los valores de sus relaciones disimtricas son muy parecidos. Watson y Crick postularon un modelo semiconservador de duplicacin de la molcula de ADN. Pensaron que durante la duplicacin del ADN (que probablemente ocurre durante la interfase de la mitosis), los dos filamentos se desenrollan y cada filamento acta como molde para la formacin de un nuevo filamento complementario. Los trifosfatos de desoxinuclesido, que probablemente existen en estado libre en el ncleo, de alguna manera atraen (segn las reglas de apareamiento) al ADN de un solo filamento desenrollado. En esta forma, se generan dos nuevos filamentos complementarios a los dos filamentos maternos. Conforme comienza a formarse las nuevas molculas hijas, toma la configuracin en espiral de la molcula progenitora (Mathews et al., 2002).

114

2.6.3 cido ribonucleico (ARN). Todos los tipos de ARN, sin importar su tamao o funcin biolgica, son sintetizados como molculas de una sola hebra. Se distingue del ADN por: Contener D-ribosa en vez de 2-desoxi-D-ribosa Contener la base pirimidnica uracilo en vez de timina. La relacin purina/pirimidina no es de 1:1 como en el ADN..

Ms que plegarse en un patrn peridico y uniforme como el ADN, las hebras nicas del ARN se doblan sobre s mismas y adoptan conformaciones que tienen varios elementos estructurales distintos, los cuales se encuentran dispersos a lo largo de toda la molcula de ARN (vueltas en horquilla, doble hlice a la derecha, asas internas y las protuberancias). Existen tres tipos de ARN, que difieren por su funcin bioqumica, masa molecular y estructura secundaria. 2.6.3.1 ARN mensajero (ARNm). El ARNm lleva el mensaje gentico del ADN a los ribosomas, sitios de sntesis proteica. Es complementario a un segmento del ADN. Al parecer, todos los ARN son sintetizados in vivo mediante un mecanismo de molde, a partir de una parte de la molcula de ADN. Cada molcula de ARNm, que acarrea el mensaje de un gen, tiene un tamao definido pero por su inestabilidad existencia transitoria, se conoce poco acerca de su estructura tridimensional (Boyer, 2000). 2.6.3.2 ARN de transferencia (ARNt). Son los tipos ms pequeos de ARN. Son los transportadores de aminocidos especficos que van a usarse en la sntesis proteica. Todos los ARNt contienen entre 74 y 93 nucletidos en una sola cadena. Todos los ARNt tienen una estructura secundaria y terciaria comn, la tpica forma de hoja de trbol es el patrn comn. Las caractersticas estructurales incluyen vueltas en horquilla, las regiones doble helicoidales y las asas (Boyer, 2000). 115

Figura 2.22. La figura de la izquierda corresponde al apareamiento de las bases A-T y G-C en la doble hlice del ADN. La figura de la derecha corresponde a las caractersticas generales de las estructuras secundara y terciaria del ARN

El ARNt fija (con ayuda de una enzima especfica) un aminocido en particular y lo conduce al sitio de sntesis proteica en el preciso instante en que lo especifique el cdigo gentico. Se halla muy enrollado sobre s mismo. Cada uno de los veinte aminocidos que se encuentran en las protenas posee, por lo menos, un ARNt correspondiente, y la mayora de los aminocidos tienen mltiples molculas de ARNt. Los ARNt contienen un gran porcentaje de bases secundarias, adems de las bases principales A, G, U y C (se han descubierto cerca de 30, casi todas formas metiladas de las bases principales). 2.6.3.3 ARN ribosmico (ARNr). Comprende el 80 % del ARN. La estructura secundaria y terciaria de las molculas de RNAt exhiben la mayora de los elementos de los RNAt; sin embargo, son ms grandes. Tienen extensas regiones donde se forman dobles hlices. Su funcin biolgica an se desconoce. Constituye un 60 % de los ribosomas (subestructura celular que sirve de sitio a la sntesis proteica). 2.6.4 Propiedades de los cidos nucleicos. Mediante qumicos y enzimas se pueden aislar el ADN y ARN (ARNm, ARNt, ARNr y ARN degradado). 116

 Las bases purnicas y pirimidnicas absorben la radiacin ultravioleta, correspondiente a una longitud de onda de 260 nm. Esta propiedad permite la determinacin cuantitativa de las bases, de sus nucletidos o de los propios cidos nucleicos. Cuando las molculas de ADN doble helicoidal se someten a condiciones relativamente moderadas de calor, cidos, bases o solventes orgnicos, las dos hebras se separan; presentndose la desnaturalizacin de la doble hlice. Cuando el agente desnaturalizante es una temperatura elevada, el proceso se denomina fusin porque sucede en un intervalo pequeo de temperatura (85-90 0C); a condiciones de pH extremo y posterior rpido enfriamiento. Si el enfriamiento ocurre lentamente se da el recocido o la renaturalizacin de los cidos nucleicos, es decir, la identificacin entre s de las dos cadenas (Boyer, 2000), (Hicks, 2001). El ARN es ms reactivo que el ADN debido a la presencia del oxidrilo en la posicin 2 de la D-ribosa. En presencia de soluciones alcalinas (NaOH 0,1 M y 25 0C) el ARN se hidroliza; mientras que el ADN en las mismas condiciones es bastante estable (Hicks, 2001). La fuente ms importante de alteraciones mutgenas la constituye el dao oxidativo producido por los radicales libres del oxgeno (Hicks, 2001) La hidrlisis enzimtica de los cidos nucleicos se puede dar por las enzimas: desoxirribonucleasas que actan sobre el ADN; las exonucleasas que se dividen en dos grupos las que requieren un extremo 3 y funcionan en la direccin 3 5 y las que reconocen el extremo 5 y funcionan en direccin 5 3; las endonucleasas varan en su capacidad cataltica sobre los ADN monocatenarios (una sola cadena) y bicatenarios (dos cadenas), algunas reconocen cierta secuencia de tres a seis bases y realizan la hidrlisis en sitios precisos. Las endonucleasas de restriccin, producidas principalmente por las bacterias, consisten en desoxirribonucleasas capaces de hidrolizar los enlaces fosfodister del ADN en sitios de reconocimiento sealados por secuencias especficas (Hicks, 2001). 2.6.5 Traduccin. El cdigo gentico determina la conexin entre la secuencia gnica (o el ARNm) y la secuencia proteica. Este cdigo es casi uniforme, aunque no completamente en todos los seres vivos. Es un cdigo redundante, con mltiples codones para la mayora de los aminocidos, e incluye seales de comienzo y de detencin. La traduccin de los ARNm en cadenas polipeptdicas se realiza en varios pasos. La traduccin de un ARNm en los ribosomas tiene tres etapas: iniciacin, elongacin y terminacin. El ARNm correspondiente a una protena se une al ribosoma. Cada aminocido especfico se acopla a una determinada molcula de ARNt, utilizando una serie de enzimas denominadas aminoacil-RNAt-sintetasas. Un triplete anticodn del ARNt se empareja con un triplete codn en el ARNm. A medida que el ribosoma se mueve a lo largo del ARNm, los aminocidos se transfieren uno a uno, a la cadena polipeptdica en crecimiento. La longitud de la cadena est limitada por tripletes especficos de iniciacin y parada en el cdigo gentico. Complementar con la lectura de traduccin del ARN, el cdigo gentico y el metabolismo de protenas (Boyer, 2000), (Matheus et al., 2002). 117

2.7 ENZIMAS Las enzimas son en su gran mayora molculas proteicas, sintetizadas por la clula viva, que actan como catalizadores biolgicos al permitir que las reacciones qumicas del metabolismo celular ocurran a una velocidad significativa, en condiciones ambientales extremadamente suaves compatibles con el mantenimiento de la viabilidad celular (pH cercano a la neutralidad y temperaturas moderadas). Se ha logrado disear nuevos catalizadores biolgicos que incluso mejoran el comportamiento de una enzima natural, como el citocromo P450 (Corma et al., 2003). 2.7.1 Caractersticas de las enzimas como catalizadores. La propiedad fundamental de una enzima, como cualquier catalizador, es aumentar la velocidad de una reaccin. Sin embargo, las enzimas se caracterizan por: Ser los catalizadores ms eficientes. En cantidades micromoleculares aceleran las reacciones celulares a velocidades extremadamente rpidas. Los catalizadores biolgicos aceleran entre 106 a 1012 veces la velocidad de las reacciones qumicas, a temperaturas suaves y presin atmosfrica (Plou et al., 1999). Ser muy especficas. Catalizan solamente una reaccin o un grupo muy limitado de ellas que estn muy relacionadas entre s. Condiciones especficas de reaccin. Las enzimas catalizan sus reacciones a temperaturas menores a 100 0C y a pHs cercanos a la neutralidad, mientras que los catalizadores qumicos frecuentemente requieren altas temperaturas y presiones, as como pHs extremos. Tener un grupo de reacciones catalizadas extremadamente amplio. Pudindose catalizar muchas ms reacciones que con los catalizadores qumicos. Tener su actividad sujeta a regulacin natural. Los mecanismos de este proceso regulador incluyen: control alostrico, modificacin covalente y variacin en la cantidad de enzima sintetizada. Cuando los mecanismos de control se alteran, por ejemplo, de las proteasas, stas se producen en exceso, a destiempo o donde no procede, apareciendo la artritis, la aterosclerosis, el cncer y otros procesos patolgicos de similar tenor. Las proteasas promueven el crecimiento de los tumores y fomentan la formacin de metstasis (Lpez, 2000). 2.7.2 Clasificacin de las enzimas. El primer criterio de clasificacin se basa en el tipo general de la reaccin qumica en la cual participa la enzima. Las enzimas tienen nombres oficiales que reflejan las reacciones que catalizan. Cada enzima tiene un nombre oficial internacional terminado en asa y un nmero de clasificacin que consta de cuatro dgitos, cada dgito se refiere a una clase y subclase de reaccin. En la Tabla 2.13, se da la resea parcial de la clasificacin sistemtica de las enzimas (Plou et al., 1999): 118

Tabla 2.13. Clasificacin de las enzimas _________________________________________________________________________ 1. OXIDO REDUCTASAS. Catalizan las reacciones en las cuales un sustrato se oxida (por lo que acta como un donador de hidrgeno) y otro sustrato se reduce. Las oxidoreductasas incluyen las deshidrogenasas, que convierten los enlaces simples en enlaces dobles, y las oxidasas, que utilizan oxgeno como oxidante. Otras enzimas de este grupo son las peroxidasas, que utilizan H2O2 como oxidante, las hidroxilasas, que introducen grupos hidroxilo y las oxigenasas, que introducen oxgeno molecular en lugar de un doble enlace en el sustrato. 2. TRANSFERASAS. Intervienen en las reacciones que implican la transferencia de un grupo intacto de tomos de una molcula dadora a una aceptora, por ejemplo, un grupo como aldehdo, cetona, acilo, amino, fosfrilo, etc., es transferido de una molcula a otra. 3. HIDROLASAS. Catalizan las reacciones que implican la ruptura hidroltica (por adicin de agua) de enlaces qumicos (C-O, C-N, C-C, P-O y otros enlaces simples). El intervalo de grupos hidrolizables es muy amplio e incluye steres, amidas, pptidos y enlaces glicosdicos entre otros. 4. LIASAS. Estas enzimas rompen los enlaces sin la adicin de agua, pero mediante reacciones de eliminacin para formar anillos o dobles enlaces. Actan sobre los enlaces C-C, C-O, C-N, C-S y C-halgeno. Este grupo incluye tambin enzimas que catalizan la reaccin inversa, es decir, la adicin de grupos transversalmente a dobles enlaces o anillos. Son ejemplos de ellas, las descarboxilasas, aldolasas y deshitratasas. 5. ISOMERASAS. Catalizan reacciones que implican cualquier tipo de isomerizacin, es decir, que alteran la estructura pero no la composicin atmica de los sustratos al cambiar un grupo de una posicin a otra en una molcula. Incluye este grupo a las racemasas, epimerasas, cis-trans isomerasas, oxidoreductasas intramoleculares, mutasas y transferasas intramoleculares. 6. LIGASAS. Catalizan la combinacin de dos compuestos acoplada a la ruptura de un enlace pirofosfrico en el ATP o compuesto semejante. Reacciones de sntesis. Incluyen enzimas que catalizan reacciones que forman enlaces C-O, C-S, C-N y C-C.

En funcin de su capacidad intrnseca para ser regulables o no, las enzimas pueden dividirse en dos grandes grupos (Hicks, 2001): Enzimas alostricas o regulables. Presentan, adems del sitio activo o isostrico, otros sitios no catalticos o alostricos, capaces de aceptar molculas interaccionantes que ejercen un efecto regulador sobre el sitio activo, al modificar las caractersticas esteroisomricas de la protena y como consecuencia del sitio activo. La regulacin puede 119

ser de dos tipos: activacin alostrica, mecanismo en el cual la enzima aumenta su afinidad por el sustrato, as como su velocidad de catlisis, e inhibicin alostrica, que implica una modificacin en la protena que da como resultado una disminucin en la velocidad de reaccin o en la afinidad por el sustrato. Este efecto inhibitorio se ejerce tambin en el sitio alostrico. Enzimas isostricas. Las enzimas no son reguladas por molculas diferentes de su sustrato o productos de la reaccin que catalizan. 2.7.3 Aplicaciones de las enzimas. Aunque se tienen procesos en que se emplean clulas enteras como catalizadores, predominan los enzimticos. Se conocen ms de 2000 enzimas, pero slo se explotan unas 400. En su mayora se trata de enzimas extracelulares y de origen microbiano. Su uso en medicina representa el 52 % del valor total, en aplicaciones analticas el 6 % y en aplicaciones industriales el 42 %. En trminos globales de produccin es la industria la que consume el mayor porcentaje de biocatalizadores. El 80 % de las enzimas utilizadas en procesos industriales son hidrolasas; se destacan las proteasas (detergentes) y las carbohidrasas (amilasas). Hallan aplicacin en la industria de detergentes (32 % del volumen total), almidn (15 %), lctea (14 %) y textil (19 %). El resto se reparte entre alimentacin (cervecera, panadera, grasas y aceites, zumos, vino, sabores, piensos para animales y otros), curtidos, papel, combustibles, eliminacin de residuos y biotransformaciones. Se prev que en los prximos aos pasen a primer plano las enzimas que intervienen en el tratamiento de la pasta de papel (sustituyendo el proceso de blanqueado con cloro ), en la eliminacin de residuos y en la produccin de compuestos qumicos y farmacuticos (Plou et al., 1999). 2.7.3.1 Catalizadores en procesos industriales. Bien sea en calidad de aditivo para modificar alguna propiedad funcional de un producto o bien como catalizador de un proceso para fabricar un producto derivado de la accin enzimtica sobre una cierta materia prima. En la Tabla 2.14 se presenta una relacin de las enzimas de mayor importancia industrial (Illanes, 1994). 2.7.3.2 En anlisis. La sustancia a analizar es sometida a la accin de una enzima especfica que la convierte en un producto, que puede ser cuantificado a travs de la medida de un parmetro asociado, como absorcin de luz, emisin de luz, generacin de calor, etc. Se requiere un alto grado de pureza de la enzima. Existen cuatro formas fundamentales de aplicacin de enzimas en anlisis (Illanes, 1994): Cintas enzimticas. Representan el sistema ms tradicional y rudimentario. Las cintas de celulosa impregnadas con colorantes y con glucosa oxidasa- peroxidasa inmovilizada, sirven para determinar niveles de glucosa en la sangre y en la orina. Acoplamiento en lnea de un reactor enzimtico a un aparato analtico de deteccin del producto de reaccin enzimtica. Generalmente se usa un reactor tubular de lecho empacado con la enzima inmovilizada, ubicado en lnea con el aparato de

120

Tabla 2.14. Enzimas de relevancia industrial _________________________________________________________________________ Origen Aplicacin

Carbohidrolasas , amilasas -amilasa -amilasa Glucoamilasa Pectinasa Celulasa Lactasa -galactosidasa Invertasa Proteasas Papaina Bromelina Pepsina Renina Proteasa fngica Proteasa alcalina Otras hidrolasas Penicilina acilasa Aminoacilasa Lipasa Pancreatinasa Oxido-reductasas Glucosa oxidasa Catalasa

Cereales germinados Hongo Bacteria Moho Moho Moho Moho, levadura Moho Levadura

Cervecera, licores, panificacin Panificacin, confitera Edulcorantes, textil, cervecera Edulcorante, cervecera Vitivincola, frutcola Farmacutica, alimentaria, textil Lctea Azcar de remolacha Edulcorante, confitera

Vegetal Vegetal Animal Animal, moho Moho Bacteria

Cervecera, crnica y farmaceut. Farmacutica Farmacutica, panificacin Quesera Panificacin Detergente, pesquera

Bacteria Bacteria Bacteria, moho Animal

Farmacutica Alimentos fortificados Lctea, panificacin, farmacut.

Moho Bacteria

Alimentos preservados, bebidas Lctea

Isomerasas Glucosa isomerasa Bacteria Edulcorantes _________________________________________________________________________

deteccin del producto de la reaccin enzimtica. Ejemplos de estos sistemas lo constituyen el anlisis de cido lctico y glucosa, donde se dan las reacciones: NAD+ LDH 121

1.

lactato

piruvato

NADH2

1. 2.

glucosa NADH2

+ +

NAD+ DP|ox.

GDH

gluconato + NAD+ +

NADH2 DP|red.

LDH: lactasa deshidrogenasa. GDH: glucosa deshidrogenasa. La Tabla 2.15 recopila algunos ejemplos de sistemas acoplados de anlisis con enzimas inmovilizadas. Tabla 2.15. Sistemas acoplados de anlisis con enzimas inmovilizadas Enzima Sustrato analizado Compuesto detectado Detector

Glucosa oxidasa-peroxidasa Glucosa Cromforo oxidado Espectrofotmetro Hexoquinasa-glucosa 6 fosfato deshidrogenasa Glucosa NADH Espectrofotmetro Lactato deshidrogenasa c. lctico NADH Espectrofotmetro Alcohol deshidrogenasa Etanol NADPH Espectrofotmetro Nitrato reductasa Nitrato Azocompuesto Espectrofotmetro Ureasa Urea CO2 Respirmetro Luciferasa ATP Luz Luminmetro Luciferasa bacteriana NADH Luz Luminmetro _________________________________________________________________________ Inclusin de la enzima como parte integral del aparato analtico. Electrodo enzimtico. Esta compuesto bsicamente de un sensor electroqumico y una enzima inmovilizada en la proximidad de la superficie sensible del sensor. El sensor electroqumico, que puede ser un electrodo convencional o de ion selectivo, tiene en su parte inferior una membrana permeable a la sustancia a detectar por el elemento sensor; bajo esta membrana se ubica la enzima inmovilizada, la cual esta a su vez contenida mediante una segunda membrana que la separa del medio de anlisis. El sustrato a analizar difunde a travs de la membrana exterior protectora hasta la enzima inmovilizada, reacciona, y el producto a su vez difunde a travs de la membrana interior selectiva hasta el elemento detector (Figura 2.23). Los detectores basales empleados en la fabricacin de electrodos enzimticos pueden ser amperomtricos (polarogrficos y galvnicos) o potenciomtricos. Los electrodos enzimticos permiten a partir de un electrodo convencional o de ion selectivo la

122

cuantificacin de una amplia gama de compuestos orgnicos. (Schultz, 1991). Tabla 2.16 se indican algunos ejemplos.

En la

Figura 2.23. Esquema de un electrodo enzimtico. (1) sensor electroqumico, (2) sello, (3) membrana interior selectiva, (4) enzima inmovilizada, (5) membrana exterior protectora.

Tabla 2.16. Enzima

Electrodos enzimticos Sustrato analizado Glucosa Etanol Urea cido rico Penicilina Aminocidos Colesterol Compuesto detectado O2 H2O2 NH4+ CO2 H+ O2 O2 Tipo de electrodo base O2 disuelto, Pt-Ag Pt-Ag Ion selectivo pCO2 pH O2 disuelto, Pt-Ag O2 disuelto, Pt-Ag

Glucosa oxidasa Alcohol oxidasa Ureasa Uricasa Penicilinasa Amino cido oxidasa Colesterol oxidasa

Trazadores de diagnstico clnico. Se presenta en el uso de enzimas en inmunoensayo. El anticuerpo se inmoviliza en un soporte slido que permite extraer selectivamente el antgeno de la muestra. El antgeno capturado es expuesto a un complejo anticuerpo-enzima que se une en forma especfica al antgeno inmovilizado. La actividad de la enzima inmovilizada puede correlacionarse con la cantidad de antgeno en la muestra. (peroxidasa, fosfatasa, glucosa 6 fosfato deshidrogenasa, etc.). 2.7.3.3 En medicina. Como agente teraputico, distinguindose las aplicaciones convencionales de administracin tpica u oral y las sofisticadas, en las cuales se pretende utilizar la enzima para suplir una deficiencia metablica congnita, resolver un trastorno funcional o atacar selectivamente clulas malignas. Se requiere un alto grado de pureza, 123

alta estabilidad a las condiciones de temperatura y pH fisiolgicos, baja antigenicidad y accesibilidad al sitio corporal de destino. Aplicaciones teraputicas convencionales. La mayor parte de las enzimas de uso teraputico convencional son hidrolasas de origen vegetal o animal. En la Tabla 2.17 se indican las ms representativas de este grupo. Tabla 2.17. Aplicaciones teraputicas convencionales Enzima Origen Funcin

Ayuda-digestiva Ayuda-digestiva Ayuda-digestiva Ayuda-digestiva Ayuda-digestiva Ayuda-digestiva Antinflamatorio Antibronquitis Ananas comosus Antinflamatorio Serratia sp. Antinflamatorio Penicillium funiculosum Tratamiento caries Estreptococcus sp. Agente tromboltico Orina Agente tromboltico Clostridium hystolyticum Tratamiento quemaduras Clara de huevo Oftalmologa, potenciador de antibiotic. _________________________________________________________________________ Aplicaciones extracorpreas (ex-vivo) En este tipo de sistemas el torrente sanguneo del paciente es derivado hacia un circuito externo a travs de un reactor enzimtico, en el que se logra el efecto deseado. Este tipo de aplicacin es til para la remocin selectiva de metabolitos txicos y de nutrientes de clulas malignas. Los casos ms estudiados son la eliminacin de urea mediante ureasa inmovilizada (rin artificial enzimtico) y de asparagina mediante asparaginasa inmovilizada. Otros casos de importancia se indican en la Tabla 2.18. Tabla 2.18. Aplicaciones de enzimas en forma extracorprea Enzima Enfermedad Tipo de reactor enzimtico _________________________________________________________________________ -galactosidasa Arginasa Bilirrubina oxidasa Mal de Fabry Hiperargininemia Ictericia 124 Empacado con sefarosa Fibra hueca Empacado con sefarosa

Pancreatina Pepsina Amilasa Papaina Celulasa Lipasa Tripsina -quimotripsina Bromelina Peptidasa Dextranasa Estreptoquinasa Uroquinasa Colagenasa Lisozima

Pncreas porcino Mucosa estomacal porcina Aspergillus sp. Carica papaya Aspergillus sp. Pncreas porcino Pncreas bovino

Heparinasa Remocin heparina Empacado con sefarosa Enzimas microsomales Falla heptica Empacado con agarosa alanina amonio liasa Fenilcetonuria Fibra hueca UDP glucuronil transferasa Falla heptica Empacado con agarosa Aplicaciones intracrporeas (in vivo). Presenta problemas por la respuesta del sistema inmunolgico del paciente y la accin de proteasas endgenas. La administracin intracorprea puede hacerse a nivel subcutneo, intramuscular, gastrointestinal, intraperitoneal, intravenoso o intraarterial. Se utilizan eritrocitos vaciados o liposomas como soporte. En ambos las enzimas son encapsuladas e inyectadas al torrente sanguneo. En la Tabla 2.19 se indican algunos ejemplos representativos de este tipo de aplicaciones. Tabla 2.19. Aplicaciones de enzimas en forma intracorprea _________________________________________________________________________ Enzima -glucosidasa Arginasa Asparaginasa - glucuronidasa Catalasa Fibrinolisina Proteasa bacteriana alanina amonio liasa Uricasa Uroquinasa Enfermedad Soporte

Glicogenosis Hiperargininema Cncer Mucopolisacaridosis Acatalasemia Trombosis Cistitis Fenilcetonuria Gota Trombosis

Albumina Polietilenglicol Poliacrilamida, liposomas Eritrocitos vaciados Colodin Sephadex Aminoetilcelulosa Polietilenglicol Polietilenglicol Agarosa

2.7.3.4 Otras aplicaciones. Utilizacin de enzimas en procesos de sntesis de compuestos qumicos. Uso de enzima degradativas en los procesos de sntesis en medios orgnicos. Uso de enzimas en sistemas electroqumicos ( celdas de combustin, bateras bioqumicas). Conversin de energa solar en energa qumica. Utilizacin de enzimas en el tratamiento de efluentes industriales contaminados. 2.7.4 Propiedades de las enzimas. Todas las enzimas descubiertas son protenas. Las estructuras de las protenas son estabilizadas por dos clases de enlaces fuertes (peptdicos y disulfuro) y tres clases de enlaces dbiles (puentes de hidrgeno, hidrfobos y electrostticos o salinos). Entre las propiedades de las enzimas derivadas de su estructura proteica estn:

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2.7.4.1 Estabilidad. Los catalizadores biolgicos (enzimas, ribozimas y anticuerpos catalticos) son estructuras lbiles, inestables. Su estabilizacin resulta fundamental en aplicaciones industriales, mdicas y analticas (Plou et al., 1999), (Mathews et al., 2002). La actividad de una enzima depende del mantenimiento de una configuracin particular, denominada estructura nativa. La configuracin nativa de una enzima es la resultante de muchas fuerzas de interaccin. Los cambios ambientales, incluso muy suaves, pueden debilitar estas interacciones alterando la estructura tridimensional nativa y provocando la prdida total o parcial de su funcionalidad biolgica (desnaturalizacin). La alteracin de la estructura cuaternaria es frecuentemente reversible, pudiendo recobrarse la capacidad cataltica; la alteracin de la estructura terciaria, en cambio, es frecuentemente irreversible y lleva asociada una prdida total o parcial de la actividad; la alteracin de la estructura secundaria es irreversible, provocando un efecto de coagulacin y la inactivacin total de la enzima (Plou et al., 1999), (Viguera, 2003). Como ya se mencion, contra la integridad de las enzimas atentan factores fsicos (calor, congelacin y radiacin), qumicos (oxidacin, reduccin, disolventes orgnicos, iones metlicos, fuerza inica y pH) o biolgicos (protelisis, modificacin y degradacin enzimtica), que merman su actividad cataltica y solubilidad (Plou et al., 1999). Las enzimas son catalizadores muy sensibles a la temperatura. Un aumento del nivel trmico se traduce en un incremento de la energa vibracional que puede provocar la ruptura de puentes de hidrgeno y la destruccin de interacciones apolares. La fuerza inica del medio afecta la estabilidad de la enzima producindose, a bajos valores de fuerza inica, una disminucin de las interacciones enzima-solvente y un incremento de las interacciones inicas intracadena que pueden desestabilizar su estructura. Por ello, debe evitarse manipular enzimas en soluciones de baja fuerza inica como, por ejemplo, en agua destilada. Por otro lado, las sales disociables en concentraciones moderadamente altas son agentes protectores de la estabilidad de la enzima. El pH afecta fuertemente la estabilidad. La carga de los residuos aminoacdicos de la protena depende de la concentracin de protones en el medio. Valores de pH que provoquen acumulacin de cargas (negativas o positivas sobre o bajo el punto isoelctrico) pueden provocar desestabilizacin de la estructura de la enzima debido a las fuerzas de repulsin. Los solventes orgnicos menos polares que el agua, pueden ejercer un fuerte efecto desnaturante al alterar el patrn de puentes de hidrgeno e interacciones apolares y magnificar las fuerzas electrostticas de interaccin entre residuos aminocdicos, al disminuir la constante dielctrica del medio. Los detergentes son tambin fuertemente desnaturantes al producir complejos protena-detergente altamente cargados (Illanes, 1994). 2.7.4.2 Capacidad cataltica. La capacidad cataltica o actividad de la molcula enzimtica, representa el mximo potencial cataltico de la enzima para un conjunto de condiciones ambientales dadas. Reside en el sitio activo, el cual comprende un nmero bastante reducido de residuos de aminocidos, prximos en la estructura tridimensional aunque lejanos en la estructura primaria. Las enzimas pierden sus propiedades catalticas al desnaturalizarse. 126

El sitio activo es relativamente pequeo cuando se compara con el resto de la enzima, ya que est constituido por una regin que contiene pocos aminocidos. ste tiene una forma tridimensional. Algunos aminocidos interactan ms frecuentemente que otros con el sustrato debido a la carga o caractersticas de sus grupos funcionales libres de la cadena peptdica. El sustrato se une a las enzimas por fuerzas relativamente dbiles. Al interactuar el sitio activo con el sustrato, se forma un complejo tan compacto que en su espacio intermolecular no cabe ni la molcula de agua. El sitio activo contiene varias zonas polares, que son esenciales para el enlace y la catlisis, as mismo, posee otras regiones no polares, en las que el sustrato interacta con mayor o menor intensidad, segn sus caractersticas. El sustrato debe tener una forma, tamao y caractersticas de carga para interactuar con el sitio activo, sin embargo, trabajos recientes sugieren que el sitio activo de algunas enzimas no es rgido, ya que su estructura se modifica al unirse al sustrato; presentndose que el sitio activo tenga una forma complementaria al sustrato solamente despus de establecida la unin (reconocimiento dinmico inducido).

Cofactores. Diversas enzimas slo catalizan las reacciones de sus sustratos en presencia de una o ms molculas especficas, pequeas y termoestables, conocidas como cofactores.. Los cofactores pueden ser iones inorgnicos, tales como el Zn++, Mg++, Mn++, Fe++, Fe+++, Cu++, K+ y Na+ o materiales orgnicos ms complejos, tales como metionina activa, sulfato activo, NAD+, NADP+, FAD, FMN, CoQ, CoA, cido lipoico, tiamina, biotina, niacina, riboflavina, cido flico, piridoxina, cido pantotnico, pirofosfato, ATP, UTP, CTP, adelinatos de aminocidos, etc. Los cofactores orgnicos se denominan generalmente Coenzimas. El complejo proteico protena-cofactor se denomina Haloenzima (catalizador ptimamente activo) y el componente proteico se llama Apoenzima (Lehninger, 1995). Algunas enzimas requieren 2 o 3 cofactores distintos y frecuentemente uno de ellos es un in metlico. Los cofactores pueden estar fuertemente ligados a la estructura proteica de la enzima, adquiriendo un rol cataltico al igual que ella, o bien, asociados libremente a la enzima durante el proceso cataltico, adquiriendo entonces un rol estequiomtrico con relacin al sustrato transformado, tal como se ilustra en el esquema: 127

Enzima sin requerimiento de cofactores.

Enzima con requerimiento de cofactores ligados (catalticos).

Enzima con requerimiento de cofactores disociables (estequiomtricos).

2.7.4.3 Especificidad. En la especificidad, dos hechos estructurales son determinantes. Por un lado, el sustrato posee los enlaces qumicos que pueden ser atacados por los grupos funcionales del centro activo de la enzima; por otro lado, el sustrato posee a su vez grupos funcionales que se unen a la enzima, permitiendo su correcta ubicacin en el centro activo, para que la reaccin tenga lugar. La enzima no discrimina entre sustratos, sino que se muestra especfica para un enlace qumico particular adyacente a un grupo determinado. Especificidad absoluta. nicamente catalizan una reaccin en particular de un sustrato en particular y no tienen efecto cataltico sobre sustratos estrechamente relacionados. Por ejemplo, la ureasa cataliza la hidrlisis de la urea, pero no la de la metil urea o tiourea. Especificidad estereoqumica. Tienen especificidad frente a una forma estereoismera de un sustrato. La deshidrogenasa del cido lctico cataliza la oxidacin del L-lctico que se encuentra en las clulas musculares, pero no la del cido D-lctico que se halla en ciertos microorganismos. La fumarasa adiciona agua al cido fumrico, pero no lo hace a su ismero cis, el cido maleico. Especificidad de grupos. Son menos selectivas en cuanto a que actan sobre molculas de estructura semejante con los mismos grupos funcionales. Muchas de las peptidasas pertenecen a esta categora. La pepsina hidroliza a todos los pptidos que poseen aminocidos aromticos adyacentes. Las carboxipeptidasas ataca a los pptidos del extremo carboxilo de la cadena, separando uno a uno los aminocidos.

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 Especificidad de enlaces. Son las menos especficas. Atacan a un tipo de enlace qumico en particular, sin importar las caractersticas estructurales en la vecindad del enlace. Las lipasas, que catalizan la hidrlisis de los enlaces ster de los lpidos, son un ejemplo de este tipo de enzimas. 2.7.5 Actividad enzimtica y su medicin. La capacidad cataltica o actividad enzimtica es la propiedad esencial de una enzima. Desde un punto de vista termodinmico la enzima, como todo catalizador, acta disminuyendo la magnitud de la energa de activacin que requiere una reaccin de transformacin de sustrato a producto. Desde un punto de vista cintico la accin de la enzima se traduce en un incremento en la velocidad de transformacin de sustrato a producto. Dado que en ausencia de enzima la velocidad es generalmente despreciable, la cuantificacin de la actividad enzimtica esta justamente basada en la medicin de la velocidad de reaccin. De esta forma en la reaccin: E S P se tendr que: v = dP/dt = - dS/dt La velocidad de reaccin disminuye continuamente a partir de un valor mximo inicial. Esta disminucin puede deberse a la desaturacin de la enzima con sustrato, por la disminucin de la concentracin de sustrato, a la inactivacin de la enzima, a la inhibicin por producto o al desplazamiento del equilibrio, si la reaccin es en algn grado reversible. Al fin de normalizar su medicin, se acostumbra a identificar el valor de la actividad enzimtica con el de velocidad inicial de reaccin, donde la influencia de los factores sealados es despreciable. De esta forma se tiene: a = vt = 0 = (dP/dt)t = 0 = (dS/dt)t = 0 Ecuacin 1

La actividad enzimtica as definida representa, por lo tanto, el mximo potencial cataltico de la enzima para un conjunto de condiciones ambientales dadas. Si el producto P o el sustrato S son cuantificados analticamente, la actividad enzimtica se podr calcular a partir de la Ecuacin 1. Si la enzima requiere cofactores disociables de naturaleza estequiomtrica se tendr:

v = -dCoE/dt = dCoE/dt

Si ni S ni P son detectables, puede hacerse uso de reacciones acopladas (de naturaleza enzimtica o no) que transformen la seal de P en una seal de Z fcilmente medible. E A S P B X C Y

v = dP/dt = dZ/dt

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El anlisis de la actividad enzimtica puede realizarse en forma continua o discreta. En el primer caso, la seal de salida del aparato analtico se registra continuamente, pudiendo evaluarse la actividad como la pendiente inicial en el grfico (P o S o Z) versus t. En el anlisis discreto, las muestras son analizadas a intervalos de tiempo, dibujndose luego la curva y evaluando la actividad enzimtica como la pendiente de la zona lineal inicial de la curva. El lapso de tiempo durante el cual la velocidad es constante (intervalo de linealidad), depende de la concentracin enzimtica. Por ello, se recomienda conocer anticipadamente el intervalo aproximado de concentracin enzimtica en que se obtiene relacin lineal P (o S o Z) versus t, para tiempos de reaccin razonablemente breves, que eviten el efecto de factores de no-linealidad y suficientemente prolongados para minimizar el error experimental en las mediciones. En el anlisis de actividad enzimtica se debe utilizar un blanco o testigo adecuado. El objetivo es discriminar cualquier generacin de productos por causas distintas a la reaccin enzimtica. Entre los mtodos analticos disponibles para cuantificar la actividad enzimtica, la espectrofotometra es la tcnica de mayor importancia por su simplicidad, versatilidad, sensibilidad y bajo costo. Existe tambin la fluorometra, la manometra y la polarimetra. La actividad enzimtica se expresa en unidades de actividad. La unidad internacional de actividad (u.i.) se define como la cantidad de enzima que cataliza la transformacin de un micromol de sustrato por minuto en condiciones ambientales definidas (concentracin del sustrato saturante y pH y temperatura ptimos). Como alternativa a la u.i., la misma Unin Internacional de Bioqumica propuso el katal (kat) que remplaza micromoles por minuto por moles por segundo. 2.7.6 Produccin de enzimas. Las enzimas pueden ser obtenidas por extraccin de clulas de animales, vegetales y microorganismos. Las enzimas microbianas han ido desplazando gradualmente a las enzimas de tejidos. En la actualidad slo se usan unas 25 especies (8 bacterias, 4 levaduras y 11 mohos) para producir la casi totalidad de las enzimas microbianas comerciales. Los organismos productores de enzimas ms tiles y mejor conocidos son los Aspergillus niger, Aspergillus orizae y Bacillus subtiles. En general, las enzimas bacterianas tienden a tener un pH ptimo alcalino o neutro y con frecuencia son termoestables; en tanto, que las enzimas fngicas, tienden a tener un pH ptimo cido o neutro y no son termoestables. 2.7.6.1 Ventajas de los microorganismos como productores de enzimas. Pueden obtenerse en abundantes cantidades, econmicamente, de forma regular y de calidad uniforme. Ser ms estables que las homlogas de las plantas o animales.

La alta productividad de enzima, como consecuencia de la elevada velocidad metablica de los microorganismos.

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 La enorme variedad de vas metablicas (y, por tanto, de enzimas) que existen, no slo en el mundo de los microorganismos en general, sino incluso dentro de una sola especie. Poder crecer en un amplio intervalo de condiciones ambientales.

La mayor flexibilidad gentica de los microorganismos, lo que supone una mayor facilidad para su manipulacin, con el fin de incrementar el rendimiento de enzima. Permitir la produccin a gran escala de una manera econmica, debido a que se tienen ciclos de fermentacin cortos y medios de cultivo de bajo costo. Tener un proceso de produccin ms fcil y seguro, que el seguido con plantas y animales. Al estar la enzima animal o vegetal, a diferencia de la microbiana, localizada en un tejido u rgano; se debe separar esa porcin del rgano del resto y se han de eliminar los residuos, incrementndose los costos de produccin. La predactibilidad en el rendimiento de enzima y la ausencia de variaciones estacionales.

El acumular las plantas superiores productos de desecho en las vacuolas, los cuales son frecuentemente inhibidores enzimticos y txicos. La estabilidad del mercado en enzimas microbianas.

Tener que los procedimientos de Screening son simples y millares de cultivos pueden ser examinados en un tiempo razonablemente corto. 2.7.6.2 Recuperacin de enzimas extracelulares e intracelulares. En la recuperacin de una enzima se engloban todas aquellas operaciones que van desde el proceso de sntesis por parte del organismo productor, hasta la obtencin de un preparado capaz de ser sometido a purificacin o a formulacin, de acuerdo con las exigencias del caso. Las enzimas se obtienen mediante tcnicas de fermentacin aerobia de cultivo sumergido o mediante cultivo de superficie. Dentro de las operaciones intermedias de recuperacin estn las de separacin slido - lquido, las de extraccin celular y las de concentracin.

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2.7.6.2.1 Operaciones de separacin slido-lquido. Incluyen: La separacin de clulas del caldo de cultivo La remocin de desechos celulares La recoleccin de precipitados La recuperacin de adsorbentes protenicos adicionados al caldo. La separacin de macromolculas disueltas en solucin.

Entre las propiedades a tener en cuenta en las operaciones de separacin estn: la densidad, el tamao y la compresibilidad de las clulas; la naturaleza del caldo; el pH y la temperatura. En muchos casos puede ser mejorada la separacin por: la adicin de facilitadores de la filtracin y de agentes floculantes, variacin del pH, uso de coloides con carga contraria, uso de enzimas clarificantes, eleccin de una cepa ms fcil de separar y control de las condiciones de fermentacin. Los mtodos de separacin de slidos en suspensin se clasifican de acuerdo con el tipo de fenmeno en que se basan: Gravitacin: centrifugacin y floculacin. Accin mecnica: filtracin y dilisis. Accin de superficie: adsorcin, intercambio inico y flotacin. Accin elctrica: electroforesis y electrodilisis.

De todos ellos los ms utilizados son la centrifugacin y la filtracin, aunque ambos ofrecen dificultad, debido al pequeo tamao de las clulas, su baja densidad y su compresibilidad. Centrifugacin. Se usa frecuentemente para el caso de microorganismos unicelulares (levaduras y bacterias), con una floculacin previa natural o inducida. La eficiencia de la centrifugacin aumenta con: el tamao de la partcula, diferencia de densidades entre la partcula y el fluido, baja viscosidad del fluido, velocidad angular elevada, amplio radio de giro de la centrfuga, pequeo espesor de la capa de sedimentacin. Entre los tipos de centrifugas utilizados estn: la tubular, la multicmara, de disco, de tornillo y de cesta. 132

 Filtracin. Es adecuada para la separacin de microorganismos multicelulares (hongos, actinomicetes) de los caldos de fermentacin. Puede tambin ser utilizada para flculos de levadura. Dado el carcter compresible de las clulas, es generalmente necesario una ayuda filtrante. La velocidad de filtracin es funcin de: la superficie del filtro, la viscosidad del fluido, la cada de presin a travs del material del filtro y de la pasta depositada sobre el filtro. Entre los tipos de filtros utilizados se tienen: el de plato y marco, el rotatorio de tambor a vaco y los filtros con membranas microporosas (filtracin cruzada o tangencial) Floculacin y coagulacin. La centrifugacin y la filtracin se pueden mejorar cuando se produce la agregacin de las partculas. Floculacin. Se presenta cuando un agente que a menudo se encuentra en soluciones muy diluidas (3 ppm) une las partculas para producir agregados. Coagulacin. Es la adherencia directa de unas partculas con otras directamente, como ocurre cuando se neutralizan sus cargas y se produce la coalescencia. Estas tcnicas se pueden aplicar a clulas enteras, restos de clulas o bien protenas solubles. 2.7.6.2.2 Operaciones de extraccin de enzimas intracelulares. Se refiere a las operaciones de liberacin de las enzimas de las clulas o de los constituyentes celulares. Los componentes de las clulas tienen una alta presin osmtica y estn encerrados por una membrana semipermeable y frgil, protegida por una pared rgida y fuerte. Presin. Existen diversos equipos diseados para la disrupcin celular, basados en la aplicacin de presin a suspensiones celulares con o sin adicin de abrasivos. Cizalla slida. Se congela una pasta de clulas (-20 oC) y se hace pasar a alta presin, a travs de un pequeo orificio. La rotura se produce al aplicar las fuerzas de corte sobre las clulas que pasan a travs del orificio, as como por el desgarro con los cristales de hielo presentes en la pasta congelada. No hay peligro de desnaturalizacin trmica. Se utiliza la prensa de Hules y la prensa X. Cizalla lquida. Se hace pasar suspensiones de clulas a alta presin, a travs de un pequeo orificio que comunica con una cmara a presin atmosfrica. Las clulas explotan por la sbita descompresin. Existe peligro de desnaturalizacin trmica. El equipo ms utilizado es el homogenizador de Manton-Gaulin. Molienda o agitacin con abrasivos. La ruptura se logra por una combinacin de esfuerzos de corte y compresin. Los equipos ms utilizados son el molino de bolas, el agitador Mickle y el molino de Dyno-Mill. Sonicacin. Se aplican frecuencias que estn por encima del lmite perceptible por el hombre, ultrasonidos de frecuencias superiores a 20 kHz, que producen lo que se denomina cavitacin gaseosa, es decir, aparecen reas donde se produce el rpido intercambio de 133

fenmenos de compresin y expansin. Cuando las burbujas gaseosas que se producen se colapsan se producen ondas de choque que constituyen los elementos destructores de este procedimiento. El calor es el principal peligro, as como la produccin de radicales libres que puedan provocar la inactivacin enzimtica. Choque osmtico. El mtodo incluye el lavado de las clulas con una solucin tamponada, para liberarlas del medio de cultivo y posteriormente se introducen en una solucin tamponada, que posea una alta presin osmtica (sacarosa al 20 %), en la que se deja que las clulas alcancen el equilibrio, perdiendo parte de su agua interna, que se elimina por centrifugacin. La pasta de clulas obtenida se dispersa rpidamente en agua a unos 4 0C, aproximadamente. El sbito aumento de la presin osmtica del interior de las clulas, hace que se produzca la liberacin de algunos constituyentes celulares. Choque por enfriamiento. Consiste en una reduccin rpida de temperatura desde la normal de crecimiento hasta 0 0C. Las bacterias Gram-negativas son ms sensibles a este proceso que las Gram-positivas. Las bacterias son ms susceptibles al choque por enfriamiento cuando se encuentran en la fase de crecimiento exponencial. Se libera al medio ambiente un material que adsorbe a 260 nm, aminocidos y ATP. Es una tcnica difcil de emplear a gran escala. Congelacin y descongelacin. Se da siempre que se guarda una pasta a 20 0C y se permita luego su descongelacin. La formacin y fusin de los cristales de agua altera el material celular, lo suficiente para permitir la liberacin de algunas protenas. Puede dar lugar a una prdida de actividad enzimtica. Digestin qumica. Entre los mtodos qumicos para la extraccin de enzimas se encuentran: Tratamiento con lcali. Es un mtodo sencillo para lograr la lisis celular. La mayora de las clulas se desintegran as, a pH entre 11,5 y 12,5. Slo sirve si la enzima que se va a extraer es estable a un pH alto durante 20 - 30 minutos. Detergentes. En condiciones de fuerza inica baja y pH apropiado, los detergentes se combinan con las lipoprotenas formando micelas. Por tanto, los constituyentes lipoproteicos de las membranas biolgicas pueden solubilizarse o las membranas hacerse permeables. Para la extraccin de enzimas existen detergentes de tipo aninico (lauril sulfato sdico), catinico (bromuro de cetil-trimetil-amonio) y no inicos (Tweens, Spams o Triton). Disolventes orgnicos. Se pueden obtener altos rendimientos al tratar clulas con altas concentraciones de etanol, metanol e isopropanol y luego resuspender las clulas en tampn. No se emplea mucho debido al costo, la toxicidad, la desnaturalizacin de las protenas y la inflamabilidad. Digestin enzimtica. Consiste en la ruptura de las clulas mediante enzimas 134

(lisozimas). Estas se obtienen de la clara de huevo y catalizan la hidrlisis de los enlaces -1,4-glicosdicos de la porcin polisacrida de las paredes celulares bacterianas. Sin embargo, la ruptura final de la envoltura celular depende de la presin osmtica del medio de suspensin. Ciertos microorganismos como las levaduras y algunos bacilos, son capaces de autolizar, es decir, en determinadas condiciones fisiolgicas sintetizan enzimas que producen una digestin parcial de su propia pared celular. La membrana expuesta es entones rota por golpe osmtico, liberando las enzimas intracelulares. 2.7.6.2.3 Concentracin del caldo de fermentacin. Los caldos de fermentacin son muy diluidos, por lo tanto hay que someterlos a operaciones de concentracin antes de su purificacin. Entre las operaciones de concentracin se tienen: Evaporacin. Es til para enzimas que no se daan por concentraciones elevadas de solutos de bajo peso molecular y que son relativamente estables a temperaturas elevadas. De lo contrario, debe realizarse la evaporacin a vaco (10 - 60 mm de Hg). Sin embargo, el peligro de la formacin de espuma, puede ocasionar la desnaturalizacin. Se utilizan evaporadores con un tiempo de residencia corto, para minimizar las prdidas debido a la labilidad trmica, como los de: pelcula descendende, pelcula fina y pelcula fina en centrifugacin. Liofilizacin. Es el mtodo de desecacin ms suave debido a que el agua es sublimada a partir de una masa congelada. Para facilitar una rpida sublimacin, se mantiene una presin muy baja y se elimina el vapor por condensacin a baja temperatura. Es una tcnica muy apreciada en la preservacin de sustancias activas lbiles. Como mtodo de concentracin su aplicacin es limitada por razones de costo y debido a la presencia de sales disueltas que producen eutticos y a la formacin de abundante espuma con la consecuente desnaturalizacin. Congelacin o cristalizacin. Se deben escoger las condiciones que permitan la formacin de cristales de hielo que no contengan la enzima. Esto se consigue agitando la solucin y permitiendo que los cristales de hielo crezcan de una forma lenta. Luego se eliminan los cristales de la fase lquida mediante centrifugacin o filtracin. Las bajas temperaturas evitan la desnaturalizacin. Se justifica para la recuperacin de enzimas muy lbiles, pero no es competitivo econmicamente con la concentracin por evaporacin. Espumacin. Las protenas, como sustancias tensoactivas, tienden a acumularse en la interfase gas-lquido, que se produce al insuflar aire o un gas inerte a la solucin enzimtica. Se han diseado equipos de construccin simple que permiten formar, recolectar y procesar espuma enriquecida. Este sistema puede aplicarse en principio no slo a la concentracin, sino a la purificacin de enzimas. El principal inconveniente se tiene en la inactivacin producida por fenmeno de espumacin, que en el caso de algunas enzimas es considerable. Precipitacin. Es una tcnica usada frecuentemente como mtodo de concentracin, 135

pero si se optimizan las condiciones de operacin sirve como tcnica de purificacin. Entre los agentes de precipitacin estn: Sales inorgnicas disociables. Debido a su gran solubilidad las sales que se usan son el cloruro sdico, sulfato sdico, acetato clcico, cloruro de potasio y el sulfato amnico. Siendo este ltimo el ms comn, en razn de su bajo costo, alta solubilidad, inocuidad para la mayor parte de las enzimas y efecto estabilizante en ciertos casos. El fenmeno de precipitacin por alta fuerza inica (salado), se ha explicado por efecto de solvatacin de iones, que limitan el agua disponible, rebajando su concentracin por debajo del lmite de solubilidad de la enzima. La precipitacin de una enzima se ve ayudada, si se encuentra en su punto isoelctrico. Por lo general las molculas de mayor peso molecular se precipitan primero, aunque esto tambin depende de su carga electrosttica y del pH de la solucin. La cintica de precipitacin por fuerza inica es rpida, alcanzndose el equilibrio a los pocos segundos de contactar la solucin enzimtica con la sal. El tamao de partcula es muy pequeo lo que obliga al uso de altas fuerzas centrfugas, para la recuperacin de precipitados. Solventes orgnicos. Cuando se van aadiendo cantidades crecientes de solventes orgnicos (metanol, etanol, isopropanol, cetona, eter etlico), las molculas de protena interaccionan ms con otras molculas de protena que con el agua. La formacin de complejos entre molculas de protena de distinta carga, contina hasta que se alcanza el punto en el que la protena precipita, debido al decrecimiento de la constante dieltrica y por tanto al aumento de las fuerzas atractivas electrostticas entre las molculas de protena de distinta carga. Se debe trabajar a temperaturas por debajo de 0 0C para evitar la desnaturalizacin. Polmeros cargados de alto peso molecular. Para el fraccionamiento de la protena pueden utilizarse polmeros solubles en agua, entre los que se destaca el polietilenglicol, por ser el ms usado, no ser txico, ni inflamable y que no desnaturaliza las protenas. A diferencia de los solventes posee en efecto estabilizador, por lo que puede utilizarse a temperatura ambiente. Es eficaz a concentraciones relativamente bajas (6-12 %). La solubilidad de la protena, en presencia del polietilenglicol, se afecta por el pH, la fuerza inica y la temperatura. Se usan adems, polmeros como el cetavin, el sulfato de protamina, el DEAE-dextrano, entre otros. Ultrafiltracin y smosis inversa. Aunque sea considerada como tcnica de concentracin, constituye tambin un mtodo vlido de purificacin. Utiliza las diferencias existentes entre los pesos moleculares (tamao) de las protenas deseadas y las no deseadas. En la ultrafiltracin las molculas se fuerzan a pasar, mediante presin a travs de una membrana de tamao pequeo (peso molecular entre 500 y 300 000). La smosis inversa es un proceso de ultrafiltracin que utiliza membranas con poros suficientemente pequeos (peso molecular lmite 250) para que permita el paso de las molculas de solvente. Hay dos tipos de ultrafiltro, el ultrafiltro microporoso y el de difusin. El primero es similar a un filtro convencional, esto es la membrana es rgida, con una serie de orificios al 136

azar extremadamente pequeos que la atraviesan, cuyo tamao medio oscila entre 500 y 5000 0A. Las molculas muy pequeas atraviesan la membrana, mientras que las grandes quedan retenidas en la superficie del filtro. Las molculas de tamao intermedio quedan retinadas en la estructura y terminan por obstruir los poros. Por esta razn los filtros microporosos han sido desplazados por los filtros difusores. El ultrafiltro de difusin es en esencia una membrana de gel hidrfila homognea a travs de la cual los solventes y solutos son transportados por difusin molecular bajo la accin de un gradiente de concentracin o de actividad. De esta manera el transporte de una molcula a travs de una membrana requiere de energa cintica y transcurre ms fcilmente a temperaturas ms elevadas. Una membrana fcilmente permeable se hidrata rpidamente y debe estar constituida por un polmero que posea una afinidad especfica elevada por el solvente. Por el contrario, una membrana rgida, relativamente poco hidratada, tiene una baja permeabilidad, en particular en aquellas ocasiones en las que exista una baja afinidad entre el polmero de la membrana y el disolvente. La ultrafiltracin es un mtodo, especialmente til para el trabajo con enzimas, debido a que: Es una tcnica suave y no destructiva (aunque algunas molculas grandes pueden sufrir roturas). A temperatura de operacin baja se evitan las prdidas en la actividad y se minimiza la autodigestin. No se emplean reactivos qumicos. No se requiere cambio de fase. Se puede operar a bajas presiones hidrostticas. Se puede conseguir simultneamente la concentracin y la purificacin.

Si se necesita, se puede mantener un pH y fuerza inica constantes, para evitar la inactivacin de la enzima. Es econmico.

2.7.6.2.4 Purificacin. El proceso de purificacin de una enzima consta por lo general de varias etapas sucesivas, en las cuales los contaminantes principalmente de naturaleza proteica, son subsecuentemente removidos, aumentando la actividad especfica de la enzima. Cada etapa de purificacin significa, sin embargo, una prdida de actividad enzimtica. A escala industrial, la tendencia es sacrificar pureza en beneficio de rendimiento; en usos analticos o mdicos, es a la inversa, el rendimiento tiene una importancia relativamente menor. Aunque el rendimiento por etapas sea elevado, luego de un cierto nmero de 137

operaciones secuenciales, el rendimiento global puede resultar bastante bajo. Por ello, la tendencia actual es el desarrollo de operaciones de purificacin suficientemente poderosas que permitan incrementos de pureza apreciables. Particin bifsica. Es una tcnica desarrollada con base en el fenmeno de incompatibilidad de polmeros, que consiste en que soluciones de dos polmeros(por ejemplo, polietilenglicol y dextrano) o de un polmero y una sal (ejemplo de las sales, fosfato de potasio, sulfato amnico) forman en determinados intervalos de concentraciones, dos fases inmiscibles. Ambas fases son acuosas por lo que, al fraccionarse las protenas entre ellas, no se produce desnaturalizacin, por el contrario los polmeros frecuentemente ejercen un efecto protector sobre la enzima. La fase en la que se localice una determinada protena depende de su propio peso molecular, del peso molecular y concentracin de los polmeros, temperatura, pH y fuerza inica. La particin es ms efectiva mientras mayor sea el peso molecular. La distribucin de la protena entre ambas fases, est gobernada por su coeficiente caracterstico de particin (K). La extraccin puede llevarse a cabo en una sola etapa, o en mltiples etapas, con flujo en paralelo o en contracorriente. La separacin entre la enzima y el polmero, se puede lograr por dilisis o ultrafiltracin, por precipitacin con sales, entre otros. Utilizacin de membranas. Se basa en la capacidad de algunas membranas polimricas de discriminar entre molculas segn su tamao y/o composicin qumica. Es necesario tener un gradiente que dirija el cambio molecular: Concentracin: dilisis y smosis. Campo elctrico: electrodilisis y electrosmosis. Presin: ultrafiltracin y smosis inversa.

Todas ellas se utilizan a escala de laboratorio, pero a escala industrial la ultrafiltracin y la smosis reversa tienen un amplio uso. Cromatografa. Se refiere a un tipo general de separaciones que dependen de alguna clase de mecanismo que ordena en tiempo (y por lo tanto produce separacin) el paso de varias especies de soluto a travs de una columna. Puesto que lo que se consigue es el retraso y no la unin permanente, el material que se va a purificar debe unirse a la fase slida para que se produzca el suficiente retraso pero que vuelva a entrar en la solucin y pueda ser eluido. Dependiendo del mecanismo, la cromatografa se puede subdividir en: Cromatografa por adsorcin. Separa las protenas de acuerdo con sus diferentes afinidades por la superficie de una matriz slida, o por un portador inorgnico (slica gel, almina, celita) o un polmero orgnico. Cromatografa de filtracin en gel. Utiliza un filtro molecular, que es un portador neutro entrecruzado, con un tamao definido de poro para el fraccionamiento molecular. Las molculas ms grandes que los poros ms grandes, no pueden entrar en la matriz y pasan 138

directamente a travs de la columna. Las molculas ms pequeas entran en el portador y son retenidas. La difusin en los poros es ahora funcin del tamao molecular, de forma que las molculas retenidas son eluidas en orden de tamao decreciente. Cromatografa por intercambio inico. Utiliza las diferentes fuerzas electrostticas entre molculas de soluto (electrlito) y los radicales de intercambio inico. Las resinas cambiadores de iones, generalmente son polmeros insolubles en agua que contienen grupos catinicos o aninicos. La naturaleza del grupo funcional vara, aunque en general son, en el caso de los cambiadores catinicos, RH+ y en los cambiadores aninicos ROH-, donde R representa la resina polmero. El cambio de los iones H+ u OHpuede producirse por iones combinados con algn cido o base ms dbiles, en este caso las protenas, y por tanto las molculas de protenas se unen reversiblemente a la resina. Las celulosas cambiadoras de iones se obtienen al introducir en la celulosa una gran variedad de grupos cargados (catinicos o aninicos) por varios procedimientos qumicos. Sin embargo, el nivel de sustitucin es usualmente muy bajo y la capacidad de estas celulosas es la dcima parte de la de las resinas. Los geles cambiadores de iones se obtienen por la introduccin de DEAE o CM en agarosa entrecruzada o en copolmeros acrlicos. Las epharosas cambiadoras de iones Pharmacia y Trisacril, tienen una gran capacidad de separar protenas. Cromatografa de afinidad. Es la interaccin de la enzima con ligantes especficos que han sido inmovilizados en la matriz cromatogrfica (agarosa, dextrano), mediante una reaccin de acoplamiento. Los ligantes especficos pueden ser un anticuerpo, un sustrato, un inhibidor o activador reversible, una coenzima, etc. Es esencial que la interaccin sea reversible. La elucin normalmente requiere un cambio del pH, de la fuerza inica o de la composicin del tampn. Cromatografa de interaccin hidrofbica. Mediante esta tcnica molculas con diferente hidrofobicidad pueden ser separadas sobre un portador que contiene grupos hidrofbicos. Se tienen mayores interacciones hidrofbicas cuando se incrementa la fuerza inica. La elucin se puede conseguir alterando la fuerza inica del solvente, el pH y la composicin o usando un modificador de la constante dielctrica. Cromatografa lquida de alta resolucin. Un problema de la mayora de las tcnicas cromatogrficas es que se emplea mucho tiempo y adems es necesario trabajar a 4 0C para reducir la posible inactivacin de las enzimas o la contaminacin microbiana. El desarrollo reciente de nuevos materiales para empaquetar las columnas de cromatografa de lquido de alta resolucin ha permitido el uso de esta tcnica para la purificacin de protenas. Se han desarrollado materiales para columnas de intercambio inico, cromatoenfoque, filtracin a travs de geles y cromatografa de afinidad. Empleando columnas estndar se pueden fraccionar aproximadamente 25 mg de protena a temperatura ambiente en menos de 1 hora, reemplazando etapas cromatogrficas que requeran normalmente toda la noche. 2.7.6.2.5 Formulacin de preparados enzimticos 139 comerciales. La etapa de

formulacin incluye las operaciones de acabado y normalizacin del preparado enzimtico: Acabado. Las operaciones de acabado tienen por objeto dar la forma definitiva al producto enzimtico y estn orientadas a la preservacin de la actividad durante el almacenamiento y la comercializacin. Las enzimas se comercializan en estado lquido o slido, por lo que las operaciones de acabado dependen del estado fsico del producto. Entre ellas deben destacarse la desalinizacin (dilisis, ultrafiltracin, resinas de intercambio inico), la esterilizacin y el recubrimiento (para evitar la presencia de microorganismos que puedan deteriorar el producto enzimtico), la concentracin y el secado (evaporacin al vaco, ultrafiltracin, secado por aspersin, liofilizacin). Una vez obtenido el preparado enzimtico en su forma final, es necesario garantizar una vida til que permita mrgenes razonables de almacenamiento y tiempos de distribucin y consumo. Se espera obtener tiempos de vida media de almacenamiento superiores a un ao. A fin de lograr este propsito se adicionan preservantes, unos para impedir la inactivacin de la enzima y otros para no permitir el deterioro por agentes microbianos; ya que las enzimas se caracterizan y se venden en funcin de su actividad ms que de su peso. Entre los preservantes de la configuracin activa de la molcula enzimtica estn las sales (NaCl, (NH4)2SO4), protenas inertes (albmina,), polmeros (polivinil alcohol, polietilenglicol, carboximetil celulosa) y azcares (sacarosa, glicerol); adems preservantes especficos (sustrato, inhibidores reversibles, cofactores, reactivos sulfhidrilos y agentes quelantes). Los preservantes antimicrobianos son los usuales en la elaboracin de alimentos (sorbato, benzoato, sales de amonio cuaternario). Normalizacin. En el producto enzimtico se debe indicar su actividad especfica ( por unidad de peso o de volumen de preparado) y estabilidad de almacenamiento. Es usual sin embargo, que los productores entreguen un volumen de informacin mayor sobre caractersticas cinticas y fisicoqumicas del producto. 2.7.6.3 Enzimas inmovilizadas. Se entiende por enzima inmovilizada (EI) aquella fsica o qumicamente asociada a (o contenida en) un soporte o matriz que no es esencial para su actividad. Entre las ventajas de enzimas inmovilizadas como catalizadores de proceso estn: Desarrollo de sistemas continuos. Mayor estabilidad. Uso ms eficiente del catalizador. Facilidad de control y automatizacin. Flexibilidad en diseo de reactores Alta especificidad de reaccin. Efluentes libres de catalizadores. Menos costo de mano de obra. Intervalos de temperatura bajos entre 4 y 60 0C. Empleo de reactores de menor tamao para una productividad dada. Se minimiza la inhibicin por el producto. Se tiene una proteccin de la enzima, por el soporte, frente a los diferentes cambios de 140

las condiciones. Se logra una distribucin uniforme de la enzima por todo el reactor. Se mejora el rendimiento y la calidad del producto.

Entre las desventajas de enzimas como catalizadores de proceso se tienen: Costo adicional de soportes y reactivos. Costo adicional de operacin de inmovilizacin. Prdida de actividad durante la inmovilizacin. Posibles requerimientos adicionales de purificacin. Restricciones difusionales. Poco adecuado para sustratos insolubles o de alto peso molecular. Mayores riesgos de contaminacin en la operacin continua de reactores. 2.7.6.3.1 Matrices utilizadas como soportes de enzimas. La naturaleza del soporte influye en: la actividad, la estabilidad y la cintica de la enzima. Los soportes slidos utilizados como matrices para la inmovilizacin de enzimas se clasifican como orgnicos e inorgnicos. Soportes orgnicos. Son los que tienen ms sitios activos por gramo, pero a menudo no tienen las propiedades de flujo ms deseables y son frecuentemente afectados por factores ambientales como el pH o deteriorados por microorganismo. Se pueden obtener con gran variedad de grupos funcionales. Se pueden clasificar en naturales y sintticos. Ejemplos de soportes orgnicos son: agarosa, celulosa, quitina, quitoxano, dextrano, inulina, cido pctico, pectina, almidn, agar, colgeno, seda, carbn activo, poliestireno, poliacrilamida, poliacrilato, polivinil alcohol, polivinil amina, nylon, entre otros. Soportes inorgnicos. Son econmicos. Tienen estabilidad trmica y presentan resistencia mecnica elevada, al ataque de los microorganismos y a los solventes orgnicos. Tienen mejores propiedades de flujo, facilidad de manejo y vida til larga. Facilidad de regeneracin mediante pirlisis. Algunos no cambian su estructura en amplios intervalos de pH, temperatura y presin. Tienen menos sitios activos que los soportes orgnicos. Se pueden clasificar en naturales y artificiales. Ejemplos de soportes inorgnicos son: bentonita, tierra de diatomeas, piedra pmez, arena, almina, nquel, slice, titanio, vidrio de tamao de poro controlado, aluminosilicato, hidrxido de titanio, entre otros. La caracterizacin de los soportes como orgnicos e inorgnicos, no describe la morfologa de estos materiales, la cual es extremadamente importante con respecto a los parmetros de rea superficial y de poro. Por consiguiente, se da una reclasificacin de los soportes como porosos y no porosos. Soportes porosos. Ofrecen mayor rea superficial por unidad de peso, lo que les permite unir mayor cantidad de enzima, la mayor parte inmovilizada en superficies internas, de este modo, las enzimas se protegen de las turbulencias existentes en la 141

superficie externa, debidas a las altas velocidades de flujo. Presentan problemas difusionales. El tamao del poro debe ser tal que no slo pueda atravesarlo la enzima, sino que adems, tiene que ser suficiente para permitir el fcil movimiento de las molculas de sustrato y de producto. Un factor importante es el ambiente interno del poro. Si el poro tiene una carga negativa alta sobre la superficie, un sustrato que tenga una carga negativa alta puede ser repelido por este ambiente; reducindose la velocidad de reaccin a cero. Por el contrario, si el soporte tiene una superficie con una carga opuesta a la del sustrato puede mejorar la reaccin enzima-sustrato. Entre los materiales porosos estn: vidrio borosilicatado, soportes cermicos basados en slice, almina y xido de titanio, titanio de poro controlado, almina de poro controlado. Soportes no porosos. En ellos el rea superficial por unidad de volumen es extremadamente baja, de modo que la superficie disponible para el ataque de la enzima es muy limitada. Su mayor ventaja es la eliminacin de las restricciones de difusin respecto al sustrato. Entre los materiales no porosos estn: metales puros u xidos metlicos con propiedades ferromagnticas (nquel, acero inoxidable, xido de hierro magntico), arena, fibras de nylon. 2.7.6.3.2 Seleccin de un soporte. La mejor eleccin depende de la naturaleza de la enzima y del tipo de aplicacin para el cual va a ser utilizada. Entre los elementos a tener en cuenta en la seleccin de un soporte estn: Durabilidad qumica con respecto al ambiente del reactor. Alta rea superficial disponible para la unin de la enzima.

Resistencia mecnica y estabilidad dimensional, para evitar compactacin y proteger la estructura de la enzima. Resistencia microbiana. Soportes ricos en carbono (almidn) o en carbono-nitrgeno (protenas), no tienen buena resistencia microbiana. Por el contrario, los xidos inorgnicos (silica, titanio, almina) son resistentes; al igual que algunos materiales orgnicos como los fluorocarbonados, propileno, etc. Estabilidad trmica. Un soporte que tenga un coeficiente de expansin alto entre 0 a 80 0C, puede presentar muchos problemas. El sitio activo de la enzima puede ser alterado cuando se expande o se contraiga con los cambios de temperatura. La forma o tamao de la partcula del soporte. Las partculas ms grandes presentan menos cadas de presin, de modo que una velocidad de flujo alta y uniforme puede ser lograda. Sin embargo, el recorrido difusional del sustrato para alcanzar todos los sitios activos de la enzima es ms grande, con este tamao de partcula. 142

La carga de la superficie o del poro con respecto a la del sustrato La porosidad y el dimetro del poro.

Su balance hidroflico/hidrofbico. Soportes ricos en grupos hidroflicos, generalmente ligan ms cantidad de enzima y los complejos producidos exhiben una ms alta estabilidad. Costos y disponibilidad del material. Tamao caracterstico de las enzimas a inmovilizar. La resistencia difusional al transporte del sustrato y del producto. Ciclo de vida completo del soporte.

El estado de oxidacin del material del soporte. Superficies redox pueden ser utilizadas para estabilizar enzimas redox (soporte de titanio para la papana) 2.7.6.3.3 Tcnicas de inmovilizacin de enzimas. Cuando la enzima es sometida al proceso de inmovilizacin, debe permanecer inalterada su secuencia de aminocidos en el sitio activo y su estructura terciaria. Es necesario realizar el proceso bajo condiciones muy controladas y moderadas. Deben evitarse las altas temperaturas, los tratamientos cidos y alcalinos, las altas concentraciones de sal, entre otros. La clasificacin de los mtodos de inmovilizacin se basa en el tipo de interaccin responsable de la inmovilizacin y la naturaleza del soporte: Atrapamiento. Se basa en la localizacin de una enzima dentro de la red espacial de una matriz polimrica o dentro de una membrana de forma que se evite la liberacin de la enzima, sin impedir la penetracin del sustrato. Se requiere que las molculas del sustrato y del producto sean relativamente pequeas. Puesto que la enzima no esta unida de ninguna forma al gel o a la membrana, este mtodo puede aplicarse ms generalmente que cualquier otro para el atrapamiento de enzimas, independiente de sus propiedades y con poca prdida de la actividad biolgica. Atrapamiento en geles. Se basa en la localizacin de las enzimas dentro de los espacios intersticiales de geles polimricas entrecruzadas, insolubles en agua. Para la formacin del gel, se disuelve la enzima en la solucin del precursor del polmero y se activa la polimerizacin; el gel resultante puede dispersarse mecnicamente en partculas del tamao deseado. Dos tipos de polmeros han sido preferentemente usados, por un lado geles como la poliacrilamida y similares y por otro, los geles derivados de materiales naturales como triacetato de celulosa, agar gelatina, carrageno o alginato, almidn, etc. 143

Es un mtodo ventajoso por la sencillez y suavidad de las condiciones de preparacin del biocatalizador y su utilidad para fijacin de clulas. Atrapamiento en fibras. Consiste en el atrapamiento de las enzimas dentro de las microcavidades de las fibras sintticas. El polmero ms usado es el acetato de celulosa, debido a su bajo costo y a su buena resistencia biolgica y qumica. Microencapsulacin. Consiste en la confinacin de una gotcula de biocatalizador dentro de una cpsula de membrana polimrica semipermeable esfrica, cuyos dimetros oscilan entre 1 y 100 um. Las enzimas inmovilizadas de esta forma estn contenidas dentro de la membrana y las molculas de sustrato y producto se difunden a travs de ella libremente, siempre que sus tamaos sean lo suficientemente pequeos para que esto sea factible. Esta tcnica es simple y econmica, pero para que sea eficaz es necesario que el biocatalizador sea estable en solucin. Los materiales empleados para formar las cpsulas pueden ser permanentes como el nylon, el colodin, la silicona, la poliurea o biodegradables como el cido polilctico o los liposomas de fosfolpidos. Unin a un soporte. Es una inmovilizacin artificial donde es muy importante la seleccin del soporte insoluble y la tcnica de unin. Adsorcin fsica. Se basa en la adsorcin fsica de las molculas de enzima en la superficie de una matriz slida, lograda poniendo en contacto una solucin acuosa de la enzima con el soporte mediante una de las siguientes tcnicas: procedimiento esttico, electrodeposicin, proceso en reactor, bao con agitacin. La adsorcin depende de las variables como el pH, la naturaleza del solvente, la fuerza inica, la cantidad de enzima y de adsorbente, el tiempo y la temperatura. Las fuerzas de unin entre la enzima y el adsorbente son relativamente bajas (puentes de hidrgeno, de van der Waals, interacciones hidrofbicas,etc.). Enlace inico. Se basa en la unin inica de las molculas de enzima a soportes slidos, que contienen restos de cambiadores de iones. La fuerza de unin entre la enzima y el soporte es mucho ms alta que la del enlace por adsorcin fsica. En algunos casos puede producirse la liberacin de la enzima, al igual que en la adsorcin fsica, cuando se utilizan concentraciones elevadas de sustrato, soluciones con fuerza inica alta o se producen variaciones en el pH. Los soportes usados son cambiadores de iones, preparados frecuentemente a partir de soportes orgnicos aunque tambin de inorgnicos (especialmente slice), con los mismos o similares grupos cambiadores de iones. Los polmeros orgnicos son derivados de polisacridos principalmente dextrano y celulosa o polmeros sintticos principalmente derivados del poliestireno. Los cambiadores inicos ms usados incluyen derivados de 144

DEAE, TEAE y ECTEOLA, mientras que los cambiadores catinicos ms utilizados son derivados de CM. Quelacin o unin metlica. Implica el uso de metales de transicin como una forma de activar la superficie del soporte, permitiendo el acoplamiento directo de la enzima, sin previa transformacin qumica del soporte, a travs de la formacin de quelatos. El grado de estabilidad operacional es elevado. Se puede producir desorcin cuando el almacenamiento se prolonga mucho. Entre los soportes utilizados estn el vidrio, la quitina, la celita, el cido algnico, la gelatina, la celulosa, entre otros. Tambin se pueden obtener hidrxidos u xidos hidratados de los metales de transicin (titanio (III), titanio (IV) y zirconio (IV)) Enlace covalente. Se basa en la unin covalente de la enzima a la matriz insoluble en agua. Implica una reaccin de preparacin del soporte y luego una reaccin de acoplamiento entre el soporte y la enzima. Presenta unas condiciones de inmovilizacin ms complicadas y menos suaves. Generalmente, no lixivian la enzima a la solucin, en presencia de sustrato o de soluciones de alta concentracin inica. Los enlaces covalentes deben implicar slo a grupos funcionales de la enzima, que no sean esenciales para la accin cataltica. Se puede emplear cualquier material polimrico. El polmero puede ser fabricado de forma que lleve las cargas que se desean, tanto en cantidad como en signo. Se puede inmovilizar prcticamente cualquier enzima. Las molculas de sustrato tienen fcil acceso a las molculas de enzima. Es imposible obtener clulas inmovilizadas aunque s enzimas no purificadas. Entrecruzamiento. Consiste en unir las molculas entre s mediante enlaces covalentes, por medio de reactivos bi-o multifuncionales, con la posibilidad de incluir una protena inerte, formando agregados tridimensionales entrecruzados, totalmente insolubles en agua, pero que no necesitan el uso de soportes adicionales. Constituye realmente una prolongacin de la tcnica de enlace covalente, bsicamente con las mismas ventajas e inconvenientes. El reactivo bifuncional ms comnmente empleado es el glutaraldehido. Algunas enzimas inmovilizadas por esta tcnica son capaces de resistir condiciones extremas de pH y temperatura. Se necesitan altas cantidades de enzima. Para poder utilizar una enzima en su estado soluble se han diseado mtodos fsicos de confinamiento que usan membranas semipermeables, fibras huecas o membranas de ultrafiltracin. Inmovilizacin sin modificacin qumica de la enzima. Se utiliza una membrana impermeable a las molculas de enzima y permeable al producto y en algunos casos a las molculas de sustrato.

145

 Inmovilizacin con modificacin qumica de la enzima. Consiste en preparar conjugados enzima-polmero solubles en agua, utilizando reacciones similares a las empleadas en el acoplamiento qumico de enzimas a polmeros insolubles. 2.7.6.3.4 Eleccin del mtodo de inmovilizacin. La mejor seleccin depende de la naturaleza de la enzima y del tipo de aplicacin para el cual va a ser utilizada. Similarmente, las caractersticas pueden variar considerablemente para la misma enzima en diferentes soportes o en un mismo soporte por diferentes tcnicas. Adems, depende tambin de las propiedades de los sustratos y productos y de los usos a los que se puede aplicar el producto. Para cada aplicacin de una enzima inmovilizada es necesario encontrar un procedimiento sencillo y econmico, para llevar a cabo la inmovilizacin, con el que se obtenga un preparado que conserve su actividad y que tenga una estabilidad operacional elevada, adems de que cumpla con otros parmetros. Por lo general, hay que ensayar diversas tcnicas hasta encontrar la ms apropiada; la inmovilizacin de la aminocilasa fue el resultado del ensayo de ms de 40 mtodos distintos. 2.7.6.4 Inmovilizacin de clulas. El uso de clulas inmovilizadas como catalizadores de proceso ha recibido gran atencin en los ltimos aos. El empleo de clulas inmovilizadas evita la extraccin y purificacin de la enzima intracelular, con lo que el catalizador puede resultar de un costo sustancialmente inferior; contra ello puede ocurrir una prdida de especificidad de la reaccin, lo que aumentar los costos de recuperacin y purificacin del producto de la reaccin; adems, los problemas de restricciones difusionales pueden tomarse ms severos. Los soportes y mtodos empleados en la inmovilizacin de clulas son anlogos a los utilizados en inmovilizacin de enzimas. Los ms utilizados son la inclusin en geles de alginato, poliacrilamida y k-carragenano. Existen varios procesos comerciales o en desarrollo con clulas inmovilizadas para la produccin de ampicilina (Achromobacter sp.), cafalecina (Achromobacter sp.), hidrlisis de la rafinosa en sacarosa y galactosa (Mortieralla vinacae), aspartato (Escherichia coli), malato (Brevibacterium ammoniagenes), citrulina (Pseudomonas putida), cido urocnico (Achromobacter liquidum), hidrlisis de la lactosa (Kluyveromyces lactis) (Illanes, 1994). 2.7.7 Cintica enzimtica. En la cintica enzimtica se estudia la influencia de la concentracin de la enzima, del sustrato, los cofactores y los inhibidores, la fuerza inica, el pH y la temperatura. 2.7.7.1 Cintica enzimtica en fase homognea. k1 k-1 dP/dt k3

E + S

ES

= k3 [ES]

Aceptando la hiptesis de estado estacionario: 146

d[ES]/dt = k1[E] [S] - k-1[ES] - k3[ES] = 0 [E] [S] _______ [ES] k-1 + k3 = _________ k1 = Km = [ET] - [ES]

[ET] = [E] + [ES] ([ET] - [ES]) [S] Km = _______________ [ES]

[E]

[ET] [S] [ES] = __________ Km + [S]

k3 [ET] [S] v = ___________ Km + [S] Si se considera el caso en que: [ET] = [ES] vmax [S] = __________ Km + [S] vmax = k3 [ET]

Ecuacin de Michaelis Menten

Km es la constante de Michaelis. Es caracterstica de cada enzima. Representa la concentracin de sustrato necesaria para obtener la mitad de la velocidad de reaccin mxima (vmax). Se expresa en unidades de concentracin. Es una medida de la concentracin de sustrato necesaria para semisaturar a la enzima. Si Km es grande se precisa una gran cantidad de S para saturar E. Si Km es pequea, basta una pequea cantidad de S para saturar E. La mayora de las reacciones enzimticas que utilizan sustratos no muy complejos muestran valores para Km entre 10-5 y 10-1 M. Cuando [S] >>>> Km, la velocidad alcanza su valor mximo (vmax). Se dice que se encuentra saturado de S. Una [S] veinte veces mayor que Km, se considera suficiente para obtener una aproximacin vlida de vmax. KS = k-1 / k1 (constante de disociacin del complejo ES). Indica la afinidad de una enzima por su sustrato; cuanto ms pequeo sea KS, mayor es la afinidad de la enzima por el sustrato. Para predecir el comportamiento de un sistema enzimtico es necesario determinar vmax y Km para la enzima particular empleada. Esto puede realizarse midiendo la velocidad inicial de reaccin en un intervalo de concentraciones de sustrato. Siguiendo una reaccin, donde la concentracin del sustrato es ms grande que la concentracin de la enzima y Km , se puede estimar los parmetros de Michaelis, midiendo la concentracin del producto a varios tiempos y usando la siguiente forma de la ecuacin de Michaelis - Menten: 147

vmax ([S]0 - [P]t) = ________________ Km + [S]0 - [P]t

la cual puede ser integrada como: [S]0 ln __________ [S]0 - [P]t ______________ t

vmax _____ Km

1 ____ Km

[P]t ____ t

2.7.7.2 Influencia del pH y la fuerza inica en la actividad enzimtica. Los cambios en el pH y la fuerza inica, pueden alterar la conformacin de la enzima, su capacidad de unin con el sustrato y la actividad cataltica de los grupos que forman el sitio activo, ya que los diversos grupos funcionales de las cadenas polipeptdicas pueden ionizarse o interactuar con otras cargas o grupos funcionales, modificando su estructura terciaria. En general, las enzimas son activas en un intervalo limitado de pH. Las enzimas presentan su mxima actividad a un valor dado de pH (pH ptimo), el cual es diferente para cada enzima. La mayora de las enzimas tienen un pH ptimo entre 4 y 8. Algunas son muy resistentes a los cambios de pH. 2.7.7.3 Influencia de la temperatura en la actividad enzimtica. A medida que aumenta la temperatura ocurren dos fenmenos simultneos: La velocidad de la reaccin aumenta como sucede en la mayora de las reacciones qumicas. La estabilidad de la enzima disminuye por inactivacin trmica.

La constante de reaccin aumenta con la temperatura de acuerdo con la ecuacin de Arrehenius: k3 = A e-E/RT Si se determina A y E, k3 puede ser calculada para una temperatura dada. Alternativamente, si se mide vmax en idnticas condiciones a dos temperaturas, las constantes A y E pueden ser evaluadas por: vmax,1 k3,2 [ET] ______ = ________ vmax,2 k3,1 [ET] E = ___ R T1 - T2 ( __________ ) T1 T2

ln

En las reacciones catalizadas por enzimas la energa de activacin oscila entre 4 y 20 kcal/mol. La estabilidad de la enzima se ve influenciada por la temperatura, en una forma similar a la desnaturalizacin, que requiere una energa de activacin de 40 a 130 kcal/mol, 148

de tal forma que la temperatura ptima de reaccin debe ser el resultado del compromiso entre estos dos efectos. La mayor parte de las enzimas presentan su actividad ptima en el intervalo de 30 40 0C y, por encima de 45 0C, comienzan a desnaturalizarse. 2.7.7.4 Inhibicin de las enzimas. Los inhibiores reducen la velocidad de una reaccin enzimtica. En muchos casos el producto de una reaccin enzimtica es un inhibidor. La inhibicin debe minimizarse para que la actividad de la enzima que cataliza la reaccin sea mxima. Se conocen cuatro tipos de inhibicin: 2.7.7.4.1 Inhibicin irreversible. Tiene lugar cuando la molcula del inhibidor se combina irreversiblemente con la de la enzima, modificando qumicamente su estructura (formando un complejo estable) y anulando o reduciendo bastante su actividad. Un compuesto que forme un enlace covalente con un grupo en el sitio activo, puede causar este tipo de inhibicin. Por ejemplo, Pb y Hg que reaccionan con los grupos SH del centro activo de la enzima. k1 k-1 k4 k3

ES

EI

v = dP/dt = k3 [ES] [ET] = [ES] + [EI] + [E] Km = ([ET] - [ES] - [EI]) [S] ___________________ [ES] [E] = [ET] - [ES] - [EI] ([ET] - [EI]) [S] [ES] = _________________ Km + [S]

k3 ([ET] - [EI]) [S] = __________________ Km + [S] donde vmax = k3 ([ET] - [EI])

vmax [S] ___________ Km + [S]

2.7.7.4.2 Inhibicin reversible. El complejo inhibidor (EI) y la enzima no son estables y pueden ser reversibles.

149

 Inhibicin competitiva. En la cual el sustrato y el inhibidor compiten por el mismo sitio activo de la enzima. Un posible modelo es: k1 k-1 k3

E + + I k2 k-2

ES

EI Encontrndose que:

1 ___ v

[I] Km 1 = ( 1 + ____ ) ( _____ ) ____ Ki vmax [S]

1 + _____ vmax

Ki = k-2 / k2

En este tipo de inhibicin la velocidad de reaccin aumenta ms lentamente en presencia del inhibidor, pero alcanza el valor de la velocidad mxima. Si la concentracin del sustrato es suficientemente alta como para superar la concentracin del inhibidor, la velocidad de reaccin puede ser igual vmax, o sea que este tipo de inhibicin puede reducirse aumentando la concentracin del sustrato.

Inhibicin no competitiva. En esta los inhibidores forman tambin un complejo reversible con la enzima pero en lugar distinto al sitio activo, de forma que la inhibicin no se reduce normalmente aumentando la concentracin de sustrato. Un posible modelo es: 150

E + S + I k2 EI k-2

k1 k-1

ES + I k4 k-4 EIS

k3

Cuando KIE = KIES = Ki , se presenta una inhibicin no competitiva simple; de lo contrario se tiene una inhibicin no competitiva mixta. Para la inhibicin no competitiva simple se tiene: 1 ___ v [I] Km 1 = ( 1 + ___ ) ____ ___ Ki vmax [S] [I] 1 + ( 1 + ___ ) ____ Ki vmax

En este tipo de inhibicin la velocidad es afectada, as que vmax decrece y Km no se ve afectada.

Inhibicin anticompetitiva o por sustrato. En esta el inhibidor se liga a ES formando un EIS no reactivo. La velocidad inicial de reaccin aumenta con el incremento de S, tan rpido como en ausencia del inhibidor, pero la velocidad mxima alcanzada es inferior a la de la enzima sin inhibidor. Un posible modelo es: k1 k-1 k3

ES +

E 151

I k2 EIS Encontrndose que: 1 ___ v [I] 1 ( 1 + ____ ) ___ Ki vmax Km ____ vmax 1 ____ [S] k-2

En este tipo de inhibicin decrece tanto la vmax como la Km.

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CAPTULO 3 FUNDAMENTOS DE MICROBIOLOGA

La microbiologa es el estudio de los microorganismos, un extenso y variado grupo de organismos microscpicos que existen como clulas aisladas o agrupaciones celulares. La clula es la unidad fundamental de toda materia viva. Las clulas microbianas son distintas de las clulas de animales y plantas, que son incapaces de vivir aisladas en la naturaleza y slo pueden existir como partes de los organismos pluricelulares. Una clula microbiana aislada es, en general, capaz de llevar a cabo sus procesos vitales de crecimiento, generacin de energa y reproduccin independientemente de otras clulas, de la misma o de diferente clase. Las clulas se pueden considerar como mquinas que realizan transformaciones qumicas. Todos los organismos vivos poseen las siguientes caractersticas en comn: La capacidad de ingerir o asimilar nutrientes y metabolizarlos para tener energa y crecer. La capacidad de reproducirse. La capacidad de excretar productos de desecho. La capacidad de reaccionar ante cambios en el ambiente. La susceptibilidad a la mutacin (cambio en las caractersticas de un organismo).

3.1 TAXONOMA La taxonoma es la ciencia de la clasificacin de los organismos y est constituida por dos subdisciplinas principales, la identificacin y la nomenclatura. El sistema de clasificacin biolgica esta basado en una jerarqua taxonmica u ordenamiento en grupos o categoras. En microbiologa la unidad taxonmica bsica es la especie; la cual esta constituida por un grupo de organismos (microorganismos) estrechamente relacionados, en los que los individuos del grupo son iguales en el mayor nmero de caractersticas. Los grupos de especies se renen en gneros. Por analoga a las especies, un gnero puede definirse como una coleccin de especies distintas que comparten las propiedades principales que definen dicho gnero pero difieren entre s por la presencia o ausencia de otros caracteres normalmente menos significativos. Aunque los gneros se agrupan en familias, las familias en rdenes, los rdenes en divisiones, etc., hasta alcanzar el nivel taxonmico ms alto, que es el dominio, la familia es el taxn superior que se emplea de manera rutinaria en estudios taxonmicos de procariotas.

 Nomenclatura. Es la denominacin de las unidades caracterizadas y delineadas por la clasificacin. Los microorganismos se nombran de acuerdo con el sistema binario de nomenclatura. La finalidad del nombre es proporcionar un medio para referirse a un microorganismo no para describirle. A cada organismo se le asigna un nombre de gnero y otro de especie. El nombre del gnero de un organismo se escribe con mayscula y puede abreviarse e indicarse con una sola letra mayscula. El nombre correspondiente a la especie no se abrevia nunca y se escribe con minscula. Los nombres de especies y gneros son derivados griegos o latinos de alguna propiedad descriptiva apropiada a la especie en cuestin, y se imprimen en cursiva. Por ejemplo, se han descrito varias especies del gnero Bacillus, incluyendo Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus stearothermophilus y Bacillus acidocaldarius. Los nombres de estas especies significan delgado, de cera, amante del calor y acidotrmico, respectivamente y cada uno de ellos se refiere a rasgos principales de la morfologa, fisiologa o ecologa caractersticas del organismo correspondiente. Identificacin. Consiste en la identificacin de los microorganismos al comparar las caractersticas de unidades desconocidas con unidades conocidas. Para poder identificar un organismo desconocido, es esencial que dicho organismo satisfaga todos los criterios taxonmicos de los rangos que estn por encima de la designacin de especie. Por tanto, en el ejemplo que se muestra en la Tabla 3.1, todas las especies del gnero Chromatium han de ser bacterias rojas del azufre, con forma de bacilo y Gram negativas. Lo contrario sin embargo, no tiene por qu cumplirse; no todos los miembros del dominio Bacteria son fototrficos y rojos. Tabla 3.1. Jerarqua taxonmica de la bacteria roja del azufre Chromatium warmingii _________________________________________________________________________ Divisin taxonmica Nombre Propiedades Dominio Bacteria Clulas procariticas; secuencias del ARN ribosmico tpicas del linaje de las bacterias rojas Divisin Gracilicutes Bacteria Gram-negativa. Orden Rhodospirillales Bacterias rojas fototrficas Familia Chromatiaceae Bacterias rojas del azufre Gnero Chromatium Bacterias rojas del azufre con forma bacilar. Especie warmingii Clulas de 3,5 4,0 m x 5-11 m; almacena azufre principalmente en los polos de la clula _________________________________________________________________________ Las reglas de la nomenclatura bacteriana se encuentran en la publicacin llamada The International Code of Nomenclature of Bacteria, que indica las normas que deben seguirse para designar organismos aislados por primera vez como nuevos gneros o especies. Este cdigo rige la nomenclatura de todos los procariotas. Para conseguir una atribucin taxonmica formal como gnero o especie, se publica una descripcin del aislado y del nombre que se propone y se deposita un cultivo axnico en una coleccin de 154

cultivos aprobada, normalmente en la American Type Culture Collection (ATCC, coleccin americana de cultivos tipo). La cepa depositada sirve como cepa tipo de la nueva especie, o gnero y especie, y se conserva como patrn de comparacin de otras cepas que se suponga pertenecen a la misma especie o gnero.

3.2 MTODOS EN MICROBIOLOGA Se dispone de tcnicas para determinar el tamao, la forma y la estructura de las clulas individuales, as como para saber como se agrupan las clulas. Existen procedimientos para cultivar microorganismos en el laboratorio. Estas tcnicas son muchas y en su aplicacin se utilizan muchos instrumentos de laboratorio. 3.2.1 Microscopios y microscopia. El microscopio permite una amplia gama de amplificaciones, desde cien veces a cientos de miles de veces. Para el examen microscpico de microorganismos se puede hacer uso bien del microscopio ptico o del electrnico. Todos los microscopios utilizan lentes para aumentar el tamao de la imagen de las estructuras que se examinan y permitir as observar sus detalles. Adems del aumento, es la resolucin la que permite observar dos puntos adyacentes como unidades distintas. A pesar de que el aumento se puede incrementar prcticamente sin lmite, no ocurre lo mismo con la resolucin, dado que esta limitada por las propiedades fsicas de la luz. Para el microscopio ptico los lmites de resolucin estn en aproximadamente 0.2 m (200 nm), mientras que el microscopio electrnico es capaz de incrementar los lmites de resolucin del ptico en aproximadamente 1000 veces. 3.2.1.1 Microscopios pticos: Se usa para la mayora del trabajo de rutina. Emplean ondas de luz. La amplificacin til mxima es de 1000 a 2000 dimetros. Comprenden los microscopios de campo claro, contraste de fases, campo oscuro, fluorescencia. El microscopio de campo claro est integrado por dos series de lentes (objetivo y ocular) que funcionan conjuntamente para producir la imagen. Este tipo de microscopio permite visualizar las muestras gracias a las diferencias de contraste que existen entre ellas y el medio que las rodea. Las diferencias de contraste se producen porque las clulas absorben o dispersan la luz en diferentes grados. Sin embargo, muchas bacterias son difciles de observar al microscopio de campo claro por su falta de contraste con el entorno. El microscopio de contraste de fases se desarrollo para poder incrementar las diferencias de contraste entre las clulas y el medio que las rodea, lo que permite su visualizacin sin necesidad de tincin. Este tipo de microscopio se basa en el hecho de que las clulas poseen diferente ndice de refraccin que el medio y por lo tanto producen un desvo en los rayos de luz que la atraviesan. Los rayos de luz que atraviesan una muestra con un ndice de refraccin distinto al del medio son retardados. Este efecto es amplificado por un anillo especial que posee el objetivo de los microscopios de contraste de fase, lo que da lugar a la formacin de una imagen oscura con un fondo brillante. Este microscopio permite la observacin en montajes hmedos (en los que la muestra permanece viable).

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El microscopio de campo oscuro es un tipo de microscopio en el que se ha modificado el sistema de iluminacin de manera que la luz incide sobre la muestra slo desde los lados. La nica luz que es capaz de entrar en el objetivo es la que al ser dispersada por la muestra incide sobre el objetivo; de ah que los microorganismos se observen brillantes sobre un fondo oscuro. La resolucin en los microscopios de campo oscuro es bastante alta, y pueden observarse en ellos objetos difcilmente visualizables en campo claro o en contraste de fases. El campo oscuro es tambin un mtodo excelente para estudiar la movilidad de los microorganismos. El microscopio de fluorescencia se utiliza para visualizar muestras capaces de emitir fluorescencia; esto es, capaces de emitir una determinada longitud de onda cuando previamente ha incidido sobre ellas una luz de menor longitud de onda. La fluorescencia puede ser debida a que determinadas clulas posean sustancias capaces de fluorescer, como por ejemplo, las clorofilas, o por haber sido previamente tratadas con un colorante fluorescente. 3.2.1.2 Microscopio electrnico. Se utilizan habitualmente para el estudio detallado de las estructuras celulares. Emplean haces de electrones. Para el estudio de las estructuras internas de la clula un microscopio electrnico de transmisin (TEM de transmisin electron microscope) es esencial. En el TEM se utilizan electrones en lugar de rayos de luz y la funcin de las lentes la realizan electromagnetos, operndose en todo momento a vaco. El poder de resolucin del microscopio electrnico es mucho mayor que el microscopio ptico. Sin embargo, los haces electrnicos poseen bajo poder de penetracin, resultando difcil la observacin de estructuras intracelulares. Por ello, se emplean tcnicas especiales para la obtencin de cortes ultrafinos, que permitan la observacin de las muestras. Cuando slo se pretende estudiar las estructuras externas de una muestra, no son necesarios los cortes ultrafinos, pudindose realizar la observacin directa en TEM, despus de aplicar una tcnica denominada tincin negativa. Tambin se puede usar el microscopio electrnico de barrido (SEM de scanning electron microscope). Mediante esta tcnica la muestra a estudiar se recubre con una fina capa de un metal pesado, como el oro. El haz de electrones del SEM barre la superficie de la muestra; los electrones desviados por la capa de metal son recogidos y proyectados sobre una pantalla para producir una imagen. 3.2.2 Preparaciones para el examen por microscopia ptica. Dos tcnicas generales son las que se emplean para proporcionar material o muestras para la observacin microscpica. Una es la suspensin de los microorganismos en un lquido. La otra utiliza pelculas o frotis secos, fijados y teidos de la muestra. 3.2.2.1 Tcnica del montaje en hmedo y de gota pendiente. Las preparaciones hmedas se hacen colocando una gota del fluido que contiene el organismo sobre una lmina de vidrio, conocida como portaobjetos, que se cubre con una fina pieza de vidrio denominada cubreobjetos. Para reducir la velocidad de evaporacin y eliminar corrientes de aire, generalmente se rodea la gota con vaselina o un material similar que proporcione un cierre entre el portaobjetos y el cubreobjetos. 156

Figura 3.1 (A) Con un palillo se hace un anillo de vaselina en torno a la depresin que hay en el portaobjetos. (B) Se pone un poco de suspensin microbiana en el centro de un cubreobjetos. (C) Se invierte el cubreobjetos y se pone sobre la depresin del portaobjetos. 3.2.2.2 Tcnicas de tincin. Con el objeto de incrementar el contraste y facilitar la observacin de la muestra en microscopia de campo claro, se puede utilizar colorantes. Los colorantes son compuestos orgnicos y cada tipo de colorante puede tener afinidad por determinadas estructuras celulares. Muchos de los colorantes utilizados estn cargados positivamente (catinicos) y se combinan fuertemente con componentes celulares cargados negativamente, como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Entre los colorantes catinicos se pueden citar el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Se han desarrollado procedimientos de tincin para: observar mejor el aspecto morfolgico, identificar partes estructurales y ayudar a identificar y/o diferenciar organismos similares. Las tinciones ms simples se realizan sobre muestras presecadas. Se coloca un frotis o una fina pelcula de la muestra sobre un portaobjeto de vidrio. La fijacin del frotis sobre el portaobjetos se logra mediante calentamiento, el cual hace que los microorganismos se peguen al portaobjetos. Sobre el portaobjetos con la suspensin seca de microorganismos se derrama una pequea cantidad de una solucin diluida del colorante, y se mantiene el contacto durante uno o dos minutos, se lava varias veces con agua y se seca. Este tipo de preparacin suele observarse con un objetivo de inmersin. La aplicacin de un solo colorante se conoce como tincin simple y la de una serie de soluciones de colorantes o reactivos se denomina tincin diferencial. La tincin diferencial no tie de manera homognea a todos los tipos de clulas. La ms importante tincin diferencial utilizada en microbiologa se denomina tincin de Gram. Dependiendo del resultado de esta tincin, las bacterias pueden dividirse en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram negativas. Adems, se tienen las tinciones diferenciales: cido resistente, Giemsa, de esporas, de cpsulas, de flagelos, entre otras. En la tincin de Gram se dan los siguientes pasos: Tincin del frotis previamente fijado al calor con cristal violeta (CV) durante 1 minuto. Todas las clulas se tien de color azul/prpura. 157

 Adicin de la solucin de iodina, dejando que acte durante 3 minutos. Se forma un complejo CV-I Todas las clulas siguen del mismo color. Adicin de alcohol (20 segundos). En las bacterias Gram positivas las paredes celulares se deshidratan, los poros merman, la permeabilidad de la pared celular y de la membrana disminuye, el complejo CV-I no puede salir de las clulas y las clulas permanecen de color azul/prpura. En las bacterias Gram negativas se extraen los lpidos de las paredes celulares, los poros se agrandan y el complejo CV-I es eliminado de la clula y stas quedan incoloras. Tincin de contraste con safranina durante uno o dos minutos. Las bacterias Gram positivas no se afectan y siguen de color azul/prpura. Las bacterias Gram negativas toman este colorante y se ponen de color rojo. En la tincin negativa la muestra se mezcla con tinta china y se extiende formando una pelcula fina. Se llama tincin negativa porque los microorganismos no se tien y se hacen visibles porque el fondo esta oscuro. El procedimiento de tincin y los reactivos son muy suaves. Se usa para el estudio de la morfologa de las clulas.

3.3 TCNICAS DE CULTIVO PURO Un estudio adecuado de los microorganismos que existen en los diferentes hbitat requiere tcnicas que permitan conocer y ordenar la compleja poblacin mixta o cultivo mixto, separndola en sus distintas especies como cultivos puros. Un cultivo puro o axnico es un cultivo que contiene slo una clase de microorganismo. Para obtener un cultivo puro se debe ser capaz de cultivar el organismo en el laboratorio. Esto requiere que se le suministren los nutrientes adecuados y las condiciones ambientales que le permitan crecer. Es tambin esencial que se evite que entren en el cultivo otros microorganismos. Tales organismos no deseados, llamados contaminantes, estn por todas partes y la tcnica microbiolgica se centra precisamente en evitar esos contaminantes. Una vez que se ha aislado un cultivo puro se pueden luego establecer las condiciones para estudiar su bioqumica, su fisiologa, su gentica y otras caractersticas. La solucin acuosa con los nutrientes necesarios se denomina medio de cultivo. Los nutrientes que estn presentes en el medio de cultivo proporcionan a la clula microbiana los ingredientes necesarios para que se produzcan ms clulas como ella misma. Los medios de cultivo se pueden preparar para ser usados en estado lquido o como geles semislidos. Un medio de cultivo lquido puede pasar a estado semislido por la adicin de un agente solidificante, que normalmente es el agar. Los medios de cultivo con agar se disponen en cajas circulares de vidrio o plstico, con tapa, que se llaman placas de petri, donde las clulas microbianas pueden crecer y formar masas visibles, denominadas, colonias. Antes de proceder a realizar un cultivo de microorganismos se debe considerar como evitar los contaminantes; para ello, se debe esterilizar el medio de cultivo inmediatamente 158

despus de su preparacin; casi siempre, mediante calentamiento. Adems, hay que tener presente que los otros materiales que entren en contacto con el medio de cultivo deben a su vez estar estriles. Los contaminantes areos constituyen el problema ms comn, ya que el aire siempre contiene partculas de polvo que generalmente contienen comunidades de microorganismos. Cuando los recipientes se abren, deben ser manejados de tal modo que el aire cargado de contaminantes no entre en ellos, con la ayuda de mecheros de alcohol. La transferencia asptica de un cultivo desde un tubo a otro, por ejemplo, se realiza normalmente con un asa de cultivo o una aguja, que ha sido previamente esterilizada por calentamiento a la llama. Los cultivos en los que ha habido crecimiento pueden tambin ser transferidos a la superficie de placas de medio con agar, donde se forman colonias, mediante el crecimiento y divisin de clulas aisladas. Por ejemplo, en el aislamiento de cultivos puros de las bacterias de la boca, se siguen los siguientes principales pasos: Se recoge la saliva en una vasija estril.

Se inocula o se siembra la saliva en un medio apropiado, de manera que las clulas individuales queden localizadas sobre o dentro del medio, separadas unas de otras. El material que se inocula se denomina inculo. Se procede a la incubacin, mediante la cual las clulas microbianas individuales se reproducen rpidamente en 18 a 24 horas, obtenindose masas individuales de clulas denominadas colonias. Cada colonia diferente es presumiblemente un cultivo puro de una sola clase de microorganismo. Entre los mtodos para el aislamiento de cultivos puros de microorganismos se tienen: Siembra en placa por estra. El inculo se siembra sobre la superficie de un medio del tipo del agar nutritivo, en una placa petri, haciendo estras con una aguja enmangada (A). En aquellos lugares donde las lneas estriadas queden suficientemente separadas crecern colonias aisladas (B).

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 Extensin en placa. Se coloca una gota de inculo en el centro de una placa de petri con un medio del tipo del agar nutritivo y con un tubo de vidrio doblado se extiende el inculo sobre la superficie del medio. En algunas placas aparecen colonias aisladas.

Siembra en masa en placa. Mediante un asa se transfiere el inculo de la suspensin original a un tubo de ensayo A (medio lquido estril), el cual se hace rodar entre las dos manos para lograr una homogenizacin del inculo con el medio. Se realizan transferencias similares de A a B y de B a C. A continuacin se vierte el contenido de cada tubo a una caja de petri. Finalmente, despus de incubadas se examinan las placas para ver si existen colonias aisladas. A partir de las placas que las tenga pueden aislarse cultivos puros de los microorganismos al transferir una porcin de una colonia a un tubo de medio estril.

Cultivo de enriquecimiento. Para mejorar la probabilidad de aislar un microorganismo microorganismo que posee una caracterstica fisiolgica o bioqumica nica, se puede sembrar por estra, por extensin o en masa pasando el inculo a travs de una serie de transferencias a un medio de una composicin y condiciones de incubacin, que favorezcan el desarrollo del microorganismo deseado. El procedimiento de enriquecimiento aumenta en efecto la proporcin del organismo deseado en relacin con lo que estaba presente en el inculo inicial. 160

 Aislamiento de una sola clula. Mediante un micromanipulador (micropipeta) se coge un solo microorganismo de una suspensin de clula, mientras se examina la preparacin con un microscopio. La clula aislada es luego transferida a un medio estril.

3.4 MANTENIMIENTO Y CONSERVACIN DE CULTIVOS PUROS Una vez que un microorganismo ha sido aislado en cultivo puro, puede ser necesario mantener el cultivo en condiciones para que siga creciendo durante un cierto perodo de tiempo. La American Type Culture Collection (ATCC), mantiene miles de especies de microorganismos, incluidos virus. Se utilizan muchos procedimientos para conservar y mantener cultivos de microorganismos. Para el mantenimiento durante corto tiempo, los cultivos pueden almacenarse a temperaturas de refrigeracin de 0 a 10 0C; para el mantenimiento durante largo tiempo se almacena en nitrgeno lquido a 196 0C. Tambin pueden ser deshidratados en un tubo, cuando estn congelados y cerrados hermticamente en el vaco. Este proceso se denomina liofilizacin (Figura 3.2).

3.5 TCNICAS DE CARACTERIZACIN. Una vez que se ha obtenido un cultivo puro de un microorganismo, se est en disposicin de realizar una serie de exmenes de laboratorio, que contribuyen con informacin acerca del microorganismo. La cuanta de pruebas de laboratorio est determinada por el tipo de cuestiones que se quieran resolver. Si el cultivo en examen corresponde a una nueva clase o a una que ya se conoce, es preciso en ambos casos, caracterizar ampliamente el cultivo. Cualesquiera que sean los objetivos, las caractersticas que deben buscarse y las pruebas que deben realizarse estn resumidas en: 161

Figura 3.2 Proceso de liofilizacin para la conservacin de cultivos. Pequeos viales tapados con algodn y que contienen suspensiones congeladas de los organismos. Se colocan en un frasco de vidrio que va unido a un condensador, el cual se conecta a una bomba de alto vaco y este sistema deshidrata los cultivos. Despus de que los cultivos han sido deshidratados se sacan los viales, se colocan individualmente en tubos mayores, se taponan con asbesto y se cierran al vaco. Morfolgicas. Observacin de muestras por microscopia ptica y electrnica, bien teidas o sin teir. Nutricionales. Determinacin de las sustancias qumicas especficas y de las condiciones fsicas (temperatura, luz, gases, pH, etc.) que se necesitan para permitir el desarrollo del microorganismo. De cultivo. Determinacin del aspecto del crecimiento microbiano sobre varios tipos de medios de laboratorio, tanto lquidos como slidos. Metablicos. Identificacin y medida de los cambios qumicos realizados por los microorganismos. Algunas pruebas son fciles de realizar y simplemente proporcionan una respuesta de s o no acerca de las causas de cambios qumicos en una sustancia en particular, por ejemplo, el cambiar los carbohidratos a cidos. En el otro extremo hay mtodos que permiten la identificacin de la mayora de los compuestos qumicos implicados en cualquier proceso metablico; esto permite reconstruir paso a paso cmo realizan estos cambios los microorganismos. Composicin qumica. Determinacin de la constitucin qumica de los componentes celulares. Se dispone de tcnicas para romper las clulas y recuperar (aislar) de la mezcla que resulta, componentes especficos tales como fragmentos de pared celular, material nuclear y membranas. Existen procedimientos disponibles por los que se puede determinar la estructura qumica de cada componente. 162

 Composicin antignica. La caracterizacin de los microorganismos, bacterias y virus, mediante el estudio de antgenos, sustancias qumicas presentes sobre su superficie. Patognicas. La determinacin del potencial productor de enfermedades de un cultivo microbiano se realiza mediante la inoculacin de animales o vegetales con cultivos puros del microorganismo. Algunas de estas pruebas son relativamente fciles de realizar. Otras son ms completas y exigen la utilizacin de tcnicas bioqumicas que han sido desarrolladas especficamente para identificar productos del metabolismo.

3.6 BACTERIAS 3.6.1 Caractersticas morfolgicas. Entre las caractersticas morfolgicas figuran el tamao, la forma, la estructura y el tipo de agrupacin. Las bacterias ms frecuentemente estudiadas en la microbiologa miden aproximadamente 0,5 a 1.0 por 2,0 a 5,0 m. Aunque las bacterias son sumamente diminutas, es posible medir sus dimensiones con relativa facilidad y precisin. Para este fin, el microscopio se equipa con un micrmetro ocular, que es un disco que lleva grabadas lneas equidistantes y que permite ver la las lneas de la regla puestas sobre los microorganismos. Las clulas individuales son elipsoidales, esfricas, alargadas (cilndricas) o en espiral (helicoidales). Las clulas bacterianas esfricas o elipsoidales se denominan cocos. Las clulas cilndricas o alargadas se denominan bacilos. Existen considerables diferencias en la longitud y la anchura de las varias especies de bacilos. Los extremos de algunos bacilos son rectangulares, otros redondeados y otros estn afilados o puntiagudos. Las bacterias en forma de espiral o espirilos se presentan predominantemente como clulas individuales sin unir. Ciertas especies de bacterias muestran patrones de ordenamiento de sus clulas tales como parejas, racimos, cadenas o filamentos. Los cocos presentan varios ordenamientos (Figura 3.3). Cada uno de estos ordenamientos es caracterstico de una especie en particular. Existen ordenamientos de los cocos en: diplococos, en los cuales las clulas permanecen unidas predominantemente en parejas; estreptococos, las clulas permanecen unidas formando cadenas; tetracocos, las bacterias forman grupos de cuatro clulas; estafilococos, las bacterias se unen formando racimos de cocos y sarcinas en las cuales se presenta un ordenamiento cbico de las clulas. Los bacilos no se ordenan segn una variedad de patrones como los caractersticos de los cocos. Algunas especies, sin embargo, muestran tendencia a un ordenamiento de sus clulas (Figura 3.4). El bacilo que causa la difteria tiende a producir agrupamientos de clulas alineadas lateralmente, denominado ordenamiento en empalizada. Las clulas de algunas especies acuticas se ordenan segn un modelo de roseta. Las clulas de otras especies se encuentran en pares (diplobacilos) o en cadenas (estreptobacilos)

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Figura 3.3. Modelo de ordenamiento de los cocos. (A) Diplococos. (B) Estreptococos. (C) Tetracocos. (D) Estafilococos. (E) Sarcinas.

Figura 3.4

Modelos de ordenacin de los bacilos. (A) Empalizadas. (B) En roseta. (C) Cadenas

En las bacterias en espiral, los espirilos, predominan las clulas individuales aisladas. Las formas espirilares de diferentes especies exhiben notables diferencias en cuanto a su 164

longitud, nmero y amplitud de las vueltas de espiral y en la rigidez de las paredes celulares. Algunos de estos organismos son cortos y apretadamente enrollados. En otros las ondulaciones son muy largas, retorcidas y curvas. Cuando la espiral es corta e incompleta, se habla de bacterias en coma o vibriones. (Figura 3.5).

Figura 3.5. Modelos de bacterias en forma de espiral El examen de una clula bacteriana por tcnicas de microscopia moderna, revela que existen estructuras por fuera de la pared celular. Otras estructuras o corpsculos se encuentran encerrados dentro de la pared celular. Algunas partes estructurales son comunes a todas las clulas, tales como la pared celular y la membrana citoplasmtica. Otras estructuras estn presentes solamente sobre o dentro de las clulas de ciertas especies. Las principales estructuras externas a la pared celular no son comunes a todas las clulas y se tienen por ejemplo: la cpsula, flagelos, esporas y pelos. Como ya se mencion los flagelos son responsables de la movilidad de las clulas bacterianas y estn constituidos por la protena flagelina. No todas las bacterias poseen flagelos; muchas especies de bacilos y espirilos no los tienen, pero los flagelos raramente se encuentran en cocos. En el caso de bacterias con flagelos el patrn de fijacin de estos apndices as como el nmero de ellos (Figura 3.6), se utiliza para clasificar estas bacterias dentro de ciertos grupos taxonmicos. Algunas clulas bacterianas, por ejemplo, los neumococos, estn rodeadas de una capa de material viscoso conocido como glicocliz, cpsula o capa mucosa. El glicocliz posee estructura y composicin diferente en los distintos organismos, debido a que contiene habitualmente glucoprotenas y un gran nmero de distintos polisacridos, incluyendo polialcoholes y aminoazcares. El glicocliz puede ser grueso o delgado, rgido o flexible, dependiendo de su naturaleza qumica. El tamao del glicocliz esta marcadamente influenciado por el medio en el que crece la bacteria; en algunos casos el grosor de ste es slo una fraccin del dimetro de la clula; en otros casos, el glicocliz es mucho mayor que la clula. Al glicocliz se le denomina cpsula, cuando las capas rgidas estn organizadas en una matriz impermeable que excluye colorantes como la tinta china. Cuando el glicocliz se deforma con facilidad, es incapaz de excluir partculas y es ms difcil de ver, se le denomina de capa mucosa. Existen razones para creer que el material que forma el glicocliz es segregado a partir de la clula y que, dada su viscosidad, no 165

Figura 3.6. Ordenamiento de los flagelos en las bacterias: (A) montrico (B) lofotrico (C) anfitrico (D) pertrico puede difundir fcilmente quedando por ello en torno a la pared celular. El glicocliz bacteriano proporcionan una cubierta protectora, sirven de reservorio de alimento almacenado y fijan una cantidad considerable de agua (resistencia a la desecacin). Algunas especies de bacterias, particularmente las de ambientes de aguas dulces (ricas en materia orgnica) y marinas, estn encerradas dentro de una vaina o tbulo. Las vainas estn formadas por compuestos metlicos insolubles, tales como xidos frricos y magnsico precipitados en torno a la clula, como productos de su actividad metablica. Ciertas bacterias se caracterizan por la formacin de un apndice semirrgido llamado pednculo que se prolonga desde la clula. El pednculo tiene una sustancia adherente en su extremo distal, que permite a la clula pegarse a superficies slidas. Las bacterias pedunculadas se encuentran en aguas dulces o en ambientes marinos. Debajo de las sustancias extracelulares tales como las cpsulas o las capas mucosas y externas a la membrana citoplasmtica, que es un componente de todas las clulas vivas, esta la pared celular, una estructura muy rgida que da forma a la clula. El espesor de la pared celular de la mayora de las bacterias estudiadas oscila entre 10 y 35 nm, sin embargo, algunas paredes celulares son mucho ms gruesa. La pared celular constituye una porcin significativa del peso total de la clula. Dependiendo de la especie y de las condiciones de cultivo, puede ser del 10 al 40 % del peso seco del organismo. Las paredes celulares bacterianas son esenciales para el crecimiento y la divisin. 166

Las bacterias Gram-positivas tienen una pared celular gruesa (15-80 nm), con triple capa, constituida principalmente por peptidoglucano, que corresponde al 50 % del peso seco de algunas clulas bacterianas. Adems, contiene cidos teicoicos y lpidos en una baja proporcin (1- 4 %). Estas bacterias son ms susceptibles a la penicilina. Su crecimiento es retrasado por colorantes bsicos, como el cristal violeta. Sus requerimientos nutricionales son relativamente complejos en muchas especies. Son las ms resistentes a la rotura mecnica. Las bacterias Gram-negativas tienen una pared celular delgada (10-15 nm), con triple capa, una capa de peptidoglucano (capa interna), una capa de lipopolisacrido (capa externa) y una capa de lipoprotena (capa media). El peptidoglucano, representa el 10 % del peso seco de algunas clulas bacterianas. Adems, contiene lpidos en una alta proporcin (1122 %) y no presenta cidos teicoicos. Estas bacterias son menos susceptibles a la penicilina. Su crecimiento no se retrasa significativamente por colorantes bsicos, como el cristal violeta. Sus requerimientos nutricionales son relativamente sencillos. Son menos resistentes que las Gram-positivas, a la rotura mecnica. La membrana citoplasmtica o membrana protoplasmtica o membrana plasmtica est localizada inmediatamente debajo de la pared celular. Su espesor es del orden de 7,5 nm. Controla el paso de sustancias qumicas en solucin hacia dentro y fuera de la clula. Proporciona adems la maquinaria bioqumica para transportar iones inorgnicos, azcares, aminocidos, electrones y otros metabolitos a travs de la membrana. Estas sustancias en solucin pasan a travs de la membrana por difusin pasiva o bien por transporte activo. La membrana citoplasmtica se repliega hacia el interior de la clula o se invagina en el citoplasma, produciendo una estructura denominada mesosoma. Con frecuencia se ve que se originan en el punto en donde la membrana inicia una invaginacin previa a la divisin celular y quedan unidos a la regin nuclear. Se cree que los mesosomas funcionan en la sntesis de la pared celular y en la divisin del material nuclear. La estructura viable derivada de una clula vegetativa por la separacin de toda la pared celular, se llama protoplasto. Los protoplastos son cuerpos redondos que toman la forma esfrica desde el momento en que carecen de la pared celular, inmviles, no se dividen, no forman nuevas paredes y por lo general no son susceptibles a la infeccin por ..... (fagos patgenos). La produccin experimental de protoplastos se logra mediante dos procedimientos: separacin de la pared celular por tratamiento enzimtico (lisozima) o cultivo de la bacteria en un medio con penicilina por ejemplo, que impide la sntesis de la pared celular. En cualquiera de los dos mtodos es necesario ajustar la presin osmtica del medio, para mantener la integridad estructural de la nueva clula desprovista de su pared celular. Cuando se colocan en agua estos protoplastos estabilizados en una determinada concentracin de sacarosa, se produce rpidamente la lisis, es decir, el agua penetra en la clula, sta se hincha y estalla. Cuando el peptidoglucano se separa en las bacterias Gram-negativas, otras capas de la pared permanecen adheridas a los cuerpos redondos, a stas se les llama esferoplastos, porque no son protoplastos limpios. El material celular contenido dentro de la membrana citoplasmtica se divide en el rea citoplasmtica de aspecto granular y que es rica en ARN, el rea cromtica o rea nuclear 167

que es rica en ADN y la porcin fluida que contiene nutrientes disueltos y materia particulada, denominada cuerpos de inclusin. Densamente empaquetadas a travs del rea citoplasmtica existen partculas de protenaARN, llamadas ribosomas, que son el sitio de la biosntesis de protena. El material nuclear o ADN, en una clula bacteriana ocupa una posicin cerca del centro de la clula y esta unido al sistema mesosoma-membrana citoplasmtica. Este material es el aparato gentico total o genoma de la bacteria y consta de un nico cromosoma, en el que van todos los genes. El cromosoma procaritico es una molcula circular, aunque se conoce que algunas bacterias poseen un ADN cromosmico lineal. Al material nuclear de la bacteria se le designa cuerpo de cromatina, nucleoide o cromosoma bacteriano. Se ha encontrado que en el genoma de la Escherichia coli existen 4,7 millones de pares de bases, que al abrirse y linealizarse alcanza una longitud aproximada de 1 mm, aunque la clula de E. coli mide slo 2-3 m de largo; por tanto, el ADN debe estar empaquetado. El empaquetamiento de tanto ADN en la clula requiere el superenrrollamiento del ADN. El ADN superenrrollado adopta una forma ms compacta que el circular. En el cromosoma de la E. coli existen unos 50 dominios superenrrollados, que son estables debido a su asociacin con protenas estructurales. Esta estructura permite el plegamiento y la torsin de la larga molcula de ADN para adaptarse a la clula. Dentro del citoplasma pueden acumularse diferentes clases de sustancias qumicas y formar grnulos y glbulos denominados cuerpos de inclusin. Por ejemplo, algunas especies de bacterias del azufre, acumulan grandes cantidades de azufre que aparecen como glbulos dentro del citoplasma. Otros cuerpos de inclusin encontrados en las bacterias estn compuestos de polifosfato, lpidos, glucgeno, almidn, cido poli--hidroxibutrico (PHB), magnetita (Fe3O4). Ciertas especies de bacterias producen esporas, ya sea externas a la clula (exosporas) o bien dentro de la clula vegetativa (endosporas). Estos son cuerpos metablicamente durmientes producidos en el ltimo estadio del crecimiento celular que, bajo condiciones apropiadas, germinan y producen la clase original de clula en crecimiento o vegetativa. Existen esporas elpticas localizadas centralmente, esfricas localizadas terminalmente y ovaladas con localizacin subterminal. Las esporas son resistentes a muchos agentes fsicos y qumicos.

3.7 CIANOBACTERIAS Las cianobacterias son organismos procariticos fotosintticos. Es decir, que contienen clorofila y otros pigmentos que les permiten realizar fotosntesis. Captan la energa lumnica a travs de ficobilisomas, complejos proteicos exclusivos de estos procariotas y algas rojas. En los ficobilisomas abunda la ficocianina, protena azulada que, junto con la clorofila , verdosa, dan a las cianobacterias su coloracin verde-azulada. Las cianobacterias tienen una estructura celular como la de las bacterias y son ligeramente mayores que stas. Son unicelulares y se encuentran aisladas o en cadenas de clulas, que a

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veces son ramificadas. La reproduccin es asexual, por fisin binaria simple, por fisin mltiple o por produccin de esporas (Garbisu et al., 1999), (Brock, 2001). Numerosos organismos procariticos, como las cianobacterias, producen vesculas de gas que son las responsables de la flotabilidad de las clulas. Las vesculas de gas son estructuras en forma de haz, huecas pero rgidas, con distinta longitud y dimetro. Se hallan localizadas en el citoplasma en un nmero muy variable, desde unas pocas hasta centenares por clula. La membrana de la vescula de gas se compone slo de protena, tiene unos 2 nm de espesor y es impermeable al agua y a los solutos, pero permeable a la mayora de los gases; por lo tanto, las vesculas de gas, aparecen como estructuras rellenas de gas rodeadas por los constituyentes del citoplasma. Algunas cianobacterias asimilan nitrgeno atmosfrico. Son las que disponen de nitrogenasa, sistema enzimtico que cataliza la reduccin de N2 a iones amonio (NH4+). En el laboratorio se cultivan sin mayor dificultad en medios lquidos o agar solidificado con luz artificial o natural. Se ha creado una industria en torno a estas microalgas, sobre todo en pases que gozan de abundante luz solar y climatologa adecuada. De entre las explotaciones a gran escala destacan por su abundancia y productividad las de Spirulina (ahora denominada Arthrospira). Antao, las cianobacterias se cultivaban en estanques abiertos a la intemperie o en el interior de invernaderos. Hoy se emplean fotobiorreactores construidos con tubos de plstico transparente o translcido, que se disponen helicoidalmente (Garbisu et al., 1999).

3.8 HONGOS El estudio de los hongos se denomina micologa. Aunque los hongos constituyen un grupo grande y diverso, prcticamente hay tres grupos importantes: los hongos filamentosos (mohos), las levaduras y las setas. Los hongos son microorganismos eucariticos quimioorganotrficos. Cuando se comparan con las bacterias, los hongos tienen en general, requerimientos nutricionales simples y sus procesos biosintticos no son particularmente diferentes o inusuales. Cuando requieren materia orgnica muerta para su nutricin se les conoce como saprfitos. Como saprfitos destruyen plantas complejas y restos de animales degradndolos a formas qumicas simples que pasan a formar parte del suelo y, finalmente, son absorbidas por otras generaciones de plantas. El crecimiento saproftico de los hongos tambin puede ser daino y causar cuantiosas prdidas si ocurre en maderas, alimentos y otros materiales. Los hongos producen venenos (micotoxinas) muy txicos y en algunos casos carcinognicos (productores de cncer). Los hongos saprfitos son importantes en las fermentaciones industriales de cerveceras y vinateras, en la produccin de antibiticos, vitaminas y cidos orgnicos. Tambin en las panaderas y el curado de los quesos. Algunos hongos a pesar de ser saprfitos, pueden invadir a los hospedadores vivos y prosperar como parsitos. Como parsitos los hongos enferman a plantas, hombres y animales; aunque la mayor parte de esos males son menos graves que los que les causan las bacterias y los virus. 169

Los hongos contienen paredes celulares rgidas y se asemejan, en cuanto a su arquitectura, a las paredes celulares de plantas, pero no qumicamente. Ciertos hongos poseen celulosa en sus paredes celulares, pero en la mayora no est presente. La quitina es un constituyente comn de las paredes y se encuentra en microfibrillas como la celulosa; otros polisacridos como los mananos, galactanos y quitosn remplazan a la quitina en algunos grupos de hongos. Algunos hongos poseen simultneamente celulosa y quitina. Las paredes celulares fngicas constan del 80-90 % de carbohidratos, siendo las protenas, lpidos, polifosfatos e iones inorgnicos, el material cementante. Los hongos pueden soportar un ambiente desfavorable, mejor que la mayora de los otros microorganismos. Por ejemplo, los hongos filamentosos y las levaduras pueden crecer en un sustrato o medio con concentraciones de azcar que inhiben a la mayora de las bacterias; por esto las mermeladas y las gelatinas pueden ser alteradas por hongos pero no por bacterias. Tambin los hongos pueden tolerar condiciones ms cidas que la mayora de los microorganismos restantes. Para la mayora de los hongos el pH ptimo oscila entre 3,8 y 5,6. Los hongos crecen a lo largo de una amplia gama de temperaturas, con un ptimo para la mayora de las especies saprfitas entre 22 0C y 30 0C; las especies patgenas (parsitos) tienen una temperatura ptima ms elevada, generalmente entre 30 0C y 37 0C. Algunos hongos crecen a temperaturas prximas a 0 0C y por ello causan alteraciones en la carne y hortalizas en refrigeracin. Los mohos termfilos se desarrollan a 62 0C. Aunque necesitan humedad para su desarrollo y pueden obtener agua de la atmsfera y del medio, los mohos pueden sobrevivir en ambientes deshidratados que seran inhibidores para la mayor parte de las bacterias diferentes a las formadoras de esporas. Cuando el medio se deseca los hongos producen esporas o pasan al estadio de resistencia. Las levaduras son facultativas, es decir pueden crecer tanto en condiciones aerobias como anaerobias. Los hongos filamentosos son estrictamente aerobios. Los hongos son resistentes a las penicilinas, tetraciclinas y el clorofenicol; son sensibles a la griseofulvina. La mayora de las partes de un hongo filamentoso son potencialmente capaces de crecer y multiplicarse. La inoculacin de un diminuto fragmento sobre un medio, es suficiente para iniciar un nuevo individuo. Los hongos se reproducen de forma natural mediante una variedad de formas, bien sea asexualmente por fisin, gemacin o formacin de esporas o sexualmente por fusin de dos ncleos de clulas parentales. Las esporas asexuales, cuya funcin es diseminar la especie, se producen en gran nmero. Existen muchas clases de esporas asexuales: conidiosporas o conidios, esporangiosporas, oidios o artrosporas, clamidosporas y blastosporas. Las esporas sexuales, que se producen por fusin de dos ncleos, se forman generalmente ms tarde y en nmero menor que las esporas asexuales. Adems, slo se forman bajo ciertas condiciones. Existen varios tipos de esporas sexuales: ascosporas, basidiosporas, zigosporas y oosporas. Las esporas asexuales y las sexuales pueden estar rodeadas de unas estructuras protectoras altamente organizadas denominadas cuerpos fructferos. La clasificacin de los hongos esta basada principalmente en las caractersticas de las esporas sexuales y de los cuerpos fructferos presentes durante los estadios sexuales de su ciclo biolgico. Los hongos con un estado sexual conocido y no conocido se denominan 170

hongos perfectos y hongos imperfectos, respectivamente. Para los hongos imperfectos deben utilizarse en su clasificacin otras caractersticas como, la morfologa de sus esporas asexuales y de los micelios. Existen cuatro clases de hongos verdaderos o filamentosos en el reino Fungi: Phycomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes y Deuteromycetes. Las levaduras son hongos unicelulares. Normalmente, son clulas ovales o cilndricas. En general, las clulas de levadura son mayores que las bacterias. Las levaduras varan considerablemente en cuanto a tamao, oscilando entre 1-5 m de anchura y entre 5-30 m de longitud. Cada especie tiene una forma caracterstica pero, aun en cultivo puro, existe una considerable variacin en el tamao y forma de las clulas individuales, dependiente de la edad y del entorno. Las levaduras no poseen flagelos ni ningn otro rgano de locomocin. Las levaduras normalmente prosperan en hbitat con abundante azcar, tales como frutas, flores e incluso la corteza de los rboles. Algunas de ellas viven en simbiosis con animales, especialmente insectos y slo algunas son patgenas para animales y el hombre. Las levaduras ms importantes desde el punto de vista comercial son las cepas cerveceras y panaderas de la especie Saccharomyces cerevisiae. Durante el proceso de gemacin, se origina una pequea yema que aumenta de tamao gradualmente y se separa de la clula madre. Las levaduras normalmente no desarrollan un micelio, sino que permanecen en estado unicelular durante todo el ciclo de crecimiento. Sin embargo, algunas pueden filamentar. As por ejemplo, la levadura Candida albicans, una levadura potencialmente patgena que causa infecciones vaginales, de pulmones e incluso infecciones sistmicas y dao tisular en enfermos de SIDA, necesita estar en forma filamentosa o micelial para ser verdaderamente patgena. Incluso la Saccharomyces cerevisiae es capaz de formar micelio bajo ciertas condiciones. Algunas levaduras se reproducen sexualmente mediante apareamiento, originando un zigoto y eventualmente ascosporas. Los mohos son hongos filamentosos. Son alargados o filamentosos, por lo general ramificados. Cada filamento crece fundamentalmente en el pice, por extensin de la clula terminal. Cada filamento se llama hifa que crece formando bolas compactas que colectivamente se conoce como micelio, que pueden fcilmente ser vistas sin el microscopio. Cada hifa tiene 5-10 m de grosor. Las hifas poseen pared celular que contiene quitina o celulosa o las dos. La mayor parte de los hongos filamentosos son inmviles, si bien pueden tener clulas reproductoras mviles. A lo largo de cada hifa, hay un citoplasma comn. Las hifas existen en tres tipos morfolgicos (Figura 3.7): No septadas o cenocticas. Estas hifas no tienen tabiques transversales o septos, derivados de sus paredes. Septadas con clulas mononucleadas. Los septos dividen a las hifas en compartimientos o clulas con un solo ncleo en cada compartimiento. En cada septo existe un poro central que permite la migracin de los ncleos y del citoplasma desde un compartimiento a otro. Aunque cada compartimiento de una hifa septada no esta limitado 171

por una membrana como en una clula tpica, habitualmente se hace referencia a un compartimiento como si fuese una clula. Septadas con clulas plurinucleadas. Los septos dividen a las hifas en clulas con ms de un ncleo en cada compartimiento.

Figura 3.7. Tres tipos de hifas (A) no septada (cenoctica) (B) septada con clulas mononucleadas (C) septada con clulas plurinucleadas Los micelios pueden ser vegetativos o bien reproductores. Algunas hifas del micelio vegetativo penetran en el medio, a fin de obtener nutrientes para el organismo. Los micelios reproductores son responsables de la produccin de esporas y usualmente se proyectan hacia el aire, a partir del micelio. El talo es todo el hongo filamentoso en forma individual, incluidas las porciones vegetativas o no sexuales y todas las estructuras especializadas. La glucosa es una fuente de carbono muy aprovechada por muchos mohos. Otros azcares, sobre todo la sacarosa y la maltosa, as como muchos compuestos ms complejos, como el almidn y la celulosa, son utilizados por muchas especies. Algunas especies necesitan, y todas pueden utilizar, sustratos con nitrgeno orgnico. Otras se sirven de nitrgeno inorgnico (sales de amonio o nitratos). Para su desarrollo necesitan pequeas cantidades de hierro, fsforo, potasio, zinc, cobre, manganeso y molibdeno. Algunas especies requieren vitaminas. Un medio natural de amplio uso para el cultivo de los mohos, en el laboratorio, es la infusin de papa con agar y glucosa.

3.9 VIRUS Los virus no son clulas, su estructura y composicin son ms simples que las de la clula procaritica. No viven libres, sino que son parsitos obligados, es decir requieren una clula viva para su propagacin. Por lo tanto, no crecen en medios artificiales de laboratorio. Constan de una cadena de cido nucleico, o bien ADN o bien ARN, envuelta 172

de una capa de protena. En comparacin con la mayora de los microorganismos los virus son muy pequeos. Su tamao oscila entre los 20-25 nm y los 200-300 nm. Los virus no pueden verse utilizando el microscopio ptico. Las partculas vricas pueden verse por microscopia electrnica y muestran varias formas. Los virus tienen hospedadores especficos, es decir, multiplican dentro de una clase particular de clula viva (vegetal, animal o microbiana.

3.10 NUTRICIN MICROBIANA Las clulas contienen grandes cantidades de pequeas molculas as como de macromolculas. La clula puede obtener la mayora de las pequeas molculas que necesita del exterior o sintetizarlas a partir de molculas ms simples. Las macromolculas por el contrario, son siempre sintetizadas en la clula. En la Tabla 3.2 se presenta la composicin qumica de bacterias, levaduras y mohos. Tabla 3.2. Composicin qumica bacterias, levaduras y mohos (% b.s.) Componente Bacteria Levadura Moho

Protena 55 (50-60) 40 (35-45) 32 (25-40) Carbohidrato 9 (6-15) 38 (30-45) 49 (40-55) Lpido 7 (5-10) 8 (5-10) 8 (5-10) cido nucleico 23 (15-25) 8 (5-10) 5 (2-8) Cenizas 6 (4-10) 6 (4-10) 6 (4-10) ______________________________________________________________________

Aunque hay muchos elementos en la naturaleza, prcticamente la totalidad de la masa celular esta formada por sustancias con cuatro tipos de tomos: carbono, oxgeno, hidrgeno y nitrgeno. Como ya se mencion, estos cuatro elementos constituyen el esqueleto de las macromolculas as como las molculas orgnicas pequeas. Otros elementos son menos abundantes que el C, O, H y N, pero son igualmente importantes para el conjunto del metabolismo. Estos incluyen el fsforo, potasio, calcio, magnesio, azufre, hierro, zinc, manganeso, cobre, molibdeno, cobalto y otros pocos elementos dependiendo del microorganismo. El agua representa el 90% del peso hmedo de una clula y las macromolculas la masa global del peso seco. En la Tabla 3.3 se presenta la composicin elemental de las bacterias, levaduras y hongos filamentosos. Los nutrientes pueden ser divididos en dos clases: macronutrientes que se requieren en grandes cantidades y micronutrientes que son solamente en pequeas cantidades. Entre los macronutrientes estn el carbono, nitrgeno hidrgeno, oxgeno, fsforo, azufre, potasio, calcio, hierro y sodio. Entre los micronutrientes o elementos trazas se tienen el cromo, cobalto, cobre, manganeso, molibdeno, nquel, selenio, tungsteno, vanadio, cinc, hierro. 173

El medio de cultivo debe proporcionar los nutrientes necesarios para la propagacin celular. Debe considerarse el anlisis del microorganismo a desarrollar, para suministrar las cantidades requeridas de cada elemento con relacin a la cantidad final de masa celular que se desea obtener (Tabla 3.2 y 3.3) (Illanes, 1994), (Scragg, 1996). Tabla 3.3. Composicin elemental de los microorganismos (% b.s.) Componente Bacterias Levaduras Hongos filamentosos _________________________________________________________________________ Carbono 45 - 52 45 - 52 45 - 55 Nitrgeno 10 - 14 6-9 4-7 Hidrgeno 10 10 10 Oxgeno 20 20 20 Azufre 0,2 - 1 0,05 0,3 0,1 0,5 Fsforo 2-3 0,8 2,5 0,5 4,5 Magnesio 0,1 0,5 0,1 0,5 0,1 0,7 Potasio 1,0 4,5 1,0 4,0 0,2 2,5 Sodio 0,5 1,0 0,01 1,0 0,02 0,5 Calcio 0,01 1,1 0,1 0,3 0,1 1,4 Hierro 0,02 0,2 0,01 0,5 0,1 0,2 ______________________________________________________________________

La fuente de carbono que se emplea depende de la capacidad metablica del microorganismo. De la Tabla 3.3 se observa que el constituyente principal de los microorganismos es el carbono. Los organismos que son fotosintticos o que obtienen energa de la oxidacin de compuestos inorgnicos, tpicamente usan dixido de carbono como la nica fuente de carbono celular; esta fijacin de CO2 requiere energa, la cual se obtiene de la luz solar o de compuestos inorgnicos. Los dems organismos obtienen su carbono de nutrientes orgnicos, los cuales tienen una doble funcin como fuentes de energa y de carbono. Lo normal es usar un carbohidrato que ingrese a las vas metablicas centrales, generalmente en forma de glucosa. No todo el carbono es empleado en la sntesis de la masa celular, ya que una fraccin importante se desprende en forma de CO2 (Illanes, 1994). Se debe adicionar al medio una fuente de energa suficiente en trminos del carbono. sta se puede basar en el rendimiento celular (gramos de clulas por gramos de sustrato usado). El rendimiento celular basado en los carbohidratos, por lo general, est entre 0,4 y 0,5. En la Tabla 3.4 se presentan algunos coeficientes de rendimiento. Los rendimientos bajos indican un cierto grado de metabolismo anaerobio o la acumulacin de intermediarios incompletamente oxidados. En los medios industriales las fuentes de carbono ms usadas son: glucosa, xilosa, sacarosa (melazas de remolacha o caa de azcar), lactosa (suero de leche), maltosa, almidn, dextrina, inulina, papel y desperdicios celulsicos, celulosa (turba y licor de sulfito), madera, metanol, etanol, glicerol, cido actico, cido succnico, metano, n-pentano, n-butano, n-parafinas, cscaras de frutas y vegetales (Scragg, 1996). 174

Tabla 3.4. Rendimiento celular de algunas fuentes de carbono/energa _________________________________________________________________________ Fuente de carbono/energa Rendimiento celular

Glucosa 0,5 Metanol 0,5 Etanol 0,75 Metano 0,62 n-alcanos 1,0 Celulosa 0,5 Almidn 0,5 _________________________________________________________________________

El nitrgeno al igual que el carbono, hidrgeno, azufre, oxgeno y fsforo, constituye la base de los componentes celulares. Es un componente mayoritario de protenas, cidos nucleicos y otros constituyentes celulares. El nitrgeno se encuentra en la naturaleza en muchas formas como amonaco (NH4+), nitrato (NO3-), nitrito (NO2-), compuestos orgnicos que contienen nitrgeno y nitrgeno molecular. La mayora de los microorganismos pueden utilizar amonaco, el cual es con frecuencia el sustrato preferido. Algunos organismos pueden usar nitrato, el cual primero debe ser reducido a amonio antes de incorporarlo al material celular. El nitrito es producto de la respiracin anaerobia, que utiliza nitrato como aceptor de electrones (Nitrosomonas sp) puede ser reducido a amonaco o a nitrgeno molecular por algunas bacterias denitrificantes, o bien oxidado a nitrato por Nitrobacter sp. Ciertas bacterias fijadoras de nitrgeno pueden usar nitrgeno molecular como fuente de nitrgeno (Rhizobium sp.), mientras que muchos microorganismos pueden utilizar complejos, fuentes orgnicas de nitrgeno, entre los que estn los aminocidos, cidos nucleicos y aminas metiladas. En los medios de laboratorio el nitrgeno se aporta normalmente como sales de amonio o nitrato. Como fuentes de nitrgeno la literatura reporta: cloruro de amonio, urea, sulfato de amonio, nitrato de calcio, nitrato de potasio, fosfato de amonio, nitrato de amonio, nitrato de sodio (Kahlon et al.., 1986), (Noomhorm et al., 1992), (Zazueta, 1998). El tipo y concentracin de la fuente de nitrgeno son importantes. Se ha encontrado que el (NH4)SO4 prolonga el crecimiento vegetativo, en tanto que el NH4NO3 lo reduce Mientras mayor sea la concentracin de la fuente de nitrgeno, ms largo es el perodo de crecimiento vegetativo, con un retardo consecuente del inicio de la produccin de cido ctrico (Scragg, 1996). En los procesos industriales se usan otras fuentes: sales de amonio y nitrato (grado comercial), urea, harinas de soya, harina de semillas de algodn, harina de semillas de nabo, harina de maz, harina de maz gelatinado, harina de pescado, licor de maz empapado, extracto de levadura, protenas hidrolizadas y residuos de destilacin (Scragg, 1996). 175

El requerimiento de hidrgeno se satisface a travs del agua y de la fuente de carbono empleada, encontrndose siempre en exceso. El oxgeno es suministrado por el aire burbujeado en las fermentaciones aerobias, donde su rol es el de aceptor final de electrones en el proceso de oxidacin del sustrato, ms que el de nutriente. (Illanes, 1994) Los diferentes elementos mostrados en la Tabla 3.3, se pueden suministrar simplemente como sales o estn presentes en algunas de las adiciones no refinadas. El agua de grifo tambin puede proveer muchos de los elementos trazas. Los microorganismos pueden usar carbono, hidrgeno y oxgeno, ya sea en forma de compuestos orgnicos o inorgnicos incluyendo CO2, H2, H2S, NH4+, NO3-, NO2-, SO4-, etc (Scragg, 1996). El fsforo se encuentra en la naturaleza en forma de fosfatos orgnicos o inorgnicos y es requerido por la clula para la sntesis de cidos nucleicos, ATP y otros nucletidos, y fosfolpidos. El azufre es fundamental por ser un elemento estructural en los aminocidos cistena y metionina y por estar presente en vitaminas tales como la tiamina, biotina, cido lipoico, as como coenzima A. El azufre sufre una serie de transformaciones qumicas en la naturaleza, llevadas a cabo exclusivamente por microorganismos y es utilizable por ellos bajo una gran diversidad de formas qumicas. La mayora del azufre celular procede de fuentes inorgnicas, ya sean sulfatos o sulfuros (FeS, CuS, ZnS, NiS, etc.). El potasio es necesario en todos los organismos. Principal catin orgnico dentro de la clula. Una gran diversidad de enzimas lo requieren especficamente como cofactor. El potasio celular procede de fuentes inorgnicas como el KCl y KH2PO4. El magnesio estabiliza los ribosomas, las paredes y membranas celulares y los cidos nucleicos y se requiere tambin como cofactor, para la actividad de muchas enzimas, especialmente cinasas. El calcio (que no es nutriente esencial para el crecimiento de muchos microorganismos), ayuda a estabilizar la pared celular bacteriana y juega un papel fundamental en la termorresistencia de la endospora bacteriana. Sirve como cofactor de enzimas. Presente en exoenzimas importantes, por ejemplo, amilasa, proteasas. El sodio, es requerido por algunos microorganismos debido a la naturaleza qumica de su hbitat. Es requerido por bacterias haloflicas. Por ejemplo, el agua de mar tiene un elevado contenido de sodio, de modo que los microorganismos marinos lo requieren para su crecimiento, mientras que especies muy relacionadas pero de agua dulces, pueden normalmente crecer en ausencia de sodio. Aunque algunas veces se lo considera un micronutriente, el hierro es requerido por las clulas en mayores cantidades que otros metales traza y por ello debe ser considerado como macronutriente. El hierro juega un papel fundamental en la respiracin celular, siendo un componente clave de los citocromos, y de las protenas que contienen hierro y azufre implicadas en el transporte de electrones, como las ferredoxinas. Cofactor de enzimas como las hidratasas, catalasas, peroxidasas, oxigenasas y nitrogenasas. No existen vas metablicas que se inhiban por exceso de azufre. Un exceso de P y K puede afectar la permeabilidad de la membrana pero no tanto como lo hace el sodio, el cual daa la permeabilidad de la membrana de los mohos. A veces se usa el KH2PO4 y el K2HPO4 como regulador del pH (Zazueta, 1998). Como fuentes de fsforo se recomiendan: fosfato dicido de potasio, fosfato cido de potasio, fosfato cido de amonio, fosfato cido de sodio y cido fosfrico. Se ha encontrado que concentraciones 176

de fosfato de 0,1 y 0,2 %, promueven la formacin de cido ctrico, concentraciones mayores promueven el crecimiento (Scragg, 1996). Aunque los micronutrientes son requeridos en muy pequeas cantidades son, sin embargo, tan importantes como los macronutrientes para la funcin celular. Los micronutrientes son metales muchos de los cuales forman parte de enzimas. Debido a que el requerimiento de elementos traza es muy pequeo, para el cultivo de microorganismos en el laboratorio se hace innecesario su adicin al medio. Sin embargo, si el medio contiene compuestos qumicos altamente purificados y disueltos en agua destilada de alta pureza, puede ocurrir una deficiencia de elementos traza. En tales casos se aade una pequea cantidad de estos metales. Entre los micronutrientes se tienen el cromo, cobalto, cobre, manganeso, molibdeno, nquel, selenio, cloro. El cromo es requerido por los mamferos para el metabolismo de la glucosa; no se conoce microorganismo que lo requiera. Componente de algunas formato deshidrogenasas. El cobalto es el componente de la vitamina B12 y enzimas con vitamina B12 (glutamato mutasa, metilmalonil CoA mutasa); adems, forma parte de la transcarboxilasa de las bacterias del cido propinico. El cobre es componente de ciertas protenas como son las implicadas en la respiracin (citocromo c oxidasa) o en la fotosntesis (plastocianina), tambin es requerido por algunas superxido dismutasas. El manganeso es componente de la superxido dismutasa bacteriana, PEP, carboxinasa, citrato sintetasa. El molibdeno es componente de enzimas como la nitrato reductasa, nitrogenasa, formato deshidrogenasa. El nquel es componente de enzimas como la ureasa, deshidrogenasa de monxido de carbono y de la mayora de las hidrogenasas. El selenio es componente de la glicina reductasa, formato deshidrogenasa. El cloro es requerido por bacterias haloflicas. El zinc es componente de la alcohol deshidrogenasa, fosfatasa alcalina, aldolasa, ARN y ADN polimerasa, anhidrasa carbnica y muchas protenas que unen ADN. El vanadio es componente de la vanadio nitrogenasa y bromoperoxiadas. El tungsteno es componente de algunas formato deshidrogenasas, oxotransferasas de los hipertermfilos, por ejemplo, aldehdo ferredoxina oxidorreductasa de Pyrococcus furiosus. La mayora de los microorganismos se desarrollan en un medio simple de glucosa y sales de amonio. Sin embargo, existen organismos que por una u otra razn no pueden sintetizar algunos de los aminocidos o compuestos orgnicos. Estos organismos requieren la adicin al medio de factores de crecimiento (aminocidos, purinas, pirimidinas y vitaminas) (Scragg, 1996). Los factores de crecimiento son compuestos orgnicos que, como los micronutrientes son requeridos en muy pequeas cantidades y slo por algunas clulas. Los factores crecimiento incluyen vitaminas, aminocidos, purinas y pirimidinas. Aunque la mayora de los microorganismos son capaces de sintetizar estos compuestos, otros requieren tomar uno o ms preformados del medio ambiente. El requerimiento ms comn son las vitaminas, las cuales se necesitan en cantidades extremadamente pequeas como cofactores de varias enzimas. As, Clostridium kluyveri requiere un medio complementado con biotina y cido p-aminobenzoico. Las bacterias lcticas que incluyen los gneros Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc y otro, son reconocidas por su complejo requerimiento de vitaminas.

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Entre las vitaminas y compuestos relacionados requeridos para el crecimiento se tienen: el cido p-aminobenzoico es precursor del cido flico o tetrahidrofolato, utilizado en la transferencia de unidades de un carbono. La biotina es una coenzima que participa en reacciones de carboxilacin, en la biosntesis de cidos grasos, fijacin de CO2 y descarboxilaciones. El cido flico es un tetrahidrofolato necesario en la transferencia de unidades de un carbono (transferencia de grupos metilo). El cido lipoico es utilizado en la transferencia de grupos acilo en la descarboxilacin del piruvato y cetoglutarato. La cobalamina (B12) interviene en reacciones de rearreglo (glutamato mutasa). La vitamina K es precursora de la menaquinona que participa en el transporte de electrones y participa en la sntesis de esfingolpidos. El cido nicotnico (niacina) es precursor del NAD+ , que participa en la transferencia de electrones en las reacciones de oxido-reduccin. El cido pantotnico es precursor de la coenzima A, la cual participa en la activacin del acetilo y otros derivados acilados. La riboflavina (B6) componente de los grupos prostticos FMN, y FAD de las flavoprotenas. La tiamina (B1) es componente del pirifosfato de tiamina en descarboxilasas, transaminasas y transcetolasas. La piridoxina (B2), fosfato de piridoxal usado en reacciones de transaminacin y descarboxilacin. La coenzima M interviene en la metanognesis.

3.11 MEDIOS DE CULTIVO En microbiologa se usan dos grandes medios de cultivo para el crecimiento de microorganismos en el laboratorio, los qumicamente definidos y los indefinidos (complejos). Los medios qumicamente definidos se preparan aadiendo al agua destilada cantidades precisas de compuestos orgnicos o inorgnicos altamente purificados; por ello se conoce la composicin qumica exacta. En muchos casos, sin embargo, el conocimiento exacto de la composicin qumica no es crtico. En estas ocasiones los medios complejos pueden ser suficientes e incluso presentar ventajas sobre los definidos. Los medios complejos presentan lisados de casena, de carne, de soja, de levadura o cualquier otra sustancia altamente nutritiva (qumicamente indefinida). Tales lisados estn disponibles comercialmente en forma de polvo y pueden ser pesados rpidamente y disueltos en agua destilada para dar lugar a un medio. Sin embargo, cuando se utiliza un medio complejo hay que tener en cuenta que no se conoce la composicin de los nutrientes. Entre los medios complejos se tienen el caldo nutritivo (3 g de extracto de carne, 5 g de peptona y 1000 mL de agua) y agar nutritivo (3 g de extracto de carne, 5 g de peptona, 15 g de agar y 1000 mL de agua) A continuacin se dan las caractersticas de varios materiales complejos usados como ingredientes de medios: El lisado de carne es un extracto acuoso de tejido de buey, concentrado hasta formar una pasta. Contiene las sustancias hidrosolubles del tejido animal que incluyen carbohidratos, compuestos orgnicos de nitrgeno, vitaminas hidrosolubles y sales. La peptona es un producto que resulta de la digestin de materiales proteicos, por ejemplo, carne, casena y gelatina. La digestin del material proteico se realiza con cidos o con enzimas. Existen disponibles muchas peptonas diferentes, dependiendo de la protena 178

utilizada y el mtodo de digestin, La peptona constituye la principal fuente de nitrgeno orgnico, puede contener adems, algunas vitaminas y a veces carbohidratos dependiendo del material proteico digerido. El extracto de levadura es un extracto acuoso de clulas de levadura, que se puede adquirir comercialmente en forma de polvo. Constituye una fuente muy rica de vitaminasdel complejo B; contiene adems nitrgeno orgnico y compuestos carbonados. El agar es un carbohidrato complejo obtenido de ciertas algas marinas; el cual se somete a un proceso de elaboracin para eliminar sustancias extraas. Es usado como agente solidificante; ya que el agar disuelto en agua se gelifica cuando la temperatura se reduce por debajo de 45 0C. El agar no es una fuente de nutrientes para las bacterias. Un medio definido (quimioheterotrofo) para Escherichia coli esta constituido por: 4-10 g de glucosa, 7 g de K2HPO4, 2 g de KH2PO4, 1 g de (NH4)2SO4, 0,1 g de MgSO4, 0,02 g de CaCl2, 2-10 g de cada uno de los elementos traza (Fe, Co, Mn, Zn, Ca, Ni, Mo) y 1000 mL de agua destilada. El pH debe ser de 7. Un medio definido para Leuconostoc mesenteroides esta constituido por: 25 g de glucosa, 0,6 g de K2HPO4, 0,6 g de KH2PO4, 3 g de NH4Cl, 0,1 g de MgSO4, 20 g de acetato sdico, 2-10 g de cada uno de los elementos traza (Fe, Co, Mn, Zn, Ca, Ni, Mo), 100-200 g de cada uno de los aminocidos (alanina, arginina, asparragina, aspartato, cistena, glutamato, glutamina, glicocola, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptfano, tirosina, valina), 10 mg de cada una de las purinas y pirimidinas (adenina, guanina, uracilo, xantina), 0,01 1 mg de cada una de las vitaminas (biotina, folato, cido nicotnico, piridoxal, piridoxamina, piridoxina, riboflavina, tiamina, pantotenato, cido p-aminobenzoico) y 1000 mL de agua destilada. El pH debe ser de 7. Un medio complejo tanto para Escherichia coli como para Leuconostoc mesenteroides est constituido por: 15 g de glucosa, 5 g de estracto de levadura, 5 g de pectona, 2 g de KH2PO4 y 1000 mL de agua destilada. El pH debe ser de 7. De los tres medios anteriores el medio complejo es el ms fcil de preparar y permite buen crecimiento de cualquiera de los microorganismos E. coli o L. Mesenteroides. El medio definido simple permite un excelente crecimiento de la E. coli pero no de L. mesenteroides, lo que indica que la primera bacteria tiene una capacidad biosinttica mayor que la segunda, ya que la E. coli puede sintetizar todos los constituyentes orgnicos celulares a partir de un compuesto carbonado sencillo, como la glucosa. Un medio definido (quimioautotrofo) para Thiobacillus thioxidans est constituido por: 10 g de azufre pulverizado, 4 g de KH2PO4, 0,4 g de (NH4)2SO4, 0,5 g de MgSO4.7H2O, 0,25 g de CaCl2, 0,01 g de FeSO4, 1000 mL de agua destilada y CO2. 3.12 CRECIMIENTO DE POBLACIONES El crecimiento se define como un incremento en el nmero de clulas microbianas en una poblacin lo cual tambin puede ser medido como un incremento en la masa microbiana. 179

La velocidad de crecimiento es el cambio en el nmero de clulas o masa celular por unidad de tiempo. El tiempo de generacin es el requerido para duplicarse una poblacin de clulas; tambin se le conoce como tiempo de duplicacin. El modelo de incremento de la poblacin en el que el nmero de clulas se dobla cada cierto perodo de tiempo se conoce como crecimiento exponencial. En la mayora de los procariotas, el crecimiento de una clula individual contina hasta que se divide en dos nuevas clulas, mediante un proceso llamado fisin binaria (Figura 3.8) Durante el ciclo de crecimiento, todos los constituyentes celulares incrementan en nmero de tal manera que cada clula hija recibe un cromosoma completo y copias suficientes de todas las otras macromolculas, monmeros e iones inorgnicos que le permitirn vivir como clula independiente.

Figura 3.8. Proceso de divisin binaria en una bacteria bacilar. El tiempo requerido en bacterias para completar un ciclo de crecimiento es muy variable y dependiente de muchos factores tanto nutricionales como genticos. Bajo las mejores condiciones nutricionales la bacteria Escherichia coli puede completar su ciclo en unos 20 minutos; otras pocas bacterias pueden incluso crecer ms rpido que esto, pero muchas lo hacen ms lentamente (Brock, 2001). Al proceso de divisin nuclear en eucariotas se le denomina mitosis y, es un proceso complejo y finamente regulado La divisin de una clula implica que se transmita a sus descendientes las instrucciones genticas que posee, aun conservndolas ella misma. El 180

resto de la clula (citoplasma, mitocondrias, membrana plsmica, etc.) tambin se duplican. Despus del proceso de crecimiento celular, los diferentes compartimientos y componentes alcanzan un tamao suficiente para ser distribuidos en partes iguales en las nuevas clulas hijas (Flix et al., 1994), (Brock, 2001). Complementar con la lectura del artculo sobre La divisin celular (Flix et al., 1994). La curva de crecimiento en cultivo por lotes (batch) o en medio no renovado se presenta en la Figura 3.9. Esta curva puede dividirse en varias fases, las cuales se aplican a poblaciones individuales y no a clulas individuales:

Figura 3.9. Curva de crecimiento tpica para una poblacin bacteriana Fase de latencia o fase lag. Se produce inmediatamente despus de la inoculacin. En ella no ocurre crecimiento inmediato. La fase de latencia puede ser ms larga o ms corta dependiendo de muchos factores. Si un cultivo en fase exponencial se inocula exactamente en el mismo medio, no se observa esta fase sino que sigue creciendo exponencialmente. Sin embargo, si el inculo se toma a partir de un cultivo viejo, entonces tiene lugar una fase de adaptacin, incluso si todas las clulas presentes en el inculo son viables, esto es, capaces de reproducirse. Esto ocurre porque las clulas, en estas condiciones, carecen de determinados componentes esenciales y tiene que transcurrir un cierto tiempo para que se proceda a su sntesis. Tambin se requiere una fase de adaptacin cuando las clulas han sido daadas mediante tratamientos por calor, radiaciones, txicos, etc., porque se requiere tiempo para reparar los daos sufridos. Por ltimo, tambin se requiere una fase de adaptacin cuando se transfieren clulas de un medio rico a un medio ms pobre. Para adaptarse a este nuevo medio, es preciso que se sinteticen enzimas que permitan metabolizar los compuestos presentes en el nuevo medio. Fase exponencial o fase log. Las clulas se reproducen a una velocidad que es la mxima para las condiciones existentes, por no existir limitacin de nutrientes. La mayora de los microorganismos unicelulares crecen exponencialmente , pero las velocidades de crecimiento exponencial pueden variar esencialmente. Tal velocidad es influenciada por las condiciones ambientales, as como por las caractersticas genticas del microorganismo en 181

cuestin. En general, los procariotas crecen ms rpidamente que los eucariotas y los eucariotas pequeos lo hacen ms rpidamente que los grandes. Fase estacionaria. En un cultivo donde no se renueva el medio, el crecimiento exponencial no puede ocurrir indefinidamente. Lo que habitualmente sucede es que, o bien un nutriente esencial del cultivo se acaba, o algn producto de desecho se acumula en el medio hasta alcanzar concentraciones inhibitorias del crecimiento exponencial; llegando la poblacin a la fase estacionaria. Aunque en esta fase no tiene lugar crecimiento, todava ocurren muchas funciones celulares, incluyendo el metabolismo energtico y algunos procesos biosintticos. En algunos organismos puede incluso tener lugar crecimiento lento durante la fase estacionaria, algunas clulas crecen y otras mueren, siendo el balance total de ausencia de incremento en el nmero de clulas (crecimiento crptico). Fase de muerte. Si la incubacin contina despus que la poblacin alcance la fase estacionaria, las clulas deben permanecer vivas y metablicamente activas, pero tambin deben morir. Si esto ltimo ocurre se dice que las clulas se encuentran en fase de muerte. En algunos casos la muerte va acompaada de lisis celular, debido a que se inducen enzimas autolticas en condiciones de inanicin. La fase de muerte de un ciclo de crecimiento es tambin una funcin exponencial; sin embargo, en muchos casos, la velocidad de muerte celular es mucho ms lenta que el crecimiento exponencial. Hay dos tipos fundamentales de productos metablicos: primarios y secundarios. Un metabolito primario microbiano es el que se forma durante la fase primaria del crecimiento del microorganismo. Es necesario en el crecimiento de ste. Un metabolito secundario, aparentemente no es esencial para el crecimiento, mantenimiento y la reproduccin; se produce durante la fase estacionaria. En el metabolismo secundario, las dos fases distintas del metabolismo se denominan trofofase e ideofase. La trofofase es la fase de crecimiento, mientras que la fase de produccin de metabolitos es la ideofase. El metabolito secundario se produce, generalmente, a partir de varios productos intermedios que se acumulan, bien en el medio de cultivo o bien en las clulas, durante el metabolismo primario. Una caracterstica de los metabolitos secundarios es que las enzimas implicadas en su produccin estn reguladas separadamente de las enzimas del metabolismo primario. En algunos casos se han identificado inductores especficos de la produccin metabolitos secundarios. Con frecuencia es posible obtener una superproduccin de metabolitos secundarios, en tanto que los metabolitos primarios, ligados como estn al metabolismo primario, usualmente no se pueden producir en grandes cantidades. Ejemplos de metabolitos secundarios son los antibiticos, alcaloides, pigmentos y toxinas (Brock, 2001).

3.13 EFECTO DE FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTO La velocidad especfica de crecimiento (), depende del microorganismo y de los parmetros ambientales de cultivo (composicin del medio de cultivo, requerimientos gaseosos, temperatura, pH, potencial de oxido-reduccin, tensoactivos, salinidad, aW) La naturaleza de los nutrientes influye en el valor de , en el caso de las fuentes de carbono, energa y nitrgeno. 182

Durante la fase de crecimiento equilibrado, el incremento de la masa microbiana est directamente relacionado con el aumento de otros constituyentes celulares, tales como el ADN, ARN, protena, lpidos, entre otros. El incremento de la poblacin se hace en progresin geomtrica (2n). El intervalo de tiempo requerido para que la clula se divida se denomina tiempo de generacin. No todas las especies tienen igual tiempo de generacin. El tiempo de generacin depende fuertemente de la idoneidad de los nutrientes que hay en el medio y de las adecuadas condiciones fsicas. Para algunas bacterias el tiempo de generacin puede ser tan corto como de 15 a 20 min., para otras puede durar varias horas. El crecimiento de una poblacin bacteriana puede ser representado por: dX/dt = X ln (X/X0) = t

: velocidad especfica de crecimiento (h-1, min.-1, s-1) X : concentracin celular. td = ln 2 / td = tiempo de duplicacin, definido como el lapso entre dos duplicaciones. Efecto de la concentracin de sustrato sobre la velocidad de crecimiento. La relacin entre la velocidad especfica de crecimiento () y la concentracin de sustrato (Figura 3.10) es una hiprbola, una curva de saturacin similar a la que describe la cintica enzimtica tipo Michaelis-Menten.

Figura 3.10. Efecto de la concentracin de sustrato sobre la velocidad especfica de crecimiento Monod propuso una expresin, la ecuacin de Monod, para describir esta curva: = max. S / ( KS + S ) 183

donde es la velocidad especfica de crecimiento (h-1), S concentracin del sustrato (g/L), max. es la velocidad especfica de crecimiento mxima y KS es la constante de Monod (g/L), que representa la concentracin de sustrato que produce la mitad de max.. Durante la fase de crecimiento exponencial S > KS y, en consecuencia = max.. KS representa la afinidad de los organismos por el sustrato. En general, los valores de KS son extremadamente bajos. Para la fuente de carbono y energa son aproximadamente de 10-5 M; para el fosfato, K+ y Mg2+, 10-5 M; para el O2 10-6 a 10-5 M y para las vitaminas y elementos traza, 10-8 a 10-6 M (Tabla 3.5). Tabla 3.5. Constantes de saturacin (Ks) para diferentes sustratos y microorganismos Organismo (gnero) Sustrato limitante K (10-5 M) _________________________________________________________________________ Escherichia Glucosa 2,2 Escherichia Manitol 1,1 Candida Glicerol 4,9 Candida Oxgeno 1,4 Candida Oxgeno 1,3 x 10-1 Saccharomyces Glucosa 14 Aspergillus Glucosa 2,8 Klebsiella Iones de magnesio 2,3 Klebsiella Iones de potasio 1,0 _________________________________________________________________________ Es posible representar el crecimiento microbiano mediante una ecuacin qumica que se rija por los principios de la estequiometra y la cintica. l CaHbOc + m NH3 + n O2 q CdHeOf Ng + r CO2 + t H2O + u ChHiOjNk

La biomasa se representa sobre la base de la composicin elemental. Los elementos cuantitativamente ms importantes son C, H, O, N, lo que justifica la aproximacin en la ecuacin. Le siguen un segundo grupo compuesto por Mg, S, Ca, Na y K, mientras que los restantes compuestos se encuentran en niveles muy bajos. Efecto de la concentracin alta de sustrato o de producto. S la concentracin inicial de sustrato es aumentada a un valor considerable ms alto que la concentracin mnima de saturacin, por ejemplo, mayor de 10-20 KS, la rapidez de crecimiento puede comenzar a disminuir debido a la inhibicin por sustrato. Para sustratos como la glucosa u otros carbohidratos, la mayora de los microbios son capaces de crecer a concentraciones de 100-150 g/L, aunque muy pocos crecern cuando sta aumente a 300-500 g/L. Por esta razn, los alimentos como las frutas, han sido conservados en soluciones con alta concentracin de azcar. A altas concentraciones de azcar o sal la inhibicin probablemente se debe al alto esfuerzo osmtico impuesto a las clulas, el cual causa su deshidratacin y problemas difusionales. 184

La inhibicin del crecimiento a concentraciones bajas de sustrato puede ser el resultado de la inhibicin de enzimas metablicas clave. As, muchas levaduras de uso comn, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae y bacterias como Escherichia coli, son microorganismos facultativos capaces de crecer en presencia o ausencia de oxgeno. En presencia de oxgeno y bajas concentraciones de glucosa, sta se oxida a CO2 y H2O para generar la energa requerida para el crecimiento. Si la concentracin de glucosa aumenta (por ejemplo, mayor de 2 g/L para E. coli), las enzimas responsables del metabolismo respiratorio son inhibidas aun cuando el suministro de oxgeno sea saturante. El resultado es un crecimiento combinado respiratorio-fermentativo; esta relacin disminuye a medida que la concentracin de sustrato aumenta. A menudo este efecto se denomina efecto de glucosa o efecto Crabtree y se debe a la represin por catabolito de la sntesis de enzimas respiratorias. El crecimiento de poblaciones microbianas tambin puede ir acompaado por la formacin de productos finales txicos que causan la inhibicin del crecimiento. Un ejemplo, es la produccin de etanol por levaduras y bacterias. Por encima de una concentracin de 1-2 % el etanol comienza a inhibir el crecimiento. Aproximadamente a 12 % usualmente se logra la inhibicin total por lo que la mayora de los vinos contienen menos del 12 %. Ciertos organismos, como Zymomonas mobilis, toleran el alcohol y son posibles rendimientos de hasta 15 16 %. Si el cultivo es afectado por concentraciones altas de sustrato o producto, la ecuacin de Monod se modifica: umax [S] = ____________________ (KS + [S]) ( 1 + [S]/Ki)

max [S] = ____________________ (KS + [S]) (1 + [P]/KP) Temperatura. La temperatura es uno de los factores ambientales ms importantes que afectan al crecimiento y a la supervivencia microbiana. Puede afectar a los microorganismos vivos de dos formas muy diferentes. A medida que la temperatura sube, las reacciones enzimticas son ms rpidas y el crecimiento se acelera. Sin embargo, por encima de una cierta temperatura, las protenas, cidos nucleicos y otros componentes celulares pueden daarse irreversiblemente. Por encima de este punto las funciones celulares paran. A bajas temperaturas, los mecanismos regulatorios de la clula son afectados, adems de las limitaciones difusionales como el transporte de sustratos hacia y dentro de la clula. Por tanto, para cada microorganismo existe una temperatura mnima por debajo de la cual no existe crecimiento, una temperatura ptima a la cual el crecimiento es el ms rpido posible y una temperatura mxima sobre la cual no existe crecimiento. La temperatura ptima siempre esta ms cerca de la mxima que de la mnima. Para cada organismo estas tres temperaturas pueden variar ligeramente de acuerdo con la composicin del medio de cultivo. La temperatura ptima de Escherichia coli en un medio rico y complejo es de 39 0C, la mxima de 48 0C y la mnima de 8 0C.

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Se distinguen cuatro grupos microbianos en relacin con su temperatura ptima: psicrfilos, mesfilos, termfilos e hipertermfilos, con temperaturas ptimas bajas, medianas, altas y muy altas, respectivamente. Un microorganismo psicrfilo puede definirse como aquel con una temperatura ptima de crecimiento de 15 0C o ms baja, una mxima por debajo de 20 0C y una mnima de 0 0C o menor. Los organismos cuya temperatura ptima de crecimiento est por encima de 45 0C se denominan termfilos y aquellos que la presentan por encima de 80 0C se llaman hipertermfilo. Como ya se mencion el crecimiento microbiano se describe por: dX / dt = X - X

Donde es la velocidad especfica de crecimiento (h1, min.-1, s-1 ) y es la velocidad especfica de muerte (h1, min.-1, s-1). Por lo general, las condiciones son tales que >>> y se hace insignificante. Puesto que tanto como son dependientes de la temperatura, la anterior suposicin no se cumple siempre. El crecimiento y la mortalidad se pueden describir por la relacin de Arrhenius: = A e -E/RT = A e E/ RT

donde A y A son constantes y E y E son la energa de activacin. Los valores tpicos de E y E son 15 - 20 kcal/mol y 60 - 70 kcal/mol, respectivamente. pH. Cada organismo tiene un intervalo limitado de pH dentro del cual es posible su crecimiento y, aun dentro de este intervalo frecuentemente cambian su metabolismo como resultado de un cambio de incluso 1 1,5 unidades de pH. Los microorganismos poseen normalmente un pH ptimo muy bien definido. En general, las bacterias crecen en un intervalo de pH de 4-8, las levaduras de 3 - 6, los mohos de 3 - 7 y las clulas eucariticas superiores de 6,5 - 7,5. Slo unas pocas especies pueden crecer a pH inferior a 2 o mayor de 10. Los que crecen a pH bajos se llaman acidfilos. Existen bacterias acidfilas obligadas incapaces de crecer a pH neutro. Cuando se eleva el pH hasta la neutralidad, la membrana se disuelve y la clula muere. Estas incluyen especies del gnero Thiobacillus, como T. ferroxidans y T. sulfolobus, que tienen la propiedad de oxidar minerales sulforados y producir cido sulfrico. Algunos microorganismos poseen un pH ptimo de 10-11 y se conocen como alcalfilos. Tales microorganismos se encuentran habitualmente en suelos altamente carbonatados y lagos bicarbonatados. La mayora de ellos pertenecen al gnero Bacillus. Estos tienen un uso industrial interesante ya que producen proteasas que son alcalinas y se emplean como aditivos para los detergentes. Independientemente de las condiciones externas en que vivan los microorganismos (pH del ambiente extracelular), el pH intracelular debe permanecer cercano a la neutralidad con el objeto de impedir la destruccin de las macromolculas lbiles en condiciones cidas o alcalinas. En los acidfilos o alcalfilos extremos, el pH intracelular puede variar entre 1 y 1,5 unidades respecto de la neutralidad, pero para la mayora de los microorganismos cuyo pH extremo est entre 6 y 8, el pH del citoplasma es neutro, o casi neutro. Estos diferentes intervalos de pH para el crecimiento, se pueden usar ventajosamente durante las fermentaciones para reducir la posibilidad de contaminacin. En un cultivo con medio no renovado el pH puede cambiar durante el crecimiento como consecuencia de las reacciones 186

metablicas. Por ello frecuentemente se emplean tampones para mantener constante el pH del medio de cultivo. Estos tampones solamente funcionan en un intervalo estrecho de pH, por lo que para valores de pH diferentes hay que utilizar tampones distintos. Para el pH neutro (pH 6 - 7,5) el tampn fosfato, generalmente como KH2PO4, es un tampn excelente. Actividad de agua. Todos los microorganismos requieren agua y la disponibilidad de ella es un factor importante para el crecimiento microbiano. La disponibilidad de agua depende no slo del contenido de agua del ambiente, esto es, cuan hmedo o seco sea un hbitat determinado, sino tambin de la concentracin de solutos en ella. Esto es porque las sustancias disueltas tienen gran afinidad por el agua, lo que hace que el agua asociada con los solutos sea inutilizable por los organismos. La disponibilidad de agua se expresa generalmente en trminos fsicos tales como actividad de agua (aW), la cual es la razn entre la presin de vapor del agua en equilibrio con una sustancia o solucin y la presin de vapor del agua pura, a la misma temperatura a la que est la sustancia o solucin. Por tanto, sus valores varan entre 0 y 1,0 (Tabla 3.6). El agua difunde de una regin de elevada concentracin (baja concentracin de soluto) a otra en que la concentracin de agua es menor (concentracin de soluto ms alta), en un proceso que se denomina smosis. La mayora de las veces, el citoplasma celular posee una mayor concentracin de solutos que el medio exterior, de modo que el agua difunde hacia el interior de la clula. Sin embargo, cuando una clula est en un ambiente con baja actividad de agua, existe una tendencia de salida del agua intracelular. Por tanto, cuando una clula se introduce en una solucin con baja actividad de agua, tal como la disolucin de sal o de azcar, pierde agua y se produce plasmlisis. La mayora de los microorganismos son incapaces de prosperar en ambientes con muy baja actividad de agua, de modo que o bien simplemente mueren o se deshidratan y pasan a condiciones durmientes durante tiempo indefinido. Tabla 3.6. Actividad de agua de diversas sustancias Actividad de agua Material Organismos que crecen _________________________________________________________________________ 1,000 Agua pura Caulobacter, Spirillum 0,995 Sangre humana Streptococcus, Escherichia 0,980 Agua marina Pseudomonas, Vibrio 0,950 Pan Bacilos Gram-positivos 0,900 Jarabe de arce, jamn Cocos Gram-positivos 0,850 Chorizo Levaduras 0,800 Pasteles de frutas, mermeladas Hongos filamentosos 0,750 Pescado salado Halobacterium, Halococcus 0,700 Cereales, caramelos, frutos secos Hongos xeroflicos _________________________________________________________________________

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Existen los microorganismos halfilos, los cuales requieren para su crecimiento cloruro sdico, variando la concentracin ptima de este compuesto de un microorganismo a otro. Por tanto, los microorganismos que son halfilos extremos, moderadamente halfilos y discretamente halfilos requieren de 15-30 %, 6-15 % y de 1-6 % de cloruro sdico, respectivamente. Los organismos capaces de crecer en ambientes con altas concentraciones de azcar se llaman osmfilos y los que crecen en ambientes muy secos se llaman xerfilos. Los organismos halotolerantes pueden soportar cierta reduccin en la actividad de agua de sus ambientes, pero generalmente crecen mejor en ausencia de cualquier soluto que reduzca significativamente la actividad de agua. Oxgeno. Los microorganismos varan en sus necesidades, o tolerancia de oxgeno. De hecho, los microorganismos pueden ser divididos en diversos grupos dependiendo del efecto del oxgeno. Los aerobios son capaces de crecer con tensin de oxgeno total, en el aire el oxgeno es el 21 %, y muchos pueden soportar incluso concentraciones ms altas. Los microaerfilos, por el contrario, son aerobios que pueden utilizar este gas slo cuando su tensin es mas baja que la del aire, usualmente por su limitada capacidad de respirar, o porque contienen alguna molcula o enzima(s) sensible al oxgeno. Los facultativos presentan respiracin aerobia y anaerobia. Los organismos que carecen de sistemas respiratorios no pueden utilizar el oxgeno como aceptor terminal de electrones. Tales organismos se llaman anaerobios. Existen los anaerobios aerotolerantes, que pueden tolerar el oxgeno y crecer en su presencia aun cuando no pueden utilizarlo y los anaerobios estrictos u obligados que mueren en presencia de oxgeno. La razn por la que los anaerobios estrictos son destruidos por el oxgeno es probablemente porque son incapaces de eliminar algn producto txico derivado del metabolismo del oxgeno. Cuando se reduce el oxgeno, se producen algunos compuestos txicos como el perxido de hidrgeno (H2O2), el superxido (O2-) y radicales hidroxilo (OH). Muchos anaerobios estrictos son ricos en enzimas flavnicas, que reaccionan con el oxgeno para dar estos productos txicos. Los aerobios poseen enzimas que descomponen los productos txicos; tales enzimas no estn presentes en los anaerobios. Para el crecimiento de muchos microorganismos aerobios es necesario suministrar mucho aire, debido a que el oxgeno es poco soluble en agua y el que es utilizado durante el crecimiento microbiano, no es remplazado suficientemente rpido a partir de simple difusin del aire. Es deseable por tanto aireacin forzosa de los cultivos, bien por agitacin vigorosa, bien insuflando aire atomizado a presin. Para el crecimiento de anaerobios existen procedimientos para disminuir la cantidad de oxgeno en los cultivos; algunos sencillos y otros mucho ms complejos para los anaerobios estrictos. Botellas, tubos o matraces completamente llenos con el medio de cultivo y tapones adecuados, proporcionan condiciones anxicas suficientemente buenas para el crecimiento de muchos anaerobios. Tambin es posible aadir algn compuesto qumico que reacciona con el oxgeno del aire y lo reduce hasta agua. Un buen ejemplo de esto es el tioglicolato, que se aade al medio denominado caldo de tioglicolato, comnmente utilizado para ensayar el requerimiento de oxgeno de un microorganismo. Despus de que el tioglicolato reaccione con el oxgeno del tubo, el oxgeno puede penetrar solamente en la parte superior, donde el medio contacta con el aire. Los aerobios estrictos crecen en la parte superior de estos tubos. Los facultativos lo hacen por todo el tubo, pero con 188

preferencia en la parte superior. Los microaerfilos crecen hacia la parte superior del tubo pero no sobre el medio. Los anaerobios crecen hacia el fondo del tubo, donde el oxgeno no puede penetrar. Los anaerobios aerotolerantes crecen por todo el tubo. Se aade al medio un colorante indicador de oxidacin-reduccin (resazurina) que cambia de color con el oxgeno; de manera que sirve para indicar el grado de penetracin del oxgeno en el medio de cultivo (Brock, 2001) Cuando se precisa de una incubacin en anaerobiosis, las placas de agar se colocan en una jarra sellada (jarra de anaerobios) que se hace anxica reemplazando la atmsfera de la jarra con una mezcla de gas libre de oxgeno (habitualmente se emplea una mezcla de N2 y CO2) o aadiendo algn compuesto que elimine el oxgeno de la atmsfera de la jarra cerrada. Por ejemplo, se genera H2 y en presencia de un catalizador adecuado, generalmente paladio, el H2 se combina con el oxgeno libre para formar H2O, eliminndose de esta forma el oxgeno contaminante. Para el crecimiento de tales anaerobios estrictos, como es el caso de las bacterias metanognicas, no basta con quitar todo el oxgeno sino que todas las manipulaciones han de llevarse a cabo en ambientes anxicos, ya que una exposicin breve al oxgeno puede acarrear la muerte de estos microorganismos. En estos casos el medio de cultivo se hierve primero para eliminarle el oxgeno y entonces se aade un agente reductor, como es el cido sulfdrico, y todo ello se sella en atmsfera libre de oxgeno. Todas las manipulaciones se llevan a cabo insuflando nitrgeno o hidrgeno, libres de oxgeno, cada vez que los recipientes hayan de ser abiertos. Se han diseado cmaras especiales que permiten la manipulacin a travs de guantes impermeables al oxgeno.

3.14 MEDICIN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO El crecimiento de una poblacin microbiana se mide siguiendo los cambios en el nmero de clulas o el peso de la biomasa celular. Existen diversos mtodos para contar el nmero de clulas o para estimar la masa celular dependiendo del microorganismo de que se trate. Contaje total de clulas. El nmero de clulas de una poblacin puede medirse directamente al microscopio, es el mtodo denominado contaje directo. Se puede realizar bien en muestras secas o en muestras lquidas. El contaje directo es una manera rpida de estimar el nmero de clulas microbianas. Sin embargo, tiene una serie de limitaciones: las clulas muertas no se distinguen de las vivas; las clulas pequeas son difciles de ver al microscopio y algunas de ellas probablemente no se cuentan; se requiere tiempo y habilidad para conseguir precisin por este mtodo; se requiere un microscopio de contraste de fases cuando la muestra no est teida; este mtodo no es bueno para una suspensin de clulas poco densa. En el caso de bacterias si la suspensin tiene menos de 106 clulas/mL se vern pocas clulas en el campo del microscopio. Estas muestras diluidas, pueden sin embargo contarse, si previamente se concentran por centrifugacin en un pequeo volumen. Existen contadores de clulas automticos, pero son costosos Contaje de viables. Una clula viable se define como la que es capaz de dividirse para 189

dar lugar a descendencia y la forma habitual de llevar a cabo un contaje de este tipo, es determinando un nmero de clulas capaces de generar colonias sobre la superficie de un medio slido. Por esta razn, a menudo a este mtodo se le denomina contaje en placa o contaje de colonias. Cada clula viable puede dar lugar a una colonia. Hay dos maneras de llevar a cabo un contaje en placa por siembra en superficie o por vertido en placa. En el mtodo de siembra en superficie, un volumen no mayor de 0,1 mL de la dilucin apropiada se extiende por toda la superficie del medio utilizando una barra de vidrio doblada y estril. La placa se incuba hasta que aparezcan las colonias, las cuales son contadas. En el mtodo de vertido se pipetea un volumen conocido (0,1 1,0 mL) en el me dio de cultivo fundido previamente y enfriado hasta aproximadamente 40 0C, despus de mezclado se vierte rpidamente en una caja de petri y se incuba. Debido que la muestra se mezcla con medio fundido el volumen puede ser muy superior al primer mtodo. El organismo que vaya a ser contado debe resistir temperaturas de 40 a 45 0C. Para obtener el nmero de colonias apropiado la muestra debe ser casi siempre diluida. Ya que casi nunca se conoce el nmero de viables a priori, normalmente es necesario hacer ms de una dilucin (Figura 3.11).

Figura 3.11. Procedimiento para contar viables utilizando diluciones seriadas de la muestra. El diluyente puede ser simplemente agua, pero una solucin balanceada de sales puede dar mejores resultados Medidas de masa o peso seco celular. En algunos casos, es necesario estimar la masa de clulas presentes en el cultivo ms que el nmero de clulas. El mtodo ms usado para medir el crecimiento microbiano es secar volmenes conocidos de cultivo celular 190

lentamente hasta obtener un peso constante. Cuando se trata de clulas que sedimentan rpidamente, como las levaduras, esto usualmente implica centrifugacin de muestras del cultivo en tubos de centrfuga prepesados, el lavado de la pastilla celular concentrada con solucin salina isotnica seguida por recentrifugacin a 4,6 x 10 rpm. Luego las clulas concentradas se colocan en un horno a 90 0C durante 20 horas o a 105 0C. Durante 6 a 10 horas, hasta que hayan alcanzado un peso constante. Para clulas bacterianas difciles de concentrar por centrifugacin, las muestras de cultivo se filtran a travs de membranas hidroflicas con un tamao de poro de 0,2 m. las clulas, retenidas en el filtro, se lavan con solucin salina isotnica y los filtros se colocan en un horno a 90 0C o a 105 0C hasta obtener un peso constante. La masa seca de las clulas bacterianas es aproximadamente entre el 10 y el 20 % de la masa hmeda. En las determinaciones del peso seco celular existen fuentes de error significativas debido a la absorcin de humedad atmosfrica por las clulas secas y los tubos de centrfuga o las membranas durante el enfriamiento. Esto se puede evitar al enfriar en un desecador o mediante la determinacin de la cantidad de agua absorbida por las membranas o tubos y con la correccin adecuada del peso seco medido. La presencia de slidos en el medio, los cuales se encuentran frecuentemente en muchos medios industriales importantes, requiere que el peso seco medido sea corregido con respecto al peso de los slidos. La desventaja principal de este mtodo es que son lentos y requieren muestras relativamente grandes del cultivo. Medida de turbidez. Un mtodo ms rpido y til para obtener una estimacin del nmero de clulas o biomasa, consiste en la utilizacin de medidas de turbidez. Las clulas microbianas desvan la luz de modo que la cantidad de sta que llega al detector del espectrofotmetro, est relacionada directamente con el nmero de clulas presentes en la muestra de cultivo de acuerdo con la Ley de Beer. Por lo general, se emplean longitudes de onda de alrededor de 600 nm. La absorbancia es afectada por el tamao y la forma de las clulas; por lo tanto, la relacin entre la absorbancia y el nmero de clulas cambia si el tamao o la forma de stas vara durante el crecimiento del cultivo. Para organismos unicelulares, las unidades de DO (densidad ptica) son proporcionales a la masa celular y tambin al nmero de clulas. Sin embargo, antes de utilizar la turbidez como mtodo de contaje, se debe realizar una curva estndar que relacione medidas directas (microscpicas o por recuento en placa) con las indirectas de la turbidez. Esta grfica puede usarse para experimentos posteriores con el mismo organismo criado en condiciones similares. La pendiente de la curva estndar no siempre es constante, ya que vara a medida que la concentracin de las clulas aumenta y se da una respuesta no lineal del espectrofotmetro a valores de absorcin altos. Por lo tanto, es importante trabajaren el intervalo lineal mediante la dilucin adecuada de las muestras del cultivo, de modo que la absorcin este directamente relacionada con la densidad celular. Peso hmedo. Este mtodo implica la pesada directa de la muestra despus de la

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centrifugacin o filtracin de sta. Aunque es una tcnica extremadamente rpida, es importante estandarizar el procedimiento, ya que mide el agua tanto intracelular como extracelular, lo cual puede ocasionar errores considerables. Volumen de clulas empacadas. Mediante la centrifugacin de muestras del cultivo en tubos de centrfuga graduados se puede determinar el volumen de clulas empacadas (VCE). Este mtodo es muy inexacto, especialmente cuando se miden pequeos cambios en la poblacin celular. Masa de un componente celular. En el caso donde se dificulte el uso de otros mtodos, la cantidad de un componente celular, la cual es una cantidad constante del peso seco total, se puede usar para estimar la concentracin de clulas o de biomasa. Se ha usado componentes como el nitrgeno, protena, ARN, ADN y ATP celulares. Pueden surgir dificultades ya que vara la cantidad de estos componentes en la clula, a menudo considerablemente, durante el crecimiento de las clulas, especialmente cuando las condiciones de ste son diferentes. Mediciones fsicas. El crecimiento de las clulas microbianas va acompaado siempre de generacin de calor. Se ha demostrado que hay una relacin directa entre la cantidad de calor producido y la concentracin de biomasa. Este mtodo es directo, no requiere de muestras y es instantneo, pero es ms adecuado para biorreactores a gran escala, puesto que la cantidad de calor generado a escala de laboratorio puede ser demasiado pequea para ser medida adecuadamente. Para cultivos aerobios es posible medir la rapidez de captacin de oxgeno, ya que se ha demostrado est directamente relacionada con la concentracin de biomasa.

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