ESTERILIZACIN

Laboratorio N 2 Prof. Jaime R. Montealegre A. Ctedra de Microbiologa General - 2002 Depto. de Sanidad Vegetal Facultad de Ciencias Agronmicas Universidad de Chile En el medio ambiente existen microorganismos que estn contaminando los objetos que se encuentran en l; as en el aire, agua y suelo existen patgenos y/o saprfitos que aprovechan los nutrientes a su alcance para desarrollarse o permanecer sobre ellos; debido a esto es difcil considerar algn lugar libre de microorganismos. Esta situacin crea dificultades en los estudios microbiolgicos, pues para estudiar los microorganismos es fundamental tenerlos en cultivos puros. Esterilizacin: es la prctica que tiene por fin destruir (matar) todos los microorganismos contenidos en una preparacin. El material tratado se denomina estril. Desinfectante: se denomina as generalmente a un agente qumico capaz de destruir microorganismos patgenos o perjudiciales. Normalmente se utiliza este trmino para tratar objetos inanimados; por ello se pueden utilizar concentraciones ms elevadas y por un tiempo ms prolongado que en organismos vivos. Se utiliza el trmino de sptico cuando un lugar u objeto posee microorganismos patgenos y stos pueden desarrollarse; el antnimo de este trmino es asptico. En muchas ocasiones, como por ejemplo operaciones quirrgicas, se necesitan rigurosas condiciones de asepsia. as en ciruga el campo operatorio debe estar exento de grmenes patgenos y de todos aquellos que por extensin son potencialmente peligrosos. Agentes antispticos: son sustancias qumicas capaces de destruir los microorganismos o detener su desarrollo o accin. Bacteriosttico o Fungisttico: son productos como por ejemplo los antibiticos y fungicidas que dependiendo de su concentracin impiden la multiplicacin de una bacteria o de un hongo. Bactericida o Fungicida: son productos que destruyen (matan) totalmente las bacterias u hongos. Accin antimicrobiana. Est influenciada por diversos factores, entre ellos tenemos: a) Tipo de microorganismo. Los agentes antimicrobianos poseen un espectro de accin determinado, as por ejemplo los estreptococos son sensibles a numerosos antibiticos, en particular a la penicilina, eritromicina, tetraciclina, cloranfenicol; mientras que las micobacterias no son sensibles a algunos antibiticos como la rifampicina y estreptomicina. b) Tipo de agente antimicrobiano. El agente puede ser fsico o qumico. c) Medio ambiente. Ejemplo pH del medio, etc.

I. Agentes Fsicos 1. Temperatura La accin de la temperatura depender del medio ambiente, estado fsico-qumico de las clulas y del nmero de stas. La mayora de las formas vegetativas son destruidas rpidamente a una temperatura de 100C cuando se encuentran en solucin acuosa, mientras que en un medio deshidratado son mucho ms resistentes. La gran mayora de las formas vegetativas bacterianas son inactivadas cuando son sometidas a temperatura de 5060C por 30 minutos. Las formas esporuladas son extremadamente resistentes y requieren temperaturas superiores a los 100C y un mayor tiempo de exposicin. El nmero de clulas presentes en el medio a esterilizar tambin es importante. Mtodos de aplicacin: a) Fuego directo: consiste en exponer los objetos a la llama de un mechero (asas con hilos de platino, boca de tubos de ensayo y matraces, pipetas Pasteur, etc.). b) Ebullicin: el material a esterilizar se coloca en recipientes con agua a ebullicin (generalmente por 15 minutos). Se utiliza para esterilizar agujas, pinzas, jeringas, etc. c) Autoclave: es un aparato que esteriliza a travs de calor hmedo. Es un mtodo muy efectivo ya que el vapor de agua difunde por smosis a travs de las membranas de las esporas coagulando su protoplasma. Se utiliza para esterilizar medios de cultivos, agua destilada, tierra, etc. La esterilizacin puede ser a travs de vapor a presin o sin presin (vapor fluente) y la fuente de energa calrica puede ser gas o electricidad. Generalmente se esteriliza a temperaturas que van entre 107-126C por un tiempo de 5-20 minutos con presiones que varan entre 5 y 20 p.s.i. d) Tindalizacin: este mtodo es muy poco utilizado en microbiologa para esterilizar lquidos o sustancias que no resisten el tratamiento a travs del autoclave debido al riesgo de alteracin. Consiste en calentar el medio a una temperatura de 60-70C durante 30 minutos 1 hora por tres veces consecutivas pero dejando un intervalo de 24 horas entre cada vez. A las temperaturas antes mencionadas todas las formas vegetativas son destruidas y las esporas termorresistentes pueden germinar entre cada paso y transformarse en formas vegetativas que son eliminadas con los tratamientos consecutivos. e) Pasteurizacin: se aplica a ciertos productos naturales donde se desea asegurar la conservacin momentnea de stos, sin alterar sus caractersticas organolpticas (color, olor, sabor). La leche por ejemplo se pasteuriza a una temperatura de 90C durante 30 segundos y luego se enfra a 10C. Por sus caractersticas, este mtodo no se puede considerar como esterilizacin. f) Horno Pasteur (Pupineles): la esterilizacin se efecta por calor seco a travs de circulacin de aire caliente a temperaturas que varan entre 120 y 180C por un lapso de tiempo de 8 horas a 20 minutos. La fuente de energa puede ser electricidad o gas. Este mtodo se utiliza preferentemente para esterilizar material de vidrio, ejemplo: placas de Petri, tubos de ensayo, matraces, pipetas, etc. Es necesario sealar que por razones de dilatacin en el proceso de esterilizacin, en el caso de pipetas volumtricas y matraces aforados, stos no deben esterilizarse a temperaturas superiores a los 140C. 2. Radiaciones El efecto bactericida de las radiaciones es conocido desde hace muchsimo tiempo, as por ejemplo se sabe que la radiacin solar, o ms precisamente las radiaciones ultravioletas, son agentes naturales de esterilizacin. A continuacin se indican los diferentes tipos: a) Radiaciones electromagnticas: las primeras radiaciones conocidas por su actividad son las ultravioletas; stas son las menos eficaces debido a su gran longitud de onda (se pueden utilizar para esterilizar bolsas de polietileno o papel, adems de otros usos); la regin ms activa de su espectro se encuentra entre los 2.600 y 2.700 Angstroms.

Los Rayos X y rayos Gama liberan una energa ms importante y debido a ello penetran ms profundamente. Por su poder de penetracin ms intenso estas radiaciones son ms eficientes, pero sus instalaciones son costosas. Adems, la irradiacin tiene la desventaja que no puede localizarse en un solo objeto. Otra desventaja es que las radiaciones ionizantes no slo destruyen los microorganismos, sino tambin las sustancias que los rodean. b) Radiaciones electrnicas: se logran por el efecto termoelectrnico que permite obtener una emisin continua de electrones, adems de la aceleracin de stos, bajo el efecto de un campo elctrico. Estos electrones lanzados a gran velocidad tienen un poder de esterilizacin idntico a los rayos gama. Ellos se pueden dirigir a voluntad sobre el objeto a esterilizar, pero su efecto es ms dbil que el de los rayos gama y su principal defecto es la alteracin de las substancias orgnicas sometidas a su accin. c) Sonidos: stos no poseen una utilidad prctica en esterilizacin; sin embargo, es necesario sealar que los ultrasonidos poseen el poder de matar microorganismos en una suspensin lquida liberando su contenido endocelular; de la misma manera pueden alterar las sustancias qumicas en solucin. En microbiologa se utilizan para extraer constituyentes endocelulares, enzimas, o para hacer preparados de pared celular bacteriana. El ultrasonido tambin puede emplearse para limpiar grillas que se utilizan en el microscopio electrnico. 3. Eliminacin mecnica a) Filtracin: se utiliza para esterilizar soluciones que posean sustancias termolbiles como por ejemplo protenas que no soportan altas temperaturas. Consiste en filtrar las soluciones a travs de filtros que slo dejan pasar partculas ultradiminutas. Los filtros son de diversos tipos; los primeros que se utilizaron fueron los filtros Chamberland (de porcelana); hoy da stos han sido reemplazados por filtros Seitz (Fig. 6), de vidrio fritado (Fig. 7), Berkefeld o filtros de diatomeas y membranas de acetato de celulosa (Fig. 8) llamados tambin filtros molecula-res de porosidad graduada. b) Centrifugacin: normalmente la centrifugacin se realiza a una aceleracin de 5.000g y permite separar partculas en suspensin en un medio lquido y tiene la desventaja que no se puede aplicar a grandes cantidades de lquido; adems, no permite una eliminacin total de los microorganismos.

II. Agentes Qumicos No todos los agentes qumicos sirven como desinfectantes o como antispticos; algunos como los cianuros son venenos celulares de alta toxicidad; otros como los antibiticos y sulfamidas poseen una accin teraputica. Su modo de accin est relacionado con: a) Oxidacin y desnaturalizacin de las protenas: los agentes oxidantes como el H2O2 y sus derivados halogenados, oxidan los grupos SH libres de las enzimas y los alteran irreversiblemente. Los metales pesados como el mercurio y sus derivados orgnicos e inorgnicos se combinan con estos grupos SH inactivndolos. Los alcoholes poseen una accin similar al calor coagulando las protenas. b) Alteracin de la membrana citoplasmtica: un gran nmero de agentes bactericidas actan directamente sobre la membrana citoplasmtica que juega un rol importante en la permeabilidad selectiva de los nutrientes. Debido a que esta membrana no es otra cosa que una barrera lipoproteica, los agentes liposolubles son los ms activos; tales son los compuestos fenlicos, jabones y sobre todo los detergentes. Estos ltimos gracias a sus grupos hidrosolubles y liposolubles se fijan sobre la membrana lipdica de la bacteria y sobre el medio acuoso circundante. Ellos modifican y desnaturalizan la estructura de la membrana suprimiendo as sus funciones vitales de permeabilidad.

c) Accin sobre el metabolismo: numerosas sustancias qumicas son bactericidas o bacteriostticas por inhibicin enzimtica, as tenemos que ciertos cianuros y los fluoruros son verdaderos venenos respiratorios inutilizables como antispticos. Los colorantes no presentan la toxicidad antes indicada, as por ejemplo los colorantes bsicos (azul de metileno, violeta de genciana) reaccionan con los cidos nucleicos de la bacteria, principalmente con los ribonucleicos que estn presentes en abundancia en el citoplasma; estas combinaciones inactivan todas las funciones de la bacteria. Otros agentes son los mutagnicos (acridinas y sus derivados) y los quelatricos. 1. Oxidantes a) Agua oxigenada: sta y todos los compuestos que dan origen a ella (perboratos y persulfatos alcalinos) son antispticos eficaces. b) Cloro y sus derivados: el cloro bajo su forma gaseosa o diversas combinaciones qumicas, es un antisptico muy utilizado; al respecto es necesario sealar que bajo su forma gaseosa es un producto peligroso y delicado de manejar. Sus compuestos lquidos como los hipocloritos y cloraminas son los ms difundidos. Todos los compuestos clorados siguen un mecanismo semejante de accin formando el cido hipocloroso; en esta reaccin el oxgeno es liberado dando as un intenso poder oxidante que destruye instantneamente a la mayor parte de los microorganismos que entran en contacto con l. Las formas esporuladas son ms resistentes y para su inactivacin se necesitan dosis 100 veces ms elevadas que las normales. La accin de estos compuestos clorados est relacionada con el pH del medio. c) Yodo: es uno de los primeros compuestos que se utiliz como desinfectante; siendo principalmente de accin bactericida y fungicida. Es poco soluble en agua pero fcilmente soluble en alcohol o en soluciones acuosas de yoduro de potasio. 2. Alcoholes: el alcohol etlico en concentraciones de 50-70% es uno de los ms utilizados; posee un efecto bactericida pero no ejerce una accin sobre las formas esporuladas. El alcohol metlico es menos activo pero ms nocivo. Los alcoholes superiores como los proplicos, butlicos y amlicos tienen un poder mayor pero su baja solubilidad al agua limita su uso. 3. Metales pesados y sus sales: ciertos metales tienen un efecto bactericida, este poder ejercido a dosis nfimas se llama oligodinmico y se puede explicar por una pobre ionizacin del metal y por la afinidad de estos iones con las protenas celulares. La plata bajo su forma metlica ha sido uno de los elementos ms utilizados. Las sales de metales pesados son ms eficaces y muy utilizadas; las ms comunes son las sales de Ag, Hg, Cu y Zn. Todas inactivan la clula precipitando las enzimas o combinndose con sus grupos -SH; esto explica a su vez la actividad y toxicidad que ejercen tanto sobre las clulas del hospedante como sobre las clulas bacterianas. 4. Fenoles: gracias a su grupo fenlico poseen propiedades bacteriostticas o bactericidas. El fenol como desinfectante ha sido reemplazado por antispticos menos custicos; a pesar de ser bactericida y fungicida es poco activo sobre las formas esporuladas y su accin puede ser favorecida por Na o K; atenuada por la materia orgnica e inhibida en presencia de soda. En general los fenoles se utilizan en medicina como desinfectantes y como antispticos pulmonares e intestinales. Algunos de ellos son: fenol, hexaclorofeno, cresol-brut, timol, resorcina, hexilresorcina.

5. Jabones y detergentes sintticos: los jabones son sales sdicas o potsicas de cidos grasos de pesos moleculares elevados (ac. oleico, linoleico, ricinoleico) cuyo poder antisptico vara segn las especies

microbianas. Su accin mecnica reduce la fuerza de tensin superficial y aumenta el poder humectante del agua. Los microorganismos son aprisionados por la espuma y luego eliminados con el enjuagado. Junto con los jabones alcalinos se han sintetizado otros compuestos de elevado poder mojante con una accin bactericida paralela, stos son los detergentes, que se dividen en: a) Detergentes aninicos (el grupo activo es el aninico). b) Detergentes catinicos (poseen un grupo activo catinico; los ms importantes son los amonios cuaternarios) entre los cuales tenemos: cloruro de alquil-dimetil-benzil-amonio, bromuro de cetil-trimetilamonio, bromuro de dimetil-cetil-cicloexil-amonio). c) Detergentes no inicos (no son de inters debido a su ausencia de actividad antimicrobiana). 6. Colorantes: la mayor parte se utilizan como antispticos de uso local y normalmente poseen una accin selectiva ya sea sobre bacterias Gram(+) o Gram(-), as por ejemplo el cristal violeta inhibe el crecimiento de la mayor parte de las bacterias Gram(+). Algunos colorantes son: azul de metileno, verde de malaquita, verde brillante, violeta de genciana. 7. Gases: A travs de este mtodo se pueden esterilizar productos inestables al calor, objetos de plstico, locales, etc. Tipos de gases utilizados: a) Formaldehdo: los vapores de formaldehdo se pueden obtener por calentamiento de soluciones diluidas de formaldehdo o por los productos de polimerizacin de este aldehdo. Estos vapores poseen un poder bactericida que aumenta con la temperatura y humedad; as por ejemplo a 22C en presencia de un 6080% de humedad, el tiempo de esterilizacin ser de algunas horas, siendo rpidamente destruidas las formas vegetativas y ms lentamente las formas esporuladas. Debido a la toxicidad de los vapores, stos deben evacuarse una vez terminada la desinfeccin. b) Oxido de etileno: posee un amplio espectro de accin con un gran poder esporicida. Su uso est ligado a una mezcla con anhdrido carbnico o fren, ya que en su estado puro es prcticamente inutilizable debido a su alto poder inflamable. El xido de etileno es gaseoso a temperatura ambiente y lquido a una temperatura inferior a 10C. Su accin en base a la temperatura le permite entrar en contacto con los productos y objetos ms diversos y su poder penetrante asegura la esterilizacin de telas y an de ciertos plsticos. La utilizacin de aparatos especialmente diseados para su aplicacin, han ampliado su campo de accin. c) B-propiolactona: es un compuesto lquido que a temperatura ambiente emite vapores que son bactericidas, esporicidas y fungicidas. Es 25 veces ms activo que el formol y 400 veces ms activo que el xido de etileno. Tiene la ventaja que no es inflamable ni explosivo, posee una accin penetrante y es de rpida eliminacin. Se puede utilizar para esterilizar materiales quirrgicos, hilo para suturas, desinfeccin de locales e incluso medios de cultivos. d) Esencias voltiles (aceites esenciales): las esencias naturales tienen un poder bacteriosttico limitado que se debe a sus compuestos fenlicos y terpnicos y tambin en menor medida a sus alcoholes y aldehdos. Ejercicios

- Conozca los diferentes mtodos y equipos de esterilizacin. - Prepare material de vidrio y esterilcelo en el horno Pasteur. - Prepare un medio de cultivo y utilice el autoclave para su esterilizacin.

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVOS PARA HONGOS Y BACTERIAS

Laboratorio N 3 Prof. Jaime R. Montealegre A. Ctedra de Microbiologa General - 2002 Depto. de Sanidad Vegetal Facultad de Ciencias Agronmicas Universidad de Chile Para el aislamiento, estudio y clasificacin de los microorganismos, es necesario utilizar un medio de cultivo en el que dispongan de las sustancias orgnicas e inorgnicas necesarias indispensables para el normal desarrollo de su metabolismo. En estos medios, los microorganismos adems de poder multiplicarse, pueden manifestar caractersticas de crecimiento y propiedades bioqumicas; aspectos de gran importancia para su clasificacin. Estos preparados estriles que poseen los elementos necesarios para el desarrollo de un microorganismo, se denominan medios de cultivos, los que segn su estado fsico, pueden ser lquidos o slidos. Cultivo: es el resultado del crecimiento de un microorganismo o grupo de microorganismos. Cultivo puro: es el cultivo de una sola especie de microorganismo y su progenie (libre de todo contaminante). 1. Caractersticas que deben poseer los medios de cultivos: - Contener sustancias nutritivas como: protenas, azcares, minerales y vitaminas. - Tener un pH adecuado. - Estar esterilizados. - Estar protegidos de posibles contaminaciones. 2. Ventajas al utilizar los medios de cultivos: - Permiten el aislamiento de un microorganismo a partir de un sustrato natural (suelo, agua, plantas, aire, excrementos, pus, etc.). - Permiten la identificacin del microorganismo, segn las caractersticas de crecimiento, morfologa celular, propiedades tintoriales y reacciones bioqumicas. - Conservacin durante meses y aos de las cepas identificadas (cepario). - Obtencin de clulas de microorganismos patgenos o de sus toxinas para la elaboracin de productos biolgicos (vacunas, antitoxinas, etc.). 3. Clasificacin de los Medios de Cultivos La clasificacin de los medios de cultivos generalmente se basa en tres de sus principales aspectos: A. Segn su composicin qumica Medios sintticos de composicin definida. Se preparan en base a sustancias qumicas definidas. Se utilizan para el estudio del metabolismo bacteriano o para el cultivo de los microorganismos auttrofos. Medios naturales de composicin indefinida. Son aquellos que se preparan en base a sustancias que se extraen de tejido animal, o vegetal y cuya composicin no es conocida exactamente. A este grupo de medios pertenece la mayora (agua peptonada, caldo comn, leche, extracto de suelo, miel diluida, etc.).

B. Segn su estado fsico En general los medios de cultivos desde el punto de vista fsico pueden clasificarse en lquidos y slidos. La multiplicacin bacteriana en los medios de cultivos lquidos se manifiesta generalmente por el enturbiamiento de ste, en tanto que en los medios de cultivos slidos la multiplicacin bacteriana se manifiesta por una formacin macroscpica denominada colonia bacteriana, que es el resultado de la multiplicacin de una sola clula bacteriana. Los medios de cultivos slidos se obtienen agregando un agente solidificante como el agar o gelatina, a un medio lquido. C. Segn su utilizacin Medios de cultivos bsicos. Se caracterizan por ser pobres en material nutritivo, de manera que su uso es muy restringido, constituyen la base para la preparacin de otros medios. Como ejemplo pueden citarse el caldo peptonado y el agar-agar corriente. Medios de cultivos especiales. Se utilizan para fines determinados, entre ellos tenemos: a) Medios mejorados. En general son los mismos medios bsicos a los que se les agrega una sustancia enriquecedora como sangre, suero, etc. El uso de estos medios es universal y est orientado especialmente a obtener buen desarrollo de cualquier tipo de bacteria, por exigente que ella sea, con ciertas excepciones de especies que requieren de medios de cultivo y ambientes muy especiales. Por esta razn se utilizan en primera instancia en el aislamiento bacteriano, ya sea a partir de otros cultivos o de productos patolgicos. Los medios de este tipo de uso ms frecuente son: Agar tripticasa-sangre, caldo tripticasa, agar chocolate, medio de Mueller-Hinton. b) Medios selectivos. Son medios que contienen sustancias que impiden o limitan el crecimiento de algunas especies microbianas y permiten el desarrollo de otras. Estos medios de cultivos tienen aplicacin en el diagnstico bacteriolgico, en que el problema corriente consiste en aislar un microorganismo de un sustrato que contiene numerosas otras especies, a menudo sin importancia etiolgica y que, en un medio mejorado creceran en forma tal que impediran el aislamiento del agente causal que es el objetivo principal del diagnstico bacteriolgico. Se incluyen en este grupo el agar cristal violeta para el aislamiento de bacterias Gram(-) y el agar telurito de potasio para el aislamiento de bacterias Gram(+). c) Medios de cultivos diferenciales. Se emplean para demostrar alguna propiedad bioqumica de la bacteria como ser degradacin de hidratos de carbono, protenas, hidrlisis de la urea, etc., propiedades que facilitan la identificacin de ellas. Como se trata de fenmenos metablicos que tienden a la identificacin de la especie, el estudio en estos medios debe realizarse empleando cepas bacterianas puras. Existen numerosos medios de este tipo, de uso preferencial en la bioidentificacin de bacilos Gram(-) ya que ellos no tienen caractersticas muy distintivas en las colonias o cultivos en general. Entre los de uso ms corriente se encuentran: - Agar fierro-triple-azcar (TSI agar) empleado en el estudio de la fermentacin de la glucosa, lactosa y sacarosa y adems la produccin de SH2. - Medio de SIM, empleado en la investigacin de SH2, produccin de indol y movilidad bacteriana. - Caldo glucosado fosfatado, para la investigacin de acetil-metil-carbinol y/o acidificacin del medio, el test de Voges-Proskauer o del rojo de metilo, respectivamente.

- Medio agar-citrato de sodio (Medio de Simmons), para el estudio de la utilizacin del citrato de sodio, como nica fuente de carbono. - Medio agar-fenil-alanina, para el estudio de la deaminacin oxidativa de este aminocido a cido fenil pirvico. - Medio caldo lisina, para la investigacin de la decarboxilacin de este aminocido a pentadiamina. - Medio caldo urea, para investigar la hidrlisis de esta sustancia. d) Medios selectivos diferenciales. Son medios selectivos a los cuales se les ha adicionado un sustrato, generalmente un azcar, para demostrar la actividad fermentativa de la bacteria sobre esta sustancia. La actividad metablica se revela por el cambio de color de una sustancia que lleva incorporada el medio. Existe una gran cantidad de medios de este tipo y son de mucha utilidad en el trabajo microbiolgico. Entre los ms comunes se encuentran: - Medio N110 para Staphylococcus, ste contiene 7,5% de NaCl, en circunstancias que la concentracin salina de la mayora de los medios es 0,25% a 0,5%. Este compuesto evita el desarrollo de casi todas las dems bacterias. - Agar Levine, Agar Mac-Conkey, selectivos para el aislamiento de bacterias intestinales Gram(-). - Agar SS, selectivo para el aislamiento de especies in-testinales de los gneros Salmonella y Shigella, principalmente. a) Medios para bacterias anaerbicas. Pueden utilizarse los mismos medios que para las bacterias aerbicas, pero adicionndoles una sustancia reductora para mantener el ambiente de anaerobiosis (glutation, cistena y principalmente tioglicolato de sodio), o tambin incubando los medios en un ambiente libre de oxgeno (anaerobiosis) (Sistema Gas-Pax). b) Petrifilm (RSA). Son placas de recuento utilizadas para cuantificar algunas bacterias como Staphylococcus aureus; stas constan de la placa Petrifilm RSA, que contiene los nutrientes modificados Baird-Parker con un agente gelificante soluble en agua fra y el disco reactivo Petrifilm de nucleasa termoestable (Tnasa) (es una enzima producida por S. aureus que permanece estable a altas temperaturas). Estas placas permiten ahorrar espacio y un diagnstico rpido de los microorganismos a determinar. Existen adems para recuento de levaduras y hongos, bacterias coliformes, E. coli, etc. 4. Preparacin de un medio de cultivo En la preparacin de un medio de cultivo, se pueden distinguir los siguientes pasos: - Extraccin de los medios nutritivos (en caso de medios naturales o mixtos). - Adicin de sustancias nutritivas (ej. glucosa) y/o de sostn (ej. agar). - Ajuste del pH. - Reparticin. - Esterilizacin. 5. Medios de cultivos ms comnmente utilizados - Agar agua. Se utiliza preferentemente para aislar hongos del suelo. Agar 10 - 18 g Agua 1000 ml (destilada, desionizada o potable). Se agrega al agua el agar y se calienta hasta licuarlo. Se distribuye en tubos o matraces y se esteriliza a 15 p.s.i. durante 20 minutos.

- Agar-papa-dextrosa (APD). Se usa para aislar la mayora de los hongos. Papas peladas 200,0 g Dextrosa 12,5 g Agar 20,0 g Agua destilada 1.000,0 ml Las papas peladas se hierven en 1.000 ml de agua destilada hasta que estn cocidas. Posteriormente el jugo se filtra mediante gasa y algodn hidrfilo, se agrega el agar y la dextrosa y se enrasa a 1.000 ml con agua destilada. Se reparte en matraces o tubos y se esteriliza en autoclave a 15 p.s.i. por 20 minutos. - Agar-papa-dextrosa acidificado. este medio permite inhibir el desarrollo de bacterias, pudiendo utilizarse para aislar hongos a partir de tejidos enfermos (ej. races). La preparacin se realiza en forma idntica al APD; salvo, que despus de esterilizado se agregar 50 gotas de cido lctico 50% por litro de medio de cultivo. - Agar nutritivo o agar peptona. Se utiliza para aislar la mayora de las bacterias, pudiendo tambin servir como medio para conservar microorganismos. Extracto de carne 3 g Peptona 10 g Agar 18 g Agua destilada 1.000 ml Los ingredientes se disuelven en 500 ml de agua destilada, se lica el agar a bao Mara, se reparte en tubos o matraces y se esteriliza a 15 p.s.i. durante 20 minutos. - Caldo nutritivo. Se emplea para el cultivo lquido de bacterias y difiere del agar nutritivo en que se omite el agar, pudindose tambin incluir un carbohidrato (10 g de sacarosa o dextrosa). 6. Suplementos antibacterianos Cloranfenicol. Antes de esterilizar agregue 0,05 g/L de cloranfenicol suspendido en 10 ml de alcohol etlico 95%; mezcle bien y esterilice a 118C durante 10 minutos. Penicilina. Preparar una solucin stock de agua destilada estril con 60 mg (100.000 unidades) y guardar en refrigerador. Agregar 1 ml de la solucin a 10 ml de medio de cultivo previo a depositarlo en las placas de Petri. Estreptomicina. Preparar una solucin stock de agua destilada estril de 750 ml con 1 g de estreptomicina y guardar en refrigerador. Agregar 1 ml de la solucin a cada 10 ml de medio de cultivo previo a depositarlo en la placa de Petri; la concentracin es de 100 unidades/ml. Ejercicio - Prepare el medio de cultivo sealado por su Instructor.