FUNDACIN HCTOR A .

BARCEL FACULTAD DE MEDICINA CARRERA DE MEDICINA 1 AO MATERIA BASES BIOLGICAS Y ANTROPOLGICAS DE LA VIDA AREA BIOLOGIA CELULAR PROFESOR TITULAR = DR EDUARDO KREMENCHUTZKY

Gentica molecular Definicin de gen Un gen es una secuencia lineal organizada cido nucleico que contiene la informacin necesaria para la sntesis de una macromolcula con funcin celular especfica . En las clulas los genes son ADN . En algunos virus son ARN La molcula resultante de la expresin del gen puede ser una protena o un ARN Estructura de un gen eucarionte Alrededor del 98,5% de nuestro genoma (restando el 1,5% que corresponde a secuencias codificadoras de genes humanos) es ADN no gnico con funcin desconocida en la mayora de los casos . Los genes contienen intrones y exones y estn separados por secuencias espaciadoras de los otros genes que estn a continuacin en el ADN . Un intrn es una regin de ADN que est dentro de un gen pero que no se llega a expresar, es decir, su secuencia no se utiliza cuando se sintetiza la correspondiente protena. Los intrones se transcriben, junto con el resto del ADN que forma el gen (los exones), formndose una molcula precursora de ARN mensajero (llamada pre-ARNm o tambin ARNnh) pero despus, durante el proceso de maduracin en el ncleo de este pre-ARN, los intrones son eliminados y ya no forman parte del ARN mensajero final, que es el que se usa para sintetizar la protena en los ribosomas. Los intrones se transcriben pero no se traducen; por ello, son regiones no codificantes. Cada intrn separa a dos exones. Los intrones, a pesar de no tener ninguna utilidad aparente (son regiones reguladoras de la expresin en muchos casos), no deben confundirse con el ADN no gnico . Tipos de genes de las clulas eucariontes

Secuencias de copia nica. En general, la mayor parte de los genes que codifican para polipptidos, los llamados genes estructurales, se encuentran en una sola copia en el genoma. Secuencias mnimamente repetidas . Se trata de genes o secuencias funcionales que codifican para protenas relacionadas y que se han originado por duplicacin de secuencias individuales y una posterior evolucin divergente (las mutaciones afectan de forma diferente a las dos copias existentes de la secuencia). Suelen ser familias de genes y de pseudogenes relacionados. Los pseudogenes son secuencias de ADN que debido a mutaciones han dejado de ser funcionales y que por tanto no se transcriben.

Secuencias moderadamente repetidas. Familias de secuencias repetidas en tndem. En este caso, se trata de genes que existen en varias copias esencialmente idnticas que derivan por duplicacin de secuencias ancestrales. Se trata de genes funcionales y las copias son idnticas tanto en secuencia como en funcin. La existencia de este tipo de genes permite a los organismos generar una gran cantidad de determinados productos en poco tiempo. Secuencias altamente repetidas . Carecen de funcin conocida. Son secuencias cortas de ADN repetidas entre 1.000 y 1.000.000 de veces y las copias no son totalmente idnticas .

Transposones: tambin es posible encontrar en los genomas de especies eucariontes secuencias o elementos que pueden cambiar de posicin dentro del genoma, transposones. Algunos genomas muestran mltiples copias de estos elementos genticos mviles, o versiones truncadas de ellos dispersas a lo largo del genoma. Algunos ejemplos son: Retrotransposones: Secuencias que se han dispersado en el genoma despus de una transcripcin inversa a partir de ARN. ADN espaciador: la funcin de este tipo de secuencias no es conocida, posiblemente sea simplemente separar a los genes. El cdigo gentico EL CODIGO GENETICO ESTA ORGANIZADO EN TRIPLETES O CODONES Si cada nucletido determinara un aminocido, solamente podramos codificar cuatro aminocidos diferentes ya que en el ADN solamente hay cuatro nucletidos distintos. Cifra muy inferior a los 20 aminocidos distintos que existen. Si cada dos nucletidos codificarn un aminocido, el nmero total de dinucletidos distintos que podramos conseguir con los cuatro nucletidos diferentes (A, G, T y C) seran variaciones con repeticin de cuatro elementos tomados de dos en dos VR4,2 = 42 = 16. Por tanto, tendramos solamente 16 dinucletidos diferentes, cifra inferior al nmero de aminocidos distintos que existen (20). Si cada grupo de tres nucletidos determina un aminocido. Teniendo en cuenta que existen cuatro nucletidos diferentes (A, G, T y C), el nmero de grupos de tres nucletidos distintos que se pueden obtener son variaciones con repeticin de cuatro elementos (los cuatro nucletidos) tomados de tres en tres: VR4,3 = 43 = 64. Por consiguiente, existe un total de 64 tripletes diferentes, cifra ms que suficiente para codificar los 20 aminocidos distintos. EL CDIGO GENTICO ES UNIVERSAL

El desciframiento del cdigo gentico dio como resultado la siguiente asignacin de aminocidos a los 64 tripletes.

P R I M E R A A B A S E G C U

U UUU Phe UUC Phe UUA Leu UUG Leu CUU Leu CUC Leu CUA Leu CUG Leu AUU Ile AUC Ile AUA Ile AUG Met GUU Val GUC Val GUA Val GUG Val

SEGUNDA BASE C A UCU Ser UAU Tyr UCC Ser UAC Tyr UCA Ser UAA FIN UCG Ser UAG FIN CCU Pro CUA His CCC Pro CAC His CCA Pro CAA Gln CCG Pro CAG Gln ACU Thr AAU Asn ACC Thr AAC Asn ACA Thr AAA Lys ACG Thr AAG Lys GCU Ala GAU Asp GCC Ala GAC Asp GCA Ala GAA Glu GCG Ala GAG Glu

G UGU Cys UGC Cys UGA FIN UGG Trp CGU Arg CGC Arg CGA Arg CGG Arg AGU Ser AGC Ser AGA Arg AGG Arg GGU Gly GGC Gy GGA Gly GGG Gly

U C A G U C A G U C A G U C A G

T E R C E R A

B A S E

Todos estos codones son combinaciones de tres bases nitrogenadas hechas con un sistema que tiene cuatro bases nitrogenadas distintas , que son adenina , citosina , guanina y uracilo. Dicho de otro modo , los codones son "palabras " de tres letras , pertenecientes a un lenguaje cuyo "abecedario" tiene cuatro letras . A , C , G y U. Desde el punto de vista matematico , se pueden formar 64 palabras de tres letras . Todas ellas , todos los codones , han sido descubiertos en la clula y se conoce que aminocido representan , en el cdigo gentico. El cdigo gentico nos indica que aminocido corresponde a cada triplete o codn del ARN mensajero.

El triplete de iniciacin suele ser AUG que codifica para Formil-metionina. Tambin pueden actuar como tripletes de iniciacin GUG (Val) y UGG (Leu) aunque con menor eficacia. Existen tres tripletes sin sentido o codones de terminacin (FIN) que no codifican para ningn aminocido: UAA (ocre), UAG (ambar) y UGA (palo).

La mayora de los aminocidos estn determinados por ms de un triplete, excepto la metionina (AUG) y el triptfano (UGG) que son los nicos que poseen un solo triplete. Cuando un aminocido est codificado por varios tripletes suele variar la tercera base, por ejemplo, la glicina es GGX, la alanina es GCX, la valina es GUX, la treonina es ACX. Sin embargo, hay varias excepciones en las que tambin puede variar la primera base, por ejemplo, la arginina es AGPu y CGX, la leucina es CUX y UUPu y la serina es UCX y AGPi.

El cdigo gentico mitocondrial es la nica excepcin a la universalidad del cdigo, de manera que en algunos organismos los aminocidos determinados por el mismo triplete o codn son diferentes en el ncleo y en la mitocondria. Excepciones a la Universalidad del Cdigo Organismo Codn Significado en Cdigo Nuclear FIN Leu Arg Arg Ile Ile Significado en Cdigo Mitocondrial Trp Thr Ser FIN Met (iniciacin) Met (iniciacin)

Todos UGA Levadura CUX Drosophila AGA Humao, bovino AGA, AGC Humano, bovino AUA Ratn AUU, AUC, AUA

El cdigo gentico es igual en todos los organismos animales y vegetales ,es UNIVERSAL , no ha variado en los 3.000 millones de aos de la evolucin , salvo en el ADN de las mitocondrias , que es el nico ADN que tiene un cdigo gentico distinto.Existen varias hipotesis que intentan explicar esto. DEGENERACIN DEL CDIGO GENTICO : Se denomina as a la existencia de varios transfer distintos que llevan el mismo aminocido. La razon de esta caracterstica es que hay 64 anticodones distintos posibles , ya que combinar conjuntos de tres bases eligiendo de entre 4 posibles (ACGU) da 64 combinaciones (43= 64). Dicho de otra manera , con un abecedario de 4 letras (ACGU) se puede formar un nmero de palabras de tres letras (anticodn) igual a 64 ,razonamiento igual al utilizado cuando se explico el concepto de codn. Esto significa que el sistema de ARN de transferencia podria transportar especficamente a 64 aminocidos distintos , ya que cada uno es transportado por un ARNt , dependiendo de cual sea el anticodn que tenga. Sin embargo existen dos fenmenos que hacen que esto no se cumpla : 1- Los anticodones AUU , AUC y ACU no existen , quedando 61 anticodones y por lo tanto 61 ARNt.

2- Slo hay alrededor de 25 Aa distintos para transportar. Por lo tanto, teoricamente, sobran muchos ARNt , ya que alcanzaria con 25. Los que "sobran" tambin transportan a los mismos aminocidos , por lo cual llegamos a la conclusin de que cada aminocido puede ser transportado por ms de un ARNt , y eso es la mal llamada degeneracin del cdigo gentico : no es "perfecto". BASE "VACILANTE" u oscilante SE DENOMINA VACILANTE U OSCILANTE A LA TERCERA BASE DE CIERTOS ARNt QUE NO TIENE INFLUENCIA EN EL CDIGO GENTICO YA QUE SI CAMBIA , EL ARNt TRANSPORTA AL MISMO AMINOCIDO. La importancia que tiene este hecho es que las mutaciones que afectan esa base vacilante no tienen ninguna expresin , no afectan ningn caracter . Se denominan mutaciones "silenciosas". EL CDIGO GENTICO ES NO SOLAPADO O SIN SUPERPOSICIONES Un nucletido solamente forma parte de un triplete y, por consiguiente, no forma parte de varios tripletes, lo que indica que el cdigo gentico no presenta superposiciones. Por tanto, el cdigo es no solapado LA LECTURA DEL CDIGO GENTICO ES "SIN SIGNOS DE PUNTUACION" Teniendo en cuenta que la lectura se hace de tres en tres bases, a partir de un punto de inicio la lectura se lleva a cabo sin interrupciones o espacios vacos, es decir, la lectura es seguida "sin comas". De manera, que si aadimos un nucletido (adicin) a la secuencia, a partir de ese punto se altera el cuadro de lectura y se modifican todos los aminocidos. Lo mismo sucede si se pierde (delecin) un nucletido de la secuencia. A partir del nucletido delecionado se altera el cuadro de lectura y cambian todos los aminocidos. Si la adicin o la delecin es de tres nucletidos o mltiplo de tres, se aade un aminocido o ms de uno a la secuencia que sigue siendo la misma a partir del la ltima adicin o delecin.

INGENIERIA GENETICA Hasta 1970 el ADN fue la molcula ms difcil de analizar qumicamente, es enormemente larga con (1,80 metro en cada clula ) y qumicamente montona porque tiene solamente fsforo, desoxiribosa y cuatro bases nitrogenadas . La secuencia de nucletidos del ADN solamente puede ser deducida en forma indirecta ya que no se pueden ver los nucletidos con ningn microscopio, ni hay ningn anlisis directo qumico que me permita ver la secuencia de nucletidos, lo cual hace que se tenga que estudiar mediante anlisis genticos especiales que utilizan ARN y protenas Actualmente la situacin cambi completamente y de ser la molcula ms difcil de analizar, la molcula de ADN pas a ser una molcula muy bien conocida .

Actualmente es posible cortar regiones especficas de la molcula de ADN, se puede producir un n infinito de copias de cada pedacito que se corte en forma muy sencilla y se puede determinar la secuencia exacta de los nucletidos a un promedio actual de unos cientos de nucletidos por da utilizando las computadoras ms sofisticadas . Por variaciones de stas tcnicas se puede : aislar un gen alterar un gen Y a eso se llama especficamente INGENIERIA GENETICA = modificar a los genes . Se los puede transferir a una clula, se puede redisear un gen, se puede insertar un gen en un huevo fecundado de un animal o de una planta para que nazca un individuo que tenga un gen que fue fabricado en un laboratorio y que fue insertado despus de la fecundacin. Estas tcnicas han tenido un impacto dramtico en todos los aspectos de la biologa celular y han permitido estudiar las clulas y las macromolculas en una forma que no se imaginaba hace pocos aos ; se han descubierto genes y protenas y se ha observado que las protenas estn mucho ms conservadas a travs de la evolucin de las especies de lo que se supona y ha cambiado mucho el concepto de evolucin. En los laboratorios se ha provisto nuevas formas de determinar la funcin de las protenas, de los distintos dominios que hay dentro de cada protena y de la relacin que hay entre ellas ; por ltimo al poder controlarse las regiones reguladoras de los genes, se puede actualmente estudiar y modificar los mecanismos complejos por los cuales los genes estn activos o estn inactivos, se puede activar o inactivar un gen a voluntad . TECNOLOGIA DE RECOMBINACION DEL ADN Todos stos logros han sido efectuados a partir de una tecnologa que es la TECNOLOGIA DE RECOMBINACION DEL ADN. Esta tecnologa abarca una serie de tcnicas,algunas nuevas y otras antiguas que son las siguientes : FRAGMENTACION DEL ADN que es el corte en sitios especficos de la molcula de ADN por medio de unas enzimas que se llaman ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION que actan como tijeras que permiten cortar pedacitos de ADN, aislarlos y depus poder trabajar con esos segmentos identificados de ADN ,as que dentro de esa molcula enorme que es el ADN podemos cortar un pedacito como si fuera con una computadora o con una tijera, sacar ese pedacito, modificarlo y eso es la FRAGMENTACION o CLIVAJE DEL ADN. SECUENCIACION DEL ADN o sea averiguar cual es el orden o la secuencia de los nucletidos que hay en el ADN, sto permite conocer exactamente los genes y tambin en cada protena , como es el gen que la tiene codificada. HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS que consisteen mezclar dos cidos nuclicos distintos y fabricar uno solo siempre respetando el mecanismo de las bases complementarias ; as que se puede tomar un polinucletido de ADN de una especie, un

polinucletido de ADN de otra especie o fabricado en el laboratorio, se los puede juntar y fabricar una molcula en doble hlice de ADN pero que sea mitad de una especie y mitad de otra por ejemplo. CLONACION MOLECULAR que consiste que a partir de una molcula de ADN se pueden hacer millones de copias idnticas. FRAGMENTACION DEL ADN Antes de 1970, aislar una gen, sacar un gen de dentro de un cromosoma era imposible y pareca algo inalcanzable porque los genes no son como las protenas que son entidades individuales y observables y tienen una forma determinada ; los genes estn dentro de la molcula de ADN y no hay un lmite que separe un gen de otro. Por lo tanto no hay forma de saber donde empieza un gen y termina otro , ni de verlos con el microscopio . Aunque la molcula de ADN en una clula se puede romper en pequeas piezas, los fragmentos que se obtienen no contienen un gen porque al no verse el lmite entre un gen y otro, no se sabe por donde romper para sacar ese gen. Como puede entonces ser purificado y aislado un gen? La solucin a ste problema comenz con el descubrimiento de las llamadas ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION, stas enzimas son producidas normalmente por las bacterias y cortan el ADN en segmentos . Son enzimas de corte del ADN en un sitio especfico de acuerdo a la serie de nucletidos que tenga y que que es reconocida por cada enzima de restriccin Por ej.una determinada enzima que se llama HPA1 corta el ADN donde encuentra la serie de nucletidos AACAA . Cuando sta enzima encuentra sta combinacin de bases en el ADN lo corta . Estas enzimas las producen normalmente ciertas bacterias que las utilizan como mecanismo de defensa contra los virus . Como tijeras genticas, las enzimas de restriccin cortan en pedacitos el cido nuclico que le introdujo el virus y lo desintegran. Diferentes especies de bacterias producen distintas ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION que cortan en lugares distintos la molcula de ADN y es relativamente fcil encontrar una endonucleasa de stas que corte y produzca pedacitos especficos que uno desee tener. Para que sirve cortar el ADN? Porque los pedacitos de ADN que se obtienen son el material que se utiliza para las otras tcnicas mencionadas de la ingeniera gentica. Entonces para poder clonar o duplicar un gen, primero se debe cortar pedacitos de ADN, despus averiguar cual es la secuencia, o sea secuenciar el ADN y una vez que se hizo todo esto se puede fabricar copias exactas por millones en muy poco tiempo. El corte que se produce es asimtrico en los dos polinucletidos generalmente pero algunas endonucleasas cortan en forma simtrica, cortan al mismo nivel los dos polinucletidos, peor no es lo ms comn . Al ser asimtrico el corte , quedan los extremos del polinucletido sin sus bases complementarias y se llaman EXTREMOS ADHESIVOS

porque cada uno de los extremos que qued sin sus bases complementarias puede unirse a un pedacito de polinucletido que tenga justo las bases que le correspondan . Esa caracterstica de tener los extremos adhesivos hace que los segmentos ade ADN as obtenidos sean muy tiles A travs de las enzimas de restriccin se pueden hacer mapas llamados justamente MAPAS DE RESTRICCION que fueron los primeros mapas genticos . SECUENCIACION DE LOS FRAGMENTOS DEL ADN Consiste en averiguar la secuencia de bases nitrogenadas de los fragmentos para finalmente conseguir la secuencia de bases nitrogenadas de todo el ADN de la clula en estudio . Los segmentos obtenidos por corte se clasifican bsicamente por un mtodo que se llama ELECTROFORESIS. El resultado que se obtiene por electroforesis , es que se producen una cantidad de rayitas en una tira de papel, separadas de acuerdo al peso molecular del fragmento . Luego esa tira de electroforesis es leda por un scanner que determina la composicin de cada segmento de ADN. HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS : Consiste en sintetizar molculas que tengan una parte de ADN de distintas clulas o ADN y ARN mezclados . Cuando se pone ADN en una solucin a 100C y a un pH de 13, las bases complementarias se separan porque se rompen los puentes de H de modo que los polinucletidos quedan totalmente separados, ste proceso se denomina DESNATURALIZACION DEL ADN . Por mucho tiempo se pens que sta DESNATURALIZACION era irreversible pero en 1961 se descubri que cada polinucletido separado puede reunirse con otro, siempre y cuando las bases sean complementarias , si se baja la temperatura. Este proceso se denomina RENATURALIZACION . La tcnica que se utiliza para reanaturalizar el ADN o sea volver a unir los dos polinucletidos es simplemente mantenerlos durante un tiempo prolongado a 65. Se pueden unir dos polinucletidos que provengan del mismo ADN, de distinto ADN, se puede unir un polinucletido de ARN con otro de ARN, se puede unir uno de ARN con uno de ADN o cualquier combinacin que uno quiera siempre y cuando las bases sean complementarias entre un polinucletido y otro . Esto es la HIBRIDACION o HIBRIDIZACION. CLONACION MOLECULAR En la clonacin del ADN, un fragmento de ADN que contiene un gen que nos interesa puede ser duplicado miles y millones de veces fabricando copias idnticas, sta clonacin

se consigue insertando el pedacito de ADN que se quiere duplicar en un elemento gentico autoduplicante o vector de clonacin molecular. Qu es un elemento gentico autoduplicante o vector de clonacin molecular ? Son segmentos de ADN que pueden duplicarse solos , naturalmente , como lo hacen todas las clulas , pero bajo un entorno controlado . Primero se utilizaron los plasmidos y luego los virus . Clonacin con plsmidos Los plasmidios, que son pequeas molculas de ADN que se encuentran en las bacterias independientemente del cromosoma bacteriano Se puede agregar al plsmido un segmento de ADN que deseamos clonar y la bacteria lo v a autoduplicar junto con el plsmido

Clonacin con virus Un segmento de ADN de un gen humano puede ser unido al cromosoma de un virus por la TECNOLOGIA DE RECOMBINACION DEL ADN y entonces ese virus v a inyectar ese ADN recombinado en una bacteria y los mecanismos normales de replicacin del virus van a producir en un da milllones virus idnticos, por lo tanto yo obtengo esa cantidad de copias del pedacito de ADN que se quera, fcil y rpido Tambin se hace clonacin con otros vectores , como los siguientes Clonacin con YAC (cromosoma artificial de levadura) Clonacin con BAC (cromosoma artificial de bacteria) Clonacin con csmidos Clonacin por mtodo artificial : la PCR La posibilidad de purificar la ADN polimerasa y de sintetizar qumicamente el ADN en el laboratorio, hizo posible un 3er mtodo de clonacin, exclusivamente artificial que se denomina PCR o REACCION EN CADENA DE LA ARN POLIMERASA (polimerase chain reaction) Esta tcnica de PCR es mucho ms rpida, ms fcil y ms barata que las tcnicas que utilizan virus y plasmidios. Aplicaciones de la ingeniera gentica

Las aplicaciones de la ingeniera gentica son mltiples y crecen da a da . Se utilizan en tratamientos mdicos y en biotecnologa y son la solucin a corto y largo plazo de determinadas enfermedades genticas con la produccin de sustancias diversas de origen transgnico. El mundo est siendo revolucionado por la ingeniera gentica . Tratamientos mdicos A continuacin mostramos algunas de las sustancias o tratamientos especficos obtenidos por estos mecanismos de gran inters para la salud humana: a) Fabricacin de protenas o pptidos de inters sanitario. b) Fabricacin de sustancias hormonales en la leche de vaca. c) Sustancias paliativas del dolor. d) Xenotransplantes y trasplantes de tejidos. e) Solucin a problemas cardiacos. f) Vas de solucin a el Dengue. g) Tratamientos contra el cncer. h) Diagnstico y solucin de enfermedades hereditarias: hemofilia, anemia falciforme, retraso mental, fibrosis qustica, hipotiroidismo congnito, esquizofrenia, maniacodepresin, hidrocefalia, microcefalia, labio leporino y espina bfida. i) Tratamientos contra el SIDA. j) Fabricacin de vacunas transgnicas. k) Fabricacin de antibiticos. Biotecnologa con ingeniera gentica: En la industria de la alimentacin: - Enzimas recombinantes alimentarias. - Aditivos. - Alimentos transgnicos: soja, maz, tomate. - Alimentos transgnicos animales. Industria qumica: - Detergentes. - Aminocidos. - Colorantes. - Plsticos biodegradables. - Emulsionantes. - Melaninas. - Adhesivos.