REGLAMENTO INTERNO DE HIGIENE Y SEGURIDAD DEL LABORATORIO DE BIOLOGA MOLECULAR DE LA CLULA II ART.

1 La observancia del presente reglamento es obligatoria para el personal acadmico, alumnos y personal administrativo que labora en el laboratorio de Biologa Molecular de la Clula II. Este reglamento deber darse a conocer a cada uno de los integrantes. ART 2 Se deber conocer el sistema de alertamiento, las zonas de seguridad, las rutas de evacuacin y las medidas de seguridad establecidas en el laboratorio. ART. 3 Mientras se est en el laboratorio es obligatorio el uso de bata. Usar guantes y lentes de proteccin cuando maneje material txico por contacto, radioactivo o contaminado infeccioso. ART. 4 Mientras se est en el laboratorio, queda estrictamente prohibido fumar, beber, comer, aplicarse cosmticos y el uso de celulares. ART. 5 Queda prohibido sentarse en las mesas de trabajo. ART. 6 Se debern conservar limpias y ordenadas las mesas de trabajo. ART. 7 Es obligacin del alumno revisar y contar perfectamente el material de cristalera que le sea entregado para la realizacin de la prctica as como revisar el buen funcionamiento de los aparatos elctricos. Lo mismo aplica para la devolucin del material. Cualquier anomala presentada del material o los equipos debida al mal uso de ste (prdida, rotura o descompostura) ser responsabilidad del alumno. ART. 8 Se deber evitar pipetear lquidos con la boca. Tambin se deber evitar dejar las pipetas dentro de los frascos de reactivos y / o soluciones. ART. 9 Es deber del alumno consultar con el profesor que imparte la prctica, cualquier duda en el procedimiento y/o en el manejo del equipo. ART. 10 Es obligatorio que se sigan las recomendaciones del uso de aparatos e instrumentos de laboratorio, las cuales se les sern indicadas por el profesor que imparte la prctica. ART. 11 Es deber del profesor de la materia nombrar una comisin de seguridad, la cual estar encargada de vigilar el seguimiento de este reglamento as como de evitar dejar sin vigilancia el laboratorio durante el periodo que abarque la clase. ART. 12 Las personas a las quienes se le sorprenda haciendo mal uso de los equipos, materiales, instalaciones, etc. propios del laboratorio sern sancionados conforme a la Legislacin Universitaria segn la falta cometida.

NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO Conocer el sistema de alertamiento, zonas de seguridad, rutas de evacuacin y medidas de seguridad establecidas en el laboratorio. En caso de incendio: Ponerse a salvo. Activar el servicio de Bomberos de la UNAM, extensiones 20565 20566 o a la Central de Emergencias 55 (red digital UNAM). Dar aviso. En caso de presentarse un lesionado grave: Activar de inmediato al Servicio Mdico de Urgencias, extensiones 20202, 20140 o marcar la Red de Emergencias 55. Regla del yo-yo. Primero mi seguridad. Al activar el servicio mdico de urgencias. Proporcionar la ubicacin. Dar referencias de vas de acceso. Mecanismo de lesin. Nmero de lesionados. Solicitar apoyo a Bomberos, vigilancia, etc. Mantener el rea de trabajo, el equipo y los aparatos tan limpios como sea posible. Se deber trabajar con bata obligatoria. Mientras se est en el laboratorio queda prohibido comer, beber y fumar. No arrojar a los desages o lavaderos residuos slidos (grasa, papel, cerillos, etc.), depositarlos en los botes de basura. Para desechar cidos fuertes y otras sustancias corrosivas, abrir primero la llave del agua hasta tener un flujo conveniente para diluir y arrastrar la sustancia y vaciar lentamente el material que se desee eliminar. No arrojar a la tubera de desage varias sustancias simultneas ya que podrn reaccionar entre s, hgalo de una en una, dejando correr el agua para espaciarlos. Muchos productos qumicos son peligrosos porque son txicos o inflamables por lo que antes de iniciar un experimento, se debe revisar las etiquetas de los reactivos que se van a emplear, en busca de cualquier advertencia de peligro, prestando especial atencin a las precauciones indicadas para su manejo. Nunca dejar sustancias sin identificar con una etiqueta, y si se trata de reactivos preparados, anotar tambin la fecha de su preparacin. Utilizar una esptula cuando manipulemos sustancias slidas para evitar el contacto con la piel y no las llevemos a la boca en ningn momento.

 Para percibir el olor de un material, no acercarlo directamente a la nariz, hay que aproximar los vapores a la cara soplando con la mano sobre la boca del recipiente que se mantendr a unos 20 cm de distancia. Cuando mida lquidos peligrosos, utilizar una probeta, pero si se requiere de mayor precisin, colocar el lquido dentro, de un recipiente estrecho (probeta) y llenar la pipeta por inmersin o utilizando una pera de hule. Nunca pipetear lquidos con la boca, sino usando propipetas. Para cada reactivo utilizar una pipeta diferente y de ser posible enjuagarla con agua inmediatamente despus de terminar de usarla. Cuidar el no derramar en las mesas cidos o lcalis fuertes, pero si esto ocurre, limpiar y enjuagar bien con agua tanto la mesa como el exterior de los frascos. El mismo cuidado debe tenerse cuando se trabaje con solventes voltiles ya que la mayora son inflamables. Cuando se trabaje con vapores irritantes, txicos o inflamables utilizar la campana de extraccin. No mantener el mechero encendido al trabajar con sustancias inflamables como son el ter, alcohol, acetona, benceno, thiner, etc. Para preparar una disolucin de un cido o de una base concentrada y muy especialmente el cido sulfrico, vierta SIEMPRE EL CIDO SOBRE EL AGUA y nunca al revs, ya que el calor generado para la disolucin, puede hacer hervir el agua con la consecuente salpicadura del cido a la cara y manos de operador. Al calentar lquidos en tubos de ensaye no apunte la boca del mismo hacia ninguna persona ya que el lquido puede hervir violentamente y ser proyectado a gran distancia. La vidriera es frgil por lo que debe manejarse con cuidado. El material de medicin (probetas, buretas, pipetas o matraces aforados) no deben someterse a calentamiento. Si se necesita insertar un tapn de hule en un tubo de vidrio o un termmetro, lubrquelo con unas gotas de agua y haga girar el tubo dentro del tapn mientras lo va introduciendo (proteja su mano con un trapo). Todo producto qumico aunque no lo sea, debe ser manejado como si fuera txico. No dejar quemadores, mecheros, parrillas, lmparas. etc. encendidos sin que alguien que los atienda. Las manos y la ropa, as como el piso y los bancos del laboratorio debern estar secos cuando se utilicen aparatos elctricos. Se deber consultar al profesor responsable para efectuar el desecho adecuado de sustancias como la acrilamida sin polimerizar, bromuro de etidio, ter, istopos

radiactivos o cualquier sustancia que sea considerada peligrosa. Todos los accidentes por inmediatamente al profesor. triviales que parezcan, deben comunicarse

FORMAS DE EXPRESAR LA CONCENTRACIN DE UNA SOLUCIN Una solucin es una mezcla en que dos o ms sustancias se han unido en una dispersin homognea. A la sustancia que se encuentra en mayor proporcin se le llama disolvente y soluto al compuesto que se encuentra en menor proporcin. La solubilidad de un soluto es la mxima cantidad que se disolver en una cantidad dada de disolvente a una temperatura especfica. Se pueden utilizar varias formas para expresar la concentracin de una solucin: UNIDADES FSICAS % p/p w/w, Porcentaje en masa: es la cantidad de soluto en gramos por cada 100 g de solucin. % v/v, Porcentaje volumen: es la cantidad de soluto en ml por cada 100 mL de solucin. % p/v w/v, Porcentaje en masa/volumen: es la cantidad de soluto en gramos por cada 100 ml de solucin. ppm, partes por milln: es igual a los miligramos de soluto en un Litro de solucin (mg/L). Densidad, expresa la cantidad de gramos del soluto por cada mililitro de solucin (g/mL). UNIDADES QUMICAS Molaridad (M): ___No. de moles de soluto___ volumen de la solucin (1L) Molalidad (m): _No. de moles de soluto_ peso del solvente (kg) Normalidad (N): ____No. de equivalentes____ Volumen de la solucin (1 L) El nmero de equivalentes es igual al peso molecular entre la valencia. La valencia es el nmero de iones H+ OH- sustituidos o sustituibles. Fraccin mol (X): No. de moles de soluto # de moles totales CLCULOS Y MEDIDAS DE UTILIDAD EN BIOQUMICA En el ao de 1960 la Conferencia General de Pesas y Medidas y la Oficina Internacional de Pesas y Medidas con sede en Pars, Francia acordaron crear el Sistema

Internacional de Pesas y Medidas (SIU o SI) con el objetivo de facilitar el intercambio de informacin cuantificable y universalizar su uso. El SI es bsicamente una versin ampliada del sistema mtrico decimal y consta de siete unidades bsicas independientes para cuantificar diferentes magnitudes fsicas. A continuacin se describen estas unidades, adems de los smbolos que se deben utilizar cuando se hace mencin a stas. Unidades bsicas del SI Magnitud fsica Longitud Masa Tiempo Corriente elctrica Temperatura Intensidad luminosa Cantidad de sustancia Nombre de la unidad metro kilogramo segundo amperio kelvin candela mol Smbolo m kg s A K cd mol

Muchas veces las unidades bsicas o derivadas pueden ser muy grandes o muy pequeas para representar una cantidad en particular. Para esos casos, el SI admite el uso de una serie de prefijos que permiten formar mltiplos o submltiplos decimales de las unidades del SI. Estos prefijos se muestran a continuacin: Prefijos utilizados en el SI Prefijo Ato Femto Pico Nano Micro Mili Centi Deci Factor 10-18 10-15 10-12 10-9 10-6 10-3 10-2 10-1 Smbolo a f p n m c d Prefijo Deca Hecto Kilo Mega Giga Tera Peta Exa Factor 101 102 103 106 109 1012 1015 1018 Smbolo Da h k M G T P E

Clculo y expresin de diluciones Una dilucin consiste en preparar una solucin menos concentrada a partir de una ms

concentrada. Las diluciones generalmente se expresan como una razn matemtica, por ejemplo 1:5 (o 1/5), 1:10 (o 1/10), etc. En el caso de una dilucin 1:5, sta expresa la cantidad, sea volumen o peso de una sustancia en un volumen total o final de la forma 1 volumen (o peso) en un volumen (o peso) total de 5 volmenes. Ntese que el volumen total o final estar compuesto de 1 volumen de la sustancia a diluir y 4 volmenes del disolvente. Para calcular la concentracin final de una solucin diluida, se multiplica la concentracin de la solucin original por la dilucin expresada como fraccin. Ejemplo: una solucin de urea cuya concentracin es de 5 mg/ml es diluida 1/10. La concentracin final de la solucin diluida es 5 x 1/10= 0.5 mg/ml. La ecuacin ms comnmente utilizada para preparar soluciones es: V1 x C1 = V2 x C2 donde, V1 es el volumen de la solucin concentrada que se debe aadir para preparar la solucin diluida C1 es la concentracin de la solucin concentrada. V2 es el volumen de la solucin diluida. C2 es la concentracin de la solucin diluida. Al utilizar esta ecuacin debe tomarse en cuenta que tanto las unidades de V1 y V2 as como las de C1 y C2 deben ser las mismas, preferiblemente ml y mol/l respectivamente. El factor de dilucin representa el nmero de veces que fue diluida la solucin concentrada. Si se hace una serie de diluciones, la concentracin de la solucin final se obtiene al multiplicar la concentracin original por el producto de los factores de dilucin. Ejemplo: si la solucin de glucosa a 45 mol/l del ejemplo anterior es primero diluida 1/9 y luego 1/100, la concentracin final de la solucin ser 45 X 1/9 X 1/100= 0.05 mol/l, con un factor de dilucin de 900. Las diluciones seriadas son tambin muy tiles. Estas diluciones son aquellas en las cuales todas las diluciones hechas a partir de la primera o luego de la primera poseen el mismo factor de dilucin. Ejercicios (para ser realizados por el estudiante en horas de estudio independiente) 1. Calcule las siguientes concentraciones: 10 M NaOH, diluido 1:20 = _____ M 2 M HCl, diluido 1:5 = _____ M 1000 mg/L glucosa, diluido 1:10 y luego 1:2 = _____ mg/L 250 ml de 5% NaCl contienen ____ g de NaCl Cunto CuSO4 5 H2O debe ser pesado para preparar 100 ml de CuSO4 al 5%? PM del CuSO4 . 5 H2O: 250 g/mol, PM del CuSO4 : 160 g/mol

 Qu porcentaje de CuSO4 . 5 H2O es agua? 2. Cuntos gramos de MgCl2 hay en 1 g de MgCl2. 3 H2O? PM del MgCl2. 3 H2O: 149 g/mol, PM del MgCl2: 95 g/mol 3. Cuntos mililitros de NaOH 0.4 M se necesitan para preparar 20 ml de una solucin 2M? 4. Qu porcentaje de Mg contiene el MgCl2. 3 H2O? 5. Cunto CuSO4. 5 H2O debe ser pesado para preparar 1 L de una solucin que contenga 80 mg de CuSO4? 6. El peso molecular de CaCO3 es 100 g/mol, cuntos gramos son necesarios para preparar?: 1 L de 0.1 M CaCO3? 50 mg/L de CaCO3? 7. Una solucin estndar de hemoglobina contiene 200 g/L. Cuntos ml deben usarse para preparar 6 ml de las siguientes concentraciones?: 200 g/L 150 g/L 100 g/L 50 g/L 8. La solucin salina normal tiene una concentracin de 0.85%. Cul es su molaridad? (PM NaCl : 58.5 g/mol) 9. Cuntos gramos de Na2HPO4 deben ser pesados para preparar 1 L de una solucin cuya concentracin es de 50 mg/ml? 10. Cul es la dilucin final de una muestra de suero en un tubo que contiene 200 l de suero, 500 l de solucin salina y 300 l de reactivo? 11. Cul es la concentracin en mol/l de una solucin que tiene 100 g de NaOH disueltos en 100 ml de agua? PM NaOH: 40 g/mol

CUESTIONARIO 1. Defina los siguientes terminos: Lpido compuesto Lpido derivado Ranciedad Jabn Secuestrante Micela Aceite secante Maragarina Esterol Lecitina Antioxidante Lpido Triacilglicerol Triacilglicerol simple Triacilglicerol mixto cido graso saturado cido graso insaturado 2.

Contraste las estructuras de la fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, fosfatildilcolina y la esfingomielina A qu subclase de fosfolpidos pertenece cada compuesto? Qu se sabe acerca del funcionamiento de los fosfolpidos? Qu es una cefalina? Cul es su funcin en el cuerpo? Los fosfolpidos son triacilgliceroles. Explique. considerablemente ms solubles en agua que los

3. 4. 5.

Dibuje la frmula del ncleo esteroidal y numere los tomos de carbono. De l nombre de tres compuestos que posean esta estructura y mencione sus funciones principales en el cuerpo. Cul es el fundamento de la prueba de Salkowski? Cul es el fundamento de la prueba de Liebermann-Burchard? PRCTICA I PROPIEDADES GENERALES DE LOS LPIDOS Introduccin

6. 7.

Los lpidos son un grupo de biomolculas que se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza. Desde el punto de vista qumico, son el grupo ms heterogneo y, de hecho, no responden a ninguna composicin general. Su caracterstica general es la apolaridad o hidrofobicidad, aunque dentro de ellos existen diferentes grados: desde lpidos totalmente apolares e insolubles en agua hasta los que tienen parte de su estructura altamente polar y son por ello, capaces de interactuar con el agua a travs de dicha zona.

Hablando desde un punto de vista general, los lpidos apolares cumplen funciones de almacn de energa metablica, lubricacin y proteccin, mientras que los polares tienen funciones estructurales, esto es, que participan en la composicin de las membranas biolgicas. Adems de stos, otros lpidos cumplen otras funciones ms especficas, como vitaminas, hormonas, etc. Debido a esa caracterstica fundamental, su grado de hidrofobicidad, los lpidos pueden extraerse de materiales que los contienen mediante disolventes orgnicos ms o menos apolares. Por otra parte como los procesos biolgicos en los que participan tienen lugar en medios acuosos, el cuerpo humano se vale a veces, de mecanismos que facilitan su transporte, como la construccin de lipoprotenas, o la utilizacin de emulsionantes (sales biliares) que facilitan el contacto con las enzimas que participan en la digestin. Acerca de alguno de estos puntos trata esta prctica. Numerosos productos naturales son ricos en lpidos. El aceite empleado normalmente en la alimentacin, sea de oliva, girasol, soya, etc., es una mezcla hidrofbica de triacilglicridos y de cidos grasos libres, entre los que destaca el cido oleico. Otra buena fuente de lpidos es la yema de huevo. Un huevo de gallina, cuyo peso oscila entre 55 y 60 g, consta de clara (65 % del peso) y yema (35 %), y su composicin aproximada en gramos es la siguiente: Peso (g) Yema Clara 19-20 35-36 total Agua (g) 9-10 31-32 Protenas (g) 3-3.5 3.5-4 Lpidos(g) totales 6-6.5 0.01 Colesterol (g) 0.2-0.25 ---------

Los lpidos presentes en la yema son de naturaleza variada, destacando los triacilglicridos, el colesterol y los fosfolpidos. Mediante una extraccin fraccionada se pueden separar los menos polares, solubles en acetona (triacilglicridos y colesterol) de los ms polares (fosfolpidos), que seran solubles en disolventes como la mezcla cloroformo/metanol. Objetivos 1. Aislar el colesterol de la yema de huevo, utilizando acetona como disolvente. 2. Determinar cualitativamente el colesterol mediante una reaccin especfica. 3. Estudiar la solubilidad del aceite de oliva en el disolvente polar, el agua y en otro disolvente ideal para lpidos apolares, la acetona.

MATERIAL *1 Huevo por equipo Centrifuga *Aceite de oliva por equipo Espectrofotmetro 1gradilla Papel milimtrico* 2 celdas de vidrio para espectrofotmetro recipiente para hielo 2 vasos de precipitado de 50 ml 1 pipeta de 10 ml 2 vasos de precipitado de 100 ml 1 varilla de vidrio 2 pipetas Pasteur 1 propipeta 1 Micropipeta de 1000 l 2 tubos de centrfuga para solventes 12 tubos de ensayo Hielo 1 probeta de 10 ml 2 pipetas de 1 ml *material que deber traer el alumno. Reactivos Acetona 20 ml por equipo (poner la acetona en hielo antes de usarse). Colesterol 5 mg/ml (disolver en etanol) 25 ml por grupo cido sulfrico concentrado 10 ml por equipo. Anhdrido actico 4 ml por equipo.

Mtodo A. Extraccin de colesterol de la yema de huevo. 1. Cascar un huevo de gallina con precaucin y separar la clara de la yema, teniendo cuidado de no romper esta. Decantar la clara. 2. Aadir sobre la yema 10 ml de acetona fra y agitar con la varilla, hasta obtener una suspensin homognea. 3. Verter el contenido en dos tubos de centrfuga y equilibrarlos. 4. Centrifugar a la mxima velocidad en la centrfuga de mesa durante 15 minutos. 5. Concluida la centrifugacin (cuando la centrfuga este totalmente parada) sacar los tubos con sumo cuidado, retirar el sobrenadante con una pipeta Pasteur. 6. Guardar el sobrenadante, al que llamaremos extracto acetnico A1. 7. Agregar 10 ml de acetona al pellet (pastilla), agitar con una varilla y repetir todo el proceso otra vez para una segunda extraccin de colesterol. El segundo extracto obtenido se llamar extracto acetnico A2. NOTA: Los tiempos de espera en las centrifugaciones pueden emplearse en ir realizando el apartado D de la prctica.

B. Deteccin cualitativa de esteroides. 1. Rotular adecuadamente los tubos del 1 al 4. 2. Pipetear en cada uno de los tubos los siguientes volmenes (en ml) de las soluciones que se te piden: Prueba de Salkowski # TUBO Colesterol Agua destilada cido Sulfrico* Extracto A1 Extracto A2 1 0 1 mL 1 mL 0 0 2 1 mL 0 1 mL 0 0 3 0 1 mL 1 mL 1 mL 0 4 0 1 mL 1 mL 0 1 mL

* Resbalar por el tubo para formar una capa en el fondo NUNCA HAY QUE DARLE DE BEBER AL CIDO 3. Se mueven los tubos en el plano horizontal, con el fin de conseguir un buen mezclado en la zona de contacto, pero sin llegar a mezclar totalmente ambas fases. 4. La reaccin es positiva, indicando la presencia de colesterol cuando se observa una coloracin azul-verde. C. Deteccin cuantitativa de colesterol 1. Rotular 7 tubos de ensayo del 1 al 7. 2. Pipetear (usar una propipeta) en cada uno de los tubos los siguientes volmenes (ml) de los reactivos, de acuerdo al orden que se ndica en la tabla. NOTA: REACCIONES MUY EXOTRMICAS CUIDADO! Prueba de Liebermann-Burchard # TUBO Colesterol Agua destilada cido Sulfrico** Extracto A1 Extracto A2 1 0 1 1 0 0 2 3 4 5 1 1 1 0 0 6 0 0 1 1 0 7 0 0 1 0 1

0.25 0.5 0.75 0.75 0.5 0.25 1 0.5 0 0 1 0.5 0 0 1 0.5 0 0

Anhdrido actico 0.5

0.5 0.5 0.5

** Se mezclan bien con una varilla de vidrio NUNCA HAY QUE DARLE DE BEBER AL CIDO

Se dejan los tubos a temperatura ambiente durante 20 minutos. La aparicin de un color azul-verdoso indica prueba positiva para esteroides. 3. Leer la densidad ptica a 625 nm despus de 30 minutos de reaccin 4. Graficar Absorbancia contra concentracin de colesterol, calcular la pendiente y ordenada al origen, utilizando la ecuacin de la recta calcular la concentracin del colesterol en las muestras problema. 5. Observar los colores del estndar, el blanco, y los extractos acetnicos (A1 y A2). Anotar los resultados. D. Solubilidad del aceite de oliva. 1. Etiquetar 2 tubos de ensayo limpios y aadir 5 ml de agua al primero y 5 ml de acetona al segundo. 2. Agregar a cada uno de los tubos 60 gotas de aceite de oliva con una pipeta Pasteur limpia y seca. 3. Agitar los tubos y observar los resultados. Anotar las observaciones. Discusin 1. Por qu desde el inicio se desecha la clara de huevo? 2. De qu est compuesta la yema de huevo? Y qu se disuelve de sta al agregar acetona? 3. Por qu escoger acetona y no otro solvente como por ejemplo etanol? 4. De qu tipo de lpidos est formado el aceite de oliva? Referencias Mathews C.K.; Van Holde K.E.; Ahern K.G. 2002. Bioqumica. 3a edicin. Pearson Addison wesley.

CUESTIONARIO 1. Defina los siguientes trminos: Micelas bicapa Liposoma smosis turgencia plasmolisis Isotnico hipertnico Hipotnico 2. Realice un esquema de los principales componentes de la membrana celular del eritrocito. 3. Describa tres experimentos que permitieron discernir la estructura de la membrana lipdica 4. Qu es el modelo de mosaico fluido de la membrana y que experimentos permitieron dilucidarlo? 5. Cmo es el lquido intracelular respecto al extracelular? 6. Qu es el tejido? 7. Qu son las acuaporinas y cul es su papel en el intercambio de lquidos en la clula? PRCTICA II MEBRANAS Y SMOSIS. Introduccin La sustancia ms abundante, con diferencia, que difunde a travs de la membrana celular es el agua. Es preciso recordar que, a travs de la membrana del eritrocito, en condiciones normales difunde por segundo en ambos sentidos una cantidad de agua equivalente a unas 100 veces el volumen de la propia clula. Aun as, normalmente, la cantidad que difunde en ambas direcciones est tan exactamente equilibrada que se produce prcticamente un movimiento neto de agua nulo. Por tanto, el volumen de la clula permanece constante. Sin embargo, en ciertas condiciones, se puede desarrollar una diferencia de concentracin para el agua a travs de una membrana, al igual que se pueden producir diferencias de concentracin para otras sustancias. Cuando esto ocurre, se produce un movimiento neto de agua a travs de la membrana celular, lo que hace que la clula se hinche o se contraiga, dependiendo de la direccin del movimiento neto. Este proceso de movimiento neto de agua causado por una diferencia de concentracin de la misma se denomina smosis. Desde que, Pfeffer en 1887 fue el primero en describir la conducta osmtica de las clulas vivas, esto ha sido un punto central en la Biologa. En 1908 Nernst reconoce que el agua puede pasar a travs de las membranas biolgicas libremente pero no los iones,

introduciendo as el concepto de la membrana "semipermeable". Para la investigacin de las propiedades osmticas de las clulas vegetales, Overton empleo el mtodo de plasmolisis, desarrollado largamente por Nageli, de Vries y Pfeffer. Este mtodo se basa en la observacin de la reduccin y aumento del protoplasma en la pared celular (plasmolisis) por la accin de una solucin hipertnica de solutos inocuos (ej. sacarosa). Este fenmeno es reversible al remover el soluto. Por otra parte, la barrera osmtica de clulas viables es tambin impermeable a pigmentos de plantas (ej. antocianinas) y en el caso de clulas daadas, con venenos, se anulan estas propiedades osmticas. Overton tambin midi los cambios de peso producido por variacin de la tensin del soluto externo. La ms sencilla interpretacin de estas observaciones fue que el agua es permeable a la barrera osmtica, mientras los solutos adicionados eran impermeables. Objetivos 1. Observar la membrana que delimita a la clula. 2. Identificar el proceso de smosis mediante la observacin en el microscopio de los cambios que sufre la clula vegetal y animal al modificar la concentracin del lquido extracelular. 3. Distinguir las soluciones hipotnica, hipertnica e isotnica, basndose en los cambios en masa o volumen que cada solucin provoque en la clula vegetal. 4. Realizar una prueba de fragilidad osmtica de eritrocitos. Material Por equipo: 14 tubos de ensaye de 12 X 15 cm 2 tubos de ensaye de 1.5 X 15 cm 3 pipetas de 5 ml 3 pipetas de 1 ml 2 pipetas Pasteur Papel filtro 5 vasos de precipitado de 250 ml 2 vasos de precipitado de 500 ml 1 probeta de 100 m Reactivos Por grupo: 300 ml NaCl al 4%, 6% y 0.9% 500 ml Amortiguador de fosfato 1mM con NaCl al 1%, pH 7.4

1 probeta de 50 ml 1 esptula 1 horadador del #11 1 piceta Balanza granataria Espectrofotmetro Centrifuga Microscopio ptico Micropipeta de 100 l y 1 ml con puntas

10 ml Rojo Neutro al 0.5% preparado en amortiguador de fosfatos 1 mM Agua destilada

Material que debe traer el alumno: Solicitar en el bioterio de su facultad 5ml sangre total (rata, cobayo, etc.) con EDTA heparina (por grupo) 1 cebolla fresca 1 papa fresca 1 cronometro

6 portaobjetos 1 cuchillo 6 cubreobjetos sanitas 1 Navaja de un filo 1 par de guantes desechables 5 reglas graduadas o vernier

Mtodo I. Clula Vegetal Cebolla 1. Hacer dos cortes transversales y paralelos en una cebolla con una separacin de un poco ms de un centmetro de longitud. 2. En los extremos de los cortes, seccionar longitudinalmente, formando una ventana, desechar las dos primeras hojas y conservar la tercera. 3. En la cara interna de esta ltima hoja, se le deber de desprender una membrana transparente. No utilice la membrana de la parte externa (que parece ms brillosa). 4. Monte un fragmento de epidermis en el portaobjetos y coloque una gota de rojo neutro. 5. Coloque un cubreobjetos y vea al microscopio. 6. Observar al microscopio y dibujar 7. Reemplazar la solucin en que esta disuelto el rojo neutro de la preparacin por una solucin de cloruro de sodio al 4%. 8. Para efectuar esta maniobra se toma un poco de solucin de cloruro de sodio al 4% con una pipeta Pasteur y se deposita una gota sobre un lado de la preparacin, entre el portaobjetos y el cubreobjetos se coloca un pedacito de papel filtro en el lado opuesto a fin de aspirar, por capilaridad, la solucin amortiguadora de fosfatos con rojo neutro. 9. Realice un dibujo de los cambios que se observan 10. Reemplazar la solucin de cloruro de sodio al 4% por la de cloruro de sodio al 6%. 11. Observar al microscopio y dibujar 12. Para finalizar, reemplazar la solucin de cloruro de sodio al 6%, por agua destilada, utilizando la tcnica indicada anteriormente. 13. Observar al microscopio y dibujar.

Papa 1. Utilizando un horadador (#11) realice perforaciones sobre una papa fresca

(1)

(2)

1cm

2. Obtenga varios cilindros de papa y realice cortes de 1 cm de largo de ste, hasta obtener 15 piezas. Nota: escoger la mejor porcin de papa que no tenga entrenudos y quitar la cascara. 3. Medir (dimetro y largo) y pesar cada cilindro de papa y anotarlos en la tabla 1. 4. Colocar 5 trozos de papa en cada uno de los siguientes tratamientos: Vaso con 50 ml solucin isotnica (NaCl 0.9%). Vaso con 50 ml solucin hipertnica (NaCl 6%). Vaso con 50 ml solucin hipotnica (Agua destilada). 5. Dejarlos por 30 minutos a temperatura ambiente. 6. Transcurrido el tiempo sacar los trozos, secarlos con papel absorbente. 7. Volver a medir y pesar. 8. Anotar los datos de cada cilindro en la siguiente tabla: Tabla 1. Datos individualizados Dimetro (cm) Largo (cm) Masa (gr)

inicial Solucin isotnica

final

Inicial

final

inicial

final

Solucin hipertnica

Solucin hipotnica

Procesamiento de Datos: Calcular los promedios y desviaciones estndar (DE) para cada tratamiento de los cilindros de papa al inicio y al final del experimento. Elaborar una tabla con los datos anteriores con el formato que se muestra a continuacin Tabla 2. Promedio DE de cada tratamiento dimetro (cm) largo (cm) Tratamiento inicial final inicial
Promedio DE Promedio DE Promedio DE

final
Promedio DE

Masa (gr)
inicial
Promedio DE

final
Promedio DE

Calcular los cambios relativos que sufrieron los cilindros de papa. Para hacer esto se tomar como valor de referencia el valor inicial de cada magnitud, como en el ejemplo siguiente: Cambio relativo en masa (%)= 100*(masa final)/ (masa inicial) Obtener los valores promedios de cada tratamiento y su desviacin estndar correspondiente. Tabla 3. Cambios relativos (%) % dimetro % largo % masa Tratamiento

Elaborar graficas de barras con los datos de ambas tablas (2 y 3) independientemente. Cada barra deber estar al lado de su contraparte, por ejemplo la barra que represente la longitud inicial en agua destilada deber estar junto a la barra de longitud final de esa misma solucin. Incluir los valores de desviacin estndar en cada barra. Hubo diferencias en los parmetros medidos antes y despus del tratamiento? En qu casos? Por qu? En que tabla o grafica se aprecian mejor estas diferencias? Fueron significativas las diferencias en todos los casos?

2. Estructura y fragilidad osmtica de eritrocitos. a. Eritrocito 1. En tres portaobjetos colocar una gota de sangre y una gota de la solucin como se indica a continuacin: Sangre total + agua destilada. Sangre total + sol. de NaCI al 6%. Sangre total + sol. salina fisiolgica. 2. Colocar un cubreobjeto y observar al microscopio. 3. Dibujar lo observado b. Fragilidad osmtica de eritrocitos 1. Solicitar en el bioterio de su facultad 5 ml de sangre de algn animal (rata, cobayo hmster) utilizando como anticoagulante EDTA heparina y colocarla a 4C hasta su uso. 2. Numerar 7 tubos del #1 al #7 3. Pipetear las soluciones en los tubos como lo indica la siguiente tabla:

Tubos
El % concentracin de NaCl resultante en cada tubo es: Sol. NaCl 1% pH 7.4 Agua destilada Sangre total ml ml ml

1
0 0 5 0.05

2
0.1 0.5 4.5 0.05

3
0.4 2.0 3.0 0.05

6
0.6 3.0 2.0 0.05

7
0.86 4.3 0.7 0.05

0.46 0.5 2.3 2.7 0.05 2.5 2.5 0.05

Mezclar por inversin Mezclar por inversin 4. Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente durante 30 minutos. 5. Mezclar nuevamente y centrifugar a 2000 r.p.m. durante 5 minutos. 6. Leer en el espectrofotmetro a una longitud de onda de 540 nm, utilizando el tubo 7 como blanco. 7. El tubo 1 equivale al 100% de hemlisis, mientras que el nmero 7 equivale al 0%. 8. La lectura del espectrofotmetro de cada tubo, dividido entre las unidades de lectura del tubo 1, multiplicado por 100, indica el porcentaje de hemlisis. Procesamiento de Datos: En el caso de la prueba de fragilidad osmtica de eritrocitos. En los sujetos normales se

obtiene una curva sigmoidea casi simtrica. El extremo inferior de la curva corresponde al comienzo de la hemlisis, la porcin media corresponde a la salida de la hemoglobina en gran cantidad y el extremo superior a la hemlisis total. Un aumento de la fragilidad osmtica desplaza la curva haca la derecha, mientras que una disminucin la desplaza hacia la izquierda.

Se ha sugerido que los dos parmetros ms significativos son: a) La concentracin de solucin salina en la cual se obtiene 10% de hemlisis. b) La concentracin de solucin salina que produce 90% de hemlisis. Normalmente se obtiene un 10% de hemlisis a una concentracin de solucin salina que vara de 0.48% a 0. 44% mientras que el 90% de hemlisis se produce a una concentracin que va de 0.44% a 0.36%. La relacin entre la concentracin de la solucin salina y el porcentaje de hemlisis en condiciones normales es la siguiente: % Solucin salina 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.85 % Hemlisis 97-100 90-99 50-95 5-45 0-6 0

La fragilidad osmtica de eritrocitos se incrementa en algunos padecimientos como esferocitosis congnita, anemia hemoltica adquirida, enfermedad hemoltica del recin nacido debido a la incompatibilidad ABO y puede estar disminuida en talasemia, anemia de clulas falciformes, ictericia y anemia por deficiencia de fierro. Realizar una grfica de Absorbancia contra concentracin de NaCl y otra de %

hemlisis contra concentracin de NaCl. BIBLIOGRAFA Kleinzeller, A. Ernest Overtons Contribution to the Cell Membrane Concept: A Centennial Appreciation. News Physiol Sci 1997; 12:49-53. Guyton C y Hall J. Tratado de fisiologa Mdica. Mxico, 2001, 1280 p.

1. 2. a) b) c) d) e) f) 3. 4. 5. 6.

CUESTIONARIO Explique en que se basa la determinacin de azcares reductores por el mtodo de Nelson-Somogyi? Defina los siguientes trminos: Difusin simple f) Desacoplante Permeasas g) Cotransporte Difusin facilitada h) Uniporte Simporte i) Antiporte Transporte activo primario j) ionforos Transporte activo secundario Qu son los transportadores de glucosa y cul es su importancia para la clula? Describa como se lleva a cabo el transporte de glucosa al interior de las clulas eucariticas. Qu tipos de compuestos inhiben el transporte de glucosa al interior de la clula? Realice un esquema de los diferentes tipos de ATPasa que existen y mencione la funcin, localizacin y el tipo de elementos que transporta. PRCTICA III TRANSPORTE A TRAVS DE LA MEMBRANA

Introduccin El transporte a travs de la bicapa lipdica de las membranas es un requerimiento universal entre los organismos vivos. Sin embargo, el agua no puede pasar realmente a travs de bicapas lipdicas sintticas y solo difunde a travs de tales barreras muy lentamente con una alta activacin de energa (Ea> 10 kcal/mol). En contraste algunas membranas de clulas son altamente permeables al agua tal que el movimiento total del agua a travs de la membrana es como si no estuviera presente en absoluto y la energa de activacin (Ea< 5 kcal/mol) es equivalente a la difusin del agua en solucin. Adicionalmente, desde hace mucho tiempo se sabe que el transporte de agua a travs de la membrana vara enormemente entre tipos celulares y aun dentro de un tipo celular la permeabilidad del agua puede cambiar dramticamente en la presencia de ciertos compuestos. Las clulas mantienen sus actividades biolgicas importando y exportando varias sustancias tales como iones y molculas polares. Las membranas biolgicas son intrnsecamente impermeables a estos compuestos pero stos son capaces de cruzar las membranas para la funcin normal de la clula. Existen dos factores principales que determinan si una molcula puede atravesar la membrana: 1) la permeabilidad de la molcula en una bicapa lipdica y, 2) la disponibilidad de una fuente de energa. La

permeabilidad es conferida por dos clases de protenas de membranas: las bombas y los canales. Las bombas usan una fuente de energa para transportar iones o molculas (ejem. transporte activo). Lo canales, en cambio, permiten que los iones fluyan rpidamente a travs de la membrana (por ejem. Transporte pasivo o difusin facilitada). La levadura Saccharomyces cerevisiae puede usar diferentes fuentes de carbn para su crecimiento, pero evolutivamente ha seleccionado mecanismos para utilizar eficiente y preferencialmente a la glucosa y fructuosa. En estos organismos, la glucosa regula la utilizacin del carbn principalmente por la represin o activacin de la transcripcin de numerosos genes que codifican enzimas implicadas en el metabolismo del carbn, adems una molcula puede afectar la fisiologa de la levadura en muchos niveles (cambios en la concentracin celular de metabolitos, modificacin y eventualmente degradacin de algunas enzimas y alteracin en la estabilidad de un nmero de RNAm. Existen sensores de glucosa en la membrana de la levadura como son los transportadores de glucosa (HeXose Transporter: HXT). En la membrana plasmtica de S. cerevisiae, existen al menos 20 transportadores de glucosa. Los ms relevantes son Hxt1 y Hxt3, con una baja afinidad por la glucosa, con una alta capacidad de transporte y Hxt2, Hxt4 y Hxt7 con una alta afinidad y una capacidad baja de transporte. Objetivo Establecer el tipo de transporte por el cual las clulas de un cultivo aerobio de levaduras de Saccharomyces cerevisiae introducen la glucosa. Hiptesis. Planteada por el alumno, basndose en el objetivo y considerando los tratamientos que recibi cada lote de clulas (con venenos, calentamiento, control), as que debern partir de una suposicin sobre cul lote de clulas habr transportado ms glucosa. Redactar siguiendo el esquema de Si ... entonces ... Mtodo NOTA: Para el reporte hacer una descripcin de lo que se hizo. No repetir la lista Material 1 matraz Erlenmeyer de 1000 ml 4 matraces Erlenmeyer de 250 ml 15 tubos de ensayo 5 tubos de espectrofotmetro 2 propipetas 4 tubos de centrfuga 4 pipetas de 5 mL 4 pipetas de 10 mL 1 vaso de precipitados de 250 mL algodn y papel aluminio de distintos tamaos*

 Soporte, anillo metlico y tela de alambre con asbesto. 2 mecheros Probeta 10 ml 1 micropipeta de 100 L y 1ml con puntas Sanitas servitoallas* Guantes y cubrebocas* Canicas de diferente tamao limpias*
*Lo debe traer el alumno

Reactivo de Somogyi (sol. 1 y 2) Sol. de glucosa 0.15 mg/ml

Material biolgico Un sobre de levadura seca activa (Fleischmann) Equipo Vrtex Incubadora con controlable Espectrofotmetro Autoclave Centrfuga

Soluciones Reactivo de arsenomolibdato 500 ml de solucin de glucosa 0.3 % (abreviado como Glc) 1 mL de 2, 4 - dinitrofenol 0.05 % (abreviado DNP) Procedimiento

temperatura

NOTA: Para la determinacin de glucosa en el medio, se determinar por el mtodo de Nelson-Somogyi que es especfico para azcares reductores. A. INCUBACIN DE LAS CLULAS Los pasos 2 al 5 deben realizarse en esterilidad, trabajando junto al mechero. Pesar 50 mg de levadura seca - activa para c/u de las 4 condiciones experimentales. 1. Preparar los siguientes tubos: levadura + 1 mL de solucin de glucosa. levadura + 1 mL de solucin de glucosa + 0.1 ml de solucin de dinitrofenol. levadura + 1 mL de solucin de glucosa + 0.1 mL de KCN levadura + 1 mL de solucin salina glucosada. A continuacin este tubo debe esterilizarse 20 min en agua hirviendo. 2. Resuspender las clulas con el vrtex 3. Agregar las suspensiones a 4 matraces Erlenmeyer que contengan 100 ml de sol glucosada. Etiquetar los matraces. Tomar 1 alicuota de 10 ml (tiempo cero) y proceder con el paso 5 4. Tapar los matraces y colocar en incubadora a 37C y con 200 rpm de agitacin tomar

alicuotas de 10 ml a los 15, 30, 45 y 60 min. 5. Centrifugar a 2500 rpm durante 5 min. B. DETERMINACIN DE AZCARES EN CADA MUESTRA Mtodo de Somogyi para determinacin de azcares Con los sobrenadantes se preparan los tubos enlistados a continuacin: Tubo: Sobrenadante Glc H 2O Reactivo Somogyi Testigo 0.0* 0.0 1.0 1.0 i 0.5 0.0 0.5 1.0 ii 0.5 0.0 0.5 1.0 iii 0.5 0.0 0.5 1.0 iv 0.5 0.0 0.5 1.0 v 0.0 0.2 0.8 1.0 vi 0.0 0.4 0.6 1.0 vii 0.0 0.6 0.4 1.0 viii 0.0 0.8 0.2 1.0 ix 0.0 1.0 0.0 1.0

COLOCAR ESTOS TUBOS TAPADOS DURANTE 20 min EN BAO MARA. DESPUS, ENFRIARLOS CON AGUA DE LA LLAVE R. Arsenomolibdato 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 AGITAR UNA VEZ QUE HAYA CESADO LA EFERVESCENCIA, DEBE DILUIRSE CADA TUBO CON AGUA DESTILADA HASTA OBTENER UN VOLUMEN TOTAL DE 10 ml. *Los nmeros indican el volumen en mililitros Calibrar el espectrofotmetro con el tubo testigo. Leer la absorbancia a 540 nm de longitud de onda. Conociendo la absorbancia de cada tubo experimental, calcular la concentracin de glucosa, utilizando la ecuacin de la curva patrn (tubos v al ix) Graficar absorbancia contra cantidad de glucosa en microgramos, tomando como referencia las lecturas de los tubos 1 al 6. Trazar una lnea recta, calcular su pendiente y ordenada al origen, escribir la ecuacin que relacione cantidad de glucosa contra la absorbencia. Calcular la cantidad de glucosa presente en los tubos 7 al 10 con base en la ecuacin de la curva patrn obtenida. Resultados y Procesamiento de los Datos Conociendo la absorbancia de cada tubo experimental, calcular la concentracin de glucosa, utilizando la ecuacin de la curva patrn. Presentar una serie de tablas con los resultados obtenidos

Tabla 1. Densidad ptica a 526 nm. Absorbancia Tratamiento 0 Control DNP* KCN** Calor Tabla 2. Cantidad de glucosa remanente en el medio de crecimiento. Absorbancia=A526 interpolada de la curva patrn Tratamiento 0 Control DNP* KCN** Calor Con estos datos calcular los moles de glucosa transportada, teniendo en cuenta los moles tericos iniciales del experimento. Indicar la cantidad en masa y mol de glucosa inicial. Tabla 3. Cantidad transportada de glucosa por lote de clulas (hacer el clculo correspondiente por matraz, no por tubo) Tratamiento Control DNP* KCN** Calor Calcular el transporte de glucosa para 0, 15, 30, 45 y 60 min. Glucosa (mol) 0 15 30 45 60 15 Glucosa (mg) 30 45 60 15 Tiempo (min) 30 45 60

Discusin Hubo diferencias notables entre la cantidad de glucosa remanente en los lotes tratados con venenos comparados con el control? A qu se debieron las diferencias? Fue diferente el efecto del KCN y el DNP? Qu tipo de mecanismo de transporte opera en la levadura para el caso de la glucosa? Haciendo los clculos para cada uno de los matraces experimentales, pueden hacerse inferencias sobre el tipo de transporte para glucosa en la levadura. La suposicin de transporte activo y pasivo sern confirmadas o rechazadas de acuerdo con las definiciones planteadas en la introduccin contrastadas por los resultados experimentales. Cules otros factores influyen en el transporte de glucosa y otros solutos al interior de las clulas? Hacer una investigacin adicional sobre el transporte de glucosa en la levadura. Conclusin 1. Se cumpli el objetivo? 2. Presentar un modelo del transporte de glucosa y los sitios de accin de los venenos utilizados. Referencias DE LIBRO: Apellidos del autor, Inicial del nombre. Ao de publicacin. Ttulo. # de edicin. Editorial. Lugar de pp (pginas consultadas). DE ARTICULO: Apellidos del autor, inicial del nombre. Ao. Ttulo del artculo. Nombre de la revista. Volumen (nmero): pg. CAPTULO EN UNA ANTOLOGA: Apellidos del autor, Inicial del nombre. Ao de publicacin. Ttulo del captulo. In: Ttulo del libro. Apellidos del editor, Inicial del nombre (ed.) # de edicin. Editorial. Lugar. Pp (pginas consultadas). Bibliografa 1. Berg J. M., Tymoczko J. L. y Stryer L. 2007. Biochemistry. Sexta edicin. Editorial W. H. Freman and Company. N. Y. EUA. 2. Gancedo M. J. (2007) The early steps of glucose signalling in yeast. FEMS Microbiol. Rev.32(4): 673-704 3. Rintala E, Wiebe MG, Tamminen A, Ruohonen L, Penttil M. (2008) Transcription of hexose transporters of Saccharomyces cerevisiae is affected by change in oxygen provision.BMC Microbiol. 8:53.

CUESTIONARIO 1. Defina los siguientes trminos Digestin metabolismo anabolismo catabolismo anaerobio aerobio glucognesis glucogenlisis diabetes acidosis 2. Qu son los carbohidratos? 3. Cmo se clasifican los carbohidratos? 4. Cul es la prueba general para un carbohidrato? Explique 5. Describa los fundamentos de 2 pruebas para determinar glucosa en sangre. 6. Describa el fundamentos de las pruebas de Timol,- Naftol, Fehling y Benedict. 7. Las cetonas no se oxidan con agentes oxidantes suaves. Sin embargo, la fructosa lo hace con el reactivo de Benedict. Explique. 8. Qu caractersticas estructurales debe reunir un disacrido para ser azcar reductor? PRCTICA IV CARBOHIDRATOS Introducin Los carbohidratos son polihidroxialdehdos y polihidroxicetonas o compuestos que, por hidrlisis, se convierten en aqullos. Un carbohidrato que no es hidrolizable a compuestos ms simples se denomina monosacrido. Un carbohidrato que por hidrlisis da dos o ms molculas de monoscaridos por hidrlisis se conoce como polisacrido. Un monosacrido se puede clasificar an mas: si contiene un grupo aldehdo, es una aldosa, si contiene una funcin cetosa, es una cetosa. Segn el nmero de tomos de carbono que contenga, el monosacrido se conoce como briosa, terrosa, pectosa, hexosa y as sucesivamente. Una aldohexosa, por ejemplo, es un monosacrido de seis carbonos con una funcin aldehdo, mientras que una cetopentosa es un monosacrido de cinco carbonos con un grupo cetnico. La mayora de los monosacridos naturales son pentosas o hexosas. Los carbohidratos que reducen los reactivos de Fehling (o Benedict), se conocen como azcares reductores. Todos los monosacridos, sean aldosas o cetosas, son azcares reductores, como lo son tambin la mayora de los disacridos, siendo una excepcin importante la sacarosa (azcar comn), que no es reductora.

Objetivos Al terminar esta prctica, el alumno ser capaz de entender la naturaleza de los carbohidratos y la importancia prctica del conocimiento de los mismos, determinndolos cualitativamente con diversos reactivos y reconociendo las diferencias entre azcares reductores y no reductores. Adems determinar la presencia de azcares reductores en algunos alimentos mediante las pruebas de Benedict y Fehling Hiptesis Formulada por el alumno Material 1 esptula 1 gradilla 1 tela de asbesto 1 cristalizador 24 tubos de ensaye 3 vasos de precipitado de 250 mL 5 pipetas Pasteur 5 pipetas graduadas de 5 mL 1 piceta 1 parrilla 2 propipetas Reactivos Glucosa al 5 % en 10 mL de agua (por grupo) Manosa al 5 % en 10 mL de agua (por grupo) Fructuosa al 5 % en 10 mL de agua (por grupo) Sacarosa al 5 % en 10 mL de agua (por grupo) Trtrato de sodio y potasio 17.5 g Citrato de sodio 17.3 g Na2CO3 anhidro 10 g CuSO4.5H2O 3.5 g NaOH 5 g

Material por equipo (que los alumnos deben traer) 1 sobre de canderel o de nutrasweet (preparar una solucin al 1 % en 10 mL de agua) por grupo 1 lata de refresco de dieta sin colorante 1 lata de refresco normal sin colorante 1 lata de jugo de manzana azcar de mesa (preparar una solucin al 5 % en 10 mL de agua ) por grupo Preparacin de soluciones por grupo -Naftol, disolucin al 0.2% Timol, disolucin al 1% en alcohol etlico. cido sulfrico concentrado Sacarosa, disolucin al 1%. Glucosa, disolucin al 5%. Reactivo de Fehling Solucin A (3.5 g de CuSO4 en agua y aforar a 50 mL).

Solucin B (17.5 g de tartrato de sodio y potasio, y 5 g de NaOH en agua y aforar a 50 mL) Reactivo de Benedict En 60 mL de agua disolver 17.3 g de citrato de sodio y 10 g de Na 2CO3 anhidro. Esta mezcla se aade lentamente y con agitacin a una solucin previamente preparada de 1.73 g de CuSO4 pentahidratado en 15 mL de agua. La solucin final se afora a 100 mL. Procedimiento Reacciones de reconocimiento de carbohidratos A. Prueba con -naftol. Esta reaccin es general para los carbohidratos y se aplica para detectar la presencia de stos en los materiales biolgicos. Mediante la accin del cido sulfrico concentrado se forma furfural a partir de las pentosas; 5-hidro-ximetilfurfural a partir de las hexosas. Numerar una serie de nueves tubos. Adicionar a cada tubo las cantidades de sustancias indicadas en la tabla 1 Tabla 1: Preparacin de los tubos para la prueba de -naftol
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Glucosa (mL) Fructosa (mL) Manosa (mL) Sacarosa (mL) Jugo de manzana (mL) Refresco normal sin colorante (mL) Refresco de dieta sin colorante (mL) Canderel o Nutrasweet (mL) Azcar de mesa (mL) Solucin -naftol (gotas) H2SO4* (mL)

1 1 1 1 1 1 1 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 1 5 1

* En todos los tubos de ensayo se vierten con cuidado, por la pared, 1 ml de cido sulfrico concentrado sin mezclarlo con la capa acuosa. En el contacto con las capas, aparece una coloracin violeta

A. Prueba con Timol. Numerar una serie de nueves tubos. Adicionar a cada tubo las cantidades de sustancias indicadas en la tabla 2 Tabla 2: Preparacin de los tubos para la prueba de Timol
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Glucosa (mL) Fructosa (mL) Manosa (mL) Sacarosa (mL) Jugo de manzana (mL) Refresco normal sin colorante (mL) Refresco de dieta sin colorante (mL) Canderel o Nutrasweet (mL) Azcar de mesa (mL) Solucin timol (gotas) H2SO4* (mL)

1 1 1 1 1 1 1 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 1 5 1

* En todos los tubos de ensayo se vierten con cuidado, por la pared, 1 ml de cido sulfrico concentrado sin mezclarlo con la capa acuosa. En el contacto con las capas, aparece una coloracin roja

C. Prueba de Fehling 1. Numerar una serie de nueve tubos. 2. Adicionar a cada tubo las cantidades de sustancias indicadas en la tabla 1 Tabla 1: Preparacin de los tubos para la prueba de Fehling Tubos 1 2 3 4 5 6 Solucin A (mL) 1 1 1 1 1 1 Solucin B (mL) 1 1 1 1 1 1 Glucosa (gotas) 3 Fructosa (gotas) 3 Manosa (gotas) 3 Sacarosa (gotas) 3 Jugo de manzana (gotas) 10 Refresco normal sin colorante (gotas) 10 Refresco de dieta sin colorante (gotas) Solucin de canderel o nutrasweet (gotas) Solucin de azcar de mesa (gotas) 3. Calentar a ebullicin durante 5 minutos. 4. La formacin de un precipitado rojo y la decoloracin positiva para azcar reductor.

7 1 1

8 1 1

9 1 1

10 10 10 de la solucin indica prueba

D. Prueba de Benedict 1. Como en la prueba anterior, preparar una serie de nueve tubos. 2. Aadir las soluciones como se indica en la tabla 2 Tabla 2: Preparacin de los tubos para la prueba de Benedict Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Reactivo de Benedict ( mL) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Glucosa (gotas) 5 Fructuosa (gotas) 5 Manosa (gotas) 5 Sacarosa (gotas) 5 Jugo de manzana (gotas) 10 Refresco normal sin colorante (gotas) 10 Refresco de dieta sin colorante (gotas) 10 Solucin de canderel o nutrasweet (gotas) 10 Solucin de azcar de mesa (gotas) 10 3. Calentar a ebullicin durante 5 minutos y dejar enfriar a temperatura ambiente. 4. La presencia de un precipitado cuya coloracin vara desde amarillo hasta rojo, con decoloracin de la solucin, indica prueba positiva. Resultados Procesamiento de los datos 1. Anotar los resultados en el siguiente cuadro y describir lo que se observa en cada tubo (color, formacin de precipitado, etc) Muestra Glucosa Fructosa Manosa Sacarosa Jugo de manzana Refresco normal sin colorante Refresco de dieta sin colorante Canderel o Nutrasweet Azcar de mesa Prueba Naftol Prueba Timol Reaccin de Fehling Reaccin de Benedict

Discusin 1. 2. 3. 4. 5. Comparar los resultados y diga qu tipo de azcar son la glucosa, manosa y sacarosa? Los alimentos probados contenan azcares reductores? Discutir la respuesta. Las determinaciones en esta prctica son cuantitativas o cualitativas? Por qu? Para qu tipo de carbohidratos utilizas las pruebas de Timol y a-naftol? Qu similitud en su composicin presentan el reactivo de Fehling y el reactivo de Benedict?

Conclusiones Se cumplieron todos los objetivos? Qu efecto puede tener en el organismo, la presencia de azcares reductores en los alimentos? Concluir tomando como base los resultados obtenidos en la prctica y a lo investigado en la bibliografa consultada. Bibliografa DE LIBRO: Apellidos del autor, Inicial del nombre. Ao de publicacin. Ttulo. # de edicin. Editorial. Lugar de pp (pginas consultadas). DE ARTICULO: Apellidos del autor, inicial del nombre. Ao. Ttulo del artculo. Nombre de la revista. Volumen (nmero): pg.

CUESTIONARIO 1. Defina los siguientes trminos Gluclisis Anaerobio facultativo Dador de electrones Fermentacin homolctica Aceptor de electrones Fermentacin alcohlica Anaerobio estricto 2. Dibuje la estructura del 2,6 diclorofenol-indofenol sdico y mencione los usos que se le da en investigacin? 3. Describa el fundamento para determinar la presencia de etanol empleando la solucin sulfocrmica? 4. Predecir si la adicin de cantidades significativas de los compuestos que se especifican a continuacin a un extracto de levadura que fermenta glucosa podran provocar un incremento (+), o un decremento (-), o no inducir ningn cambio (0), en la velocidad de conversin de glucosa en etanol: a) iodoacetato, b) ATP, c) ADP, d) AMP, e) fosfato, f) fluoruro, g) bisulfito (reacciona con los aldehdos), h) citrato, i) arseniato. PRACTICA V FERMENTACIN DE LA GLUCOSA POR LA LEVADURA DE PANIFICACIN Introduccin Hay dos diferentes vas en la clula que pueden ser llevadas a partir de los alimentos: la fermentacin y la respiracin celular. Ambas vas inician con los mismos pasos, a este proceso se le llama gluclisis, la cual es el rompimiento de los tomos de glucosa (6 carbonos) en dos molculas de tres carbonos llamadas cido pirvico. La gluclisis es conocida probablemente como la va ms vieja en donde se produce ATP. Hay varios tipos de procesos de fermentacin, dos de las tipos ms conocidos de fermentacin son: la fermentacin del cido lctico y la fermentacin alcohlica. La fermentacin alcohlica es realizada por las levaduras y algunas especies de bacterias. El producto final de este va fermentativa es el etanol y el dixido de carbono (CO 2). La levadura de panificacin Saccharomyces cerevisiae es capaz de efectuar la gluclisis a partir de la glucosa hasta etanol en condiciones anaerobias y hasta anhdrido carbnico en condiciones aerobias. Los humanos han utilizado esta va para producir de manera industrial bebidas y vinos. En el caso que nos ocupa, se estudiar el transcurso de la gluclisis en condiciones anaerobias, observando la produccin de una cantidad considerable de gas, lo que nos permitir seguir la reaccin con respecto al tiempo Objetivo Que el alumno observe y conozca la produccin de etanol por medio de la fermentacin alcohlica.

Material *1 g de levadura fresca 2 pipetas de 10 ml y 1 ml 1 vaso de precipitado de 50 ml y 100 ml gradilla 1 mechero, tripe, malla de asbesto, 2 tubos de ensayo de 10 ml propipetas 1 varilla de vidrio *2 jeringas de plstico de 10 ml con aguja, nuevas. *1 o 2 bloques de parafina (veladora). *guantes y cubrebocas *material que deber de traer el alumno por equipo. Reactivos 1. 10 ml de glucosa al 5% en amortiguador de acetato (se debe hervir antes de usarse para reducir el contenido de oxgeno disuelto) 2. Amortiguador de acetato: 12.112 g de acetato sdico cristalizado y 0.78 ml de cido actico glacial en 500 ml de agua destilada 3. Solucin de 2,6-diclorofenol-indofenol sdico al 2% 4. Solucin sulfocrmica: 1 g de dicromato potsico en 50 ml de cido sulfrico 0.5 N 5. Etanol 10 mM. Medir 0.29 ml de etanol y aforar en 50 ml de agua destilada. Mtodo Pesar 1 gramo de la levadura y disolverla en 10 mililitros de la solucin de glucosa al 5% en buffer de acetato. La suspensin se prepara agitando con una varilla la levadura hasta que la suspensin sea homognea, es conveniente efectuar el procedimiento de mezclado con relativa rapidez procurando que no entre aire en la disolucin, A esta suspensin adicionarle 1 ml de 2,6 diclorofenol-indofenol sodico. Inmediatamente despus de preparada, tomar 3 ml. de la suspensin con una jeringa de 5 ml, posteriormente se coloca la aguja de la jeringa en la parafina para evitar la entrada de oxgeno. A intervalos de 10 minutos (1 hora de incubacin), se va tomando la nota del volumen del contenido de la jeringa y el color de la suspensin. Es importante utilizar jeringas cuyos mbolos cierren hermticamente y sean de fcil desplazamiento, ya que, de lo contrario, las lecturas de gas producido pueden resultar alteradas. La produccin de gas no es inmediata, ya que la levadura

consume el poco oxgeno disponible, primero, mediante la oxidacin aerobia de la glucosa. El color del indicador de xido-reduccin indica el ambiente rdox del interior de la jeringa (azul = alcalino; rosa = cido; coloreado = oxidado; incoloro = reducido). Hacer una grfica de los mililitros de gas producidos (ordenadas) frente al tiempo (abscisas), indicando en el mismo los cambios de color observados. Despus de 1 hora de fermentacin se filtra y se toma una alcuota de 1 ml en un tubo para la determinacin de etanol. A este mililitro (1 ml) se le adiciona 0.5 ml de solucin sulfocrmica diluida, se mezcla y se calienta en bao de agua hirviendo; aparece un color verde, percibindose el olor caracterstico del acetaldehdo. Por otra parte en otro tubo colocar 1 ml de etanol (10 mM ) y adicionar 0.5 ml de solucin sulfocrmica diluida, se mezcla y se calienta en bao de agua hirviendo esto corresponde al control positivo de la produccin de etanol por la fermentacin alcohlica. La presencia de etanol se puede comprobar mediante su oxidacin con cido sulfocrmico a acetaldehdo. Discusin 1. Explique por qu la formacin de gas no se produjo inmediatamente en el experimento. 2. Por qu se debe hervir la solucin de acetato de sodio y cido actico? 3. Describe brevemente la gluclisis y sita el experimento dentro de este proceso 4. Qu nos indica el cambio de color en la reaccin? 5. Para qu es la solucin 2,6 diclorofenol-indofenol sodico y la sulfocrmica? 6. Cules son las reacciones que son irreversibles en el proceso de la gluclisis? 7. Qu gas es el que se produce durante el experimento? 8. En la industria, qu importancia tiene esta levadura? Referencias. David L. Nelson; Michael M. Cox. LEHNINGER. PRINCIPIOS DE BIOQUMICA. Ediciones Omega. ISBN: 8428212082. ISBN-13: 9788428212083. Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter. MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL. Fourth edition. 2002.

CUESTIONARIO 1. 2. 3. 4. Cules son las fuentes de carbono que usa la levadura? Cules son las vas metablicas que catabolizan a los carbohidratos? Describir la gluclisis y la fosforilacin oxidativa. Cules son los productos finales del catabolismo de los carbohidratos en las levaduras? 5. Enliste los inhibidores de la cadena respiratoria de los sitios I, II y III. Describa su efecto sobre el consumo de 02 y la sntesis de ATP. 6. Explique brevemente el mecanismo por medio del cual los protonforos desacoplan la fosforilacin oxidativa; describa su efecto sobre el consumo de O 2 y la sntesis de ATP. 7. En que se basa el ensayo de Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) PRCTICA VI

ESTUDIO DEL BOMBEO DE PROTONES POR LEVADURAS

EFECTO DE LOS INHIBIDORES DE LA ELECTRONES Y DE LOS DESACOPLANTES Introduccin CADENA

DE

TRANSPORTE

DE

El metabolismo energtico es la base de las funciones celulares. Una adecuada transferencia de electrones a travs de una serie de reacciones redox garantiza la obtencin de sustratos energticos necesarios para el ptimo funcionamiento de las clulas. En la membrana interna mitocondrial se encuentran la cadena respiratoria, que est formada por protenas que se ensamblan en complejos multiproticos denominados I, II, III y IV. El complejo I denominado NADH-deshidrogenasa recibe los electrones de la oxidacin del NADH y los transfiere a la coenzima Q, la cual se desplaza libremente a travs de la membrana interna mitocondrial; el complejo II, succinato deshidrogenasa se encarga de transferir los electrones del succinato a la coenzima Q, sin translocar protones; el complejo III, citocromo c-coenzima Q oxidoreductasa recibe los electrones de la coenzima Q y los transfiere al citocromo c, un transportador electrnico protico soluble que se encuentra en el espacio intramembranal; y el complejo IV o citocromo oxidasa acopla la oxidacin del citocromo c con la reduccin del oxgeno molecular a agua. Las reacciones globales de los complejos I, II, III y IV son exergnicas y la energa liberada en ellas crea un gradiente de protones a travs de la membrana interna mitocondrial al resultar los protones bombeados al espacio intermembranal. Este

gradiente de protones libera la energa suficiente para que tenga lugar la sntesis de ATP por la ATP-sintasa.

Un mtodo indirecto el cual se utiliza ampliamente para evaluar la funcionalidad mitocondrial es el desarrollado por Mosmann en 1983, el cual se basa en la reduccin de MTT (Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol) por las deshidrogenasas mitocondriales. En trminos generales, las sales de tetrazolio al reducirse pasan al estado formazn, el cual es un compuesto de color azul e insoluble en agua. El empleo de esta tcnica nos permite evaluar la actividad de los complejos de la cadena respiratoria bajo diferentes condiciones experimentales. Objetivos 1. Relacionar el consumo de glucosa con los cambios de pH producidos por las levaduras 2. Evaluar el efecto de diferentes inhibidores y los desacoplantes de la cadena de transporte de electrones en la funcionalidad mitocondrial a travs de la reduccin de MTT. 3. Correlacionar los cambios de pH con la reduccin de MTT.

Hiptesis Si las levaduras consumen glucosa entonces se observar una disminucin progresiva de su concentracin en el medio de cultivo con el tiempo y estarn relacionados con los cambios en el pH extracelular. Si las deshidrogenasas mitocondriales reducen al MTT, entonces el empleo de algn inhibidor de la cadena de transporte de electrones disminuir la capacidad reductora de estas enzimas, reflejndose as una disminucin en la reduccin del MTT, la cual estar relacionada con la funcionalidad mitocondrial. Material 4 vasos de precipitado de 100 ml 2 Pipetas de 5 y l0 ml 6 tubos eppendorf de 2 mL 1 micropipeta de 100 L y 1ml con puntas Espectrofotmetro Potencimetro Celdas de espectofotmetro Piceta *Levadura (Saccharomyces cerevisiae) 200 mg/ml

Solucin de glucosa al 10 % Solucin de dinitrofenol 40 mmol/L en etanol Solucin de azida de sodio 400 mmoI/L Agua destilada Solucin MTT (5mg/mL) Isopropanol cido (192ml de isopropanol + 8ml de HCl) *base de unicel *lo debe traer el alumno Mtodo

Experimento 1 (control)
1. Diluir 5ml de la levadura con 40ml de agua destilada 2. Determinar el pH de la solucin repitiendo la medicin dos veces (total tres) con intervalos de 3 minutos para obtener la lnea basal 3. Adicionar 5ml de glucosa al 10%, agitar y medir el pH 4. Determinar el pH de la solucin cada 5min (4 veces) y luego cada 10min (2 veces ms)

Experimento 2 (dinitrofenol)

1. Diluir 5ml de la levadura con 40ml de agua destilada 2. Aadir por decantacin (no pipetear) 0.2 ml de la solucin de dinitrofenol 40mmol/ L, concentracin final de 200 mol/L 3. Determinar el pH de la solucin repitiendo la medicin dos veces ms con intervalos de 3 minutos para obtener la lnea basal 4. Esperar 5minutos 5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento control

Experimento 3 (azida de sodio)

1. 2.

Diluir 5ml de la levadura con 40ml de agua destilada Aadir por decantacin (no pipetear) 0.5 ml de la solucin de azida de sodio 400mmol/L, concentracin final de 5mmol/L. Agitar con cuidado 3. Determinar el pH de la solucin repitiendo la medicin dos veces ms con intervalos de 3 minutos para obtener la lnea basal 4. Esperar 5 minutos 5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento control Experimento 4 (Reduccin de MTT) 1. Tomar 1.5 mililitros de las soluciones de levaduras de los experimentos 1, 2, 3, 15 minutos despus de haber adicionado los inhibidores y colocarlo en un tubo eppendorf de 2 mL (Todo se realiza por duplicado).

2. 3. 4. 5. 6.

Agregar a cada tubo 12L de MTT (5mg/mL) e incubar los tubos 20 min a 37C. Pasado el tiempo de incubacin, sacar los tubos y observar la coloracin. Centrifugar los tubos a 12000 rpm durante 3 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender en 1 mL de isopropanol-cido. Leer las muestras a 570nm.

Anlisis de Resultados 1. Hacer una grfica de los experimentos 1, 2 y 3, usando los valores de las lecturas de pH contra tiempo. 2. Discutir el significado de los cambios de pH en el experimento control, con dinitrofenol como desacoplante y con azida de sodio como inhibidor. 3. Para el experimento 4 hacer una curva en porcentaje considerando la absorbancia de los tubos control como el 100% de la capacidad de las mitocondrias de las levaduras de reducir el MTT y ver que efecto tienen los inhibidores y/o desacoplantes empleados. 4. Hacer una relacin de las vas que producen estos cambios, tomando en cuenta que las levaduras poseen una ATPasa de protones en la membrana mitocondrial que se encarga de sintetizar ATP; y que tienen otra ATPasa de protones en la membrana plasmtica cuya funcin es similar a la bomba de Na+/K+ en las clulas de los mamferos. Referencias 1. Mosmann T. 1983. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assay. J. Immunol. Methods 65: 5563. Pea A.1975. Studies on the mechanism of K+ transport in yeast. Arch. Biochem Biophys 167:397-409. 3. Pardo JP.1990. La ATPasa de H+ de la membrana plasmtica de los hongos. Mensaje Bioqumico. 13:119-172. 2.

CUESTIONARIO 1. Qu es el ciclo del glioxilato? 2. Qu es el glioxisoma? 3. Realice un esquema del ciclo del glioxilato y seale las reacciones catalizadas por la isocitrato liasa y la malato sintasa 4. Dnde se utiliza el succinato producido en esta va? 5. Explique como se regula el ciclo del glioxilato 6. Describa la va de sntesis de sacarosa en plantas PRACTICA VII METABOLISMO DE LIPIDOS CON VERSION DE GRASAS A SACAROSA Introduccin Desarrollada por el alumno Germinacin de semillas. El glioxisoma; ciclo del glioxilato, enzimas (Isocitrato liasa y malato sintasa). Diferencias entre el proceso de degradacin de cidos grasos de animales y plantas. Objetivos Demostrar que los lpidos de las semillas de ajonjol son transformados a sacarosa Cuantificar la cantidad de lpidos, carbohidratos y protenas de semillas germinadas y no germinadas 1. Explicar las diferencias en ambos tipos de semillas tomando en cuenta el ciclo de glioxilato durante el proceso germinativo. Hiptesis Formulada por el alumno. Las consideraciones a tomar sern: 1. Diferencias en el contenido de lpidos, carbohidratos y protenas de semillas germinadas y no germinadas. 2. Importancia del ciclo del glioxilato en el proceso germinativo.

Materiales parafilm 2 frascos de boca ancha 2 pipetas Pasteur ligas 4 vasos de precipitado de 50 ml paquete de gasas 1 vaso de precipitado de 250 ml papel aluminio 4 pipetas 1 ml charola 2 pipetas 5 ml 20 tubos de ensaye 2 pipetas 10 ml gradilla mechero, tripe, tela de asbesto recipiente para hielo 2 pipetas Pasteur 8 tubos eppendorf Piceta 2 embudos Micropipetas 100 l y 1 ml com puntas papel filtro 8 celdas de espectrofotmetro propipetas Hielo sanitas o servitoallas 4 jeringas con aguja (3 ml)* Equipo Reactivos balanza granataria y Mezcla cloroformo-metanol 2:1 esptula Solucin amortiguadora de fosfatos 0.1M, pH microcentrfuga 7.5, 3mM de MgCl2 bao mara Reactivo de Biuret. espectrofotmetro Solucin patrn de glucosa 150 g/ml. mechero, tripi, tela de Solucin patrn de casena 20 mg/ml asbesto Solucin de NaCl al 1% Sol. de hipoclorito de sodio al 1%. Sulfato de sodio anhidro Material biolgico 10 gr de semillas de ajonjol* *material que debe traer el alumno

Procedimiento Consta de varios pasos los cuales se numeran a continuacin

I. Germinacin de las semillas.

1 Pesar 4 lotes de semillas de ajonjol de 2.5 g cada uno. 2. Lavar 2 lotes de las semillas con 50 ml de sol. de hipoclorito de sodio y enjuagarlas con agua previamente hervida y enfriada. 3 Colocar en cada uno de dos frascos de boca ancha, 2.5 g de semillas, tapar con 2 capas de gasa sostenindolas con una liga. Guardar los dos lotes de semillas restantes. 4. En una bandeja con un poco de agua colocar los dos frascos boca abajo. Mantenerlos frascos en la bandeja con agua durante 4 das tapados con papel aluminio, a temperatura ambiente.

II. Preparacin de los extractos

1. Homogenizar en un mortero a baja temperatura (colocar en hielo), 2.5 g de semillas germinadas y por separado 2.5 g de semillas sin germinar, cada lote con 10 ml de solucin amortiguadora de fosfatos pH 7.5, MgCI2 3 mM. 2. Centrifugar 15 000 rpm durante 15 minutos. Si es necesario filtrar los sobrenadantes a travs de varias capas de papel filtro, a que los filtrados salgan claros. Guardar los extractos en fro mientras se utilizan.

III.- Determinacin de protenas

Tubos Sol. Patrn de casena (ml) Ext. Enz.Sin germ.(ml) Ext. Enz. Germinado (ml) Ext. Enz. Sin germ. Diluido 1:10 (ml) Ext. Enz. germinado Diluido 1:10 (ml) NaCl 1%(ml) Reactivo de Biuret (ml) El tubo 9 corresponde al blanco. Despus 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 5 4 1 5 4 6 4

0.25 0.5 0.75 1 - - 1 - - 1 - - - - 5.75 5.5 5.25 5 5 5 4 4 4 4 4 4 de 30 min. Leer a 540 nm.

IV.- Determinacin de carbohidratos

Tubos
Sol. Patrn de glucosa (ml) H2O Destilada (ml) Ext. Enz. Sin germ. 1:20 (ml) Ext. Enz. Germinado 1:20 (ml) Ext. Enz. Sin germ. Diluido 1:50 (ml) Ext. Enz. germinado Diluido 1:50 (ml) Reactivo Somogyi

1 0.2 0.8 1.0 1.0

2 0.4 0.6 1.0 1.0

3 0.6 0.4 1.0 1.0

4 0.8 0.2 1.0 1.0

5 1.0 0 1.0 1.0

6 0.5 0.5 1.0 1.0

7 0.5 0.5 1.0 1.0

8 0.5 0.5 1.0 1.0

9 0.5 0.5 1.0 1.0

10 1.0 1.0 1.0

COLOCAR ESTOS TUBOS TAPADOS DURANTE 20 min EN BAO MARA. DESPUS, ENFRIARLOS CON AGUA DE LA LLAVE R. Arsenomolibdato

AGITAR UNA VEZ QUE HAYA CESADO LA EFERVESCENCIA, DEBE DILUIRSE CADA TUBO CON AGUA DESTILADA HASTA OBTENER UN VOLUMEN TOTAL DE 10 ml.

Calibrar el espectrofotmetro con el tubo 10. Leer la absorbancia a 540 nm.

V. Determinacin de lpidos
1. Lavar y secar perfectamente dos vasos de precipitados de 25 ml y pesarlos. 2. Tomarlos dos lotes de semillas restantes (uno sin germinar y otro germinado) y pasar cada grupo de semillas por separado a un mortero para macerarlas con 10 ml de sol. Cloroformo-metanol fra (Evitar que las semillas germinadas pasen con agua). 3. Separar el sobrenadante pasndolo a u tubo para centrifuga convenientemente rotulado. 4. Volver a homogenizar las semillas con 5 ml de cloroformo-metanol y pasar el sobrenadante a su respectivo tubo de centrfuga. 5. Centrifugar a 3000 r.p.m. durante 5 minutos. 6. Si se observa agua en el sobrenadante, filtrar a travs de sulfato de sodio anhidro. 7 Pasar los sobrenadantes a sus respectivos vasos y eliminar los solventes mediante calentamiento en bao Mara y pesar los vasos nuevamente. 8. Por diferencias, calcular la cantidad de lpidos en cada lote de semillas. Procesamiento de los datos. Resultados 1) Graficar absorbancia vs. mg de protena y obtener lo siguiente: a) Pendiente, ecuacin de la recta y ordenada al origen (tomar en cuenta diluciones) b) Calcular lo siguiente para cada lote de semillas (germinados y sin germinar) Miligramos de protena/ml de extracto Miligramo de protena/gramo de semillas 2) Graficar absorbancia vs. mg de carbohidratos y obtener lo siguiente: a) Pendiente, ecuacin de la recta y ordenada al origen b) Calcular lo siguiente para cada lote de semillas (germinados y sin germinar) Microgramos de carbohidratos/ml de extracto Microgramos de carbohidratos/gramos de semilla 3) Calcular por diferencia de peso miligramos de lpidos/gramo de semilla.

4) Completar la siguiente tabla: Lpidos Carbohidratos Protenas (mg/mL) (g/mL) (mg/mL) Semillas germinadas Semillas no germinadas 5) Comparar los resultados obtenidos en los lotes de semillas germinadas contra los obtenidos en los lotes de semillas sin germinar. Discusin 1. Hubo diferencias entre la cantidad de lpidos, carbohidratos y protenas de semillas germinadas y no germinadas? 2. A qu se debieron las diferencias en dichos casos y por qu se realizaron diluciones? 3. Qu importancia tiene el ciclo del glioxilato para el proceso germinativo? 4. En qu procesos metablicos de la semilla interviene los lpidos, protenas y carbohidratos? 5. Qu ventaja evolutiva pueden tener los organismos que realizan el ciclo del glioxilato? 6. Qu procesos metablicos ocurren durante la germinacin de las semillas? 7. Mencione alguna utilidad desde el punto de vista biotecnolgico del ciclo del glioxilato Conclusiones Se cumplieron todos los objetivos? Referencias Stryer L. 1988. Bioqumica. 3era ed. Revert. Mxico. 394-395 pp. Importante: en el texto de la Introduccin o Discusin deber citarse claramente quin dijo qu, por ej. ... una reaccin catalizada por la malato sintasa (Stryer , 1988).

CUESTIONARIO 1. Dibuje un cloroplasto y seale las diferentes partes que lo componen 2. Qu es un fotosistema y como es el proceso de la generacin de O 2 durante la fotosntesis? 3. Cul es el papel bioqumico de la clorofila a, b y carotenos? 4. En cuntas fases se divide la fotosntesis, en qu fase de la fotosntesis se reduce el NADP+ y el ADP se fosforila en ATP, en qu fase se fija el carbono? 5. Cmo se llama la enzima que se encuentra en el ciclo de Calvin y es la encargada de fijar el CO2 y cules son los productos finales del ciclo de Calvin y cul de ellos es un precursor de hexosas? 6. Cul es el objetivo de utilizar DCPIP es esta prctica? 7. Qu es un herbicida? 8. Seale el sitio de inhibicin del DCMU PRCTICA VIII REDUCCIN DEL 2-6 DICLOROFENOL-INDOFENOL (DCPIP) DEPENDIENTE DE LA ACTIVIDAD FOTOSINTTICA DE CLOROPLASTOS AISLADOS DE Spinacea oleraceae (espinaca) Introduccin: En los vegetales superiores los cloroplastos se presentan generalmente como cuerpos ovales de aproximadamente 5 a 10 m de largo. Es en los cloroplastos donde se llevan a cabo las reacciones fotosintticas de las clulas eucariticas. El proceso fotosinttico en plantas superiores, lo podemos separar en dos fases: la primera, llamada fase luminosa fotoqumica, requiere de la energa luminosa y sus productos principales son: ATP, NADPH y O2. La segunda fase, tambin llamada la fase obscura de la fotosntesis, requiere del ATP y de NADPH para transformar, por medios bioqumicos, al C02 en carbohidratos y otros productos. En 1937, Roberto Hill observ que un homogenizado de hojas conteniendo cloroplastos intactos, tena la capacidad de reducir el oxalato de potasio frrico (un aceptor artificial de electrones) en presencia de la luz con desprendimiento de O2. La reaccin podra representarse de la siguiente manera: Luz H2O + Aceptor de electrones

1/2 de O2 + Aceptor de e- reducido

La absorcin de la luz por los pigmentos fotosintticos es el primer evento de la

fotosntesis, siendo la clorofila el principal pigmento en bacterias fotosintticas, algas y plantas superiores. Actualmente se sabe que las reacciones fotoqumicas de la fotosntesis se llevan a cabo en el sistema de membranas tilacoidales, que se encuentran en el interior de los cloroplastos, mientras que en las reacciones de la fase obscura se realizan en el estroma. Objetivo Determinar colorimtricamente la actividad fotosinttica de los cloroplastos en diferentes condiciones mediante la reduccin del DCPIP. Material y Mtodos Soluciones: Las siguientes soluciones se prepararn para todos los equipos, a excepcin de la acetona al 80% que es por equipo. Medio de aislamiento de cloroplastos. Preparar 500 ml de una solucin con agua desionozada, que contenga sacarosa 400 mM, tricina 20 mM, KCl 20 mM, MgCl2 5 mM, se ajusta el pH a 8.0 con KOH Medio de reaccin. Preparar 500 ml de una solucin con agua desionizada, que contenga sacarosa 100 mM, MgCl2 5 mM, KCl 10 mM, tricina 15 mM, KCN 0.5 mM, se ajusta el pH a 8.0 con KOH. Medio de reaccin con DCPIP. Tomar 400 ml de medio de transporte de electrones y agregar la cantidad necesaria para obtener una solucin 0.3 mM de DCPIP en el medio de transporte de electrones. 10 ml de acetona al 80% (por equipo Herbicida comercial, DCMU (dicloro metil urea) 3 mM. NOTA: Se prepararn 10 ml de DCMU 3mM disueltos en etanol, el DCMU preparado se encontrar en el congelador, en donde se guardara nuevamente para los siguientes grupos que realicen la prctica.

Matraz de 250 ml Pipeta Pasteur 2 vasos de precipitado de 50 ml Agua destilada y desionizada 6 tubos de centrfuga *Cubreobjetos y portaobjetos 7 tubos de ensaye *1 lmpara de luz incandescente de 6 tubos de espectrofotmetro 150 watts 1 probeta de 100 ml y 50 ml Hielo picado Micropipeta de 100ml y 1 l con 1 mortero o una licuadora puntas *1 reloj (cronmetro) 1 embudo 1 charola grande 2 pipetas graduadas de 10 ml *Papel aluminio 2 pipetas graduadas de 5 ml *Toallas de papel o sanitas 2 pipetas graduadas de 1 ml *Parafilm recipiente metlico para hervir *Gasa Soporte, anillo, mechero y tela de *Papel filtro asbesto *Hojas frescas de espinaca Agitadores de vidrio *base de unicel *Espejo *Material que debe traer el alumno *tela negra

Precaucin: El aislamiento de los cloroplastos debe realizarse a una temperatura entre 0C y 5C y en obscuridad. A. Obtencin de cloroplastos: 1 Seleccionar aprox. 40 g de hojas frescas de espinaca, lavarlas con agua de la llave, procurando que el agua no caiga directamente sobre las hojas y secarlas con toallas de papel 2. Cortar el tallo, la nervadura principal y el pice de cada hoja y desecharlos 3. Colocar los en un vaso de licuadora previamente enfriado en hielo y agregar 100 ml de medio de aislamiento fro, homogenizar a la velocidad ms alta por unos segundos, destapar la licuadora y con una esptula mover los pedazo de hoja de arriba hacia abajo, para cuando se mjense de nuevo no daar los cloroplastos por dao mecnico, homogenizar nuevamente por unos segundos, hasta obtener pedacitos muy pequeos de hoja de aprox. 3 Mm de dimetro. 4. Filtrar la suspensin usando 8 capas de gasa, recoger el filtrado en dos tubos de centrfuga de 15 ml cada uno, previamente enfriados en hielo, repartir equitativamente el filtrado y balancear los tubos. 5. Centrifugar por 5 min. a 4000 rpm, decantar el sobrenadante y desecharlo. 6. El sedimento se resuspende con 2.0 ml de medio de aislamiento de cloroplastos. Durante toda la prctica se mantienen los cloroplastos en bao de hielo.

10. Tomar, con una pipeta Pasteur, una gota de la suspensin de cloroplastos y observarla al microscopio. 11. Tomar 0.5 ml de la suspensin de cloroplastos en un tubo de ensaye y ponerla durante 10 minutos en agua hirviendo Suspensin de cloroplastos hervidos, y observarlos al microscopio. B. Cuantificacin de clorofila: 1. Para determinar la concentracin de clorofila, colocar en dos tubos de centrifuga (los ensin de cloroplastos 2. Cubrir con parafilm, los tubos, agitarlos bien e incubar el tubo en la obscuridad por 5 minutos. 3. Centrifugar los tubos a 5000 r.p.m. durante 5 minutos, y colocar el sobrenadante en tubos de espectrofotmetro. 4. Leer su absorbancia a 645 y 663 nm calibrando el cero de absorbancia con acetona al 80% (Esto se hace por duplicado) 5. [Chl en g] = [ 8.05 (Abs663) + 20.29 (Abs645)] 5 Recuerde que la cuantificacin se realiz por duplicado C. Determinacin de la reduccin del DCPIP 1. Para determinar la reduccin del DCPIP preparar 5 tubos de espectrofotmetro como se indica en la tabla siguiente: Tubos de espectrofotmetro 1 2 3 0 0 3 3 0 0 4 3 0 0 5 3 0 50 l

Medio de reaccin con ml 0 DCPIP (300 M) Medio de reaccin sin DCPIP ml 3 Herbicida comercial Suspensin de cloroplastos ml 0

ml 60 g 0 g 60g 60 g 60 g

2. Colocar los tubos en una gradilla de unicel. 3. Tapar los tubos con papel parafilm y mezclar su contenido invirtindolo

suavemente.

Evitar la formacin de burbujas 4. Tapar el tubo 4 con papel aluminio 5. Medir inmediatamente la absorbancia de cada uno de los tubos a la longitud de onda de 660 nm de. Ajustar acero con el tubo 1. Anotar los resultados tiempo cero. 6. Colocar todos los tubos frente a una lmpara de 150 watts a 10 cm de distancia durante 1 minuto y tomar nuevamente lectura en el espectrofotmetro. Repetir este proceso 4 veces ms 7. Hacer una grfica de Absorbancia contra tiempo, interpretarla y discutirla.

PRCTICA IX ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA PIRUVICO TRANSAMINASA Introduccin Las reacciones de transaminacin son catalizadas por las aminotransferasas y se llevan a cabo en todos los organismos durante el metabolismo de aminocidos. Estas enzimas se encuentran prcticamente en todos los tejidos pero abundan en el corazn, cerebro, riones, testculos e hgado y en los vegetales durante la maduracin de las semillas. En la reaccin enzimtica se realiza la transferencia de un grupo amino (-NH2) de un aminocido a un cetocido. La transaminasas ms abundantes en la naturaleza son: la glutmico-oxaloactica (GOT) y la glutmico-pirvica (GPT), la cual es tambin conocida como Alanina aminotransferasa la cual cataliza la transferencia del grupo amino de la Alanina al -cetoglutarato. Los productos de esta reaccin reversible de transaminacin es el piruvato y el glutamato como es presentado en la siguiente reaccin: GPT L-Alanina + -Cetoglutarato ------> Piruvato + L-Glutamato En el plasma, la actividad de estas enzimas es indicador de algunas patologas, tales como el infarto o el traumatismo del msculo esqueltico, ya que ambos provocan un aumento en dicha actividad enzimtica. Para medir cuantitativamente la actividad de la GPT, se mide la cantidad de cetocido (cido pirvico) obtenido durante la reaccin. Los cetocidos reaccionan en forma estequiomtrica con la 2,4 -dinitrofenilhidrazina, dando lugar a un compuesto colorido que tienen un mximo de absorcin a 505 nm. Objetivo general Medir la actividad enzimtica de la Alanina aminotransaminasa en un extracto crudo de semillas de chcharo mediante un mtodo espectrofotomtrico. Objetivos particulares Determinar parmetros cinticos, tales como Km y Vmax de la transaminasa extrada de chcharos frescos. Material: 1 charola para hielo 1 Centrifuga clnica 1 Mortero con pistilo 1 Embudo de vidrio 6 tubos de centrifuga

15 tubos de ensayo 1 Gradilla para tubos 1 Pipeta graduada de 10 mL 1 Pipeta Pasteur 3 Pipetas de 1 mL graduadas en 1/100 3 Pipetas graduadas de 5 mL 2 Pipetas graduadas de 10 mL 1 Vaso de precipitados de 600 mL 1 Mechero 1 Tripie con tela de asbesto Espectrofotomtro 6 tubos para espectrofotmetro Micropipeta de 100l y 1 ml con puntas

Material proporcionado por el ALUMNO (A):

Chicharros en vaina Navaja filosa Arena fina Gasa

Reactivos.

Solucin patrn de piruvato (Acido piruvico 1 mM). Sustrato (Alanina/-cetoglutarato 1 mM/ 1mM). Solucin amortiguadora de Tris-HCl 0.1 M pH 7.5 y EDTA 4%. Solucin amortiguadora de Tris-HCl 40 mM pH 7.5 y EDTA 0.25 mM. Reactivo de Color (Solucin de 2,4-dinitrofenilhidrazina al 0.01% en HCl 1.0 N). Solucin de Hidrxido de sodio 0.4 N.

Procedimiento.

A. Procedimiento de obtencin de la enzima:

1.-Poner el mortero en la charola con hielo (bao de hielo). 2.- Pesar 10 gramos de chcharos, picarlos con una navaja sobre el mortero fro. 3.- A los trozos de chcharo, adicionar 20 mililitros de la solucin amortiguadora de TrisHCl 40 mM, una cucharadita de arena fina y macere hasta obtener una suspensin homognea (manteniendo siempre el mortero en el bao de hielo). 4.- Filtrar la suspensin homognea de chicharos a travs de cuatro capas de gasa, y con ayuda de un embudo de vidrio recuperar el filtrado en un tubo de centrfuga. 5.- Equilibrar los tubos de centrfuga, y centrifugar a 3 000 rpm por 5 minutos. 6.- Recuperar con una pipeta Pasteur la parte liquida (sobrenadante), teniendo cuidado de

no tocar el botn. El sobrenadante colocarlo en un tubo de ensaye y etiquetarlo como enzima, mantener la enzima siempre en bao de hielo.

B. Efecto de la concentracin de sustrato y curva patrn.

1.- Preparar un bao a 37C. 2.- Prepare los siguientes tubos de acuerdo a la siguiente tabla: Reactivos Patrn de pirvato (mL) Agua destilada (mL) Sustrato (mL) 1 0 1.2 --2 0.1 1.1 --3 4 5 6 7 0.2 0.4 0.6 0.8 --1.0 --0.8 0.6 0.4 --------0 8 ----9 ----10 ----11 ----12 ----13 ------

0.0 5 Tris-HCl 0.1M --- --- --- --- --- --- 1.0 0.9 pH 7.5 (mL) 5 Enzima (mL) --- --- --- -- --- --- 0.2 0.2 INCUBAR A 37C por 30 minutos (mL) Sol. 2-4 1 1 1 1 1 1 1 1 dinitrofenilhidrazi na AGITE VIGOROSAMENTE Y ESPERE 20 minutos NaOH 1 N 5 5 5 5 5 5 5 5 Deje reposar por 5 minutos Leer la absorbancia a 505 nm Resultados.

0.1 0.2 0.4 0.8 1.0 0 0 0 0 0.9 0.8 0.6 0.2 0 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 1 1 1 1 1

1.- Tabular los datos obtenidos de la absorbancia para la curva patrn: mL de solucin patrn 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 molas de pirvico Absorbencia a 505 nm

2.- Realizar una grfica usando como en el eje de las X las molas de pirvico y en el eje

de las Y la absorbancia. Si los puntos no quedan dentro de la recta, normalice haciendo una regresin por mnimos cuadrados. 3.- Tabular los siguientes datos: Tubo No. Sustrato Molas Absorbencia de Alanina 505 nm Producto molas de pirvico/30 minutos

7 8 9 10 11 12 13

4.- Con ayuda de la curva patrn calcule las molas de pirvico obtenidas en cada uno de los tubos de incubacin 5.- Para determinar Km y Vmax, grafique la inversa de la vo (velocidad inicial: molas de pirvico/min) como ordenadas, versus la inversa de la concentracin de sustrato [S] ( molas de alanina). Cuestionario. 1.- Qu mtodo de graficacin se utiliz para calcular la Km y la Vmax de la transaminasa? 2.- Todas las transaminasas deben tener el mismo valor de Km? 3.- La Km obtenida en este experimento representa gran afinidad por su sustrato? Explique. 4.- Qu trascendencia tiene la determinacin de Km para el metabolismo de aminocidos? Referencia. David L. Nelson; Michael M. Cox. LEHNINGER. PRINCIPIOS DE BIOQUMICA. Ediciones Omega. ISBN: 8428212082. ISBN-13: 9788428212083. Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter. MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL. Fourth edition. 2002.