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Hurtado y de la P., Marcela; Correa L., Tania; Soria A, Olivia; Lozada G., Concepcin; Medina L., Jos Ral; Domnguez R., Adriana Miriam Desarrollo de un mtodo analtico por cromatografa de lquidos de alta resolucin para la cuantificacin de sulfxido de albendazol en orina Revista Mexicana de Ciencias Farmacuticas, Vol. 41, Nm. 1, enero-marzo, 2010, pp. 30-36 Asociacin Farmacutica Mexicana, A.C. Mxico
Disponible en: http://redalyc.uaemex.mx/src/inicio/ArtPdfRed.jsp?iCve=57912960004

Revista Mexicana de Ciencias Farmacuticas ISSN (Versin impresa): 1870-0195 rmcf@afmac.org.mx Asociacin Farmacutica Mexicana, A.C. Mxico

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Volumen 41 Nmero 1 Enero - Marzo 2010

Trabajo Cientfico

Desarrollo de un mtodo analtico por cromatografa de lquidos de alta resolucin para la cuantificacin de sulfxido de albendazol en orina
Development of a high-performance liquid-chromatography analytical method for the quantification of albendazol sulfoxide in urine
Marcela Hurtado y de la P., Tania Correa L., Olivia Soria A., Concepcin Lozada G., Jos Ral Medina L., Adriana Miriam Domnguez R. Departamento Sistemas Biolgicos, Universidad Autnoma Metropolitana-Xochimilco
Resumen Se desarroll un mtodo analtico por CLAR y deteccin UV para la cuantificacin de sulfxido de albendazol en orina. La extraccin en fase slida permiti concentrar la muestra y cuantificar el metabolito en las concentraciones esperadas en orina despus de administrar una dosis de albendazol. El mtodo fue selectivo, con un recobro absoluto > 80%; lineal (R2 > 0.99), preciso (CV < 7%) y exacto (diferencia 15% del valor nominal) en el intervalo de concentraciones utilizadas (0.125 a 4 g/mL). La aplicabilidad del mtodo se demostr mediante la determinacin del metabolito en dos voluntarios sanos a los que se les administr una dosis oral de 400 mg (tabletas) de albendazol. No se detect sulfona de albendazol en el perodo de recoleccin de las muestras. Abstract An analytical method for the quantification of albendazole sulfoxide in urine was developed. Solid phase extraction allowed albendazole sulphoxide sample enrichment and the metabolite quantification, in concentrations found in urine after a single dose administration of albendazole, using UV detection. The method was selective and allowed not less than 80% of absolute recovery for the metabolites, it was precise (CV < 7%), linear (R2 > 0.99) and accurate (bias < 15%) in the range of the concentrations assayed (0.125 to 4 g/mL). The method was successfully applied to samples from two volunteers for the determination of albendazol sulfoxide, after the administration of a single oral dose of albendazol (400 mg tablet). Albendazole sulfone concentrations were not detected during sample collection period. Palabras clave: metabolitos de albendazol, sulfxido de albendazol, sulfona de albendazol, extraccin en fase slida. Correspondencia: M. en C. Marcela Hurtado y de la Pea Departamento Sistemas Biolgicos Universidad Autnoma Metropolitana-Xochimilco Calzada del Hueso 1100 Colonia Villa Quietud Delegacin Coyoacn C.P. 04960, Mxico D.F., Mxico Telfono: (55) 5483 7254 Fax: (55) 5483 7237 e-mail: mhurtado@correo.xoc.uam.mx Keywords: albendazole metabolites, albendazole sulfoxide, albendazole sulfone, solid-phase extraction.

Fecha de recepcin: 22 de septiembre de 2009 Fecha de recepcin de modificaciones: 8 de febrero de 2010 Fecha de aceptacin: 9 de febrero de 2010

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Introduccin
El albendazol (5-propiltio-1H-bencimidazol-2-il carbamato de metilo) (ABZ) es un frmaco antihelmntico de amplio espectro con demostrada actividad sistmica1 que presenta efecto de primer paso y se transforma en un compuesto conocido como sulfxido de albendazol (ABSO). Este cambio esta mediado por los sistemas flavin monooxigenasa y citocromo P450. El ABSO se oxida al compuesto inactivo sulfona de albendazol (ABSO2) va citocromo P450.2 Debido al extenso metabolismo del ABZ despus de su administracin oral, las concentraciones plasmticas del frmaco inalterado son muy bajas y su efecto sistmico se ha asociado principalmente al ABSO. 3-6 Este metabolito es detectable tanto en plasma como en lquido cefalorraqudeo7 y en el interior de los parsitos despus de un perodo de incubacin.8 La mayora de los mtodos publicados para cuantif icar metabolitos de albendazol utilizan plasma humano y plasma de diferentes especies animales;9-14 sin embargo, slo algunos consideran la determinacin de los compuestos en orina.15-17 La determinacin de los metabolitos en orina representa ventajas sobre aquellos mtodos que utilizan plasma ya que se dispone de grandes volmenes de fluido biolgico que pueden ser sometidos a un proceso de concentracin mediante el tratamiento adecuado de la muestra. Estos mtodos se simplifican por la ausencia de protenas adems de que el procedimiento de muestreo no resulta invasivo. Algunos estudios de excrecin urinaria de metabolitos de albendazol se han llevado a cabo bajo regmenes de dosis mltiples y con perodos de recoleccin de orina prolongados (8, 12 y 24 h).15,16 De esta forma se logran detectar niveles urinarios de los metabolitos de albendazol mayores a los que se encontraran despus de administrar una sola dosis y durante perodos cortos de recoleccin de orina. Domnguez y col.17 no detectaron metabolitos de albendazol en orina al utilizar un mtodo por cromatografa de lquidos de alta resolucin (CLAR) con detector ultravioleta (UV), despus de la administracin de una dosis nica de 7 mg/kg de ABZ en voluntarios sanos. Dada la mayor sensibilidad de un detector de fluorescencia, este detector ha sido utilizado con xito en la determinacin de ABSO y ABSO2 en orina con un volumen de muestra pequeo en periodos de recoleccin de 8 h.16 Es posible lograr niveles comparables de cuantificacin utilizando un detector de UV de uso ms comn, con el adecuado manejo de un volumen grande de muestra. En la determinacin de trazas de analitos, se consiguen altos factores de enriquecimiento, mediante la separacin del analito contenido en un volumen grande de muestra, en cartuchos de extraccin en fase slida. Este procedimiento tiene ventajas significativas cuando se trata de recuperar metabolitos a partir de orina ya que por una parte, es conocida la importancia de la va renal en la eliminacin de frmacos y/o sus metabolitos y por otra, es posible contar con

los volmenes grandes de muestra. En este trabajo se propone un mtodo para determinar ABSO en presencia de ABSO2 mediante el tratamiento por extraccin en fase slida de 25 mL de orina para concentrar los metabolitos en un volumen de 400 L de disolvente. Este procedimiento permite cuantificar ABSO en muestras de orina, despus de una dosis de ABZ utilizando para la determinacin un sistema cromatogrfico con deteccin UV. El mtodo se aplic exitosamente al anlisis de muestras de orina de dos voluntarios que ingirieron una dosis de 400 mg de ABZ en tabletas.

Material y mtodos
Reactivos Los metabolitos ABSO y ABSO2 se sintetizaron mediante el mtodo reportado por Soria y col.18 La pureza de los metabolitos se evalu por cromatografa en capa fina, cromatografa de lquidos de alta resolucin y espectrofotometra de absorcin ultravioleta. Los compuestos fosfato dibsico de potasio, cido clorhdrico y cido actico fueron grado reactivo (Merck, Mxico). Los disolventes metanol y acetonitrilo fueron grado cromatogrfico (J.T. Baker, Mxico). El agua utilizada en todos los experimentos fue grado cromatogrfico obtenida mediante un equipo Simplicity System (Millipore Corporation, USA). Preparacin de las curvas de calibracin Se prepararon soluciones madre de ABSO y ABSO2 de 1 mg/ mL en acetonitrilo y se almacenaron a 4C. La soluciones de trabajo se prepararon diariamente mediante la dilucin de soluciones madre en orina blanco para obtener concentraciones de 0.125 a 4 g/mL. Equipo El sistema cromatogrfico (Perkin Elmer S.A.) consisti de una bomba binaria serie 200, un inyector manual Rheodyne modelo 7225 y un detector UV/visible de longitud de onda variable (Applied Biosystem).
La separacin cromatogrfica se efectu en una columna Zorbax C8, 250 4.6 mm, 5 m de tamao de partcula (Agilent Technologies).

Condiciones cromatogrficas Como fase mvil se emple una mezcla de agua-metanolacetonitrilo-cido actico 50:41:8:1. La separacin cromatogrfica se realiz a una velocidad de flujo de 1 mL/min y la deteccin de los metabolitos a una longitud de onda de 286 nm. Preparacin de las muestras Las muestras de orina de 25 mL se sometieron a un proceso de extraccin en fase slida, utilizando cartuchos C18 de 10 g

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Volumen 41 Nmero 1 Enero - Marzo 2010 Extra Clean Column (Alltech). Los cartuchos se acondicionaron previamente mediante el paso consecutivo de 20 mL of acetonitrilo, 30 mL de mezcla de solucin amortiguadora de fosfatos 0.01 M pH 8-acetonitrilo (50:50, v/v) y 30 mL de solucin amortiguadora de fosfatos 0.01 M pH 8. Posteriormente, el volumen de orina se transfiri al cartucho y se realizaron los siguientes lavados: 30 mL de solucin amortiguadora de fosfatos 0.01 M pH 8; 20 mL de una mezcla de solucin amortiguadora de fosfatos 0.01 M pH 8-acetonitrilo (80:20, v/v) y 6 mL de metanol. Los analitos se eluyeron con 8 mL de mezcla de acetonitrilo-metanol-cido actico (49.5:49.5:1, v/v/v). El eluato se evapor a sequedad en bao de agua a 45C bajo suave corriente de nitrgeno. El residuo se reconstituy en 400 L de mezcla de fase mvil-acetonitrilo (50:50, v/v) y se filtr a travs de acrodiscos de poro de 0.45 m (Millipore Corporation, USA). Finalmente, se inyectaron muestras de 20 L al sistema cromatogrfico bajo las condiciones descritas previamente.

Exactitud Para evaluar la exactitud del mtodo se compararon los resultados de concentracin obtenidos contra la concentracin nominal de muestras control (n = 6), analizadas paralelamente con una curva de calibracin en orina. Se consider como exacto los valores con desviacin relativa de 15% del valor de la concentracin nominal y con precisin de no ms de 15% para el valor del CV.
Para el lmite de cuantificacin se consider la concentracin ms baja del metabolito con la cual se obtuvo una precisin satisfactoria (CV < 20%) y exactitud (expresada como el porcentaje de desviacin relativa del valor nominal) con un valor lmite de 20%.

Validacin del mtodo Selectividad Se sometieron muestras de orina blanco de diferentes voluntarios al tratamiento de extraccin descrito y se inyectaron en el sistema cromatogrfico. Los cromatogramas obtenidos se compararon con muestras de orina aadidas con cantidades conocidas de ABSO y ABSO2 a fin de evaluar la presencia de interferencias de origen endgeno en el ensayo. Linealidad y precisin La linealidad y la precisin del sistema se determinaron mediante el anlisis estadstico de regresin lineal y el clculo del coeficiente de variacin (CV) del factor respuesta de tres curvas de calibracin de estndares disueltos en la mezcla fase mvil-acetonitrilo (50:50, v/v).
Para determinar la linealidad del mtodo analtico se analizaron tres curvas de calibracin en orina en un intervalo de concentraciones de 0.125 a 4 g/mL. Los parmetros de regresin y el anlisis de varianza de la regresin se obtuvieron del ajuste de los datos del rea bajo la curva en funcin de la concentracin de ABSO y de ABSO2.

Reproducibilidad del mtodo Se analizaron por duplicado muestras control de tres concentraciones conocidas (baja, media y alta) en muestras de orina, en tres das. Se determin para cada concentracin el valor promedio, la desviacin estndar y el CV en porciento para los seis resultados obtenidos de cada concentracin. Estabilidad La estabilidad de los metabolitos de albendazol en muestras de orina, en congelacin a 20C, durante tres meses, fue confirmada previamente por otros autores 16. Por este motivo, en el presente trabajo no se llev a cabo el estudio de estabilidad de las mismas. En este estudio, las muestras urinarias obtenidas fueron congeladas inmediatamente a 20C y analizadas en un perodo no mayor a 24 a 48 h posterior a su recoleccin, por lo que se consider adecuada su estabilidad. Muestras biolgicas Dos voluntarios sanos, voluntario 1 (sexo masculino de 27 aos de edad y peso corporal de 68 kg) y voluntario 2 (sexo femenino de 25 aos de edad y peso corporal de 50 kg) libres de tratamiento farmacolgico alguno recibieron, previo consentimiento firmado, una dosis oral de 400 mg de ABZ (tabletas) despus de un perodo de 12 h de ayuno y de colectar una muestra de orina blanco etiquetada como tiempo cero.
Dos horas despus de la administracin de la dosis de ABZ, los voluntarios recibieron un desayuno ligero. Las muestras de orina se recolectaron en los siguientes intervalos de tiempo: 02, 24, 46, 68, 812 y 1224 h para el voluntario 1 y 02, 24, 46, 68, 812, 1224 y 2436 h para el voluntario 2. Las muestras de orina de los voluntarios se analizaron paralelamente a duplicados de muestras control a tres niveles de concentracin (0.336, 0.788 y 3.36 g/mL) para ABSO, (0.318, 0.746 y 3.180 g/mL) para ABSO2 y una curva de calibracin en orina. El tratamiento de las muestras se llevo a cabo dentro de las siguientes 24 h de la obtencin de stas. El ensayo se acept siempre y cuando los resultados del anlisis de

Recobro y precisin El nivel de recuperacin absoluta se determin en trminos del porcentaje de recobro al analizar siete rplicas de muestras de orina aadidas con ABSO y ABSO2 y soluciones estndar no sometidas a extraccin a tres concentraciones diferentes comprendidas en el intervalo de trabajo: 0.27 g/mL (nivel bajo), 0.54 g/mL (nivel medio) y 1.08 g/mL (nivel alto) para ABSO y 0.30 g/mL (nivel bajo), 0.60 g/mL (nivel medio) y 1.19 g/mL (nivel alto) para ABSO2. La precisin del mtodo se evalu con los resultados del anlisis de muestras procesadas en un da de trabajo. En cada nivel de concentracin se determin el CV.

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las muestras control estuvieran comprendidos dentro de 15% del valor nominal.

Resultados y discusin
Validacin del mtodo analtico Selectividad Los cromatogramas obtenidos a partir de muestras de orina blanco no mostraron interferencia en los tiempos de retencin del ABSO y ABSO2 (6.7 y 7.8 min, respectivamente) atribuibles a compuestos endgenos (Figura 1).

Linealidad El detector mostr una respuesta lineal, en el intervalo de concentraciones esperadas, con coeficientes correlacin R > 0.999 para ambos metabolitos y un CV< 2 % en el factor respuesta en todos los niveles de concentracin.
Bajo las condiciones establecidas y aplicando el mtodo de extraccin propuesto, el mtodo present un comportamiento lineal en el intervalo de 0.125 a 4 g/mL al correlacionar el rea bajo la curva obtenida contra la concentracin de ABSO y ABSO2 en orina (Figura 2).

Figura 2. Linealidad del mtodo para sulfxido (ABSO) y sulfona (ABSO2) de albendazol.

El intervalo de trabajo utilizado para este mtodo es comparable al reportado por Lanchote y col.16 en el cual se utiliza un detector de fluorescencia. Los lmites de deteccin para el detector de fluorescencia frecuentemente son menores de uno a tres rdenes de magnitud a los intervalos de concentracin en mtodos donde se utiliza el detector UV.19 Por tal motivo, si el tratamiento de extraccin de la muestra aqu propuesto se aplicara con un detector de fluorescencia sera posible alcanzar un lmite de cuantificacin significativamente menor.

Figura 1. Cromatogramas de (A) orina blanco, (B) orina aadida con sulfxido (ABSO) y sulfona (ABSO2) de albendazol y (C) orina de un voluntario recolectada de 48 h despus de administrar una dosis oral de 400 mg de albendazol.

Recobro y precisin Los resultados obtenidos para el recobro absoluto de cada metabolito a los tres niveles de concentracin y sus respectivos valores de CV se presentan en la Tabla 1. Se encontr un recobro absoluto de 82 a 97% con CV < 7% lo que permite considerarlo como repetible y con recobros aceptables.

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Tabla 1. Recobro absoluto promedio y precisin para sulfxido (ABSO) y sulfona (ABSO2) de albendazol
ABSO (g/mL) 0.27 0.54 ABSO2 (g/mL) 0.30 87.49 4.91 5.61 0.60 94.37 4.50 4.77 Concentracin aadida Recobro absoluto % (n = 7) Desviacin estndar Coeficiente de variacin (%) 1.08 1.19 85.98 3.51 4.08

El lmite de deteccin determinado como cinco veces la relacin seal/ruido fue 0.02 g/mL para el ABSO y 0.04 g/mL para el ABSO2.

82.75 94.89 97.00 5.48 6.62 5.76 6.07 4.59 4.73

Reproducibilidad del mtodo El mximo valor de CV obtenido para muestras aadidas de ABSO analizadas por duplicado en diferentes das fue 7.2% y en el caso de ABSO2 de 8.6%. Para ambos compuestos la variabilidad obtenida en diferentes das fue inferior al 15% (Tabla 3), por lo que la reproducibilidad del mtodo es aceptable. Anlisis de muestras urinarias Se encontraron concentraciones cuantificables de ABSO a lo largo del perodo de muestreo de ambos voluntarios. La cantidad total excretada de ABSO en 24 h para el voluntario 1 fue de 2.95 mg y para el voluntario 2 en 36 h fue de 2.76 mg. Estos resultados se encuentran dentro del intervalo reportado previamente por Lanchote y col16 en cuyo estudio se encontraron valores entre 1.94 a 5.89 mg/24 h para la cantidad total excretada en orina de ABSO, despus de la administracin oral de albendazol bajo un rgimen de dosificacin mltiple (7 mg/kg/12 h).
La utilidad de la determinacin de frmaco y/o metabolitos en muestras urinarias, radica en que stas son un reflejo del comportamiento en plasma, dada la relacin que hay entre lo que se absorbe y lo que se elimina, de tal forma que es posible determinar algunos parmetros farmacocinticos sin requerir la toma de muestras sanguneas. La constante de velocidad de eliminacin de ABSO para cada voluntario se calcul a partir de la fase terminal de la representacin semilogaritmica de los datos de velocidad de excrecin urinaria en funcin del tiempo medio del perodo de recoleccin de orina (Figura 3). La vida media de eliminacin en el voluntario 1 fue de 11 h, mientras que para el voluntario 2 fue de 7 h. Ambos valores concuerdan con lo reportado en otros estudios farmacocinticos realizados tanto con muestras plasmticas como con muestras urinarias.17,20 En este estudio, los resultados obtenidos para el voluntario 1, no muestran una fase ascendente en la velocidad de excrecin
Tabla 3. Reproducibilidad para sulfxido (ABSO) y sulfona (ABSO2) de albendazol
Concentracin aadida Exactitud % (n = 6) Desviacin estndar Coeficiente de variacin (%) ABSO (g/mL) 0.15 0.56 1.12 ABSO2 (g/mL) 0.128 0.53 1.22

Exactitud En la Tabla 2 se presentan los resultados obtenidos para evaluar la exactitud del mtodo para ambos metabolitos a tres niveles de concentracin (n = 6). Como se observa ningn dato supera el 15% del valor nominal de concentracin.
El lmite de cuantificacin del mtodo fue 0.125 g/mL para ambos metabolitos ya que concentraciones menores presentaron valores de CV > 20 %.
Tabla 2. Exactitud del mtodo analtico para sulfxido (ABSO) y sulfona (ABSO2) de albendazol

Concentracin de ABSO en orina Concentracin de ABSO2 en orina (g/mL) (g/mL) % % Agregada Encontrada Desviacin Agregada Encontrada Desviacin 1.082 1.082 1.082 1.082 1.082 1.082 Media 0.541 0.541 0.541 0.541 0.541 0.541 Media 0.150 0.150 0.150 0.150 0.150 0.150 Media 0.134 0.169 0.130 0.138 0.135 0.137 0.509 0.563 0.537 0.594 0.551 0.502 1.018 0.971 1.009 0.964 0.966 1.006 5.9 10.3 6.7 10.9 10.7 7.0 8.6 5.9 4.1 0.7 9.8 1.8 7.2 4.9 10.7 12.7 13.3 8.0 10.0 8.7 10.6 0.127 0.127 0.127 0.127 0.127 0.127 0.120 0.112 0.114 0.143 0.110 0.110 0.596 0.596 0.596 0.596 0.596 0.596 0.552 0.606 0.564 0.613 0.587 0.617 1.192 1.192 1.192 1.192 1.192 1.192 1.161 1.120 1.160 1.109 1.109 1.143 2.6 6.0 2.7 7.0 7.0 4.1 4.9 7.4 1.7 5.4 2.9 1.5 3.5 3.7 5.5 11.8 10.2 12.6 13.4 13.4 11.2

92.23 100.94 101.85 103.46 101.7 93.6 2.10 2.30 7.26 7.20 7.16 7.00 6.06 5.90 8.76 8.60 6.84 7.30

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de los mismos.9 En el desarrollo de este mtodo se logr una cuantificacin selectiva del metabolito activo ABSO en presencia del metabolito secundario ABSO2.

Conclusiones
El mtodo desarrollado muestra recobros altos, una adecuada precisin, es lineal y exacto en el intervalo de concentraciones esperadas para ABSO y presenta el planteamiento de un tratamiento sencillo con extraccin en fase slida para la determinacin de los metabolitos de ABZ presentes en orina. La aplicacin del mtodo desarrollado se demostr con el anlisis de muestras de voluntarios sanos que recibieron una dosis de ABZ de 400 mg. Las concentraciones de ABSO determinadas en las muestras de orina de los voluntarios se encontraron dentro del intervalo de concentraciones contempladas en la validacin del mtodo. Los niveles de ABSO2 en orina despus de una dosis nica de ABZ probablemente estn por debajo de los lmites de cuantificacin considerados para el mtodo desarrollado, por lo que dicho metabolito no se determin en las muestras.

Figura 3. Perfil de velocidad de excrecin urinaria vs tiempo medio del perodo de recoleccin de orina para sulfxido de albendazol (ABSO) de dos voluntarios sanos despus de administrar una dosis oral de 400 mg de albendazol.

urinaria del ABSO sin embargo, en la fase descendente se observa un pequeo pico en la grfica correspondiente. Por otro lado, los datos del voluntario 2 mostraron dos picos antes de la fase descendente (Figura 3). Si bien es cierto que el mtodo de velocidad de excrecin urinaria puede presentar este tipo de variaciones, es posible que el comportamiento urinario observado en estos voluntarios, refleje un perfil de concentracin plasmtica con dos picos. La presencia de un doble pico para el perfil de concentracin plasmtica de ABSO, ha sido descrito previamente20 y podra ser explicado por el metabolismo presistmico de albendazol a nivel de la pared intestinal demostrado por Redondo y col 21. Con dichos antecedentes es posible que lo observado en los datos urinarios represente una segunda fase de crecimiento en los niveles plasmticos de ABSO, sin embargo para confirmar esta hiptesis se requiere realizar el estudio en un mayor nmero de voluntarios. El compuesto ABSO2 no se detect en ninguna de las muestras analizadas. Esta reportado que la cantidad total excretada de este metabolito en orina, despus de la dosificacin mltiple de 7 mg/kg/12 h de ABZ, fue de 0.03 a 0.13 mg en 24 h.16 En el presente estudio donde se administr una dosis de ABZ a los voluntarios y el lmite de cuantificacin para ABSO2 fue de 0.125 g/mL, era poco probable su determinacin; sin embargo, el hecho de que el mtodo desarrollado sea selectivo para ABSO es de gran importancia por tratarse del metabolito activo. Algunos mtodos previamente reportados no presentan resolucin entre ambos metabolitos por lo que su aplicacin al anlisis de muestras puede resultar en la determinacin conjunta

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