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Grundlagen der modernen UV-Vis- Spektroskopie

Ein Leitfaden

Tony Owen

Copyright Agilent Technologies 2000

Alle Rechte vorbehalten. Reproduktion, Adaption oder Übersetzung ohne ausdrückliche schriftliche Genehmigung nicht gestattet.

Änderungen vorbehalten.

Gedruckt in Deutschland 06/00 Publikationsnummer 5980-1397DE

Vorwort

Vorwort

1988 erschien bei Hewlett-Packard die Broschüre Diodenarray-Technologie in der UV/Vis-Spektroskopie. Damals war das allgemeine Verständnis für die Eigenschaf- ten und Vorteile der Diodenarray-Detektion, obwohl bereits 1979 eingeführt, im Vergleich zu scannenden Spektralphoto- metern noch gering. Die Broschüre sollte helfen, diese Situation zu verbessern. Sie wurde gut aufgenommen und mehrere tausend Exemplare wurden an Kunden verschickt.

Seit dieser ersten Einführung hat sich vieles verändert und so ist es an der Zeit, eine Neuauflage der Broschüre zu druk- ken. Computer werden zunehmend zur Datenauswertung eingesetzt, die Gute Laborpraxis gewinnt an Bedeutung und eine neue Generation von Diodenarray-Spektralphotome- tern mit noch besserer Leistung ist verfügbar. In dieser Ein- führung werden alle Aspekte der UV-Vis-Spektroskopie erläutert, die zum Erzielen optimaler Ergebnisse eine Rolle spielen. Mikroprozessoren und/oder Computersteuerung haben die Datenauswertung vereinfacht und zu einer Pro- duktivitätssteigerung geführt. Außerdem wurde die Bedien- barkeit der Geräte verbessert. Trotz dieser Vorteile ist eine gute Kenntnis der Grundlagen der UV-Vis-Spektroskopie, der gerätetechnischen Grenzen und der Fehlerquellen bei der Probenhandhabung unabdingbar.

In dieser Einführung wird gezeigt, daß der konventionelle Ansatz der Einzelmessung bei einer Wellenlängenicht zur Erzielung optimaler Ergebnisse ausreicht. Mehrfachmes- sungen bei mehrern Wellenlängen oder besser, mit vollen Spektren, sichern höchste Genauigkeit und Präzision der Ergebnisse und liefern die Informationen zum Ausschluß von Fehlerquellen.

An dieser Stelle möchte ich meine Kollegen von Agilent Technologies, denen ich viele meiner Kenntnisse verdanke, für Ihre Unterstützung danken.

Inhalt

Kapitel 1

Spektroskopie

Grundlagen Das elektromagnetische Spektrum Wellenlänge und Frequenz 3

Entstehung von UV-Vis-Spektren Transmission und Absorption Abgeleitete Spektren Gewinnung abgeleiteter Spektren Anwendungen Signal-Rausch-Verhältnis Apparative Aspekte Qualitative Analyse

2

2

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-

3

6

7

8

9

10

10

10

IdentifizierungSpektrum und Struktur 10

12

Bestätigung der Molekülstruktur

Farbe 13

Andere qualitative Informationen 15

Schmelzpunkt von Proteinen und Nukleinsäuren

15

Enzymaktivität

16

Apparative Aspekte Quantitative

17

Analyse 17

Das Beersche Gesetz

17

Probenvorbereitung

21

Mehrkomponentenanalysen

22

Das Prinzip der Additivität

22

Einfache Methode simultaner Gleichungen 22

Methode der kleinsten Fehlerquadrate

25

Andere Methoden

27

Probenbeschaffenheit

28

Anforderungen an das Meßgerät 28

29

Chemische Derivatisierung 29

Indirekte Quantifizierung

Spektralphotometrische Titrationen

29

Untersuchung von Enzymkinetiken

29

Kapitel 2

Apparative Aspekte

Gerätedesign

32

Komponenten

32

Inhalt

Lichtquellen 33

Monochromatoren 34

35

Optik 38

Das herkömmliche Spektralphotometer Das Diodenarray-

Spektralphotometer 40

38

Detektoren

Konfigurationen

41

Einstrahlgeräte 41

Zweistrahlgeräte

42

Design mit Strahlteiler

44

Dual-Wellenlängen Design 45 Messung eines Spektrums 45 Grundparameter der Meßgeräte 46 Spektrale Auflösung 46

Wellenlängenrichtigkeit und -präzision 50

Photometrische Richtigkeit und Präzision

51

Streulicht

51

Rauschen

52

Linearer dynamischer Bereich

53

Drift 55

Kapitel 3

Probenhandhabung und Messung

Flüssige Proben

58

Küvetten

58

Material

58

Küvettentypen

60

Fehlerquellen

61

Pflege der Küvetten

62

Wahl des Lösungsmittels

62

Einfluß von Lösungsmittel, Konzentration, pH und Temperatur 63

Feste Proben

65

Fehlende Referenz

65

Brechungsindex

66

Probengeometrie 66

67

Änderung der Spaltbreite 67 Zeitliche Mittelwertbildung 68

Wellenlängenmittelung

68

Starke Absorption 69 Interferenzen 71

Schwache Absorption

Arten von Interferenzen

71

Andere absorbierende Stoffe

71

Inhalt

Streuung 71

Korrekturmöglichkeiten 73

73

Mehrkomponentenanalyse 74

Background-Modeling 75

Isoabsorption

Interne Referenz

76

Dreipunktkorrektur

77

Ableitungen von Spektren

78

Photochemische Effekte

82

Fluoreszenz 82

Probenzersetzung

84

Kapitel 4

Methodenentwicklung und Validierung

Methodenentwicklung

86

Linearität

87

Richtigkeit 91

Präzision 93

Empfindlichkeit

94

Meßbereich

96

Selektivität

97

Robustheit 98

Anforderungen an das Meßgerät 99

Methodenvalidierung

99

Kapitel 5

Routinemeßbetrieb

Leistungsüberprüfung des Meßgerätes

102

Testparameter

102

Wellenlängenrichtigkeit und -präzision

103

Photometrische Richtigkeit und -präzision

104

Streulicht

104

Auflösung

105

Rauschen

106

Glätte der Basislinie

106

Stabilität

106

Linearität

106

Standards

107

Emissionslinienstandards

107

Feste Absorptionsstandards

108

Flüssige Absorptionsstandards

109

Gesetzliche Auflagen

110

GLP/GMP

111

Europäische Pharmacopoeia

111

Inhalt

Pharmacopoeia der USA

112

Testmethoden des American Standard

114

Empfehlungen

116

Selbsttest des Meßgerätes

120

Systemeignungstest

121

Fehlerfreier Betrieb

121

Elektronische Datenspeicherung

122

Standardarbeitsanweisungen

122

Ergänzungsdaten

122

Bestätigungswellenlängen

123

Vollständige Spektren

124

Statistische Methoden

125

Anhang A

Begriffsdefinitionen

Begriffsdefinitionen

128

128

Anhang B

Eigenschaften von Diodenarray-

Spektralphotometern

 

Vorteile der Diodenarray-Spektroskopie

130

Schnelle Aufnahme von Spektren

130

Simultanmessungen bei mehreren Wellenlängen

131

Reproduzierbarkeit der Wellenlänge

132

Empfindlichkeit

133

Statistische Auswertung

133

Robustheit und Verläßlichkeit

134

Offener Probenbereich

134

Nachteile der Diodenarray-Spektroskopie

135

Auflösung

135

Streulicht

135

Probenzersetzung

136

Komplexität

137

Fehler bei der Messung fluoreszierender Proben

137

Anhang C

Literaturverzeichnis

Kapitel 1

Kapitel 1

Grundlagen und Anwendun- gen der

UV-Vis-Spektro-

skopie

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie

In diesem Kapitel werden Theorie, Grundlagen,

Anwendungsmöglichkeiten und Grenzen der

UV-Vis-Spektroskopie in der chemischen Analytik

vorgestellt.

Grundlagen

Das elektromagnetische Spektrum

Ultraviolette (UV) und sichtbare Strahlung stellen einen kleinen Ausschnitt des gesamten elektromagnetischen Spektrums dar. Andere Bereiche sind u. a. Radio-, Infrarot- (IR), kosmische und Röntgenstrahlung (siehe Abbildung 1).

Frequenz [Hz] Ultraviolett Sichtbar Infrarot Kosmischer Hintergrund Gammastrahlen Röntgenstr. Ultraviolett
Frequenz [Hz]
Ultraviolett
Sichtbar
Infrarot
Kosmischer Hintergrund
Gammastrahlen
Röntgenstr.
Ultraviolett
Sichtbar
Infrarot
Mikrowellen
Radar
Fernsehen
NMR
Radio
Wellenlänge [m] Abbildung 1 Das elektromagnetische Spektrum
Wellenlänge [m]
Abbildung 1
Das elektromagnetische Spektrum

Der Energieinhalt elektromagnetischer Strahlung wird mit folgender Formel angegeben:

2

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie

E

=

hν

E ist die Energie (in Joule), h die Planck-Konstante (6,62 × 10 -34 Js) und ν die Frequenz (in Sekunden).

Wellenlänge und Frequenz

Elektromagnetische Strahlung kann als Überlagerung oszil- lierender elektrischer und magnetischer Felder aufgefaßt werden, die sich im Raum wellenartig ausbreiten. Da sich Strahlung wellenartig verhält, kann sie sowohl über ihre Wellenlänge als auch über ihre Frequenz beschrieben wer- den. Diese sind über folgende Beziehung miteinander ver- knüpft:

ν

=

c ⁄ λ

ν ist die Frequenz (in Sekunden), c die Lichtgeschwindig- keit von (3 × 10 8 ms -1 ), und λ die Wellenlänge (in Metern). In der UV-Vis Spektroskopy wird die Wellenlänge normaler- weise in Nanometern angegeben (1 nm = 10 -9 m).

Aus den oben vorgestellten Gleichungen folgt, daß Strah- lung mit kürzerer Wellenlänge eine höhere Energie auf- weist. In der UV-Vis-Spektroskopie hat das UV-Licht bei niedrigerer Wellenlänge die höchste Energie. In einigen Fäl- len reicht diese Energie aus, um photochemische Reaktio- nen auszulösen, während das Spektrum einer Substanz gemessen wird. Auch Sonnenbrand geht auf den UV-Anteil des Sonnenlichtes zurück.

Entstehung von UV-Vis-Spektren

Wenn Strahlung in Wechselwirkung mit Materie tritt, kön- nen die Reflexion, Streuung, Absorption, Fluoreszenz, Phos- phoreszenz (jeweils Absorption und Emission) oder photochemische Reaktionen (Absorption und Bindungs- bruch) auftreten. Grundlage der UV-Vis-Spektroskopie bil- det jedoch die Nutzung der Absorption.

Weil Licht eine Energieform darstellt, führt die Absorption von Licht durch Materie zur Erhöhung des Energieinhaltes der beteiligten Moleküle bzw. Atome. Der Gesamtenergiein-

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie

halt eines Moleküls wird allgemein durch die Summe seiner elektronischen, Schwingungs-, und Rotationsenergie gege- ben:

E

Gesamt

=

E

Elektronisch

+

E

Schwingung

+

E Rotation

Die Beiträge der einzelnen Energieformen zur Gesamtener- gie eines Moleküls sind nicht kontinuierlich, sondern beste- hen aus einer Serie diskreter Energiezustände. Die Energiebeiträge der einzelnen Zustände weisen folgende Reihenfolge auf:

E

Elektronisch

>

E

Schwingung

>

E Rotation

In einigen Molekülen und Atomen können Photonen auf- grund ihres Energieinhaltes Übergänge zwischen bestimm- ten elektronischen Zuständen induzieren. Der Wellenlänge des absorbierten Lichtes entspricht genau die Energie- menge, die zur Anhebung eines Elektrons aus einem niedri- geren in einen höheren Energeizustand erforderlich ist. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für elektronische Übergänge im Formaldehyd und die hierfür erforderlichen Wellenlän- gen.

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie

Übergang Übergang
Übergang
Übergang

Abbildung 2 Elektronische Übergänge im Formaldehyd

Diese Übergänge sollten sehr schmale Absorptionsbanden bei Wellenlängen zur Folge haben, die für die Energiediffe- renzen der Energiezustände der absorbierenden Spezies charakteristisch sind. Dies trifft auch auf Atome zu, wie in Abbildung 3 dargestellt.

trifft auch auf Atome zu, wie in Abbildung 3 dargestellt. Abbildung 3 Elektronische Ü berg ä

Abbildung 3 Elektronische Übergänge und Atomspektren

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie

Bei Molekülen sind allerdings die Energien der Schwin- gungs- und Rotationszustände den elektronischen Zustän- den überlagert. Da sehr viele Übergänge zwischen den unterschiedlichen Energienniveaus auftreten können, ent- stehen breite Banden (siehe Abbildung 4). Die Bandenver- breiterung ist in Lösungen aufgrund der Wechselwirkung mit Lösungsmittelmolekülen noch größer.

Elektronische Energiezust ä nde Schwingungszust ä nde Rotationszust ä nde Elektronische Ü berg ä nge

Elektronische Energiezustände

Schwingungszustände

Rotationszustände

Elektronische Energiezust ä nde Schwingungszust ä nde Rotationszust ä nde Elektronische Ü berg ä nge

Elektronische Übergänge

Elektronische Energiezust ä nde Schwingungszust ä nde Rotationszust ä nde Elektronische Ü berg ä nge

Abbildung 4 Elektronische Übergänge und UV-Vis-Spektren von Molekülen

Transmission und Ab- sorption

Wenn Licht von einer Probe reflektiert oder durchgelassen wird, ist die Menge des absorbierten Lichtes die Differenz zwischen der ursprünglichen Intensität (I o ) und der Intensi- tät (I) nach Wechselwirkung mit der Probe. Die Menge des absorbierten Lichtes kann als Transmission und Absorption ausgedrückt werden. Transmission wird normalerweise als ein Bruchteil von 1 oder Prozentwert ausgedrückt und ist wie folgt definiert:

T

=

II

o

oder

%

T

=

(

II

o

) × 100

Die Absorption ist folgendermaßen definiert:

6

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie

A = –log T

Für die meisten Anwendungen wird die Absorption verwen- det, weil der Zusammenhang zwischen Absorption, Konzen- tration und optischer Schichtdicke häufig linear ist.

Abgeleitete Spektren

Wenn ein Spektrum als Auftragung der Absorption (A) gegen die Wellenlänge (λ) angegeben ist, werden die abge- leiteten Spektren wie folgt errechnet:

Nullter Ordnung:

Erster Ordnung:

Zweiter Ordnung:

A = f(λ)

dA

-------

dλ

d 2 A

---------

dλ

2

= f ′(λ)

= f ″(λ)

Abbildung 5 auf der nächsten Seite zeigt die Wirkung einer Ableitung auf eine einfache gaussförmige Absorptions- bande. Die abgeleiteten Spektren sind stets komplexer als das Spektrum nullter Ordnung.

Die erste Ableitung gibt die Änderungsrate der Absorption als Funktion der Wellenlänge an. Sie beginnt und endet bei Null, und durchläuft die Nullinie bei der Wellenlänge, bei der die maximale Absorption λ max einer Absorptionsbande liegt. Die Ableitung hat einen positiven und eine negativen Anteil, deren Maximal- und Minimalwerte bei denselben Wellenlängen liegen, wie die Wendepunkte der Absorptions- banden.

Die herausragende Eigenschaft einer Ableitung zweiter Ord- nung ist eine positive und eine negative Bande mit einem Minimum bei derselben Wellenlänge, an der das Maximum

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie

der Bande nullter Ordnung liegt. Diese Ableitung weist zwei positive Satellitenbanden auf beiden Seiten der Hauptbande auf. Die vierte Ableitung weist eine positive Bande mit einem Maximum bei der Wellenlänge des Maximums der Bande nullter Ordnung auf. Geradzahlige Ableitungen wei- sen negative oder positive Banden mit Minima oder Maxima bei derselben Wellenlänge wie λ max der Absorptionsbande auf.

Absorption Absorption 1. Ableitung 2. Ableitung 3. Ableitung 4. Ableitung
Absorption
Absorption
1.
Ableitung
2. Ableitung
3.
Ableitung
4.
Ableitung

Abbildung 5 Abgeleitete Spektren einer gaussförmigen Absorptionsbande

Gewinnung abgeleiteter Spektren

Zur Gewinnung abgeleiteter Spektren können optische, elektronische und mathematische Methoden eingesetzt werden. Obwohl optische und elektronische Methoden in

8

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie

den Anfängen der UV-Vis-Spektroskopie weit verbreitet waren, werden sie nun von mathematischen Methoden nahezu vollständig ersetzt.

Zur Berechnung der Ableitung bei einer bestimmten Wellen- länge (λ) wird ein Datenbereich von ± n Datenpunkten aus- gewählt und ein Polynom der Form

A λ

=

a

0

+

a

1

λ

++

a l λ l

an den Datenbereich nach der Methode der kleinsten Feh- lerquadrate angepaßt. Die Koeffizienten a 0 a l stehen für die abgeleiteten Werte bei einer Wellenlänge, wobei a 1 den ersten, a 2 den zweiten und höhere Koeffizienten höhere Ableitungen angeben. Auf der Methode von Savitzky und Golay basieren die meisten hocheffizienten Ableitungsalgo- rithmen in kommerziellen Meßgeräten. Mit dieser Metho- den werden Rohdaten auch geglättet. Wenn die Ordnung (l) des Polynoms kleiner ist als die Anzahl der Datenpunkte (2n+1) im Datenbereich, kann das Polynom nicht durch alle Datenpunkte verlaufen. Daher liefert die Kurvenanpassung nach der Methode der kleinsten Fehlerquadrate eine geglät- tete Approximation der Rohdatenpunkte.

Obwohl die Bildung der ersten oder einer höheren Ablei- tung eines UV-Vis-Spektrums zu einem, verglichen mit dem Spektrum Nullter Ordnung (siehe Abbildung 5), komplexe- ren Verlauf führt, nimmt der inhärente Informationswert dieser Spektren nicht zu. Er nimmt im Gegenteil durch Informationsverluste, z. B. über einen Offset, ab.

Anwendungen Abgeleitete Spektren können zur Verdeutlichung der Unter- schiede zwischen Spektren und in der qualitativen Analyse zur Auflösung überlappender Banden genutzt werden (siehe Bestätigung der Molekülstrukturauf Seite 12). Weitaus wichtiger ist ihr Nutzen in der quantitativen Analyse zum Erkennen von Einflüssen wie Streuung, Matrix oder ande- rer absorbierender Verbindungen (siehe Ableitungen von Spektrenauf Seite 78).

Signal-Rausch-Verhältnis

Apparative Aspekte

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie

Eine unerwünschte Folge der Bildung von Ableitungen ist die Zunahme des Signal-Rausch-Verhältnisses. Diese Zunahme ist eine Folge des Diskriminierungseffekts (siehe Ableitungen von Spektrenauf Seite 78) sowie der Tatsa- che, daß das Rauschen aus vergleichsweise scharfen Einzel- peaks besteht. Daher weisen Spektraldaten, die mit 2 nm Intervallen aufgenommen wurden, im Rauschen eine Band- breite von 2 nm auf. Wenn die Bandbreite des Analyten 20 nm beträgt, ist das Signal-Rausch-Verhältnis der ersten Ableitung 10fach schlechter als im Spektrum Nullter Ord- nung. Die Glättungseigenschaften der polynomialen Anpas- sung nach Savitzky-Golay führen zur einer Milderung dieses Effektes im Signal-Rausch-Verhältnis. Bei zu starker Glät- tung wird jedoch eine Verzerrung der abgeleiteten Spektren erzeugt.

Die höhere Auflösung abgeleiteter Spektren stellt höhere Anforderungen an die Reproduzierbarkeit der Wellenlängen des Spektralphotometers. Kleine Wellenlängenabweichun- gen in der Absorption können zu großen Fehlern in den Ableitungen führen.

Die negative Wirkung der Ableitungen auf das Signal-Rausch-Verhältnis stellt besonders hohe Anforderun- gen an ein Spektralphotometer hinsichtlich geringem Rau- schen. Wenn mehrere Spektren aufgenommen und gemittelt werden können, wird hierdurch das Signal-Rausch-Verhält- nis vor Bildung der Ableitungen nochmals verbessert.

Qualitative Analyse

IdentifizierungSpek-

trum und Struktur

UV-Vis-Spektren weisen im Allgemeinen nur einige wenige breite Absorptionsbanden auf. Im Vergleich zu Methoden, wie der Infrarotspektroskopie, die viele schmale Banden erzeugen, liefert die UV-Vis-Spektroskopie nur eine begrenzte Menge an qualitativer Information. In organi- schen Molekülen führen meist π-Bindungen (ungesättigte

10

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie

Bindungen) zur Absorption. Ein Chromophor ist eine Mole- külgruppe, die normalerweise eine π-Bindung enthält. Die Einführung einer solchen Bindung in einen gesättigten Koh- lenwasserstoff, der keine Absorption im UV zeigt, führt zu einer Substanz, die normalerweise zwischen 185 und 1000 nm absorbiert. In Tabelle 1 sind einige häufige Chro- mophore mit den zugehörigen Absorptionswellenlängen zusammengestellt.

Tabelle 1

Ausgewählte Chromophore und zugehörige Absorptionsmaxima

Chromophore

Struktur

Beispiel

λ max (nm)

Carbonyl (Ketone)

RR’C=O

Aceton

271

Carbonyl (Aldehyd)

RHC=O

Acetaldehyd

293

Carboxyl

RCOOH

Essigsäure

204

Amid

RCONH 2

Acetamid

208

Ethyl

RCH=CHR

Ethylen

193

Acetylen

RC=CR

Acetylen

173

Nitrile

RC=N

Acetonitril

< 160

Nitro

RNO 2

Nitromethan

271

Die Gegenwart einer Absorptionsbande bei einer bestimm- ten Wellenlänge ist ein guter Indikator für die Gegenwart eines Chromophors. Die Lage des Absorptionsmaximums ist nicht festgelegt und hängt auch von den Nachbargruppen im Molekül und vom verwendeten Lösungsmittel ab. Andere Parameter, wie z. B. der pH-Wert und die Tempera- tur können ebenfalls zur Modifizierung von Intensität und Lage des Absorptionsmaximums führen.

Konjugierte Doppelbindungen erhöhen sowohl Intensität als auch Lage der Absorptionsbande. Für einige Moleküle, wie z. B. Kohlenwasserstoffe mit konjugierten Doppelbin- dungen oder Karotine, wurde der Zusammenhang zwischen Intensität und Wellenlänge systematisch untersucht.

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie

Auch Übergangsmetallionen verfügen über elektronische Energieniveaus, die zur Absorption im sichtbaren Licht bei 400700 nm führen

Bestätigung der Mole- külstruktur

Obwohl UV-Vis-Spektren nicht zur eindeutigen Identifizie- rung einer unbekannten Substanz ausreichen, werden sie häufig zur Bestätigung der Struktur einer Substanz verwen- det, indem das gemessene Spektrum mit einem Referenz- spektrum verglichen wird.

Im Falle hoher Ähnlichkeit der Spektren können zur Diffe- renzierung auch abgeleitete Spektren verwendet werden. Wie in Abbildung 6 dargestellt, nimmt die Anzahl der Ban- den mit der Ordnung der Ableitung zu. Die erhöhte Komple- xität der abgeleiteten Spektren kann in der qualitativen Analyse zur Charakterisierung von Substanzen oder zur Identifizierung genutzt werden. So zeigt z. B. das Absorpti- onsspektrum des Steroids Testosteron eine einzelne, breite und unstrukturierte Bande bei etwa 330 nm, die zweite Ableitung weist hingegen sechs klare Peaks auf.

Die Erhöhung der Auflösung kann auch zur Identifizierung unbekannter Substanzen eingesetzt werden. Abbildung 6 zeigt hierzu folgende Computersimulation: Zwei gaussför- mige Peaks mit einer natürlichen spektralen Bandbreite (Natural Spectral Bandwidth, NBW) mit 30-nm-Abstand werden so überlagert, daß eine einzelne Bande mit einem Maximum in der Mitte zischen beiden Einzelbanden resul- tiert. Die beiden Komponenten werden nicht aufgelöst. In der vierten Ableitung sind die beiden Banden jedoch klar mit Maxima in der Nähe der jeweiligen λ max der Einzelkom- ponenten sichtbar.

12

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie

Farbe

Absorption

Absorption
4. Ableitung Abbildung 6 Erhöhung der Auflösung
4. Ableitung
Abbildung 6
Erhöhung der Auflösung

Farbe ist eine wichtige Substanzeigenschaft. Die Farbe von Materie wird durch ihre Absorption bzw. Reflektivität bestimmt. Das menschliche Auge sieht stets die zur Absorp- tion komplementäre Farbe. Dies ist in Abbildung 7 und Abbildung 8 zur Erläuterung dargestellt.

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie Abbildung 7 Durchl ä ssigkeit und Farbe   Wellenl ä nge
Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie Abbildung 7 Durchl ä ssigkeit und Farbe   Wellenl ä nge
Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie Abbildung 7 Durchl ä ssigkeit und Farbe   Wellenl ä nge
Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie Abbildung 7 Durchl ä ssigkeit und Farbe   Wellenl ä nge
Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie Abbildung 7 Durchl ä ssigkeit und Farbe   Wellenl ä nge

Abbildung 7 Durchlässigkeit und Farbe

  Wellenl ä nge [nm] absorbierte und komplement ä re Farbe rot blaugr ü n
 

Wellenlänge [nm]

absorbierte und

komplementäre Farbe

rot blaugr ü n
rot blaugr ü n

rot

rot blaugr ü n

blaugrü n ün

orange gr ü nlich blau
orange gr ü nlich blau
orange gr ü nlich blau

orange

orange gr ü nlich blau

grü nlich blau ünlich blau

  gelbgr ü n purpur
  gelbgr ü n purpur
 

gelbgrün

  gelbgr ü n purpur

purpur  gelbgr ü n

gr ü n rot-purpur
gr ü n rot-purpur

grün

gr ü n rot-purpur

rot-purpurgr ü n

blaugrü n ün

blaugr ü n rot

rotblaugr ü n

gr ü nlich blau orange

grü nlich blau ünlich blau

gr ü nlich blau orange

orangegr ü nlich blau

blaugelb

blau gelb

gelbblau

violett gelbgr ü n

violettgelbgr ü n

violett gelbgr ü n

gelbgrü n ün

Abbildung 8 Absorption und Komplementärfarben

In der Realität sind Erzeugung und Wahrnehmung von Farbe komplizierte Vorgänge, die von vielen Faktoren bestimmt werden, wie z. B. dem Spektrum des auffallenden Lichtes und, im Falle von Feststoffen, deren Oberflächen-

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie

struktur. Zur Farbmessung stehen Farbmeßsysteme, wie z.B. CIE L*a*b und andere Geräte zur Verfügung. Auch die meisten Spektralphotometer können, zusammen mit geeig- neter Software, Farben ermitteln. Ein detailliertere Diskus- sion der Entstehung und der Eigenschaften von Farben übersteigt jedoch Umfang und Ziel dieser Einführung. Zur weitergehenden Lektüre stehen verschiedene Publikationen 2,3 zur Verfügung, die die Eigenschaften und Messung von Farbe genau diskutieren.

Andere qualitative In- formationen

Schmelzpunkt von Proteinen und Nukleinsäuren

Die UV-Vis-Spektroskopie kann zur Bestimmung verschie- dener physikochemischer Eigenschaften von Substanzen und damit von Strukturinformationen verwendet werden. Hierfür folgen zwei Beispiele.

Die Absorptionsspektren von Proteinen resultieren zum größten Teil aus der Gegenwart der aromatischen Amino- säuren Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin. Proteine wei- sen bei Raumtemperatur eine spezifische räumliche Struktur bzw. Konformation auf, die in der Nähe der aroma- tischen Aminosäuren eine spezielle elektronische Umge- bung erzeugt. Bei Erwärmung wird bei einer bestimmten Temperatur diese Struktur aufgefaltet, das Protein schmilzt. Bei diesem Vorgang ändert sich die elektronische Umge- bung der aromatischen Aminosäuren mit der Folge, daß sich die Spektren ändern und verschieben.

Mehrkomponentenanalysen (siehe Mehrkomponenten- analysenauf Seite 22) können zur Bestimmung des Anteils jeder aromatischen Aminosäure in einem intakten Protein verwendet werden 4 .

Desoxyribonukleinsäuren (DNA) besteht in ihrem Grundzu- stand aus zwei Strängen von Desoxyribosemolekülen, die sich helikal um eine Achse winden. Die Stränge sind durch Wasserstoffbrücken zwischen den Basen Purin und Pyrimi- din (P-P), Adenin und Thymin (A-T) bzw. Guanin und Cyto- sin (G-C) miteinander verbunden. Diese Basen bilden die UV-Absorptionseigenschaften von DNA mit einem Peakma-

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie

ximum bei 260 nm. Analog jedem anderen Mehrkomponen- tensystem setzt sich die Gesamtabsorption jedes DNA-Moleküls als Summe aus den Beiträgen der Einzelab- sorptionen zusammen:

A DNA

=

A

Adenin

+++

Guanin

Cytosin

A

A

A Thymin

Fast immer ist die beobachtete Absorption deutlich gerin- ger als die erwartete, weil die Wasserstoffbrücken zwischen den Basenpaaren deren elektronische Eigenschaften modi- fizieren. Beim Erwärmen eines Moleküls brechen die Was- serstoffbrücken auf und die Doppelhelix entfaltet sich, wodurch die Absorption auf den erwarteten Wert zunimmt. Dieser Denaturierungsprozeß wird auch als Schmelze bezeichnet. In einem Schmelzexperiment mit DNA wird die Temperatur schrittweise erhöht. Dabei wird bei jeder Tem- peratur die Absorption bei 260nm gemessen und gegen die Schmelzkurve aufgetragen.

Der Mittelpunkt des Temperaturbereiches, in dem die Schmelze auftritt, wird T m -Wert genannt. Der T m -Wert einer bestimmten DNA-Probe hängt primär vom Anteil der G-C-Paare, die je drei Wasserstoffbrücken ausbilden, in der Probe ab. Im Unterschied hierzu bilden die A-T-Paare nur zwei Wasserstoffbrücken aus. Je höher der prozentuale Anteil der G-C-Paare in der Probe ist, desto höher ist der beobachtete Wert für T m .

Enzymaktivität

Die Enzymaktivität stellt ein Maß zur Beschreibung der katalytischen Effizienz dar. Die Konzentration eines Enzyms in einer unreinen Zubereitung wird in Units pro Mil- liliter angegeben, die spezifische Aktivität der Zubereitung wird in Units pro Milligramm Protein angegeben. Bei der Reinigung eines Enzyms erreicht die spezifische Aktivität einen Grenzwert, der dem des reinen Enzyms entspricht.

Die enzymatische Reaktionsgeschwindigkeit hängt von Fak- toren, wie Substratkonzentration, pH-Wert, Ionenstärke und Temperatur ab. Die Bedingungen, unter denen die Aktivität

16

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie

bestimmt wird, müssen daher präzise definiert werden. Gewählt werden normalerweise die optimalen Prüfbedin- gungen bei festgelegten Temperaturen (25-, 30-, oder 37 °C) mit Sättigungskonzentrationen aller Substrate. Zur Bestim- mung der Aktivität wird ein System mit bekannten Substrat- und, wo erforderlich, Koenzymkonzentrationen erstellt. Dann wird eine eingewogene Enzymmenge hinzugefügt und der Reaktionsumsatz bestimmt. Aktivitätsmessungen wer- den normalerweise in Forschungseinrichtungen durchge- führt, wo Enzyme auch isoliert und gereinigt werden sowie in der Herstellung von Enzym Assay Kits, in welchen die Enzymaktivität von Charge zu Charge konsistenz sein muß.

Apparative Aspekte Die Wellenlängen- und photometrische Genauigkeit sind für die qualitative Analyse besonders wichtig, besonders bei der Identifizierung und Strukturbestätigung unbekannter Stoffe. Oft werden auf verschiedenen Geräten Spektren auf- genommen und miteinander verglichen. Deshalb sollten alle Spektren bei einer definierten spektralen Auflösung gemes- sen werden.

Quantitative

Analyse

Das Beersche Gesetz

Wenn 100 Photonen in eine Zelle ein- und nur 50 auf der anderen Seite wieder austreten, beträgt die Durchlässigkeit 0,5- oder 50%. Von diesen 50 Photonen treten auf der ande- ren Seite einer weiteren identischen Zelle nur 25 aus und so weiter. In Abbildung 9 ist eine Auftragung der Durchlässig- keit gegen die Konzentration dargestellt.

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie

Durchgang
Durchgang

Optische Schichtdicke

Abbildung 9 Zusammenhang von Durchgang und KonzentrationDas Bou- guer-Lambertsche Gesetz

Lambert (1760) wird die erste mathematische Formulierung dieses Zusammenhanges zugeschrieben, obwohl es nach heutigem Wissen wahrscheinlich Bouguer bereits 1729 for- mulierte. Der Ausdruck lautet:

T

=

II o

=

e kb

Dabei ist I o die ursprüngliche Lichtintensität, I die Intensi- tät nach Durchgang, e die Basis des natürlichen Logarith- mus, k eine Konstante und b die optische Schichtdicke (normalerweise in cm).

Das Beersche Gesetz entspricht der Formulierung von Bou- guer mit dem Unterschied, daß es in Konzentra- tionseinheiten ausgedrückt ist. Die absorbierte Lichtmenge ist proportional zur Anzahl der absorbierenden Moleküle, durch die der Lichtstrahl geht. Abbildung 10 zeigt eine Auf- tragung der Durchlässigkeit gegen die optische Schicht- dicke.

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie

Durchlässigkeit
Durchlässigkeit

Optische Schichtdicke

Abbildung 10 Durchlässigkeit und optische SchichtdickeDas Beersche Gesetz

Aus der Kombination beider Gesetze entsteht das Gesetz nach Beer-Bouguer-Lambert:

T

=

II

o

=

e kbc

Dabei ist c die Konzentration der absorbierenden Spezies. Diese Gleichung kann durch Bildung des Logarithmus in einen linearen Ausdruck umgeformt werden und wird nor- malerweise in der dekadischen Form angegeben.

A

==

log T

log(

I

I

o

)

= log(

I

o

I)

= εbc

Dabei ist ε der molare Absorptions- oder Extinktionskoeffi- zient. Dieser Ausdruck wird allgemein das Beersche Gesetz genannt. In Abbildung 11 ist eine Auftragung von Absorp- tion gegen Konzentration dargestellt.

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie

Absorption [AU]
Absorption [AU]

Konzentration

Abbildung 11 Auftragung nach dem Gesetz von BeerBouguer-Lambert

Der Extinktionskoeffizient (ε) ist für eine Substanz bei exakt definierten Bedingungen, wie z. B. Wellenlänge, Lösungsmittel und Temperatur, charakteristisch. In der Pra- xis ist der gemessene Extinktionskoeffizient teilweise von den Charakteristika der eingesetzten Meßgeräte abhängig. Aus diesen Gründen werden die Literaturwerte der Extink- tionskoeffizienten in der quantitativen Analyse nicht einge- setzt. An ihrer Stelle wird aus einer oder mehreren Standardlösungen mit bekannter Konzentration der Analy- sensubstanz eine Kalibrierkurve für die zu analysierende Substanz aufgenommen.

Bei elektronischen Übergängen ist die Energiedifferenz zwi- schen dem Grund- und den angeregten Zuständen relativ groß. Aus diesem Grund sind bei Raumtemperatur wahr- scheinlich alle Moleküle im elektronischen Grundzustand. Absorption und Relaxation in den Grundzustand sind schnelle Prozesse, das Gleichgewicht stellt sich schnell ein. Aus diesem Grund sind quantitative Messungen mit UV-Vis-Spektroskopie sehr exakt. Der einfache lineare Zusammenhang zwischen Absorption und Konzentration

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie

und die einfache Handhabung führten zur tausendfachen Anwendung der UV-Vis-Spektroskopie in der quantitativen Analytik.

Unter der Annahme, daß das Beersche Gesetz aus einem Spektrum Nullter Ordnung abgeleitet ist, wird zwischen der Konzentration und der Amplitude in allen höheren Ableitun- gen des Spektrums auch ein linearer Zusammenhang gefun- den:

Nullte Ordnung:

Erste Ableitung:

n-te Ableitung:

A

= εbc

dA

-------

dλ

=

------bc dλ dε

n A

d

---------

dλ′

=

d

-------- bc

dλ′

n ε

λ ist die Meßwellenlänge, A die Absorption, ε der Extinkti- onskoeffizient, b die optische Schichtdicke und c ist die Konzentration der Probe.

Bei der Quantifizierung von Einzelkomponenten ist die Wahl einer Wellenlänge mit abgeleiteten Spektren schwieri- ger als mit dem Absorptionsspektrum, da sowohl positive als auch negative Peaks auftreten. Die geradzahligen Ablei- tungen weisen ein Peakmaximum bzw. -minimum bei der Wellenlänge λ max des Absorptionsspektrums auf. Bei unge- radzahligen Ableitungen ist diese Wellenlänge eine Null- stelle. Durch Bildung der Differenz zwischen höchstem Maximum und niedrigstem Minimum wird das beste Signal-Rausch-Verhältnis erreicht, jedoch nimmt die Quer- empfindlichkeit auf andere Substanzen zu.

Probenvorbereitung

Zur Erzielung exakter Ergebnisse sollte eine Probe nur die absorbierende Substanz erhalten, für die eine Kalibrierung durchgeführt wurde. Wenn die Probe als Lösung vorliegt,

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie

wird eine Probe mit reinem Lösungsmittel als Blank ver- messen. Es ist möglich, die Beiträge einer etwaigen stören- den Substanz durch Messung bei einer zweiten Wellenlänge zu eliminieren.

Mehrkomponenten-

analysen

Das Prinzip der Additivität

Einfache Methode simulta- ner Gleichungen

Mehrkomponentenanalysen mit UV-Vis-Spektroskopie wer- den bereits genauso lange durchgeführt, wie Einzelstoffana- lysen. Da die Meßergebnisse, wie unten ausgeführt, oft fehlerhaft waren, fand keine breite Anwendung statt. Moderne Geräte liefern jedoch genauere Daten und die Anwendung moderner Kurvenanpassungsverfahren ermög- licht exaktere Ergebnisse. Vielleicht ebenso wichtig ist die Tatsache, daß mit diesen Methoden unrichtige Ergebnisse erkannt werden können. Aus den genannten Gründen nimmt heute die Mehrkomponentenanalyse mit UV-Vis-Spektroskopie zu.

Nach dem Beerschen Gesetz (siehe Das Beersche Gesetzauf Seite 17), ist die Absorption proportional zur Anzahl der Moleküle, die bei einer spezifischen Wellenlänge Strahlung absorbieren. Dieses Prinzip gilt auch bei der Anwesenheit von zwei oder mehr absorbierenden Spezies. Alle quantitati- ven Mehrkomponentenanalysen basieren auf diesem Prin- zip der Additivität: Bei jeder Wellenlänge ist die Absorption einer Mischung gleich der Summe der Absorptionen aller Einzelkomponenten bei dieser Wellenlänge.

Der einfachste Ansatz der Mehrkomponentenanalyse basiert auf der Messung bei so vielen verschiedenen Wellen- längen, wie unterschiedliche Substanzen in der Mischung vorliegen. Die gewählten Wellenlängen liegen in den Absorptionsmaxima der einzelnen Stoffe. Zur Kalibrierung werden die Absorptionen reiner Standardlösungen bekann- ter Konzentrationen gemessen und daraus der Extinktions- koeffizient für jede Substanz bei allen gewählten Wellenlängen berechnet.

Die Absorption der Mischung ist bei jeder Wellenlänge die Summe der Einzelabsorptionen, die jeweils auf dem Extink-

22

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie

tionskoeffizienten und der Konzentration der Substanz beruhen. Für zwei Stoffe x und y ergeben sich damit fol- gende Gleichungen:

A (x + y)

und

A (x + y)

=

=

A

x

+

A

y

A

x

+

A

y

=

=

e

x

bc

x

e

x

bc

+ ey bc y

x

+ ey bc y

Aist die Absorption bei der Wellenlänge′, A′′ bei der Wel- lenlänge′′. eist die molare Absorption bei der Wellenlänge′, e′′ bei der Wellenlänge′′. c ist die Konzentration und b ist die optische Schichtdicke.

Diese Gleichungen können zur Bestimmung der Konzentra- tion jedes Stoffes leicht gelöst werden. Wenn die Messun- gen immer exakt durchgeführt werden, können auch für komplexe Mehrkomponentenmischungen mit ähnlichen Spektren exakte Ergebnisse ermittelt werden. In der Praxis treten jedoch stets Meßfehler auf, die die Genauigkeit von Ergebnissen reduzieren, wenn die Spektren stark überlap- pen. Abbildung 12 zeigt eine simulierte Zweistoffmischung ohne Überlappung der Spektren im Absorptionsmaximum.

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie

Absorption [AU]
Absorption [AU]

Wellenlänge [nm]

Abbildung 12 Eine Zweikomponentenmischung geringer spektraler Überlappung

Im Unterschied hierzu zeigt Abbildung 13 eine simulierte Zweikomponentenmischung mit deutlicher Überlappung der Spektren im Absorptionsmaximum.

Absorption [AU]
Absorption [AU]

Wellenlänge [nm]

Abbildung 13 Eine Zweikomponentenmischung mit deutlicher spektraler Über- lappung

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie

Für eine Mischung aus x und y mit cx = cy = 1 werden theo- retisch folgende Absorptionen gefunden:

Geringe spektrale Überlappung

Deutliche spektrale Überlappung

A(x + y) = 1.1 + 0.0 = 1.1

A(x + y) = 0.6 + 0.5 = 1.1

A’’ (x + y) = 0.0 + 0.9 = 0.9

A’’ (x + y) = 0.4 + 0.5 = 0.9

Ein Fehler von 10 % in der Messung von A(x + y) und A′′ (x + y) , so daß A(x + y) = 0.99 (- 10 %) und A′′ (x + y) = 0.99 (+ 10 %) ist, führt zu folgenden Ergebnissen in Tabelle 2 für die quantitative Berechnung:

Tabelle 2

Vergleich der Ergebnisse von Mehrkomponentenanalysen mit Beispielen für geringe und deutliche spektrale Überlappung

 

Geringe spektrale Über- lappung

Deutliche spektrale

Überlappung

 

Nominale

Berechnete

Fehler

Berechnete

Fehler

Substanz

Konzentration

Konzentration

in %

Konzentration

in %

x

1

0.9

- 10 %

0

- 100 %

y

1

1.1

+ 10 %

1.98

+ 98 %

Methode der kleinsten Feh- lerquadrate

Die Wirkung von statistischem Rauschen kann durch die Verwendung zusätzlicher spektraler Informationen redu- ziert werden. Das heißt, zur Quantifizierung wird anstelle eines Datenpunktes eine Serie von Datenpunkten verwen- det. In diesem sogenannten überbestimmten System wird eine Kurvenanpassung der Standardspektren an die gemes- senen Absorptionswerte zur quantitativen Bestimmung genutzt 5,6 . Abbildung 14 zeigt das Spektrum des Zweikom- ponentengemisches aus Abbildung 13 mit einem statistische Fehler von 10 % an jedem Meßpunkt.

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie

Wahr Gemessen Absorption [AU]
Wahr
Gemessen
Absorption [AU]

Wellenlänge [nm]

Abbildung 14 Spektrum einer Zweikomponentenmischung mit 10 % statistischem Fehler bei jeder Wellen länge

Bei 21 Datenpunkten (2-nm-Intervalle im Bereich 200240 nm) wird nach Anpassung mit der Methode der kleinsten Fehlerquadrate ein Fehler von < 1 % ermittelt. Der Fehler bei üblichen Messungen bei zwei Wellenlängen betrug etwa 100 %, siehe Tabelle 3.

Tabelle 3

Vergleich der Ergebnisse von Mehrkomponentenanalysen aus der Lösung eines simultanen Gleichungssystems und der Methode der kleinsten Fehlerquadrate

Verwendung von 210 und 230 nm

Verwendung des Berei- ches von 200240 nm

 

Nominale

Berechnete Kon-

Fehler

Berechnete

Fehler

Substanz

Konzentration

zentration

in %

Konzentration

in %

x

1

0,0

- 10 %

1,003

+ 0,3 %

y

1

1,98

+ 10 %

0,995

- 0,5 %

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie

Mit dieser Methode wird die Vermessung von komplexeren Mischungen sowie von Mischungen von Substanzen ähnli- cher Spektren möglich.

Die Restwerte der Berechnung nach der Methode der klein- sten Fehlerquadrate sind ein guter Indikator der Qualität der Anpassung der Standardspektren an die Probenspek- tren und damit auch ein guter Indikator für die Qualität der Quantifizierung.

Als Beispiel einer Mehrkomponentenanalyse wird die Quan- tifizierung von fünf Hämoglobinen aus Blut mit minimaler Probenvorbereitung gezeigt. 7 Abbildung 15 zeigt die Absorptionsspektren von Hämoglobinderivaten. Dieselbe Analyse wurde zuvor mit unterschiedlichen Methoden durchgeführt, darunter Spektroskopie und Titration.

Sulfhämoglobin Oxyhämoglobin Carboxyhämoglobin Hämoglobin (pH 7,0–7,4) Deoxyhämoglobin Absorption [AU]
Sulfhämoglobin
Oxyhämoglobin
Carboxyhämoglobin
Hämoglobin (pH 7,0–7,4)
Deoxyhämoglobin
Absorption [AU]

Wellenlänge [nm]

Abbildung 15 Absorptionsspektren verschiedener Hämoglobinderivate

Andere Methoden

Weitere statistische Methoden in der Mehrkomponenten- analyse umfassen Berechnung der Partiell kleinsten Qua- drate (PLS), Analyse der Einzelbeiträge (PCR) und Mehrfache kleinste Fehlerquadrate (MLS).

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie

Theoretisch bieten diese Methoden einige Vorteile gegen- über den oben beschriebenen Methoden, in der Praxis führt dies jedoch zu einer weitaus komplexeren Kalibrierungs- prozedur.

Probenbeschaffenheit

Anforderungen an das Meßgerät

Die einfachen gekoppelten Gleichungssysteme und die Methode der kleinsten Fehlerquadrate liefern nur dann exakte Ergebnisse, wenn die Kalibrierung mit reinen Stan- dardlösungen oder Standardmischungen für jede Substanz in der Probe durchgeführt wird, die einen Beitrag zum UV-Spektrum liefert. Die unbekannte Probe darf nicht über eine weitere absorbierende Verbindung verfügen.

Die Quantifizierung von Einzelsubstanzen wird normaler- weise durchgeführt, indem auf einem Gerät ein oder meh- rere Standards, gefolgt von der eigentlichen Probe, vermessen werden. Diese Kalibrierung dient der Eliminie- rung instrumentell bedingter Fehler, wodurch die absolute Wellenlängen- und photometrische Genauigkeit an Bedeu- tung verlieren. Auf der anderen Seite ist die photometrische Reproduzierbarkeit zur Erzielung präziser Ergebnisse essentiell. Wenn Messungen nur beim Absorptionsmaxi- mum ausgeführt werden, ist die Wellenlängenreproduzier- barkeit von geringer Bedeutung, weil die Abweichungen in der Absorption dort gering sind. Wenn jedoch eine Wellen- länge auf einer Flanke genutzt wird, ist die Wellenlängenre- produzierbarkeit entscheidend. Schließlich ist das Linearitätsverhalten des Gerätes kritisch, weil die Kalibrie- rung Linearität voraussetzt.

Genaue Analysen von Mehrkomponentenmischungen erfor- dern ein hervorragendes Signal-Rausch-Verhältnis, beson- ders wenn die Quantifizierung mit gekoppelten Gleichungen erfolgt. Bei Verwendung der Methode der kleinsten Fehler- quadrate, werden Daten von den Flanken der Absorptions- banden in der Rechnung berücksichtigt, so daß auch hier eine hervorragende Wellenlängenreproduzierbarkeit erfor- derlich ist. Darüberhinaus sind schnelle Scanvorgänge erforderlich, da mehr Daten erfaßt werden

28

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie

Indirekte Quantifi- zierung

Chemische Derivatisie- rung

Spektralphoto-

metrische Titrationen

Untersuchung von En- zymkinetiken

Viele Substanzen zeigen entweder nur schwache oder keine Absorption im UV oder im sichtbaren Bereich. Hier kann eine chemische Derivatisierung durchgeführt werden, wofür bereits viele Methoden entwickelt wurden. Hierbei werden organische Reagenzien eingesetzt, die mit der Ana- lysensubstanz einen Komplex bilden, welcher eine starke Absorption aufweist. Die eigentliche Analyse erfolgt analog der direkten Messung. Bei dieser Methode kann die Wahl eines geeigneten Derivatisierungsreagenzes sowohl die Empfindlichkeit, als auch die Selektivität erheblich verbes- sern.

Bei volumetrischen Analysen wird die Farbveränderung, die den Endpunkt einer Titration definiert, meistens durch Beobachten festgelegt. Eine Beurteilung ist sehr subjektiv und stellt damit eine Fehlerquelle dar. Der Einsatz eines Spektralphotometers zur Endpunkterkennung führt in diese Analysen die gewünschte Objektivität ein und ermöglicht die Automatisierung.

Die direkte UV-Vis Analyse einer Substanz in biologischen Matrizes, z. B. Blut oder Nahrungsmitteln, ist schwierig. Interferenzen durch andere Substanzen machen die direkte Messung einer Substanzeigenschaft, z.B. der Absorption, oft unmöglich. Die Abtrennung der interessierenden Substanz kann zeit- und kostenintensiv sein und ist in der Routinea- nalyse daher unpraktisch.

Hier können enzymatische Methoden zur indirekten Analy- tik einer Substanz oder Substanzgruppe aus einer komple- xen Matrix eingesetzt werden. Bei sorgfältiger Wahl eines Enzyms kann jede Änderung nach Hinzufügen des Enzyms auf die spezifische Reaktion zwischen der Substanz bzw.

Grundlagen und Anwendungen der UV-Vis-Spektroskopie

Substanzgruppe mit dem Enzym zurückgeführt werden. Diese Selektivität bildet die Grundlage von Enzymmetho- den.

Enzymatische Methoden können grob in zwei Gruppen ein- geteilt werden: Die Bestimmung von Reaktionsraten und Endpunktbestimmungen. Die Reaktionsgeschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion hängt von vielen Faktoren ab, darunter Temperatur, pH, Enzymaktivität, Enzym- und Substratkonzentration. Wenn alle Parameter auf einem kon- stanten Level gehalten werden können, ist die Reaktionsge- schwindigkeit der Substratkonzentration direkt proportional. In Endpunktbestimmungen werden die Bedin- gungen so gewählt, daß die Konvertierung von Substrat zu Produkt innerhalb einer bestimmten Zeit abgeschlossen ist (ca. 520 min). Die Differenz aus ursprünglicher und späte- rer Absorption ist dann der Substratmenge direkt proportio- nal.

Kapitel 2

Kapitel 2

Apparative

Aspekte

Apparative Aspekte

Im Idealfall liefern analytische Geräte stets korrekte

Messungen chemischer oder physikochemischer Para-

meter. In der Praxis treten, wie überall, Meßfehler

auf. In diesem Kapitel werden die Grundkomponenten

eines Spektralphotometers sowie verschiedene Konfi-

gurationen vorgestellt. Die wichtigsten apparativen

Parameter und ihre Bedeutung bei Messungen werden

diskutiert.

Gerätedesign

Komponenten Ein Spektralphotometer ist ein Gerät zur Messung der Transmission oder der Absorption einer Probe als Funktion der Wellenlänge elektromagnetischer Strahlung. Es besteht aus folgenden Grundkomponenten: 8

Eine Lichtquelle zur Erzeugung breitbandiger elektroma- gnetischer Strahlung

Ein Dispersionselement, das aus der breitbandigen Strahlung eine bestimmte Wellenlänge (oder richtiger ein Wellenband) auswählt

Eine Probenzone

Ein oder mehrere Detektoren zur Messung von Strahlung

32

Apparative Aspekte

Weitere optische Bauteile, wie z. B. Linsen oder Spiegel, lei- ten das Licht durch das Meßgerät.

Lichtquellen

Wellenlänge [nm] Strahlungsintensität
Wellenlänge [nm]
Strahlungsintensität

Abbildung 16 Intensitätsspektrum der Deuteri- umbogenlampe

Strahlungsintensität
Strahlungsintensität

Wellenlänge [nm]

Abbildung 17 Intensitätsspektrum der Wolfram- halogenlampe

Die ideale Lichtquelle emittiert eine konstante Intensität über alle Wellenlängen bei geringem Rauschen und hoher Langzeitstabilität. Eine Lichtquelle mit diesen idealen Eigenschaften existiert nicht. In der UV-Vis-Spektroskopie werden normalerweise folgende zwei Lichtquellen verwen- det:

Die erste Lichtquelle ist die Deuteriumbogenlampe mit einer guten kontinuierlichen Intensität im UV- und einer

ausreichenden Intensität im sichtbaren Bereich (siehe Abbildung 16). Obwohl moderne Deuteriumbogenlampen nur geringes Rauschen produzieren, ist das Lampenrau- schen meist der limitierende Faktor für die Leistungsfähig- keit von Geräten hinsichtlich Rauschen. Im Laufe der Zeit nimmt die Intensität einer Deuteriumbogenlampe stetig ab. Eine solche Lampe hat eine Halbwertzeit (die Zeit, die ver- geht, bis die Lampe nur noch die halbe ursprüngliche Inten- sität aufweist) von ca. 1000h.

Die zweite Lichtquelle ist die Wolframhalogenlampe (siehe Abbildung 17) mit guter Intensität über Teile des UV-Spek- trums und im gesamten sichtbaren Bereich. Dieser Lampen- typ weist sehr geringes Rauschen bei geringer Drift auf und

verfügt über eine nutzbare Lebensdauer von 10000h.

Die meisten Spektralphotometer nutzen für Messungen im UV und sichtbaren Bereich beide Lampentypen. Dabei wird entweder zwischen beiden Lichtquellen umgeschaltet oder das Licht beider Lichtquellen so gemischt, daß eine breit- bandige Lichtquelle entsteht.

Strahlungsintensität
Strahlungsintensität

Wellenlänge [nm]

Abbildung 18 Intensitätsspektrum der Xenonlam- pe

Monochromatoren

(a) Prisma

(a) Prisma (b) Gitter Erster ordnung Zweiter Ordnung

(b) Gitter

(a) Prisma (b) Gitter Erster ordnung Zweiter Ordnung

Erster ordnung Zweiter Ordnung

Abbildung 19 Dispersionselemente

Apparative Aspekte

Eine weitere Lichtquelle ist die Xenonlampe (Abbildung 18) mit einem guten Kontinuum über den gesamten UV und sichtbaren Bereich. Da die gegenwärtig verfügbaren Xenon- lampen ein weit höheres Rauschen als Deuterium- oder Wolframlampen erzeugen, werden sie nur für Anwendungen eingesetzt, die primär eine hohe Intensität erfordern, wie z.B. für bestimmte Reflektionsmessungen mit diffuser Strahlung.

Dispersionselemente spalten die verschiedenen Wellenlän- gen des Lichtes winkelabhängig auf. In Kombination mit einem Austrittsspalt dienen sie zur Auswahl einer bestimm- ten Wellenlänge bzw. eines schmalen Wellenbandes aus dem Lichtkontinuum der Quelle. In Spektralphotometern wer- den dazu häufig Prismen und holografische Gitter einge- setzt.

Ein Prisma kann aus dem Sonnenlicht alle Regenbogenfar-

ben erzeugen. Dasselbe Prinzip wird in Spektralphotome- tern genutzt. Prismen sind einfach und kostengünstig mit dem Nachteil, daß die Winkelabhängigkeit der Dispersion nichtlinear ist (siehe Abbildung 19a). Zusätzlich ist die Win- kelabhängigkeit temperaturabhängig.

Aus diesen Gründen werden in den meisten modernen Spektralphotometern holografische Gitter anstelle von Pris- men eingesetzt. Sie werden aus Glasrohlingen durch Eingra- vieren sehr schmaler Vertiefungen hergestellt. Ursprünglich wurde dies mechanisch durchgeführt, mit modernen Ver- fahren erfolgt dies in einem optisch-holografischen Prozeß. Die Dimensionen der Gravuren sind der aufzuspaltenden

34

Apparative Aspekte

Wellenlänge vergleichbar. Schließlich wird eine Aluminium- beschichtung für eine hohe Reflexion aufgebracht. Licht wird auf dem Gitter wellenlängenabhängig in unterschiedli- chen Winkeln reflektiert. Holografische Gitter zeigen eine lineare Winkelabhängigkeit der Wellenlängen und sind tem- peraturunabhängig. Sie reflektieren Licht allerdings in ver- schiedenen Ordnungen, die überlagern können (siehe Abbildung 19b). Daher werden Filter eingesetzt, damit nur Licht der gewünschten Reflexionsordnung den Detektor erreicht. Ein konkaves Gitter kann das Licht gleichzeitig aufspalten und fokussieren.

Ein Monochromator besteht aus einem Eintrittsspalt, einem Dispersionselement und einem Austrittsspalt. Im Idealfall tritt aus dem Austrittsspalt monochromatisches Licht aus. In der Realität tritt ein Wellenlängenband aus, das im günsti- gen Fall symmetrisch aufgebaut ist. Die Breite dieses Ban- des in halber Höhe wird spektrale Gerätebandbreite genannt (Instrumental Bandwidth, IBW).

Detektoren

Kathode Anode
Kathode
Anode

Abbildung 20 Die Photomultiplier-Röhre

Ein Detektor ist ein Gerät, das ein Lichtsignal in ein elektri- sches Signal konvertiert. Im Idealfall soll er eine lineare Response über einen weiten Bereich, niedriges Rauschen und hohe Empfindlichkeit aufweisen. Spektralphotometer verfügen als Detektor entweder über einen Photomultiplier oder über Photodioden.

Die Photomultiplierröhre (siehe Abbildung 20) kombiniert eine Signalumwandlung mit mehreren Verstärkungsstufen innerhalb der Röhre. Die natürlichen Eigenschaften des Kathodenmaterials bestimmen die spektrale Intensität. Ein Photomultiplier zeigt meist eine gute Empfindlichkeit im gesamten UV-Bereich. Solche Detektoren weisen eine hohe Empfindlichkeit bei niedrigen Lichtstärken auf. Bei Anwen- dungen der analytischen Chemie ist dagegen eine hohe Empfindlichkeit bei niedrigen Konzentrationen, also nied- rige Absorption bei hohen Lichtintensitäten erforderlich. Zur Detektion geringer Abweichungen zwischen Blank und

Apparative Aspekte

Probe muß ein Detektor daher bei hoher Intensität ein besonders niedriges Rauschen aufweisen.

In wachsendem Umfang werden Photodioden als Detekto- ren in Spektralphotometern eingesetzt (siehe Abbildung 21). Photodiodendetektoren haben einen größeren dynami- schen Bereich und sind als Festkörper weitaus robuster als ein Photomultiplier. In einer Photodiode trifft das Licht auf den Halbleiter und macht ihn leitfähig für Elektronen, wodurch ein der Diode parallel geschalteter Kondensator entladen wird. Die in festen Intervallen zur Nachladung des Kondensators erforderliche Ladungsmenge ist proportional zur eingefallenen Lichtintensität. Ältere Photodioden hatten eine nur geringe Empfindlichkeit im unteren UV-Bereich, aber dieser Nachteil ist in modernen Detektoren ausge- räumt. In Siliciumdetektoren liegen die Detektionsgrenzen zwischen 170 und 1100nm.

Metallkontakt Photon p-Schicht Innenzone n-Schicht Goldblock
Metallkontakt
Photon
p-Schicht
Innenzone
n-Schicht
Goldblock

Abbildung 21

Die Photodiode

Einige moderne Spektralphotometer enthalten anstelle eines einzelnen Detektors eine Diodenzeile. Eine Dioden- zeile (englisch Diode Array) besteht aus einer Reihe von

Apparative Aspekte

Photodiodendetektoren, die auf einem Siliciumkristall nebeneinander angeordnet sind. Jede Diode hat einen eige- nen Kondensator und ist über je einen Transistorschalter mit einem Ausgangskabel verbunden (siehe Abbildung 22). Die Transistorschalter werden dabei von einem Schiebere- gister gesteuert. Alle Kondensatoren sind zu Beginn defi- niert aufgeladen. Wenn Photonen in das Silicium eintreten, werden freie elektrische Ladungsträger erzeugt, die die Kondensatoren entladen. Alle Kondensatoren werden in regelmäßigen Intervallen neu geladen, wobei der erforderli- che Ladungsstrom für einen Scanzyklus das Maß für die Lichtintensität darstellt.

Licht

Photodiode Kondensator Schiebe- register Transistor schalter Videoanschluß
Photodiode
Kondensator
Schiebe-
register
Transistor
schalter
Videoanschluß

Auslesereihenfolge

Abbildung 22 Schematische Darstellung eines Diodenarrays

Die zur Nachladung eines Kondensators erforderliche Ladungsmenge ist proportional zur Anzahl der Photonen, die auf eine Diode trafen und damit zur Lichtintensität. Ein Absorptionsspektrum wird durch Messung der Lichtintensi- tät im gesamten Wellenlängenbereich erhalten. Ein Diodenarray besteht normalerweise aus 200 bis 1000 Ele- menten. Die genaue Zahl hängt vom Meßgerät und dem vor- gesehenen Einsatzzweck ab. So besteht z. B. der

Apparative Aspekte

Diodenarray des Spektralphotometers Agilent 8453 aus 1024 Elementen, die lichtempfindliche Fläche ist ca. 25 × 0,5 mm groß. Die Auslesezeit beträgt ca. 100ms und entspricht der Belichtungszeit.

Die Fertigungstechnik für Diodenarrays ähnelt der für hoch- integrierte Schaltungen. Diodenarrays haben komplexe Strukturen, sind aber, da es sich um Festkörperstrukturen handelt, sehr zuverlässig.

Optik

Das herkömmliche Spektralphotometer

Zur Streuung und Bündelung von Licht werden in Meßgerä- ten sowohl Linsen als auch konkave Spiegel eingesetzt. Lin- sen sind kostengünstige Bauteile mit dem Nachteil ihrer chromatischen Aberration. Darunter versteht man, daß Licht unterschiedlicher Wellenlängen nicht am gleichen Brennpunkt fokussiert wird. Durch sorgfältige Konstruk- tion und Kombination in ein optisches System kann die chromatische Aberration einzelner Linsen kompensiert werden und aus einfachen und kostengünstigen Bauteilen ein leistungsstarkes System aufgebaut werden.

Achromatische Linsen bestehen aus mehreren Linsen ver- schiedener Glassorten mit unterschiedlichen Refraktionsin- dices und sind weitgehend frei von chromatischer Aberration. Sie bieten eine hohe Leistungsfähigkeit, sind jedoch relativ teuer.

Konkave Spiegel sind in der Herstellung kostengünstiger als achromatische Linsen und weisen keine chromatische Aberration auf. Ihre Aluminiumoberfläche korrodiert aller- dings leicht, wodurch die Leistungsfähigkeit abnimmt.

Jede optische Oberfläche, einschließlich der Nahtstellen einer achromatischen Linse, führt durch Absorption und Reflexion zu einem 510 %igen Verlust der Lichtintensität. Spektralphotometer sollten aus diesem Grund mit einem Minimum optischer Oberflächen ausgestattet sein.

Abbildung 23 zeigt die Schemazeichnung eines herkömmli- chen Einstrahlphotometers. Polychromatisches Licht der

38

Apparative Aspekte

Lampe wird auf den Eintrittsspalt eines Monochromators fokussiert, der nur ein schmales Lichtband passieren läßt. Dieser Lichtstrahl passiert den Probenbereich und gelangt zum Detektor. Die Absorption einer Probe wird bestimmt, indem die Lichtintensität im Detektor mit und ohne Probe (Blank) gemessen und miteinander verglichen wird. Wie oben ausgeführt enthalten die meisten Spektralphotometer zwei Lampen als Lichtquellen, eine Deuterium- und eine Wolframlampe, und als Detektoren entweder einen Pho- tomultiplier oder, besonders modernere Geräte, Photo- dioden.

Probe Monochromator Detektor Austrittspalt Dispersions- Element Quelle Eintritts- spalt
Probe
Monochromator
Detektor
Austrittspalt
Dispersions-
Element
Quelle
Eintritts-
spalt

Abbildung 23 Schemazeichnung eines herkömmlichen Spektralphotometers

Diese Konstruktion ist zur Absorptionsmessung bei einer einzelnen Wellenlänge des Spektrums gut geeignet. Zur Ver- messung verschiedener Stoffe bei unterschiedlichen Wel- lenlänge oder zur Aufnahme von Spektren ist sie jedoch weniger geeignet. Zur Durchführung solcher Aufgaben mit einem herkömmlichen Spektralphotometer müssen Teile des Monochromators gedreht werden. Die erforderliche Mechanik reduziert die Reproduzierbarkeit und die fortlau- fende Datenaufnahme ist langsam.

Das Diodenarray- Spektralphotometer

Apparative Aspekte

In Abbildung 24 ist eine Schemazeichnung eines Diodenar- ray-Spektralphotometers dargestellt. Das polychromati- sche Licht aus der Quelle wird durch den Probenbereich geleitet und im Eintrittsspalt eines Polychromators fokus- siert. Der Polychromator spaltet den Lichtstrahl auf und lei- tet ihn auf den Diodenarray. Dort mißt jede Diode die Intensität in einem bestimmten engen Band des Spektrums. Die Bandbreite des von einer Diode detektierten Lichtes hängt von den Dimensionen des Eintrittsspaltes und der Größe der Diode ab. Jede Diode hat diesselbe Funktion wie der Austrittsspalt eines Monochromators.

Diodenarray Dispersions-
Diodenarray
Dispersions-

Element

Polychromator

Diodenarray Dispersions- Element Polychromator Eintritts- Probe Quelle spalt

Eintritts-

Probe

Diodenarray Dispersions- Element Polychromator Eintritts- Probe Quelle spalt

Quelle

Diodenarray Dispersions- Element Polychromator Eintritts- Probe Quelle spalt

spalt

Abbildung 24 Schemazeichnung eines Diodenarray-Spektralphotometers

Der Polychromator (Eintrittsspalt und Dispersionselement) und der Diodenarray sind baulich in einer Einheit zusam- mengefaßt, die als Spektrograph bezeichnet wird. Aufgrund der Vertauschung der Anordnung von Probe und Dispersi- onselement im Vergleich zu einem konventionellen Gerät, wird diese Anordnung oft inverse Optik genannt.

Zur Minimierung möglicher photochemischer Reaktionen wird eine Blende (Shutter) eingesetzt, die eine Probe

40

Apparative Aspekte

solange vor dem Licht der Lampe schützt, bis eine Messung ausgeführt wird. Zur Messung wird die Blende automatisch geöffnet, so daß der Lichtstrahl durch die Probe auf den Diodenarray fällt. Der Intensitätsunterschied zwischen den Messungen mit und ohne Probe wird gemäß der Erläuterun- gen in Das herkömmliche Spektralphotometerauf Seite 38 gemessen. Ein Diodenarray-Spektralphotometer ist durch seinen Aufbau, der eine parallele Datenaufnahme und elek- tronisches Auslesen ermöglicht, sehr schnell; es weist eine hervorragende Wellenlängenreproduzierbarkeit und eine hohe Zuverlässigkeit auf.

Konfigurationen

Einstrahlgeräte

Kommerziell sind unterschiedliche Konfigurationen von Spektralphotometern, jeweils mit spezifischen Vor- und Nachteilen erhältlich.

Sowohl herkömmliche als auch Diodenarray-Spektralphoto- meter werden als Einstrahlgeräte gebaut. Einstrahlgeräte sind kostengünstig; das einfachere optische System mit geringen Intensitätsverlusten liefert eine hohe Empfindlich- keit. Referenzspektralphotometer, die von Normungsinsti- tuten, wie z. B. dem National Institute of Standards and Technology (NIST) in den USA oder dem National Physical Laboratory (NPL) in Großbritannien eingesetzt werden, sind Einstrahlgeräte.

Besonders Diodenarray-Spektralphotometer sind für die Einstrahlauslegung gut geeignet, weil Spektren sehr schnell erfaßt werden und das Zeitintervall zwischen der Vermes- sung von Blank und Probe sehr kurz ist. Zusätzlich können interne Referenzmessungen vorgesehen werden, um die Folgen einer Lampendrift zu reduzieren (siehe Interne Referenzauf Seite 76).

In Abbildung 25 ist das optische System eines modernen Diodenarray-Spektralphotometers, dem Agilent 8453, darge- stellt. Die Einstrahlauslegung sorgt für eine minimale Zahl optischer Komponenten mit einer hervorragenden Durch- lässigkeit. Der Diodenarray mit 1024 Elementen ermöglicht

Apparative Aspekte

die Messung im Wellenlängenbereich von 190 bis 1100nm bei guter Auflösung.

Blende Linse Wolfram- lampe Probe Deuterium- Linse lampe Spalt Gitter 1024-Element- Diodenarray
Blende
Linse
Wolfram-
lampe
Probe
Deuterium-
Linse
lampe
Spalt
Gitter
1024-Element-
Diodenarray

Abbildung 25 Aufbau der Optik im Diodenarray-Spektralphotometer Agilent 8453

Zweistrahlgeräte

In einem konventionellen Einstrahlspektralphotometer werden Probe und Blank bei einer Wellenlänge nacheinan- der mit einigen Sekunden Verzögerung gemessen. Die Ver- zögerung bei der Aufnahme eines Spektrums kann mehrere Minuten betragen. Während dieser langen Zeitintervalle kann die Lampendrift zu erheblichen Fehlern führen.

Zweistrahl-Spektralphotometer wurden zur Kompensation dieser Intensitätsänderungen der Lampe zwischen Blank- und Probenmessungen entwickelt. In dieser Konfiguration wird in der Nähe der Lichtquelle ein Chopper im Lichtweg angeordnet, der zwischen Proben- und Referenzlichtweg umschaltet. Er dreht sich mit einer solchen Geschwindig- keit, daß mehrmals pro Sekunde zwischen Blank- und Pro- bemessung umgeschaltet wird. Damit können mittel- und langfristige Schwankungen der Lampenintensität (Drift) kompensiert werden.

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Apparative Aspekte

In Abbildung 26 ist eine Schemazeichnung eines Zweistrahl- spektralphotometers dargestellt. Im Vergleich mit Einstrahl- geräten weisen Zweistrahlgeräte mehr optische Komponenten auf, die den Lichtdurchsatz und die Empfind- lichkeit reduzieren. Zur Erzielung hoher Empfindlichkeit sind daher lange Meßzeiten erforderlich. Zusätzlich kann der kompliziertere mechanische Aufbau zu einer geringeren Zuverlässigkeit führen.

Monochromator Austritts- spalt Referenz Dispersive Einheit Eintritts- Chopper Quelle Detektor spalt Probe
Monochromator
Austritts-
spalt
Referenz
Dispersive
Einheit
Eintritts- Chopper
Quelle
Detektor
spalt
Probe

Abbildung 26 Optisches System eines Zweistrahl-Spektralphotometers

Bisher war die höhere Driftstabilität der Zweistrahlgeräte ein Hauptfaktor für die Konstruktion solcher Hochlei- stungs-Spektralphotometern. Die neuesten Fortschritte in der Konstruktion von Lampen und Elektronik konnten die Driftstabilität von Einstrahlgeräten steigern und führten zu einer Wiederentdeckung dieser Konstruktion. Einstrahlge- räte bieten eine höhere Empfindlichkeit und eine leichtere Bedienung, wobei die Drift normalerweise nur noch um einen Faktor zwei schlechter ist, als bei Zweistrahlgeräten.

Das erste kommerziell erhältliche Diodenarray-Spektralp- hotometer, das HP 8450A war ein Mehrstrahlgerät (siehe Abbildung 27). Ein Strahlenleiter wurde zur wechselweisen

Apparative Aspekte

Ausrichtung des Strahls in eine Referenz und vier Proben- positionen verwendet, aus Gründen der Übersichtlichkeit
Ausrichtung des Strahls in eine Referenz und vier Proben-
positionen verwendet, aus Gründen der Übersichtlichkeit
ist in der Abbildung nur eine eingezeichnet.
Lampe, sichtbares Licht
Umlenk-
Referenzkü- spiegel
UV-Lampe
vette
Elliptischer
Umlenk-
spiegel
spiegel
Oberer Strahl-
Elliptische-
leitspiegel
UV
Spiegel
Proben-
küvette
Sichtbar
Umlenk-
spiegel
Spektrograph-
Holographisches
spalt und
Unterer Strahl-
Gitter
Diodenarrays
leitspiegel
und Unterer Strahl- Gitter Diodenarrays leitspiegel Abbildung 27 Optisches System des

Abbildung 27 Optisches System des Diodenarray-Spektralphotometers HP 8450A

Design mit Strahlteiler Spektralphotometer mit einem Strahlteiler (siehe Abbildung 28) ähneln dem Zweistrahlphotometer, wobei anstelle des Choppers ein Strahlteiler eingesetzt wird, der das Licht simultan durch Blank und Probe auf zwei identische Detek- toren leitet. Diese Konstruktion erlaubt die zeitgleiche Ver- messung von Blank und Probe. Obwohl die Konstruktion mit Strahlenteiler einfacher als bei echtenZweistrahlgerä- ten ist und weniger optische Baugruppen erforderlich sind, wird durch die Verwendung zweier unabhängiger Detekto- ren eine neue potentielle Quelle für Drift eingeführt.

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Apparative Aspekte

Monochromator Austritts- spalt Dispersions- Referenz Detektor element Eintritts- Quelle spalt Probe Detektor
Monochromator
Austritts-
spalt
Dispersions-
Referenz
Detektor
element
Eintritts-
Quelle
spalt
Probe
Detektor

Abbildung 28 Optisches System eines Spektralphotometers mit Strahlteiler

Mit dieser Konstruktion kann eine hohe Stabilität erreicht werden. Aufgrund der zwei Detektoren ist sie im Vergleich zu einem Zweistrahlgerät jedoch schlechter, da jeder Detek- tor unabhängig driften kann. Das Rauschen ist gering, jedoch größer als bei einem Einstrahlgerät, da der Strahl aufgeteilt wird und weniger als 100% der Lichtintensität die Probe passieren.

Dual-Wellenlängen Design

Messung eines Spek- trums

Zweiwellenlängen-Spektralphotometer ermöglichen die simultane Messung bei zwei Wellenlängen, wobei z. B. gleichzeitig zwei Reaktionen in Lösung verfolgt werden können. Der Monochromator enthält zwei Dispersionsele- mente (er wird damit zum Duochromator), dessen Ausgang in einem einzigen Lichtstrahl vereinigt wird. Solch kom- plexe Meßgeräte sind normalerweise sehr viel kostspieliger als herkömmliche Spektralphotometer und wurden fast vollständig von Diodenarray-Spektralphotometer ersetzt, die echte Multi-Wellenlängegeräte darstellen.

Die quantitative Interaktion einer Probe mit Strahlung wird durch die Messung der ursprünglichen Intensität ohne

Apparative Aspekte

Probe und der Intensität hinter der Probe bestimmt und zwar sowohl in Transmission als auch in Absorption. Diese Intensitäten werden in den Gleichungen Transmission und Absorptionauf Seite 6 I o und I genannt.

In der UV-Vis-Spektroskopie werden die meisten Proben in Lösung vermessen. Dabei ist ein Blank in einer Küvette zu messen, die nur das reine Lösungsmittel enthält, das auch für die Probenzubereitung verwendet wurde.

In Einstrahlgeräten wird die Küvette mit dem Lösungsmittel ins Spektralphotometer eingesetzt und ein Blank gemessen. Die Probenlösung wird danach in derselben Küvette ver- messen. Moderne Meßgeräte speichern dabei die I o Refe- renzwerte automatisch, die zur Berechnung des Absorptionswertes der Probe benötigt werden.

In Zweistrahlgeräten oder solchen mit Strahlenteiler wer- den zwei Küvetten eingesetzt. Beide Küvetten werden zunächst mit reinem Lösungsmittel befüllt und eine soge- nannte Balance-Messung durchgeführt. Mit dieser Messung wird der Absorptionsunterschied in den beiden Lichtwegen ermittelt. Die Probenküvette wird dann mit Probenlösung befüllt und I o und I werden praktisch gleichzeitig gemessen. Das dabei gewonnene Spektrum wird dann mit dem Balance-Spektrum korrigiert.

Grundparameter der Meßgeräte

Spektrale Auflösung

In diesem Abschnitt werden wir einige Geräteparameter diskutieren, die sich auf Genauigkeit und Präzision der gemessenen Absorptionswerte auswirken (in Anhang A fin- den Sie die Definitionen von Richtigkeit und Präzision). Fehlerquellen aus dem Bereich der Probenhandhabung wer- den in Kapitel 3 Probenhandhabung und Messungbespro- chen.

Die Spektrale Auflösung ist das Maß für die Fähigkeit des Meßgerätes zwischen zwei benachbarten Wellenlängen zu unterscheiden. Zwei Wellenlängen werden normalerweise

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Apparative Aspekte

dann als aufgelöst bezeichnet, wenn das Minimum zwischen zwei Peaks im Ausgangssignal des Detektors weniger als 80% des Maximalwertes beträgt. Diese Bedingung ist unter der Bezeichnung Rayleigh-Kriterium bekannt. In Abbildung 29 wird schematisch dargestellt, wie sich zwei eng benach- barte Emissionslinien im Geräteeingang und der Signalaus- gang des Detektors unterscheiden.

Detektor-

Intensität ausgangssignal Wellenlänge Wellenlänge
Intensität
ausgangssignal
Wellenlänge
Wellenlänge

Abbildung 29 Zur Definition der spektralen Auflösung