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Sistemas de Restrio-Modificao
X
X Y
Metionina
CH3
S-adenosil-homocistena
Homocistena
H2O
Exemplo de metilao
Sistemas de Restrio-Modificao
Tipo I- ex sistema EcoKI, que s clivam DNA NO METILADO Tipo II- consoante a enzima podem clivar DNA METILADO ou NO METILADO Tipo III
S METILAM
Palndromos
RADAR MADAM IN EDEN IAM ADAM ESOPE RESTE ICI ET SE REPOSE 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5
Endonucleases de tipo II
AccI AluI BamHI EcoRI HaeIII Sau3AI Acinetobacter calcoaceticus Arthrobacter luteus Bacillus amyloliquefaciens H Escherichia coli Haemophilus aegyptius Staphylococcus aureus 3A
Natureza das extremidades geradas aps corte com as enzimas de restrio, determinada pelo lado da ligao fosfodister onde ocorre o corte
3-OH 5-P
Extremidades 5 e 3 projectadas
a 5 do eixo de simetria
a 3 do eixo de simetria
A metilase de EcoRI (M.EcoRI), cataliza a transferncia de grupos metilo de SAM para as adeninas marcadas com * na sequncia de reconhecimento
aact G A *A T T C tcgac ttga C T T *A A G agctg
A modificao da adenina (A*) para 6-metiladenina, protege o DNA da clivagem pela EcoRI
Enzimas de Tipo I ligam-se sequncia alvo, metilando-a, ou clivando o DNA, consoante o estado de metilao deste
+ + +
+ + +
+ + + -
r+ m + r- mr- m+ r- m-
Sistema de Modificao
Metilao Dam
Metilao Dam: Gm6ATC
(grupo metilo na posio N6 da adenina: N6-metiladenina )
Diferentes padres de metilao vs diferentes sensibilidades de clivagem Uma sequncia de DNA pode sofrer diferentes metilaes, adquirindo diferentes padres de metilao, consoante a especificidade das metilases da clula
Ex. Gm6ATC (Dam) GATm5C GATm4C GAThm5C
As enzimas de restrio podem apresentar diferentes sensibilidades aos diversos padres de metilao
Ex: Sau3A1 CLIVA Gm6ATC NO CLIVA GATm5C GATm4C GAThm5C
DpnI s corta sequncia de reconhecimento quando metilada DpnII no metilada Sau3AI metilada e no metilada
CLIVA
DpnI
NO CLIVA S CLIVA
DpnII
NO CLIVA
GATC
GATC
G*ATC
Metilase
As estirpes de Diplococcus pneumoniae que produzem DpnI e DpnII tero que possuir padres de metilao adequados proteco da restrio por cada uma destas enzimas
GAT C
Proteco da Restrio
G*AT C
DNA cloning...
One of the most important goals of recombinant DNA technology is to clone a particular gene of interest or other DNA fragment of interest The approach used to clone a specific gene, depends to a large degree on:
the gene what is known about it objective
VECTORS
Central component of gene cloning experiments Two types of naturally ocurring DNA molecules: Plamids Bacteriophages Properties Self-replicating Unique restriction enzymes cleavage sites Selectable marker Easy to recover
SELECTION MEDIA
Non-recombinant DNA plasmid. Bacteria cells harbouring this plasmid will grow, but wont be recombinant clones
Each colony, a large number of cells, results from one initial single cell Cell divides and vectors are passed to progeny Each colony is a CLONE, ie, contains identical copies of recombinant DNA molecules
Within the host, vector directs the copy number of recombinant DNA molecules.
G*ATC
MboI
GATC CTAG
G*ATC CT*AG
G*ATC CT*AG
Isoesquizmeros
1- Reconhecem a mesma sequncia e clivam nos mesmos locais AccIII
TCCGGA AGGCCT TCCGGA AGGCCT
BspEI
KpnI
GGTACC CCATGG
SmaI
CCCGGG GGGCCC
3- Reconhecem a mesma sequncia mas apresentam diferente sensibilidade metilao DpnII e MboI no clivam G*ATC metilado vs Sau3AI cliva G*ATC metilado DpnI cliva G*ATC metilado vs MboI no cliva G*ATC no metilado e ainda clivam em locais diferentes
Posso amplificar DNA humano numa estirpe de E. coli mcrA- e mcrBCe posteriormente cliv-lo com MspI? E com HpaII? Porqu?
MspI e HpaII so isoesquizmeros, mas HpaII bloqueada pela metilao em CG, realizada nos mamferos e pelas enzimas de modificao Dcm. MspI- no sensvel metilao, Dcm ou metilao CpG dos mamferos, ie, Cm5CGG. No entanto no cliva em m4CCGG, m5CCGG, Cm4CGG e hm5Chm5CGG HpaII- no cliva em Cm5CGG,
m4CCGG, m5CCGG,
Cm4CGG e hm5Chm5CGG
REGULAO EPIGNICA Alterao da expresso gnica que no se deve a alteraes na sequncia de DNA, mas a algo que a somar sequncia de DNA, influi a expresso gnica, como seja: - modificao de bases - factores proteicos que se ligam ao DNA