BACTERIAS DEGRADADORAS DE HIDROCARBUROS AISLADAS DE SUELOS CONTAMINADOS

Belloso Claudio, Carrario Javier

Belloso Claudio Mendoza 4197 - 2.000 Rosario - Argentina Tel-Fax: 041-380853 e-mail: belloso@satlink.com Carrario Javier Pasaje Mateo Biglioni 761 Corral de Bustos. Crdoba - Argentina Tel: 0468-22182

Palabras Claves: Bacterias Degradadoras de Hidrocarburos. n-hexadecano. Resazurina.

RESUMEN La recuperacin de un ambiente contaminado con hidrocarburos por medio de la bioremediacin, por ejemplo, exige un adecuado estudio y caracterizacin de los microorganismos presentes. Se han logrado aislar bacterias degradadoras de hidrocarburos de suelos contaminados, se han cultivado en el laboratorio y se han alimentado con un hidrocarburo puro como nica fuente de carbono. Estas bacterias, una vez probada su actividad hidrocarburoltica podran emplearse para acelerar los procesos de biodegradacin.

INTRODUCCION Los residuos oleosos producidos por la industria petrolera continan siendo un problema ambiental respecto a su tratamiento y disposicin final. Industrias enclavadas en un comienzo en lugares muy poco poblados, hoy, debido al gran crecimiento demogrfico, algunas de ellas han quedado encerradas dentro de un cerco, en el cual, no solo est la industria sino tambin su otrora landfarming. La recuperacin de un ambiente contaminado con hidrocarburos como este por medio de la bioremediacin, por ejemplo, exige un adecuado estudio y caracterizacin de los microorganismos presentes.

OBJETIVOS Aislar cepas bacterianas y estudiar su crecimiento en medios lquidos y slidos conteniendo hidrocarburos como nica fuente de carbono.

MATERIALES Y METODOS Matriz: suelo obtenido del Landfarming de Refinera San Lorenzo, industria petrolera ubicada en la Ciudad de San Lorenzo, Provincia de Santa Fe. Extractables en Eter Etlico (E.E.): 3,43 % p/p. Antigedad del Landfarming: 15 aos.

Aislamientos: Diluciones del suelo al 1% fueron sembradas en tubos con 5ml de caldo Bushnell - Haas (1) conteniendo 50 l de nhexadecano esterilizado por radiacin UV y 100 l de una solucin estril de resazurina de 50 ppm. Se hicieron los correspondientes blancos de indicador y de n-hexadecano. Se incubaron durante cinco das a 30C. Se consideraron positivos aquellos cultivos en los cuales vir el indicador, de azul a rosado. De los cultivos positivos se realiz posteriormente el aislamiento en Agar Bushnell - Haas suplementado con n-hexadecano. Al cabo de siete das de incubacin a 30C se obtuvieron colonias incoloras, pequeas de borde entero e irregular.

RESULTADOS Para corroborar que las colonias que crecan en medio slido con nhexadecano, tambin podan crecer con el extractable etreo obtenido del suelo contaminado, se tomaron al azar 12 colonias de las obtenidas y se las sembr nuevamente en 12 tubos conteniendo Caldo Bushnell Haas con indicador resazurina y con el extractable etreo ahora como nica fuente de carbono. Se sembraron paralelamente tubos testigos que contenan la cepa aislada en Bushnell - Haas con el indicador sin fuente de carbono. Se incubaron los tubos durante cinco das a 30C, en 7 de los 12 tubos se pudo observar el viraje del indicador, mientras que en los 12 tubos testigo no se detect cambio alguno del indicador. De los 7 tubos positivos se aisl nuevamente en Agar Bushnell - Haas con el extractable etreo como nica fuente de carbono.

Al cabo de 7 das de incubacin a 30C aparecieron las colonias en las 7 placas. Mediante el Kit API 20E se pudo identificar solo una de las siete cepas aisladas, la cual correspondi a Pseudomonas aeruginosa. Las seis cepas restantes se estudiaron mediante 38 reacciones bioqumicas, no pudindose lograr finalmente su identificacin (2). Las cepas estudiadas no identificadas mostraron entre s una similar taxonoma numrica de alrededor del 30 %. Cuadro 1. Reacciones Bioqumicas de las cepas aisladas en Kit API 20E
CEPAS N 2 3 4 5 6 - - - - - - - + - - - - - - + - - - - + + - - - - - - - - - - - - - - - - + - - - - - - + - - - - - + - - + - - - - - + - - - - - - - - - - - - - - - + - - - - + + - - - + - - - - - - - + + - - + - - - - - + + + + + - - - -

TEST (*) 1 ONPG + ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA OX NO2 N2 MOB + McC OF-O OF-F +

7 + + + + + + -

(*) Abreviaturas: ONPG, -galactosidasa; ADH, arginina dehidrolasa; LDC, lisina descarboxilasa; ODC, ornitina descarboxilasa; CIT, citrato; H2S, cido sulfhdrico; URE, ureasa; TDA, triptfano desaminasa; IND, indol; VP, produccin de acetona, GEL, gelatinasa; GLU, glucosa; MAN, manitol; INO, inositol; SOR, sorbitol; RHA, ramnosa; SAC, sacarosa; MEL, melibiosa; AMY, amigdalina; ARA, arabinosa; OX, citocromo oxidasa; NO 2, produccin de NO 2; N2, produccin de N2; MOB, movilidad; McC, crecimiento en agar Mac Conkey; OF, oxidacin fermentacin. CONCLUSION Aproximadamente un 60% de las cepas aisladas que crecen con nhexadecano como nica fuente de carbono tambin lo hacen con el extractable etreo. De cualquier manera, algunas cepas pierden la capacidad de crecer con hidrocarburos como nica fuente de carbono despus de 2 o 3 transferencias sucesivas por distintos medios. El mismo hbitat en el cual se desarrollan este tipo de bacterias podra ser la causa de los cambios observados en sus fenotipos lo cual conduce a la baja coincidencia con las especies codificadas. Dichas bacterias podran utilizarse para degradar hidrocarburos en suelos una vez propagadas en laboratorio y luego inoculadas.

BIBLIOGRAFIA (1) Bushnell, LD; Haas, HF. The utilization of certain hydrocarbons by microorganisms. J. Bacteriol. 41: 653-673, 1941. (2) Holt JG, Krieg NR, Sneath PH, Staley JT, Williams ST. Bergeys Manual of Determinative Bacteriology 9 th ed., Baltimore, Williams & Wilkins, 1994.