Materia Biologa

Dra. Ana Mara Ortuo Toms

Dpto. Biologa Vegetal ( (Fisiologa Vegetal) p g g g g ) Facultad de Biologa Universidad de Murcia

Objetivo: Visualizar los fenmenos osmticos de turgencia y plamolisis celular. Introduccin: La clula vegetal adulta encierra una voluminosa vacuola separada del medio que la rodea por una membrana llamada tonoplasto. tonoplasto Esta se comporta en primera aproximacin como membrana semipermeable con respecto a numerosas sustancias disueltas, como por ejemplo el cloruro sdico o la sacarosa. sacarosa La pared celular rgida, limita la posibilidad de dilatacin de la clula y en consecuencia la absorcin de agua Ello constituye agua. por otra parte, un marco gracias al cual, los cambios de agua son perceptibles directamente.

Material: Hojas de cebolla. Colorante rojo neutro al 1 % en tampn fosfato 0,1 M pH=7,4. pH=7 4 Disolucin de NaCI al 6 %. Microscopio ptico.

Manipulacin:

Sirvindose de pinzas y bistur, tomar un fragmento de epidermis, de la parte interna del casco de cebolla, de aproximadamente 0,5 cm de lado. Sumergirlo durante un minuto en la disolucin de rojo neutro al 1 % solubilizado en tampn fosfato 0,1 M pH=7,4. pH 7,4. Montar el fragmento de epidermis en el porta, tapndolo a continuacin con el cubre, eliminando el exceso de liquido succionando con papel de filtro y observar al microscopio.

Manipulacin:

Reemplazar el colorante, en la preparacin, con disolucin de NaCl al 6%, colocando unas gotas de esta disolucin en el p porta-objetos, junto a un borde del cubre, pero sin j j p mancharlo y colocando un fragmento de papel de filtro en el lado opuesto, para aspirar por capilaridad el colorante.

La disolucin de l L di l i d cloruro sdico ocupar el l di l lugar d aquel, l de l lo que se reconoce porque el lquido de la preparacin se aclara. Repetir los lavados cuatro o cinco veces y observar inmediatamente la preparacin al microscopio microscopio.

Informacin que debe adquirir o cuestiones que debe resolver el alumno con el desarrollo de la prctica: A qu se d b l gran extensin d l coloracin d l clula A debe la i de la l i de la l l tras la tincin con rojo neutro? Qu papel d Q l desempean l dif las diferentes concentraciones d l t t i de las disoluciones de tampn fosfato y de cloruro sdico sobre la del jugo vacuolar? A qu atribuye los cambios que se observa en la vacuola en cada caso?

Objetivo: Observar granos de almidn de la patata y conocer la j g p tcnica de tincin con Lugol para el reconocimiento de la presencia de dicho polisacrido. Introduccin: El Lugol es una disolucin acuosa de yodo y yoduro potsico que sirve para averiguar si, en una disolucin de azcares no reductores (reaccin de Fehling negativa) negativa), existe el polisacrido almidn (prueba de lugol positiva). El almidn es un polisacrido mezcla de amilosa y amilopectina amilopectina.

Cuando el almidn se pone en contacto con unas gotas de p g Lugol toma un color azul-violeta caracterstico (la amilosa se colorea de azul oscuro a negro y la amilopectina se colorea entre naranja y amarillo). Se trata de una reaccin no qumica, en la que se forma un compuesto de inclusin del yodo en el interior de las hlices de la amilosa Esta inclusin es reversible y est condicionada amilosa. por la temperatura.

Material: Patata Microscopio ptico Reactivo Lugol (yodo-yoduro potsico 1%) (yodo yoduro Suspensin acuosa de almidn Manipulacin: Coger un trozo de patata, aadirle una gota de agua en la superficie y hacer un raspado de tejido. Se obtiene una suspensin de granos de almidn que enturbia la gota de agua, dndole color blanquecino. Poner una gota de esta suspensin sobre el porta, colocar el cubre y observar al microscopio.

Manipulacin: p Poner ahora una gota de reactivo yodo-yoduro potsico (1%) sobre el porta, en contacto con el borde del cubre, y con un papel de filtro en el borde opuesto, hacer que penetre en l preparacin. t la i Observar de nuevo en el microscopio.

+ Lugol

Manipulacin: p En caso de que no se disponga de microscopio: Se puede hacer reaccionar la suspensin obtenida tras el p p g y y raspado de la patata con una gota de reactivo yodo-yoduro potsico (1%), para observar el cambio de coloracin. Se coloca en un tubo de ensayo 3 ml de una suspensin acuosa d almidn, se l aaden 3 gotas d l solucin d de l id le d de la l i de Lugol, se observar la aparicin del color azul-violeta caracterstico. A continuacin se calienta suavemente, sin que llegue a hervir, se observar que pierde el color, posteriormente se enfra el tubo de ensayo con agua del grifo y despus de unos 2-3 min reaparecer el color azul.

Informacin que debe adquirir o cuestiones que debe resolver q q q el alumno con el desarrollo de la prctica: Conocer la forma de los grados de almidn obtenidos a partir g p de este material vegetal. Relacionar el tamao de los granos y el nmero de capas que se observan en ellos. b ll Conocer la posibilidad de utilizar el reactivo yodo-yoduro potsico (1%) para d t t t i detectar l presencia d almidn en un la i de l id medio. Fundamento de la reaccin de color y de los cambios con la temperatura.

Objetivo: Poner de manifiesto la presencia de azcares j p reductores en un medio, mediante una reaccin d color d d di di i de l de tipo redox. Introduccin: Los monosacridos y la mayora de los disacridos poseen poder reductor, que deben al grupo carbonilo que tienen en su molcula. El reactivo de Fehling es utilizado con el fin de poner de manifiesto la capacidad reductora de un azcar. Consiste en una mezcla de dos reactivos: el Fehling A (sulfato cprico),de g ( p ), color azul, y el Fehling B (tartrato sdico-potsico), incoloro. Tras la reaccin con el glcido reductor, se forma xido de Cobre (I) que tras ser calentado da un precipitado de color (I), rojo. De este modo, el cambio de color indica que se ha producido una reaccin de tipo redox y que por tanto, el glcido presente es reductor.

Material y Manipulacin: p 1 parte Poner en tubos de ensayo 3 ml de solucin acuosa de g glucosa, fructosa, sacarosa y almidn. , , Aadir en cada tubo 1 ml de solucin de Fehling A (contiene CuSO4) y 1 ml de Fehling B (tartrato sdico-potsico, para alcalinizar el medio y permitir l reaccin). l li i l di i i la i ) Calentar los tubos en un bao mara hasta que hiervan durante 10 minutos. d t i t La reaccin ser positiva si la muestra se vuelve de color rojo y ser negativa si queda azul o cambia a un tono azul azulverdoso.

Material y Manipulacin: 2 parte La sacarosa es un disacrido que carece de poder reductor (porque en el enlace de los monosacridos que forman parte de su molcula participan los carbonos anomricos), por lo que la reaccin con el reactivo de Fehling es ), p q g negativa, tal y como ha quedado demostrado en la 1 parte. Sin embargo, en presencia de HCl y en caliente, la sacarosa se hidroliza y se desco po e e os o osac dos descompone en los monosacridos que la forman, glucosa y fructosa, que s a o a , g ucosa uctosa, s son reductores. La prueba de que se ha verificado la hidrlisis se realiza con el reactivo de Fehling y, si el resultado es positivo, aparecer un precipitado rojo (tras el calentamiento en bao mara a ebullicin durante 10 min). Si el resultado es negativo, la hidrlisis no se habr realizado correctamente, y si en el resultado final aparece una coloracin verde en el tubo de ensayo se debe a una hidrlisis parcial de la sacarosa.

Material y Manipulacin: 2 parte Para llevar a cabo esta parte de la prctica: Tomar 3 ml de solucin de sacarosa y aadir 10 gotas de HCl diluido. Calentar a la llama del mechero durante unos 5 minutos. Dejar enfriar. Neutralizar aadiendo 3 ml de solucin alcalina alcalina. Realizar la prueba de Fehling como se indica en la 1 parte.

Informacin que d b adquirir o cuestiones que d b resolver debe d debe f l el alumno con el desarrollo de la prctica: Establecer a qu se deben las diferencias observadas entre los cuatro carbohidratos analizados (glucosa y fructosa dan positiva la reaccin de Fehling mientras que sacarosa y Fehling, almidn no dan positiva la reaccin). Analizar e interpretar los resultados obtenidos tras la hidrlisis de la sacarosa.

Objetivos: Romper o lisar con detergentes la pared celular, la membrana plasmtica y la membrana nuclear para dejar libre el ADN y hacer que precipite en alcohol, para poder visualizar las fibras del ADN ADN.

QU ES EL ADN?ES EL ADN

Prctica 4: Extraccin y aislamiento de ADN

.. Su funcin esencial es la de conservar la informacin durante la divisin celular, transmitirla de generacin en generacin y hacer efectiva la informacin gentica que contiene.

ADN es la abreviatura del Acido DesoxirriboNucleico. Es la molcula de la vida pues constituye el material gentico de todos los organismos vivos y se encuentra en el interior del ncleo de las clulas El ADN es el clulas. componente qumico primario de los cromosomas y el material que constituye los genes.

Cedido amablemente por la Dra. Leonor Ruiz

TAPAS Etapa

ETAPAS Y FUNDAMENTO DE LA EXTRACCIN DE ADN DE PLANTAS QU HACEMOS? Rompemos la pared celular y las membranas plasmtica y nuclear Separamos el ADN de protenas y restos celulares POR QU LO HACEMOS? Para liberar el contenido celular y nuclear, nuclear en el que se encuentra el ADN Las protenas y restos celulares interfieren en la extraccin de ADN CMO LO HACEMOS? Mezclando el material vegetal con una solucin de extraccin y trituramos Aadiendo al tampn de extraccin zumo de pia o de papaya que contienen un enzima, la papana, que elimina las protenas Aadimos alcohol sobre la fase acuosa que contiene el ADN disuelto

Etapa

Etapa

Precipitamos el ADN

La molcula de ADN es soluble en agua pero no en alcohol, por lo que precipitar en la interfase entre ambos

APLICACIONES
Agricultura y ganadera:

Nos ayuda a conocer el genoma de los seres vivos para saber ms de ellos Gracias al estudio ellos. del ADN podemos distinguir entre especies y variedades, encontrar caractersticas de inters agronmico (produccin, sabor, color, resistencias a enfermedades,). Obtener nuevas variedades mejoradas.

Protocolo de Extraccin de ADN

Equipos
Tubos plstico Vasos de plstico Colador Cucharilla de caf Una batidora Hielo Gasa para colar

Productos
Guisantes Agua destilada Detergente lavavajillas Sal Zumo de pia o de papaya Alcohol de 96 muy fro

AHORA VIENE LA PARTE DIVERTIDA;

Cedido amablemente por la Dra. Leonor Ruiz

1 Tu fuente de ADN va a ser 30gr de guisantes 2. Tampn de extraccin: En un vaso echamos media cucharadita de detergente de lavavajillas, una pizca de sal y media cucharadita de zumo de pia. Aadimos 30 ml de agua destilada.

3.- Mezclamos esta solucin con los guisantes

4.- Trituramos la mezcla, con la batidora, segundos 5.- Filtramos el lquido obtenido con un colador y gasa.

a velocidad mxima durante 30

6.- Llenamos la mitad de un tubo con la disolucin filtrada. 7.- Aadimos cuidadosamente la misma cantidad de alcohol muy fro, hacindolo resbalar por las paredes del tubo para que f b l l d d lt b forme una capa sobre el filtrado. b l filt d 8.- Dejamos reposar durante 2 3 minutos 9.- Podemos ver una madeja algodonosa Enhorabuena estis viendo el ADN!

Informacin que debe adquirir o cuestiones que debe resolver el alumno con el desarrollo de la prctica: Para qu se utiliza el detergente y el NaCl en la extraccin? Qu componente aporta el zumo de pia o de papaya y cul es su utilidad? tilid d? Por qu se incorpora finalmente el etanol muy fro al medio?

Objetivo: Estudiar la produccin de CO2 durante la respiracin e j p p investigar el efecto de un inhibidor de la glicolisis. Introduccin: La respiracin es un proceso por el cual las clulas obtienen energa, mediante la degradacin de compuestos orgnicos tales como los azcares, de alto contenido energtico. La glicolisis consiste en la conversin de un azcar sencillo (hexosa) en dos molculas de piruvato. Esta ruta prcticamente comn a todos los seres vivos, consta de varios pasos catalizados enzimticamente.

Introduccin: Uno de ellos, el paso de 2-Fosfoglicerato a Fosfoenolpiruvato, p , q est catalizado por el enzima Enolasa, que necesita la presencia de iones Mg2+ para poder actuar. En presencia de iones F- , el Mg2+ se compleja en forma de MgF M F2, con l cual se i hib l glicolisis y no h respiracin. lo l inhibe la li li i hay i i En el transcurso de la glicolisis se producen, por cada molcula de l d glucosa, 2 molculas d ATP y otras d l l de ATP, t dos d coenzimas de i +). reducidos (NADH + H

Introduccin: El piruvato puede sufrir distintas transformaciones p p g dependiendo del tipo de organismo y de las condiciones en que se encuentre.

En presencia de O2, los seres aerobios y facultativos continan la l oxidacin d l piruvato, a travs d l ciclo d K b y d l id i del i del i l de Krebs de la cadena de transporte de electrones de las mitocondrias, hasta dar CO2 y H2O como productos finales. Los organismos anaerobios, y los facultativos en ausencia de O2, transforman el piruvato en otros compuestos ms g reducidos, para regenerar el NAD+ necesario para continuar la l l l glicolisis, con l cual l mayor parte d l energa d l lo l la de la de la glucosa es desaprovechada.

Introduccin: Esta va se conoce con el nombre de fermentacin, y p p , , dependiendo del producto final se le llama alcohlica, lctica, etc. En el caso que vamos a estudiar, las levaduras Saccharomyces cerevisiae son organismos f i i i facultativos, que en ausencia d O2 l i i de producen CO2 y etanol a partir del piruvato, por lo cual son muy utilizados industrialmente, por ejemplo en la fabricacin de la cerveza cerveza.

Material: Levaduras en suspensin acuosa durante 24 h a 25C. Disolucin de glucosa al 5%. g Disolucin de NaF 0,01, 0,05 y 0,10 M Tubos de ensayo para respirmetro

Manipulacin: Antes de empezar a operar, rotule 5 tubos graduados, numerndolos del 1 al 5 en la parte cerrada del tubo. Para construir el respirmetro simple, llene con suspensin de levaduras, agua, solucin de glucosa e inhibidor segn se indica a continuacin en la Tabla Tabla. Coloque un tubo de ensayo grande (de mayor dimetro que el graduado) sobre el graduado introducindolo lo ms posible posible, y presionando ambos, invierta el conjunto rpidamente, de manera que derrame la menor cantidad de lquido posible.

Manipulacin: Se mide el volumen de aire que queda entre el lquido y el fondo del tubo graduado e invertido, y se anota. Si las levaduras respiran, el CO2 desprendido se acumular en la cmara de aire, aumentando la presin sobre el lquido, con lo que ste ser desplazado y el volumen gaseoso aumentar. Al cabo de una hora aproximadamente midiendo el volumen aproximadamente, final de la cmara gaseosa y restndolo del inicialmente obtenido, tendremos una medida de la cantidad de respiracin que haya tenido lugar. p q y g

N Tubo

Suspensin de levadura

Agua destilada

Solucin de glucosa 10%

NaF

Volumen inicial cmara gaseosa

Volumen final cmara gaseosa

Diferencia de volmenes (indicativo del CO2 desprendido)

1 2 3 4

5 ml

10 ml

5 ml

5 ml

5 ml

5 ml

5 ml

5 ml (0,01M)

5 ml

5 ml

5 ml (0,05M)

5 ml

5 ml

5 ml (0,1M)

Informacin que debe adquirir o cuestiones que debe resolver el alumno con el desarrollo de la prctica: Razonamiento sobre los procesos que estn ocurriendo en cada uno de los 5 tubos. Cul es la funcin del tubo 1? Por qu se aade glucosa a los tubos 2, 3, 4 y 5? Diferencias observadas en los tubos 3, 4 y 5 (inhibicin parcial o total dependiendo de la concentracin del inhibidor). inhibidor)