PRUEBA DE COOMBS OBJETIVO.

Demostrar la presencia de anticuerpos hemoagrupadores absorbidos a las clulas rojas en vivo (prueba directa), adems de la presencia de anticuerpos absorbidos invitro. FUNDAMENTO. Se basa en el principio de los ateroanticuerpos contra componentes del suero humano segn la descrita por Mareschi y los principios de la aglutinacin publicados por Landsteiner. Los eritrocitos humanos en presencia de un anticuerpos dirigido contra un antgeno que posean, pueden ser sensibilizadas para no lograr la aglutinacin por la naturaleza misma del anticuerpo o el antgeno en cuestin. El suero antihumano, reaccionar contra la gamma globulina que han sensibilizado a componentes del complemente humano y propiciar la aglutinacin de los eritrocitos. INTRODUCCIN. Marechi en 1908 escribi el principio de la reaccin de antiglobulina. Fue hasta 1945, cuando se us como prueba inmonohematolgica por Coombs, Maurant y Race detectan anticuerpos anti Rh. En 1957 Dacie y colaboradores definieron la reaccin del suero de antiglobulina con componentes de complemento humano. El suero anti-humano, llamado suero de Coombs se prepara por medio de inyecciones repetidas a los animales con sueros humanos mezclados del grupo 0, despus de eliminar hemolisinas y aglutinas no especficas se agrega al suero cido de sodio al 0.1% como conservador. El suero deber mantenerse entre 2 y 8C mientras no est en uso, para evitar su desnaturalizacin y contaminacin. Como lo dice su nombre, esta prueba permite establecer la presencia de globulinas; pero puesto que los anticuerpos son globulinas, permite encontrarlas tambin. Los anticuerpos incompletos, entre ellos muchos de los que explican la eritroblastosis fetal y la anemia hemoltica adquirida, se absorben sobre la superficie de los eritrocitos, pero no los aglutinan. El suero antiglobulina humana (de Coombs) permite reconocer estos glbulos rojos sensibilizados al combinarse con los anticuerpos globulinicos que ya cubren su superficie, con lo cual se produce la aglutinacin. Puesto que el suero contiene globulinas que neutralizan muy rpidamente los anticuerpos antigobulinas humanas (de Coombs), es evidente que para identificar los glbulos sensibilizados es absolutamente necesario remover la totalidad del suero de los glbulos mediante lavados repetidos (tres cuando menos) con grandes volmenes (50 a 100 veces el volumen de los glbulos rojos) de suero fisiolgico estril.

El suero de Coombs, es un auxiliar en el diagnstico por lo que que se usa rutinariamente en las siguientes pruebas: 1. Prueba de compatibilidad o pruebas cruzadas. 2. Deteccin e identificacin de anticuerpos. 3. Prueba para la variante del antgeno Rh-D llamada Du. 4. Pruebas de eritrocitos en cordn umblical a pacientes transfundidos (Coombs directo). MATERIAL 1. Gradilla metlica 2. Tubos de Khan (13 x 75mm). 3. Tubos de hemlisis 4. Pipeta Pasteur con bulbo 5. Cronmetro 6. Termmetro de 10C a +110C 7. Torundas con alcohol 8. Lanceta desechable APARATOS 1. Centrfuga 2. Bao mara elctrico MUESTRA 1. Sangre completa 2. Suero PRUEBA DE COOMBS DIRECTA: La prueba directa de Coombs se usa para demostrar la presencia de los anticuerpos que han fijado en las clulas del paciente in vivo, por ejemplo en la enfermedad hemoltica del recin nacido, en la anemia hemoltica adquirida, etc. PROCEDIMIENTO 1. 2. Preparar una suspensin al 2% en solucin salina normal de las clulas probadas. Agregue dos gotas de la suspencin de las clulas preparadas a un tubo de 13 x 75mm.

3. Lavar con solucin salina y centrifuge a 3500 r.p.m. durante 1 minuto. Efecte este lavado tres veces. 4. 5. 6. Despus del ltimo lavado, decante lo ms posible. Agregue dos gotas de suero anti-humano Mezcle bien y centrifugue por 1 minuto a 1500 r.p.m. por 15 segundos.

7.

Resuspenda los eritrocitos de los tubos y examine el resultado.

INTERPRETACIN La aglutinacin de los eritrocitos del paciente, por el anti-humano, indica que estos se encontraban sensibilizados por anticuerpos. PRUEBA INDIRECTA DE COOMBS: La prueba indirecta de Coombs es utilizada para demostrar la presencia de los anticuerpos circulares que cubren, pero que no aglutinan, a las clulas suspendidas en salina. Se efecta esta prueba combinando invitro a un anticuerpo con antgeno especfico. Ejemplo, cuando se hace una prueba anti-D en un suero materno, las clulas de la prueba debern contener el antgeno D. PROCEDIMIENTO 1. Prepare una suspensin al 2% en solucin salina normal de las clulas seleccionadas para la prueba. 2. 3. 4. Agregue dos gotas del suero que va a probarse a un tubo de Khan. Agregue dos gotas de la suspensin de las clulas preparadas, al tubo Khan Agregue dos gotas de albmina bovina solucin al 22% al tubo

5. Incube en un bao mara a 37C por 15 minutos. (la incubacin puede prolongarse hasta 60 minutos si se desea). 6. Saque el tubo del bao mara, llnela con solucin salina fresca, centrifugue a 3500 r.p.m. durante 1 minuto y decante. Lvese tres veces. 7. 8. 9. Despus del ltimo lavado, decante lo ms posible. Agregue dos gotas de suero Anti-humano y mezcle bien. Centrifugue por 1 minuto a 1500r.p.m. durante 15 segundos.

10. Resuspenda los eritrocitos con una agitacin moderada y examine el resultado CONTROLES POSITIVOS Y NEGATIVOS PARA LA PRUEBA ANTIGLOBULINA (COOMBS) 1. Preparese suspensiones al 2% de sangre conocidas como Rh positivas y Rh negativas, en solucin salina. (las muestras de sangre debern ser de personas normales y sanas cuyas clulas den una reaccin negativa en la prueba directa de Coombs).

2. Diluya el suero Anti-D (anti-Rho) con solucin salina a una proporcin a cada de los tubos de ensayo. 3. Coloque dos gotas de las suspensiones preparadas a los tubos de ensaye identificados adecuadamente. 4. Incube a 37C por 15 minutos. Durante este tiempo, las clulas Rh negativas permanecern sin cubrirse y servirn como el control negativo. 5. Saque los tubos del bao mara. Llene los tubos con solucin salina fresca y centrifugue a alta velocidad. Repita el procedimiento por 3 veces. Decante completamente el sobrenadante despus del ltimo lavado dejando las clulas depositadas en el fondo de los tubos 6. Agregue dos gotas de suero anti-humano en cada tubo y agtelo bin; centrifugue a 3500r.p.m. durante 15 segundos. 7. Resuspenda el depsito celular mediante ligera agitacin y examine el resultado.

8. Las clulas Rh positivas estarn aglutinadas mientras que ls clulas Rh negativas permanecern sin aglutinarse.