1

Anderson Lab In Situ Hybridization Protocols

March 1997

These  protocols  describe  non­radioactive methods  for  in  situ  hybridization   on 

frozen  sections,  whole  mount  embryos and on cultured cells. They  have been freely 
adapted   and   modified   from   the   protocols   of   Richard   Harland,   David   Wilkinson, 
Domingos Henrique, Andy McMahon, Tony Campagnioni, and others.  This protocol is 
modified from the November 1995 version previously circulated.
 2

I: In Situ Hybridization of Frozen Sections

Sections are collected on Superfrost/Plus slides purchased from Fisher and dried 
in air for one hour at room temperature, then stored at  ­20°C.  Alternatively, use RNAse 
­ free slides coated with TESTA, in which case you must dry two hours.  It is sometimes 
necessary to wash the slides in DEPC­PBS and three changes of DEPC­water before 
storing at ­20°C. This depends on both the probe and embedding material used. Details 
of how to prepare TESTA coated slides are in the Appendix.

A: Pre­Treatment of Sections

N.B. All reagents and mailers in the following steps must be RNAse­free. 
In this section, steps 6 and 7 (the acetylation) is vital for some probes, but raises the 
background for others.  Some probes, like SCG­10, Brn­3 and neurofilament, work 
best without acetylation.  Other probes, like GATA­2, require it.   Some work okay 
without it but have improved signal to background if acetylation is included.  I 
recommend comparing sister slides with and without acetylation the first time you 
try a probe.  

1. Warm slides to room temperature and dry at 50°C for 15 minutes.
2. Fix in 4% paraformaldehyde in DEPC­PBS at room temperature for 20 minutes.
3. Wash twice in DEPC­PBS at room temperature for 5 minutes.
4. Treat slides with 50µg/ml Proteinase K in PK buffer at room temperature for between 
8­15 minutes depending on the age of the embryo.
5. Wash once in DEPC­PBS at room temperature for five minutes. Fix in 4% 
paraformaldehyde in DEPC­PBS for 15 minutes.
6. Rinse once in DEPC­water.
7. Place slides in an RNAse­free glass trough with a stir bar. Add 250ml 0.1M RNAse­
free triethanolamine­HCl pH 8.0. Add 0.625ml acetic anhydride (CARE!) with constant 
stirring. Turn off stirrer when the acetic anhydride is dispersed and leave for a further 10 
minutes.
8. Wash slides in DEPC­PBS at room temperature for five minutes.
9. Prehybridise for 3­4 hours at 60°C. Replace with 1­2µg/ml of probe and continue 
incubation for a further 12­16 hours.  These steps should be performed in the 
 3

hybridization oven, not the regular 60°C oven, as the latter does not maintain its 
temperature well.
 N.B.   We have found that the most effective way to carry out the hybridisation is in slide 
mailers. It is a good idea to thoroughly seal the lids of the slide mailers with parafilm to 
prevent evaporation of probe. 

B: Washing Steps

N.B. After hybridisation, it is not necessary to use RNAse­free buffers. 
1. Place slides in a trough with a stir bar. Wash in 1xSSC at 60°C for 10 minutes.
2. Wash in 1.5xSSC at 60°C for 10 minutes. Cool slides to 37°C.
3. Wash twice in 2xSSC at 37°C for twenty minutes each.
4. Treat with 0.1µg/ml RNAse A in 2xSSC at 37°C for 30 minutes.
5. Wash in 2xSSC at room temperature for 10 minutes.
6. Wash twice in 0.2xSSC at 60°C for 30 minutes each.
7. Wash once in 0.2xSSC at room temperature for 15 minutes.
8. Wash once in PBT for 15 minutes.
9. Incubate slides in 20% heat­inactivated sheep serum in PBT for between one and five 
hours at room temperature. For some probes, the longer incubation seems to cut down 
on background.

C: Antibody Visualisation of Digoxygenin

1. Incubate slides with pre­absorbed anti­digoxygenin antibody (coupled to alkaline 
phosphatase) diluted to a final concentration of 1:2000 in 20% sheep serum in PBT at 
4°C overnight.
2. Wash three times in PBT at room temperature for 30 minutes each.
3. Wash twice in Alkaline Phosphatase buffer at room temperature for 5 minutes each. 
Levamisole is sometimes included in the second wash and reaction buffer as an 
inhibitor of endogenous alkaline phosphatase, but on most embryo sections the 
endogenous activity does not survive the hybridization procedure.
4. For every ml of Alkaline Phosphatase buffer, add 1µl of NBT and 3.5µl of BCIP, and 
develop in the dark for between 2­20 hours, depending on the abundance of the RNA. 
Since the alkaline phosphatase enzyme is very stable, it is possible to wash out the 
NBT/BCIP, replace with alkaline phosphatase buffer , and to continue the reaction at a 
later time.
 4

5. Wash twice in PBS to remove substrates.
6. Fix slides in MEMFA for at least 15 minutes at room temperature. Mount slides in 
glycerol/PBS.

N.B. If the BCIP/NBT precipitate is not fixed, it will slowly darken over the course of 
about a month.  Eventually, the background will become too dark.

Additional Protocols for sections: Double label protocols.

These modifications were contributed by Tetsuchiro Saito.

Modifications for two probe double label protocol
This protocol works best for demonstrating two populations of cells expressing two 
separate markers, since both products are cytoplasmic, and the NBT/BCIP product 
(purple) can obscure the INT/BCIP product (red).

A: Preparation of probes. 
1. A probe is prepared by using fluorescein RNA labeling mix in place of digoxygenin 
NTPs.

B: Hybridization.
Both the digoxygenin labeled probe and the fluorescein labeled probe are included in 
the hybridization buffer at 1­2µg/ml each.

C: Staining.
The following steps are performed in slide mailers. 
1. Sections are incubated with either anti­fluorescein­AP Fab fragments or anti­
digoxygenin­AP Fab, pre­absorbed and at the appropriate dilution in 20% sheep serum 
in PBT, at 4°C overnight.  Stain the weaker probe first.
2. After washing, stain with NBT/BCIP as in the normal protocol, until staining reachs 
the desired intensity.
 5

3. Wash three times in PBS at room temperature for 5 minutes each to remove substrates.
4. Incubate in TE (100mM Tris­HCl pH 7.5, 50mM EDTA) at 85°C for 10 minutes to 
inactivate alk­phos.  Use the 68°C water bath turned up to 85°C.
5. Wash three times in PBS at room temperature for 5 minutes each.
6. Wash once in PBT at room temperature for 10 minutes.
7. Incubate slides in 20% heat­inactivated sheep serum in PBT at room temperature for 
30 minutes.
8. Incubate slides with the other antibody at 4°C overnight.  If you used anti­fluorescein 
originally, use anti­digoxygenin as the other antibody, and vice versa.
9. Wash three times in PBT at room temperature for 30 minutes each.
10. Wash twice in Alkaline Phosphatase buffer at room temperature for 5 minutes each. 
11. For every ml of Alkaline Phosphatase buffer, add 7.5µl INT/BCIP stock solution, and 
develop in the dark for between 2­20 hours, depending on the abundance of the RNA.
N.B. Anti­digoxygenin­AP Fab final concentration is 1:2000.  Anti­fluorescein­AP is used 
at 1:4000.

Modifications for one probe, one antibody double label protocol

Since each antibody epitope can vary in stability, this protocol must be specifically 
tailored for the antibody used.  Tetsuchiro does not recommend trying membrane or 
cytoplasmic antigens for double label; nuclear antigens best survive the hybridization 
procedure.  This is the protocol I have used for combining the quail nuclear antigen with 
in situ hybridization.  (PMW)

A: Pre­Treatment of Sections
Test different proteinase K concentrations to find which provides the best compromise 
between in situ signal and antibody signal.  For example,
100% proteinase K 50µg/mL
10% proteinase K 5µg/mL
1% proteinase K 0.5µg/mL
substituted into the normal hybridization procedure.  Also try the following:
1. Warm slides to room temperature and dry at 50°C for 15 minutes.
 6

2. Fix in 4% paraformaldehyde in DEPC­PBS at room temperature for 20 minutes.
3. Wash twice in DEPC­PBS at room temperature for 5 minutes.
4. Prehybridise for 3­4 hours at 60°C. Replace with 1­2µg/ml of probe and continue 
incubation for a further 12­16 hours. 

B: Washing Steps
Follow the normal protocol for stringency washes through the 15 minute wash with PBT 
(steps 1 ­ 8).
9. Block with 1% goat serum, 1% BSA, 0.5% Triton in tissue­culture grade D­PBS at room 
temperature for 1 hour.
10. Incubate overnight with 1:1 QCPN supernatant and 1% goat serum, 1% BSA, 0.2% 
Triton in TC D­PBS.

C: HRP Development
1. Wash three times in PBT at room temperature for 5 minutes each.
2. Wash three times in PBS at room temperature for 5 minutes each.
3. Inactivate the endogenous peroxidase with 0.3% H2O2 in methanol at room 
temperature for 30 minutes.  I have tested slides pre­treated with 1µg/mL proteinase K 
and hybridized at 60°C for 18 hours, followed by normal SSC washes, and have found 
residual endogenous peroxidase activity in the red blood cells.
4. Wash three times in PBS at room temperature for 5 minutes each.
5. Wash three times in PBT at room temperature for 5 minutes each.
6. Incubate with secondary antibody (goat anti mouse­HRP, in this case) in 1% goat 
serum, 1% BSA, 0.1% Triton in TC D­PBS.
7. Wash three times in PBT at room temperature for 5 minutes each.
8. Wash once in PBT at 4°C overnight to further reduce background, if necessary.
9. Wash three times in acetate imidazole buffer at room temperature for 5 minutes each.
10. Develop HRP reaction with nickel­DAB in acetate imidazole buffer. 
11. Wash three times in PBS at room temperature for 5 minutes each.
12. Wash once in PBT at room temperature for 10 minutes.
13. Incubate slides in 20% heat­inactivated sheep serum in PBT at room temperature for 
one hour.
Now follow the normal protocol for visuallization of digoxygenin (or fluorescein.)
 7

Very important: Fixing the slides in MEMFA eliminates the Ni­DAB signal!  Mount and 
view the slides right away.

Troubleshooting and common problems.

A. Low signal / high background
Is your oven maintaining temperature?  Are people going in and out of it?  If you’re 
using a hybridization oven, you can also consider trying 68°C or 72°C.

If you are re­using the 20% sheep serum block or anti­digoxygenin antibody, check it for 
particulates, or just replace it.  (especially for spotty background)

Be extremely rigorous about how long your slides are in 0.2X SSC.  This high­stringency 
step strips the probe off the sections.  It is necessary to reduce background, but I have 
found that with clean probes, the high­stringency washes can be pared back to 25 
minutes and this improves signal.  The same is true for the RNAse A step.  (PMW)

Did you hydrolyze your probe?  Poor signal is also common if the probe is less than 500 
bp.  (Hai rarely hydrolyzes his probes, though, and his wholemounts are lovely.)

Check for particulates in the phosphate buffer used in making the fixative or sucrose for 
your animals.  Contaminated PB used to make either reagent causes unholy background 
for antibody staining, and severely reduces signal for in situ.

B. Uneven labeling across the short axis of the slide.
There is some debate as to what causes this phenomenon.  Andy says to reduce the 
speed of the stir bar during the SSC washes to under 3.  Pat says it’s evaporation of 
formamide during hybridization, and to use fresh probe next time.  Try both.
 8

II: Whole Mount In Situ Hybridization.

Embryos should be dissected free of any extra­embryonic membranes, fixed in 
4% paraformaldehyde  in DEPC­PBS for 2 hours at room temperature (or 4°C 
overnight), washed in DEPC­PBS, and then stored in 100% methanol at ­20°C until 
required. Hai punctures the embryos on the forehead and hindbrain region with a fine 
needle to allow free exchange of reagents. 
In general, we do the washes and incubations in 15 ml tubes containing about 5­6 
ml liquid. The tubes are rocked gently on a rotating platform to allow thorough 
exchange of solutions. 

A: Pre­Treatment of Embryos

1.  Bleach the embryos in methanol/peroxide (5 volumes methanol, 1 volume 30% H2O2) 
at room temperature for three to five hours.
2.  Wash twice in 100% methanol 5 minutes at room temperature.
3.  Rehydrate the embryos in:

75% MeOH : 25% PTw 5 minutes at room temperature
50% MeOH : 50% PTw " " "
25% MeOH : 75% PTw " " "
100% PTw " " "

Wash twice in PTw for 5 minutes each.

 4. Treat embryos with 10µg/ml proteinase K in PTw for 5­60 minutes. This is a critical 
step, as over­digestion will destroy the embryos, and under­digestion will give a poor 
signal. Exact times should be determined for each embryo species and age; for example, 
10 minutes is fine for E9.5 mouse.  Treat the embryos very gently after this step until 
they are re­fixed.
5. Rinse twice gently in PTw. Re­fix embryos in 4% paraformaldehyde for 30 minutes at 
room temperature.
6. Wash twice in PTw for five minutes each at room temperature. 
7. Transfer embryos to a 2ml Eppendorf tube. Remove as much liquid as possible, taking 
care to avoid damaging the embryos. It's better to remove too little than too much. 
 9

Replace with 1 ml hybridisation mix. Remove this mixture after the embryos sink, and 
replace with fresh hybridisation mix.
8. Pre­hybridise the embryos at 63 ­ 70 °C for between 1 and 4 hours.  Hai uses a heat 
block.  Add probe to a final concentration of about 1µg/ml, and hybridise overnight at 
the same temperature.
(N.B. The subsequent washes with hybridisation mix can be quite costly. The Appendix 
contains an alternative hyb recipe that uses much less tRNA and works fine for whole 
mounts. I've tried it a couple of times on sections and it seems to work OK too, but 
proceed with caution.)

B: Washing Steps

1. Wash three times with pre­warmed (70°C) hybridisation mix for five minutes each in 
the same tube.
2. Wash twice with pre­warmed hybridisation mix for 30 minutes each at 70°C. 
3. Wash once with a 1:1 mixture of hybridisation mix and TBST (pre­warmed) at 70°C 
for 20 minutes.
4. Wash twice with TBST at room temperature for five minutes each.
5 Incubate embryos in 50 µg/mL RNaseA in TBST at 37°C for one hour with gentle 
rocking.
6. Wash three times with TBST for five minutes each at room temperature.
7. Wash twice in formamide wash solution for 30 minutes each at 60°C
8. Wash three times with TBST for five minutes each at room temperature.
9. Block embryos with TBST containing 10% sheep serum for 1 ­ 3 hours at room 
temperature.

C: Antibody Visualisation of Digoxygenin

1. Incubate with pre­absorbed anti­digoxygenin antibody diluted to a final 
concentration of 1:2000 at 4°C overnight with gentle rocking.
2. Wash three times with TBST with 2mM levamisol for five minutes each at room 
temperature.
3. Wash five times with TBST at room temperature for one hour each.
4. Wash overnight with TBST at 4°C.  This sounds excessive, but it helps clean up the 
background.
 10

5. Wash twice with Alkaline Phosphatase buffer at room temperature for 30 minutes 
each. 
6. For every ml of Alkaline Phosphatase buffer, add 1µl of NBT and 3.5µl of BCIP, and 
develop in the dark for between 2­20 hours, depending on the abundance of the RNA. 
The product should usually be visible in an hour or two.
7. When the reaction has proceeded to your satisfaction, it is imperative to quickly stop 
the reaction to prevent excess background. Wash three times in TBST for five minutes 
each in the dark.
8. Fix in 4% paraformaldehyde at room temperature for 30 minutes or overnight at 4°C 
in the dark.
9. Dehydrate with methanol and TBST series for five minutes each at room temperature:
25% methanol and 75%TBST
50% : 50%
75% : 25% 
10. Incubate in 100% methanol for 10 minutes at room temperature.  This darkens the 
reaction product from purple to a deep blue.
11. Rehydrate to TBST using the series in reverse.
12. Wash twice in TBST for five minutes at room temperature
13. Clear the embryos in 4 : 1 glycerol:water for photography.
14 If sectioning is desired, do not immerse in glycerol.  Sink in 15% sucrose and freeze in 
OCT, or embed in 8% gelatin/15% sucrose.
 11

III: In Situ Hybridization on Cultured Cells

This protocol is typically used for cells or explants cultured in 35mm dishes, but 
can be adapted to coverslips.  In general, the signal tends to come up much more slowly 
than in either sections or whole mounts. 

A: Pre­Treatment of Cells

1. Fix in 4% paraformaldehyde in DEPC­PBS at room temperature for 10 minutes.
2. Wash three times in DEPC­PTw at room temperature for 5 minutes each.
3.  Permeablilize with 0.2 M HCl for 10 minutes at room temperature.
4.  Wash two times in DEPC­PTw for 5 minutes each.
5.  Digest with 10 ug/ml of Proteinase K in DEPC­PTw for 10­30 minutes at room 
temperature.  Ten minutes is typically sufficient, but you may wish to vary this 
incubation depending on the probe and the nature of the cultured tissue.  Longer 
digestions may improve the signal but overdigestion causes cells to fall off the plate 
during the hybridization and washing steps. 
6.  Rinse once very carefully with DEPC­PTw.
7.  Fix again in 4% paraformaldehyde in DEPC­PBS for 15 minutes.
8.  Wash three times in DEPC­PTw for 5 minutes each. 
9.  To 25ml 0.1M triethanolamine, pH8.0, add 62.5µl acetic anhydride and quickly mix 
until thoroughly dispersed. Incubate cultures in this mixture for 10 minutes at room 
temperature.
10. Wash cultures in 1x DEPC­SSC for five minutes at room temperature.
11. Pre­hybridize for 6 hours at room temperature or 3 hours at hybridization 
temperature. Remove pre­hyb and add probe at a final concentration of between 1 and 
2µg/ml.  Hybridize overnight at 60°C.

N.B. To prevent evaporation, incubate in a tight­sealing tupperware box containing 
towels soaked in 50% formamide and 5xSSC.

B: Washing Steps

1.  Wash once in 1x SSC at hybridization temperature for 10 minutes.
 12

2.  Wash once in 1.5x SSC at hybridization temperature for 10 minutes.  Then cool to 
approximately 37 C.
3.  Wash twice in 2x SSC at 37 C for 20 minutes each.
4.  Treat with 0.2 ug/ml of RNAse A in 2x SSC at 37 C for 10 ­ 30 minutes.  Ten minutes 
is typically sufficient, though longer RNAse treatment may lower the background 
and/or signal depending on the probe.
5.  Wash once in 2x SSC for 10 minutes at room temperature.
6.  Wash twice in 0.2x SSC at hybridization temperature for 30 minutes each.
7.  Wash twice in PTw at hybridizaton temperature for 10 minutes each.
8.  Wash once in PTw for 10 minutes at room temperature.
9.  Wash once in PBT for 15 minutes at room temperature.
10.  Incubate in 20% sheep serum in PBT for 3 hours at room temperature.

C: Antibody Visualisation of Digoxygenin

1. Incubate cultures with anti­digoxygenin antibody (coupled to alkaline phosphatase) 
diluted to a final concentration of 1:1000 in 20% sheep serum in PBT at 4°C overnight, or 
for two hours at room temperature. It is not necessary to use pre­absorbed antibody, 
although it doesn't hurt.
2. Rinse three times in PBT.
3. Wash four times with PBT at room temperature for 10 minutes each.
4. Wash twice in Alkaline Phosphatase buffer (first wash without levamisole, second 
wash with) at room temperature for 10 minutes each.
5. For every ml of Alkaline Phosphatase buffer, add 4.5µl of NBT and 3.5µl of BCIP, and 
develop in the dark for between 2­36 hours, depending on the abundance of the RNA. It 
may be necessary to wash the cultures and add fresh reaction mixture after 12 hours or 
so.
6. When the reaction has proceeded far enough, wash in PBT, and fix in MEMFA.
 13

Appendix: Additional Techniques

A:  Preparation of RNAse ­ Free Slides

1. Soak VWR slides overnight in Dichrol at room temperature in a fume hood. Wash the 
slides thoroughly to remove any residual Dichrol, rinse for one hour in running water, 
then for a further hour in running distilled water.
2. Dry slides at 150°C for 20 minutes.
3. Dip slides in a 2% solution of TESTA (3­aminopropyltriethoxysilane; Sigma A­3648) in 
dry acetone for 5 minutes.
4. Wash in 2 changes of acetone and three changes of DEPC­water. Dry overnight at 
42°C and store dry. TESTA slides should be used within 6 weeks, as their adhesive 
properties tend to fade after this time, i.e. your sections will fall off during 
hybridization, and you will have to do it all over.

B: Probe Preparation

1. Cut between 20 and 40µg of maxi­prep quality plasmid DNA with a five­fold excess 
of an appropriate restriction enzyme for 2 hours. Check digestion on mini­gel.
2. Extract cut template in an equal volume of 50 : 48 : 2 phenol : chloroform : isoamyl 
alcohol. Spin down, transfer the upper layer to a fresh tube and extract with chloroform 
: isoamyl alcohol. 
3. Precipitate upper layer with 1/9 volume of 3M NaOAc and 2 volume ethanol at­80°C. 
Spin down at 4°C for 15 minutes. Wash pellet with 70% EtOH and spin again. 
Resuspend pellet in 20µl of RNAse­free TE, and store at 4°C until required.

Important note: even very small amounts of Dep­C can inactivate RNA polymerase.  I 
have noted reductions in yield if I use Dep­C treated water to make RNAse­free TE, 
even though the water was autoclaved before making the TE.  I resuspend my cut 
plasmid in Steve's AGDW, and also use it for reaction water.  These details alone 
increased my RNA yield from around 15µg per reaction to 60µg per reaction. (PMW)
 14

4. Set up the following reaction in 50µl total volume:
5x Stratagene synthesis buffer 10µl
0.1M DTT (RNAase free) 5µl
10mM NTPs/digoxygenin­UTP 2.5µl
RNAsin  0.25µl (10 units)
RNA polymerase (T3, T7 or Sp6) 4.5µl   (90 units)
DNA template 2.5µg
RNAse free­water to 50µl
Incubate at 37°C for 2 hours.
5. Remove 2µl for mini­gel sample. Add 20 units of RNAse­free DNAse and continue 
incubation for a further 10 minutes at 37°C. Remove a second 2µl sample and check that 
DNA has been degraded on a 1% TBE mini­gel.
6. Add 52µl of 'Stop' buffer to the reaction. 
7. Separate unincorporated ribonucleotides on a Sephadex G50 spin column by spinning 
for 2 minutes on setting 5 on the Anderson Lab benchtop centrifuge. (Modify as 
necessary).(Noted by Ding: no need to do it)
8. Transfer the purified probe to a clean tube. Add 1/9 volume of 3M NaOAc, pH4.8 and 
2 volumes of ethanol. Precipitate at ­80°C for 10 minutes. Spin down at 4°C for 15 
minutes, wash the pellet in 95% EtOH/5% DEPC­water and spin again for 5 minutes. 
9. Resuspend the pellet in 50µl of an RNAse­free solution of 40mM NaHCO3 / 60mM 
Na2CO3. Remove a 1µl sample for OD260 measurement. Incubate at 60°C for 35 minutes 
to hydrolyse the probe into small fragments (between 200­300 bp). 35 minutes works 
fine for a 1kb probe. For other probe sizes, use the following formula:

The amount of time, t , for hydrolysis in 40mM NaHCO3 / 60mM Na2CO3 at 60°C is 
given by:
(Starting length, kb) ­ (Desired length, kb)
t  = —————————————————————
        (0.11) (Starting length, kb) (Desired length, kb)

10. Precipitate hydrolysed probe again as in (8) above. Resuspend the probe in 
hybridisation buffer to a final concentration of 10µg/ml. N.B. Resuspend in a small 
volume first, then make a final dilution.
11. Store probe at ­20°C until required. Probes should stay stable for months on end.
 15

C: Sephadex G­50 Spin Column

1. Suspend Sephadex G­50 in distilled water. DEPC­treat overnight and autoclave. Let 
Sephadex settle out, and replace water with RNAse­free 0.3M NaOAc pH 6.0/ 0.1% SDS.
2. Pack the base of a 3ml syringe with glass wool that has been siliconised with 
"Sigmacote" and autoclaved. Handle wool with forceps heated in a gas jet.
3. Load 5ml of G­50 slurry onto the column and spin down. (3 minutes at setting 5 on 
Anderson Lab benchtop centrifuge ­ modify as necessary).
4. Remove buffer from tube and replace with a clean Eppendorf tube. Column is now 
ready for use.

D: Pre­absorbing Anti­Digoxygenin Antibody

1. Fix a series of rat/chick E12.5 ­ E13.5 embryos in 4% paraformaldehyde for 2 hours at 
room temperature. Use about 8 rat embryos for every ml of 1:200 antibody. Wash with 
PBS and store at ­20°C in methanol.
2. Rehydrate in:

75% MeOH : 25% H2O 5 minutes at room temperature
50% MeOH : 50% H2O " " "
25% MeOH : 75% H2O " " "
100% PTw " " "

3. Dissociate embryos with a syringe and incubate in 10% heat inactivated serum in PTw 
for one hour at room temperature. Spin down and discard supernatant.
4. To the minced embryos add an equal volume of 1:200 anti­digoxygenin antibody in 
PTw containing 1% serum. Incubate for three hours at room temperature on a rotary 
wheel.
5. Spin down the embryos, recover supernatant and dilute to 1:2000 final concentration 
with PBT containing 20%  serum.

N.B. Use a serum species compatible with the antibodies you are using. The Boehringer 
anti­DIG antibodies are made in sheep.  Heat inactivate serum by incubating it at 55°C 
for 30 minutes.
 16

E: Pre­absorbing Anti­Digoxygenin Antibody ­ Embryo Powder Method

This is an alternative to the protocol above, which may be more convenient for small 
batches of antibody.

1. Homogenise embryos of an appropriate age and species in a minimum volume of ice 
cold PBS, by squirting through a 30mL syringe.
2. Add 4 volumes of ice cold acetone, mix well and incubate on ice for 30 minutes.
3. Spin pellet out at 10,000g for 10 minutes, wash with ice cold acetone and spin down 
again.
4. Spread pellet out on filter paper, let it dry thoroughly and grind into a fine powder. 
Store at 4°C.  The yield is surprisingly low.  Two dozen D8 chicks can yield 25mLs of 
homogenized embryos, and 1.2g of powder.

To produce 2ml of pre­absorbed antibody:
5. Weigh out 3mg embryo powder and mix with 0.5ml PBT.
6. Incubate at 70°C for 30 minutes. Vortex hard for 10 minutes.
7. Cool mixture on ice, add 5µl serum and 1µl anti­digoxygenin antibody. Mix for 1 hour 
at 4°C.
8. Spin down hard and dilute supernatant to 2ml with PBT containing 20% serum.

F: Fixation of Embryos for Sectioning

Embryos smaller than about E18 rat can be fixed by immersion in 4% paraformaldehyde 
in 0.1M phosphate buffer.  Larger animals (like newborn pups) must be fixed by 
perfusion.  Perfusion is necessary because fixative cannot simply diffuse into the tissues 
of these larger, more developed animals in time to preserve morphology, mRNA, and 
antigens.  Perfusion requires opening the thoracic cavity of a living specimen, 
puncturing the lower ventricle of the heart with a fine gauge butterfly needle, and 
pumping fixative through the circulatory system.  If you have never done this, have it 
demonstrated for you the first time.

To make 20mL of 4% paraformaldehyde:
1. Weigh out 0.8g solid paraformaldehyde.  Add to 10mL distilled water in a screw­cap 
type disposable tube.  Add 20µl 10N NaOH.  Place in the 68°C water bath for a few 
minutes until the paraformaldehyde goes into solution.
 17

2. Add 15µl concentrated HCl (12.7N).  Cool on ice.
3. Add 10mL 0.2 M phosphate buffer pH 7.4.  0.2M phosphate buffer must be kept 
sterile: contamination will result in your signal being completely destroyed.
4. Fix animals at 4°C  for 4 to 24 hours.  Change solutions to 15% sucrose in 0.1M PB. 
Incubate at 4°C until the animals sink.  
5. Wash animals in OCT.  Place in mounting form in fresh OCT.  Freeze on dry ice.  Store 
blocks at ­80°C for up to a year.

Some people feel  very young animals, such as D3­D4 chicks, must be mounted in 
gelatin for good histology.  I have found the sharpness of the blade becomes the most 
important factor if the tissue is fixed properly.  

Paraformaldehyde that has been made up in a large batch and stored for more than a 
day does not necessarily fix tissue properly.  If you are storing blocks at ­80°C and find 
you lose signal, or morphology, over time, you are not fixing your tissue properly.  Try 
using fresh fix.  (PMW)
 18

Solutions
Stop Buffer

1% SDS
  20mM EDTA
  20mM Tris pH7.5
  100mM NaCl

PK Buffer for sections:

50mM Tris­HCl pH 7.5
5mM EDTA

1M Triethanolamine, pH 8.0:

Add 66.5 Triethanolamine and 20ml conc. HCl to 413.5ml DEPC­water in an 
RNAse­free bottle.

PTw:

1xPBS
0.1% TWEEN­20

PBT:

1xPBS
2mg/ml BSA
0.1% Triton X­100

100x Denhardt's Solution

2% BSA (ICN 810661)
2% Polyvinylpyrrolidone (PVP­40)
2% Ficoll 400
 19

Make a slurry in DEPC­water and dilute.
Hybridisation Solution:
For 50ml

50% Formamide 25ml
5x SSC 12.5ml 20xSSC
0.3mg/ml Yeast tRNA 0.3ml of 50mg/ml in DepC­H2O
100µg/ml Heparin 50µL of 100 mg/mL in DepC­H20
1xDenhardt's Solution 0.5ml 100x
0.1% Tween 20 0.5mL 10% Tween in DepC­H20
0.1% CHAPS 0.5mL 10% CHAPS in DepC­H20
5mM EDTA 0.5mL of 0.5M EDTA pH 8.0

All components should be RNAse free

Cheaper Hybridisation Solution for Whole Mounts:

For 100ml

50% Formamide 50ml
5xSSC 25ml 20xSSC 
20µg/ml Yeast tRNA 0.1 of 20mg/ml in DepC­H2O
100µg/ml Heparin 10mg
0.1% Tween 20 1mL 10% Tween in DepC­H20
0.1% CHAPS (Sigma C­3023) 1mL 10% CHAPS in DepC­H20
5mM EDTA 1mL 0.5M EDTA pH 8.0

All components should be RNAse free

NBT:

75 mg/ml Nitro blue tetrazolium in 70% dimethyl formamide and 30% water. 
Hai suggests making a stock of 30mg/mL in 70% formamide and adjusting the 
amount added accordingly.
20
 21

BCIP:

50 mg/ml 5­bromo­4­chloro­3­indoyl phosphate in 100% dimethyl formamide

TBS:

500mM NaCl 
20mM Tris, pH 7.5

TBST:

500mM NaCl 
20mM Tris, pH 7.5
1% Tween 20

MEMFA:

0.1M MOPS pH 7.5
2mM EGTA
1mM MgSO4
3.7% Formaldehyde

­ Make a 10x stock of the salts and add fresh formaldehyde each time.

Alkaline Phosphatase Buffer:

100mM Tris, pH 9.5
50mM MgCl2
100mM NaCl
0.1% TWEEN 20
5mM Levamisole ­ add fresh each time.
 22

N.B. This buffer should always be made up fresh each time from its components ­ it 
tends to acidify quite quickly.  (Tris pH 9.5 mixed with the MgCl2 is the problem. Mix 
the other three components with water, and add the Tris right before use.  HW)

Reagents, Glassware and Apparatus

­ The following solutions can be made up in untreated bottles. Treat with 0.05% DEPC 
overnight at 37°C and then autoclave:

EDTA, NaCl, MgCl2, NaHCO3 / Na2CO3, NaOAC

­ The following solutions cannot be autoclaved. Make these up in DEPC­treated water in 
glass bottles:

Tris, SDS, any buffers with Tween, Triton or CHAPS 

­ The following solutions cannot be autoclaved.  Make up in sterile 50mL tubes:

Hybridisation buffer, Denhardt's

­ The following solutions do not need to be RNAse free:

TBS, TTBS, PBT, BCIP, NBT, MEMFA, Tris­Imidazole buffer

­ PTw for whole mounts and cultured cell in situs needs to be made with DEPC­PBS. For 
post­hybridisation washes, this is not necessary.

­ RNAse free forceps and spatulas should be flamed in a gas jet just prior to use.

­ Glass boats, jars, and slide mailers cannot be autoclaved. Before each experiment, soak 
them overnight in water containing 0.05% DEPC at 37°C. Wash them twice in DEPC­
treated water before use.
 23

Ordering Information
Reagent Company Catalog  Amount  Used in
number
anti­digoxygenin Fab  Boehringer  1 093 274 antibody
Mannheim
anti­fluorescein Fab  Boehringer  1 426 338 two­probe double 
Mannheim label antibody
3­aminopropyl  Sigma A­3648 100 mL subbing slides
triethoxysilane (TESTA)
AP color development  BioRad 170­6539 300mg AP reaction mix
reagent  BCIP
AP color development  BioRad 170­6532 600mg AP reaction mix
reagent  NBT
Bovine serum albumin ICN 810661 hybridization buffer
Bovine serum albumin Sigma A­3912 250 g PBT 
CHAPS Sigma C­3023 hybridization buffer
Ficoll 400 hybridization buffer
Formamide Fluka 4767 250mL hybridization buffer
Heparin Sigma H­3393 10,000  hybridization buffer
units
INT/BCIP stock solution Boehringer  1 681 460 3 mL two­probe double 
Mannheim label
Levamisole Sigma L­9756 10g AP reaction mix
Polyoxyethylene sorbitan  Sigma P­1379 hybridization buffer, 
monolaurate (Tween­20) AP reaction mix
Polyvinylpyrrolidine  (PVP­ hybridization buffer
40)
Proteinase K Sigma P­6556 25mg pre­hybe
Ribonuclease A Sigma R­5503 100mg SSC washes
Sephadex G50 Pharmacia 17­0045­02 100g Spin column
Sheep serum (lamb) Gibco 16070­013 100mL antibody buffer
SigmaCoat Sigma SL­2 100mL Spin column
SuperFrost/Plus microscope  Fisher 12­550­15 slides that don't need 
slides subbing
Type X­SA transfer  Sigma R­8759 10,000  hybridization buffer
ribonucleic acid units
Probe synthesis
 24

Reagent Company Catalog number  Amount

0.1M DTT Promega P117B 250µL
5x transcription buffer Promega P118B 500µL
DIG­RNA labeling mix Boehringer Mannheim 1 277 073 40µL
Fluorescein­RNA labeling mix Boehringer Mannheim 1 685 619 40µL
RNAse inhibitor Boehringer Mannheim 799 017 2000 units
T3 RNA polymerase  Promega P208C 1000 units
T7 RNA polymerase Promega P207C 1000 units
Sp6 RNA polymerase Promega P108B 1000 units
DNAse I, RNAse free  Boehringer Mannheim 776 785 10,000 units