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INSTRUO DE TRABALHO

Verso do Documento: Local: Laboratrio: Seo no Laboratrio: Nome do Teste: Cdigo do Documento: Nome do Equipamento:

Descrio do Documento 1 Instituto Nacional de Cardiologia de Laranjeiras (INCL) Terapia Celular SALA LIMPA PARA PROCESSAMENTO CELULAR OBTENO DE CLULAS MONONUCLEARES DE MEDULA SSEA (CMMO) INCL IT0002 PROCESSAMENTO DE MEDULA SSEA N.A

Descrio Resumida da Alterao Reviso 1/2: Dados da Amostra Medula ssea coletada com heparina Sangue perifrico coletado sem anticoagulante Vide INCL IT0001-v02- COLETA DE MEDULA SSEA Vide INCL IT0001-v02- COLETA DE MEDULA SSEA Medula ssea: Refrigerado (4 -8 C) e de forma assptica N.A. N.A. A Medula ssea deve ser processada logo aps coleta As CMMO devem ser infundidas at duas horas, quando refrigeradas, aps processamento; A CMMO para anlise em Citometria de Fluxo pode ser analisada at 24hs aps processamento. Medula ssea: N.A. o Soro autlogo: refrigerado (4-8 C) at 4hs, aps -20 C Soro autlogo (-20C) o Suspenso de mononucleares refrigerado (4-8 C) N.A. Vide manual de Biossegurana - item manipulao de amostras biolgicas

Material: Volume Ideal: Volume Especfico: Transporte: Rejeio da Amostra: Acondicionamento: Estabilidade:

Conservao Pr Analtica: Conservao Ps Analtica: Tratamento Pr Analtico: Segurana:

Mtodo e Princpio Nome do Mtodo: Princpio: Separao mononuclear por gradiente de densidade. O aspirado de medula ssea aps ser diludo com salina apresenta densidade abaixo de 1077. Quando num mesmo tubo e submetidas a centrifugao com fora centrfuga controlada, a frao de clulas mononucleares da medula ssea se encontra em camada acima da camada do reagente Ficoll-Paque, pois apresenta menor densidade que este reagente. Desta maneira, separada dos eritrcitos e granulcitos presentes na amostra.

Equipamentos: Instrumentos Especiais:

Equipamentos Centrfuga refrigerada, geladeira, microscpio e micropipetas e pipetador automtico Fluxo laminar classe II A2

2 Local Fsico do Manual: Manual Informatizado: Na sala estril de processamento celular No computador do Lab. de Terapia Celular identificado pelo nome do mtodo.

Tcnica Instrues

ATENO: O ambiente ideal para o processamento da medula ssea e obteno da CMMO de sala limpa, composto por uma gradao: classe 100 (ambiente interno do fluxo laminar), classe 10.000 (ambiente externo do fluxo laminar), classe 100.000 (ante-sala de acesso ao laboratrio) e, finalmente o ambiente sem controle de partculas. Quanto menor a classe, menor o nmero de partculas contadas e mais limpo o ambiente. No dia anterior ao procedimento: Limpar a cmara de fluxo laminar com lcool 70% e manter a luz ultravioleta ligada durante15-18 hs. No dia do procedimento: Ligar a cmara de fluxo laminar pelo menos 60 min antes do incio dos trabalhos Retirar os reagentes da geladeira Separar material de trabalho Centrifugar o sangue perifrico coletado em tubo de soro gel, segundo instrues do INCL IT0001 v02 COLETA DE MEDULA SSEA, SORO E PLASMA em centrfuga clnica (10 minutos a 3000 RPM).Coletar o soro autlogo assepticamente, dentro do Fluxo Laminar, para preparo de soluo de infuso de CMMO. O soro restante dever ser aliquotado em criotubos de 2mL, congelados a -20C e posteriormente enviados para o INCL juntamente com as amostras de plasma para determinao de BNP, conforme intrues de arquivo INCL IT0005-v02-TRANSPORTE PARA BNP. Centrifugar o sangue perifrico coletado segundo instrues do INCL IT0001 v02 COLETA DE MEDULA SSEA, SORO E PLASMA em centrfuga clnica (10 minutos a 3000 RPM). Coletar o plasma, aliquot-lo em criotubos de 2mL e congelar a -20C. Proceder o envio da amostra conforme INCL IT0005-v02-TRANSPORTE PARA BNP. Antes de receber a medula ssea: O tcnico deve paramentear-se de forma assptica (capote, touca , sapatilha, mscara e luvas estreis) Proceder com assepsia e anti-sepsia conforme recomendaes para procedimentos cirrgico Separar material dentro do fluxo laminar Aliquotar de maneira estril em tubos Falcon de 50 ml: salina, meio RPMI e Ficoll para uso durante o procedimento Calar luvas estreis Abrir campo cirrgico estril (70x70cm) Separar 2 ml de Heparina em seringa estril Montar o sistema de filtrao (4 hastes e base de apoio em acrlico = mesa de sustentao, embolo e seringa de vidro para montar os filtros = sistema de filtrao), (opcional). Deixar separado sob o campo estril: 3 pacotes de gaze estril, 2 beckers, Aguardar envio da medula puncionada SEPARAO DE MEDULA SSEA 1. Abrir o campo estril interno (que envolve a cuba rim com as seringas contendo a medula ssea aspirada) somente dentro da capela de fluxo lanimar. 2. Adicionar 2 ml (10.000 unidades) de heparina ao Becker do Kit de filtrao de medula ssea*, j devidamente apoiado na mesa de sustentao. 3. Transferir o aspirado de medula ssea das seringas para o recipiente contendo heparina. 4. Esta parte de pr-filtragem opcional. Montar o sistema de filtrao utilizando primeiramente o filtro com a malha mais grossa (60 mesh, 250 m) no caso do uso do Kit de filtrao da University of Washington. 5. Colocar outro Becker na mesa de sustentao e transferir o contedo do segundo Becker de volta o primeiro Becker atravs do sistema de filtrao. Usar o mbolo se o contedo no descer com a fora da gravidade.

3 6. Usar 25 mL (metade do volume para diluio da medula ssea) de salina estril para lavar internamente o primeiro Becker, despejando tambm este volume atravs da malha de filtrao mais grossa. 7. Limpar o primeiro Becker com uma gaze estril limpa. 8. Substituir a malha grossa pela malha fina (100 mesh, 150 m) 9. Colocar o primeiro Becker (j devidamente limpo) na mesa de sustentao e transferir o contedo do segundo Becker de volta para o primeiro Becker atravs do sistema de filtrao (agora com o filtro de malha fina). Usar o mbolo se o contedo no descer apenas com a fora da gravidade. 10. Usar os 25ml restantes (volume para completar a diluio da medula ssea) de salina estril para lavar internamente o segundo Becker, despejando tambm este volume atravs da malha de filtrao mais fina. 11. Neste momento teremos um volume final em torno de 100 a 200 ml (medula ssea + salina estril na proporo 1:1). 12. Caso a pr-filtrao no seja usada reiniciar aqui o procedimento a partir do passo 3. Acrescentar ao recipiente contendo o aspirado de medula e a heparina salina estril para atingir a uma proporo final (1:1 de medula e salina se aspirado de medula for 100 ml teremos um volume final de 250 ml). Preparar tubos de centrfuga de 50 ml com 20 ml de Ficoll-Paque, que dever ser manipulado na cmara de fluxo laminar. 13. Acrescentar cuidadosamente sobre a soluo Ficoll-Paque, 25 ml de medula ssea diluda 1:1 em salina, obtendo-se ao final duas fases, que perfazem um volume total de 45 mL em cada tubo. 14. Centrifugar a 550 g por 25 minutos, a temperatura ambiente e sem freio (ou com o tempo mximo de frenagem). 15. Coletar e desprezar camada de gordura no sobrenadante. 16. Coletar o anel de clulas mononucleares acima da camada de Ficoll-Paque e transferir para dois tubos de centrfuga de 50 ml. 17. Completar o volume dos tubos com meio RPMI 18. Centrifugar a 550 g, por 15 minutos, a 15 C. 19. Ressuspender as clulas em meio RPMI e juntar os precipitados em um nico tubo,completando para 50 ml. 20. Centrifugar a 550 g por 10 minutos, a 15 C e ressupender em 30 ml de salina estril com 5% de soro autlogo. 21. Centrifugar a 550 g por 10 minutos a 15 C e ressuspender em 1-2 ml de soluo salina estril contendo 5% de soro autlogo. 22. Proceder a contagem das clulas (em cmaras de Neubauer com Turk e azul de Trypan para estimar a viabilidade celular). 23. Retirar dez milhes de clulas mononucleares deste volume de 1-2 ml ajustar volume para 1 ml com meio RPMI sem fenol e encaminhar ao INCL para o processo de anlise por citometria de fluxo, conforme especificado no Procedimento Operacional Padro de Transporte de Amostras. 24. Ajustar o volume de clulas restantes em soluo salina (NaCl 0,9%) estril contendo 5% de soro autlogo. a. 20 mL para cardiomiopatia dilatada e doena de Chagas b. 10 mL para infarto agudo do miocrdio c. 5 mL para doena isqumica crnica 25. Filtrar a suspenso celular usando os filtros BD para retirar possveis grumos com dimenso superior a 100 m (BD Medimachine Filcon 100 m Sterile, Syringe-Type, Pkg of 300, cat# 34061 ou BD Cell Strainer 100 m cat # 252360). 26. Colocar o volume final da suspenso de clulas mononucleares em seringas opacas estreis (seringa revestida de pelcula insufilm n. 35). a. 2 seringas de 10 ml tipo Luerlock no caso de injeo intra-coronria na cardiomiopatia dilatada e doena de Chagas; b. 1 seringa de 10 mL tipo Luerlock para injeo intracoronria no infarto agudo do miocrdio; c. 5 seringas de 1 ml no caso de injeo intra-miocrdica doena isquemica crnica; Encaminhar as seringas em recipiente estril com tampa ao laboratrio de hemodinmica (a e b) ou ao centro cirrgico (c). 27. Caso o paciente seja randomizado para placebo, enviar amostra de clulas para imunofenotipagem, congelar clulas restantes e colocar nas seringas opacas apenas soluo salina contendo 5% de soro autlogo. OBS: A quantidade mnima de clulas necessrias para o procedimento todo de 1,1 x 10 clulas, posto que devero 8 ser injetadas no mnimo 10 clulas/paciente. *A O kit de filtrao da Washington University compsto de um aparato de filtrao (a) 140ml j com as malhas de filtrao grossa e fina e por base de apoio em acrlico para becker e becker de ao inox (b), utilizamos 2 de 250ml.
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b)

QUANTIFICAO CELULAR POR LQUIDO DE TURK. A. Contagem das clulas nucleadas totais: 1. Diluir a suspenso de clulas com o Lquido de Turk. A diluio inicial deve ser de 1:100 (10 L de clulas diludas 10X em salina contendo soro autlogo para 90 L de Lquido de Turk); 2. Homogeneizar com auxlio de pipetador e ponteira de 200 L e aplicar uma alquota (10 L) na Cmara de Neubauer; 3. Observar ao microscpio. Todas as clulas nucleadas coram em azul. As hemcias so mortas e degradadas, por ao do cido actico contido no Lquido de Turk e no so vistas; 4. Contar as clulas encontradas nos 4 quadrantes e fazer os clculos, conforme apresentado ao final deste anexo (item C).

OBS.: a diluio ideal para a contagem de clulas na Cmara de Neubauer aquela que permite a contagem de 20 a 200 clulas por cada um dos 4 quadrantes da Cmara de Neubauer. Assim, se a contagem inicial de clulas no estiver dentro desta faixa, fazer nova diluio, aumentando-a ou diminuindo-a, at que seja alcanada a diluio ideal. Sugerese que se retire uma alquota de 10 ul de CMMO (pellet de 1ml) e dilua em 90 ul de salina com soro autlogo para obteno de amostra j diluda 10X para contagem em lquido de Turk e em azul de Trypan.

B. Preparo de Lquido do Turk: (vide instrues de preparo de reagentes) C. Uso da CMARA DE NEUBAUER e clculo da concentrao celular: A cmara de Neubauer possui o desenho de uma grade, a qual visualizada apenas ao microscpio. Esquematicamente, esta grade composta por 4 quadrantes localizados um em cada extremidade. No esquema aqui representado, os quadrantes esto nos crculos grandes. Cada quadrante possui 16 quadrados menores.

5 Q-1 Q-2

Q-3
2

Q-4

Cada quadrante possui rea de 0,1 mm . Ao adaptar uma lamnula de vidro cmara de Neubauer, obtm-se altura de 0,1 2 3 3 3 -4 mm. A capacidade de volume , portanto, de 0,1 mm x 0,1 mm = 0,1 mm (0,1 mm = 0,0001 cm = 0,0001 mL ou 10 mL). Esta medida padronizada possibilita a quantificao da suspenso celular. Para isto deve-se contar as clulas presentes nos 4 quadrantes (crculos grandes), no sentido sugerido pela seta para cada quadrante. Em seguida, o nmero total de clulas obtido nos 4 quadrantes dividido por 4 (mdia) e multiplicado pelo valor da diluio realizada. Ao final, o valor encontrado 4 multiplicado por 1 x 10 /mL (ordem de grandeza da cmara).

Q1Q 2Q3Q4 dil 110

4

o / mL = n de clulas/mL dil a diluio (ou a multiplicao das diluies feitas.

DETERMINAO DA VIABILIDADE CELULAR POR EXCLUSO COM AZUL DE TRYPAN A. Contagem da clulas mortas: 1. Diluir a suspenso de clulas em salina (soro fisiolgico) suplementada com 5 a 10% de soro fetal bovino, plasma humano ou albumina humana; 2. Aps estar na presena de soro fetal bovino, plasma humano ou albumina humana, diluir a suspenso de clulas com a Soluo de Azul de Trypan 0,4%, obtendo a diluio de 1:2 (1 parte da suspenso celular para 1 parte da Soluo de Azul de Trypan 0,4%); 3. Uma alquota desta deve ser aplicada cmara de Neubauer e observada ao microscpio.; 4. As clulas vivas permanecem refringentes e incolores e as mortas so coradas em azul. Contar as clulas coradas em azul presentes nos 04 quadrantes da Cmara de Neubauer (o uso da Cmara de Neubauer descrito no Anexo 1); 5. Proceder os clculos para determinao da viabilidade celular conforme descrito ao final deste anexo. Obs1.: Com o uso da cmara de Neubauer, para que se alcance a preciso da contagem de clulas, a diluio total deve permitir a contagem de 20 a 200 clulas totais (vivas + mortas) por quadrante da cmara de Neubauer. No a a entanto, deve-se considerar que a 2 diluio, com a Soluo de Azul de Trypan, sempre de 1:2. A 1 diluio (em salina) a que pode ser ajustada.

Obs2.: a mistura da suspenso celular com a Soluo de Azul de Trypan deve ser feita IMEDIATAMENTE ANTES DA CONTAGEM.

B. Preparo da soluo de AZUL DE TRIPAN (vide instrues de preparo de reagentes)

C. Clculo de nmero de clulas mortas:

(1) nmero de clulas mortas (azuis) por mL:

Q1Q2Q3Q4 dil 110

4

/mL = n de clulas (azuis)/mL dil a diluio realizada (ou a multiplicao das

o

diluies feitas)

(2) % de viabilidade:

viabilidade(%) =

vivas 100 vivas so clulas vivas; e, totais so clulas vivas + mortas (azuis) totais

Nome do Produto Ficoll-Paque PLUS RPMI 1640 sem vermelho de fenol Heparina Violeta de Genciana Azul de Trypan (Trypan Blue) Escova de clorexidina 2% Cloreto de Sdio Injetvel 0,9% - 10 mL Cloreto de Sdio 0,9% - 100 mL Luvas Cirrgicas Esterelizadas Luvas de procedimento Compressas de Gaze Hidrfila Estril Seringa Descartvel estril, atxica, apirognica - 20mL Seringa Descartvel estril, atxica, apirognica - 10mL Seringa Descartvel estril, atxica, apirognica - 10mL Luer Lock Seringa Descartvel estril, atxica, apirognica - 5mL

INSUMOS (Reagentes, Kits, Padres, Calibradores e Controles) N Marca Referncia Localizao Validade Testes Amershan17-1440-02 1 Geladeira 3 anos Pharmacia GIBCO Roche Sigma Sigma Rioquimica 11835-030 1434802 G2039 T8154 RG Anvisa: 101520.10005 RG Ministrio Sade: 1.4277.0009.001 -3 RG Ministrio Sade: 103110011 RG Ministrio Sade: 1.0182.4200.04 RG Ministrio Sade: 1.0182.4200.04 RG Anvisa: 100.711.50043 RG Anvisa: 101.606.10007 RG Anvisa: 100.334.30030 RG Anvisa: 100.334.30030 RG Anvisa: 101.722.10012 5 1 500 100 1 1 Sala Estril 1 Sala Estril 3 anos Sala Estril 1 Sala Estril 1 1 1 Sala Estril 1 Sala Estril BD Plastipak 1 Sala Estril 1 5 anos 5 anos 5 anos Sala Estril Sala Estril 5 anos 3 anos 5 anos 3 anos 3 anos Geladeira Sala estril Sala estril Sala Estril Sala Estril 1 ano 5 anos 5 anos 2 anos 3 anos

Segurana Txico Atxico Atxico Txico Carcinognico, Txico -

CoreAmp

Halex Istar

New Hand

New Hand Cremer Injex

BD Plastipak

Plascalp

7 Agulha Descartvel 21G1 / 25 X 0,8 Agulha Descartvel 22G1 / 25 X 0,7 Agulha Descartvel 22G1 / 40 X 12 Capote Cirrgico Esterilizvel Touca descartvel Mscara descartvel Prop descartvel / Sapatlia descartvel RG Anvisa: 101.606.10008 RG Anvisa: 101.606.10008 RG Anvisa: 101.606.10008 Isento de RG no Ministrio Sade Isento de RG no Ministrio Sade Isento de RG no Ministrio Sade Isento de RG no Ministrio Sade Sala Estril Sala Estril Sala Estril Sala de Puno Sala de Puno Sala de Puno Sala de Puno

Injex Injex Injex

1 1 1 1 1 1

5 anos 5 anos 5 anos 3 anos 3 anos 3 anos

Descarpack Descarpack Descarpack

Instrues e preparo Soluo fisiolgica + soro autlogo (5%): 1. Misturar os reagentes: 1 mL de soro autlogo 19 mL de salina (NaCl 0,9%) estril 2. Homogeneizar; o 3. Armazenar sob refrigerao (4-8 C). Obs.: Preparar no dia do procedimento de separao celular. Lquido de Turk: 1. Misturar os reagentes: 97 mL de gua injetvel 1 mL de Soluo Aquosa de Violeta de Genciana a 1% (em p - marca SIGMA, catlogo SIGMA - G 2039) 2 mL de acido actico 2. Homogeneizar; 3. Armazenar a temperatura ambiente. Azul de trypan 0.4% 1. Misturar os reagentes: 0,4 g do p de azul de trypan (sugesto - marca SIGMA, catlogo SIGMA - T 6146) 100 mL de soro fisiolgico (soluo NaCl 0,9%) 2. Homogeneizar em agitador magntico por aproximadamente 20 min; 3. Filtrar com papel de filtro. Se possvel, filtrar em sistema estril, com membrana 0,22 m (sugesto sistema swinex 35mm, Millipore Inc.) e manter a soluo estril; 4. armazenar a temperatura ambiente. OBS.: Tal soluo pode ser obtida pronta para o uso: Referncia: Trypan blue solution, 0,4%, marca SIGMA, catlogo SIGMA - T 8154. Alternativas de Procedimentos N.A Calibrador N.A Calibrao N.A Clculos

Concentrao celular

Q1Q 2Q3Q4 dil 110

4

o / mL = n de clulas/mL dil a diluio

Viabilidade celular (%) Linearidade N.A

vivas 100 viabilidade(%) = totais

(ou a multiplicao das diluies feitas)

Interpretao Tcnica Valores de Referncia e Limites de Anlise de Consistncia N.A N.A Controle da Qualidade N.A N.A N.A N.A N.A N.A N.A N.A

Valor de Referncia: Revisional: Id dos Controles: Instrues: Frequncia: Limites: Aes Corretivas: Registros: Controles Alternativos: PCEQ: (Programa de Controle Externo da Qualidade)

Validao do Mtodo Atravs da comparao do rendimento celular obtido em outro laboratrio e realizao da tcnica de imunofenotipagem da frao mononuclear isolada. Interpretao Interpretao Clnica N.A Correlao N.A Significado Clnico N.A Interferncias N.A Principais Referncias 1. Boyum, A. Separation of white blood.cells. Nature (1964) 204: 793- 794. 2. Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Scand. J. Clin. Invest. (1968) 21 suppl. 97: 77-89. 3. Degushi, Y e Kehrl, JH. Selective Expression of Two Homeobox genes in CD34-Positive Cells from human bone marrow. Blood (1991) 2: 323-28.

9 Final do Documento - Dados do Documento Patrcia Cristina dos Santos Costa Fabiana Bergamin Muccillo

Autor do Documento:

Data de Criao:

Ass: Fevereiro/2005

Aprovao Aprovado para Implementao: Data da Implementao: Autor da Aprovao:

Antnio Carlos Campos de Carvalho

Ass: Data da Aprovao: Status Geral do Documento: Ativa