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DISPENSA

BIOINDICATORI E BIOMARKERS
a.a. 2007-2008

Docente Prof. SILVIA CASINI
Email : CASINIS@UNISI.IT

A CURA DI

M. C. FOSSI & S. CASINI

Bioindicatori e biomarkers 1

1. LA BIOINDICAZIONE
Ogni organismo vivente, animale o vegetale, che, campionato in un determinato ambiente, ci fornisce indicazioni sul livello di contaminazione di quella determinata area si definisce organismo “bioindicatore” o organismo “sentinella”. In maniera ancora più specifica si intendono per “bioindicatori” (Bargagli et al. 1998):

“.. tutti quegli organismi che mediante reazioni identificabili (biochimiche, fisiologiche, morfologiche, ecc.) forniscono informazioni sulla qualità dell’ambiente (o di una parte di esso)”
La bioindicazione si basa su diverse scale di intervento da ecologica a molecolare: dalle variazioni di parametri biochimici, fisiologici e comportamentali, al bioaccumulo di contaminanti, fino alla presenza/assenza di specie. L’approccio più comunemente utilizzato della bioindicazione si basa sulla valutazione dei livelli di contaminanti nell’organismo bioindicatore. Questa metodologia si basa sul principio ecotossicologico del “bioaccumulo” per cui un organismo animale o vegetale tende, per fattori intrinseci ed estrinseci, ad accumulare nel proprio interno concentrazioni del contaminante superiori a quelli del comparto ambientale dove si trova. Questa caratteristica si descrive con il parametro BCF (BioConcentration Factor) che indica il rapporto fra la concentrazione del contaminante nel mezzo e quella nell’organismo bioindicatore e/o bioconcentratore in questione. Per questo principio appare chiaro che la bioindicazione presenta un notevole numero di vantaggi rispetto alla chimica ambientale classica quali: • I livelli dei contaminanti nell’organismo bioindicatore o bioaccumulatore sono di diversi ordini di grandezza superiori a quelli del mezzo in cui si trova (acqua, aria, sedimento); questo permette di risolvere molti problemi di rivelabilità strumentale tipici delle matrici abiotiche. • L’organismo bioindicatore e bioaccumulatore funziona da integratore in termini temporali dell’input tossicologico di una determinata area di studio. La scelta dell’organismo bioindicatore dipende da molti fattori, e soprattutto dal quesito sperimentale di partenza. In linea generale gli organismi bioindicatori e bioaccumulatori debbono possedere alcune caratteristiche fondamentali quali: spazio-

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• • • • • •

Optimum ecologico ed ampia distribuzione nell’area di studio.
Facile identificazione sistematica. Adeguate conoscenze sull’anatomia, fisiologia ed ecologia della specie. Uniformità genetica e lungo ciclo vitale. Facile reperibilità stagionale.

Home range ben identificato.

La scelta dell’organismo bioindicatore deve tenere conto di una serie di caratteristiche relative alla sua fisiologia, al tipo d’alimentazione, all’habitat ed al generale stile di vita. Tutto questo insieme di caratteristiche si identifica con la “nicchia trofica”, cioè l’insieme di funzioni della specie nella comunità e le interazioni con la componente biotica ed abiotica (Bargagli et al.,1998). Negli ecosistemi naturali le specie tendono a differenziare le proprie nicchie, presentando così nello stesso ambiente diversi modi e livelli d’esposizione ai contaminanti. Appare chiaro quindi che, in un corretto programma di biomonitoraggio, la prima fase dello studio consiste nella identificazione del “comparto ambientale critico” (cioè quel comparto dove si ripartiscono e/o si accumulano con preferenza i contaminanti), seguita da una seconda fase d’identificazione nel comparto critico delle “nicchie ecologiche critiche” e delle specie corrispondenti (Fossi 2000). Un altro elemento fondamentale nella scelta del bioindicatore riguarda la sua “mobilità”. L’informazione che ci fornisce l’organismo bioindicatore è relativa all’area vitale dove l’organismo si muove e si alimenta (nicchia spaziale e trofica). Nel caso di un organismo sedentario o sessile otterremo un’informazione di tipo puntiforme, mentre nel caso di un organismo mobile avremo un’informazione integrata dell’intera area vitale. In sintesi la scelta dell’organismo bioindicatore è fondamentale per soddisfare il quesito sperimentale di partenza della nostra indagine di biomonitoraggio. Infatti, se le specie bioindicatrici sono capaci di dare risposta agli stress ambientali in relazione all’estensione della loro nicchia spaziale e trofica, possiamo definire i bioindicatori come integratori di piccolo, medio ed ampio raggio, a seconda che la nicchia interessi areali ristretti o addirittura puntiformi (animali sessili e specie sedentarie), fino agli ambiti regionali in specie di grande mobilità, come alcuni mammiferi marini o certi uccelli migratori. La scelta della scala dello “strumento” di bioindicazione sarà consequenziale alla scala topografica del progetto di studio. Per la valutazione della presenza e degli effetti di inquinanti derivanti da sorgenti puntiformi in ambito locale si impone la scelta di specie a ristretta mobilità. Mentre l’impatto complessivo di tutte le attività di un grande bacino deve essere monitorato attraverso l’uso di specie ad ampia mobilità, con preferenza appartenenti ad un livello trofico elevato e quindi capaci di una buona integrazione (Bargagli et al., 1998; Fossi 2000).

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SCELTA DELL’ ORGANISMO BIOINDICATORE
La valutazione delle caratteristiche ecologiche dell’area di studio ha la funzione di identificare le più idonee stazioni di campionamento ed indirizzare l’analisi ecotossicologica verso adeguate speciebersaglio, o bioindicatrici. Le peculiari caratteristiche di studio integrato proprie del progetto BioAgri hanno evidenziato nel corso della loro messa a punto la necessità di finalizzare le attività di mappaggio dei biotopi e di censimento delle specie presenti in natura alle esigenze delle successive analisi ecotossicologiche, poiché la dilatazione dei tempi che si renderebbe necessaria per un’approfondita indagine naturalistica, valutabile nell’ordine di alcuni anni, causerebbe la perdita di immediatezza del monitoraggio senza peraltro aggiungere conoscenze indispensabili alla corretta valutazione di impatto ambientale. A tale scopo quindi si suggerisce di caratterizzare ecologicamente l’area di studio soltanto attraverso la descrizione dei biotopi dominanti, avendo cura al contempo di sottolineare eventuali nicchie ecologiche di particolare rilievo; tale strategia deve essere applicata anche per le attività di censimento, che tendono a determinare le specie dominanti ed a segnalare casi di particolare interesse. A seguito delle indagini ecologiche e faunistiche (Censimenti) vengono selezionati gli organismi indicatori (specie-bersaglio o bioindicatori) tra le specie occupanti diversa posizione a livello della catena trofica terrestre o di acqua dolce.

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rispondendo in maniera rapida e precisa ai quesiti basilari di questa disciplina come: quali sono gli effetti che i composti inquinanti provocano sulle popolazioni e/o comunità naturali? Ed ancora: come la valutazione di questi effetti può rappresentare un segnale precoce del livello di contaminazione ambientale? Ma Cosa si intende esattamente per "biomarker" e qual è l’origine di questa metodologia? L’idea di misurare certi parametri biologici come indicatori dello stato di benessere di un organismo risale alle origini della storia della medicina. Fossi 2000). come in passato. Peakall. controllare e regolare la loro immissione e diffusione nella biosfera. I BIOMARKERS Negli ultimi decenni l’ecotossicologia si è imposta. le feci e le condizioni generali dell’organismo. Citiamone a questo proposito una storica. Hugget et al. successivamente l’idea ha preso campo in maniera sempre di più ampia. devolute al miglioramento delle nostre condizioni di vita. quella formulata dalla National Academy of Science (NRC. 1994. soprattutto negli ultimi due decenni. Viviamo in un’epoca che si “vanta” e si “avvale” della sintesi di migliaia di molecole di sintesi. Fino ad ora sono state formulate numerose definizioni di biomarkers. citologiche e fisiologiche. dalla medicina del lavoro alla prevenzione dell’oncogenesi. E’ nostro dovere. 1992. Giungendo ai giorni nostri con il rapido evolversi delle tecnologie molecolari. per evitare.. già i medici dell’antica Cina erano in grado di definire la “salute” di un individuo esaminando le urine. Fossi & Leonzio. come la disciplina “guida” di un nuovo indirizzo scientifico e sociale basato sul concetto dello “sviluppo sostenibile”.2. L’idea di utilizzare i biomarkers nel settore delle indagini ecotossicologiche si è manifestata per la prima volta con le ricerche pionieristiche degli anni ‘70 di Bayne e collaboratori (1976) e Payne (1977) nell’ambiente marino. 1990.. Peakall & Shugart. ognuna delle quali soffre delle limitazioni e delle generalizzazioni tipiche del concetto di definizione. per noi e per le generazioni future. Walker et al. biochimiche. 1993. come confermato dal crescente numero di pubblicazioni specialistiche sull’argomento (McCarthy & Shugart. 1996. i biomarkers hanno trovato applicazione in tutte le branche della medicina. 1992. Infatti. nell’ambito delle scienze ambientali. il verificarsi di rilevanti danni ambientali. Negli ultimi decenni i biomarkers si sviluppano come un elemento innovativo nell’ambito delle indagini ecotossicologiche. trovando applicazione in una vasta gamma di situazioni ambientali. 1989) che descrive un biomarker come: Bioindicatori e biomarkers 5 .

1993. in un fluido biologico o a livello dell'intero organismo (individuo o popolazione) la quale fornisce l'evidenza di un'esposizione e/o un effetto ad uno o più composti inquinanti (e/o radiazioni)”. Depledge (1994) definisce come biomarker “ecotossicologico: ”. L'obiettivo di tale monitoraggio ambientale è infatti quello di stimare (strumento “diagnostico”).. inibizioni attività enzimatiche. in funzione dell’intercorrelabilità degli effetti ai vari livelli di complessità strutturale. di una struttura o di una funzione. si definisce come biomarker quella risposta e/o quelle risposte che un organismo bioindicatore può generare Bioindicatori e biomarkers 6 . attraverso l’utilizzo di “segnali precoci” di esposizione o di effetto. a livello delle componenti biochimiche o cellulari di un processo. che può essere misurata in un sistema biologico". ma quello di fornire indicazioni sul suo “stato di salute” come segnale potenziale di alterazioni ai più alti livelli ecologici (Peakall & Shugart. prevedere (strumento “prognostico”) e. formazione prodotti metabolici. La grande novità di questo approccio metodologico.". Il concetto di biomarker si è però evoluto notevolmente in questi ultimi anni assumendo una valenza sempre più ampia sia dal punto di vista della gerarchia delle risposte che per la sua portata ecologica. e successivamente. 1998. come l'insuccesso riproduttivo o l’incremento della mortalità nell'ambito di una popolazione. In sintesi. e troppo spesso confusi. “prognosticare” e quindi prevedere il verificarsi di effetti negativi a lungo termine anche su scala ecologica.. quali: bioindicatore e biomarker. l'utilizzo di biomarkers permette in primo luogo di “diagnosticare”. Fossi. di conseguenza. ecc. evitare eventi inaccettabili a livello ecologico..) il tipo e/o i tipi di contaminanti ai quali l’organismo bioindicatore è sottoposto ed i livelli “semi-quantitativi” dell’esposizione. rispetto alle metodologie classiche della tossicologia ambientale. quella variazione biochimica. Una precisazione doverosa da fare a questo punto riguarda la differenziazione fra due termini ecotossicologici concettualmente distinti. indotta da un contaminante. 1994. Fossi2000).. Mentre si intende per bioindicatore un qualsiasi organismo (animale o vegetale) che può essere utilizzato come indicatore del livello di contaminazione di un determinato ambiente. attraverso lo studio delle risposte immediate (induzione sistemi detossificanti. è quella di trovare fondamento sul concetto della intercorrelabilità degli effetti di un contaminante ai vari livelli di complessità strutturale. Fossi & Leonzio. che può essere misurata in un tessuto. fisiologica o comportamentale. alterazioni del DNA. Il ruolo dei biomarkers nelle indagini ecotossicologiche non è quindi quello di dare informazioni “quantitative” sui livelli di esposizione di un organismo ad un determinato contaminante. cellulare. quella variazione.

Non prevede l'effetto della sommatoria dei diversi inquinanti sull'organismo. la valutazione degli effetti dei contaminanti di origine antropica sulle comunità naturali é un problema di difficile soluzione per i seguenti motivi (Peakall & Shugart. Nei Box 1 e 2 sono sinteticamente descritte le principali limitazioni della chimica ambientale e della tossicologia classica nella risoluzione di tematiche ecotossicologiche (Fossi 2000). antagonismi). Fossi 2000): • • • Esistono varie vie di assunzione dei composti inquinanti all’interno dell'organismo.LIMITI DELLA CHIMICA AMBIENTALE L'utilizzo della chimica ambientale fornisce informazioni precise ed accurate. Fossi 1998. Bioindicatori e biomarkers 7 . sia dal punto di vista quantitativo che qualitativo. Ma quali sono i vantaggi di questa metodologia nei confronti degli approcci tradizionali ? Come precedentemente accennato. • Esiste un periodo di latenza molto lungo prima che si manifestino alterazioni a livello di popolazioni e comunità. tali sostanze possono generare fra di loro diverse interazioni biochimiche e tossicologiche (sinergismi. I contaminanti presentano una diversa biodisponibilità a seconda dei comparti ambientali in cui si trovano. Box 1 . per un indagine basata sull’utilizzo di biomarkers. Gli organismi sono generalmente esposti non ad un solo composto inquinante ma ad una miscela di molti contaminanti (cocktail chimico). sulla distribuzione degli inquinanti nei vari comparti ambientali ma: • • • • Risulta inadeguato in casi di presenza di contaminanti ignoti.nei confronti di uno o più agenti stressanti (chimici o fisici). Non prevede le variazioni spaziali e temporali dell’organismo rispetto alla fonte di contaminazione. la scelta a monte di un valido organismo bioindicatore. 1993). Le attuali metodologie d’indagine. Risulta estremamente dispendioso in termini di utilizzo di uomini e di mezzi. Quindi risulta prioritaria. 1993. sono in molti casi inadeguati per lo studio di problemi di tale complessità (Peakall & Shugart. quali ad esempio le analisi di chimica ambientale ed i tests della tossicologia classica.

1990. L’effetto sinergico dei diversi contaminanti sull'organismo. Bioindicatori e biomarkers 8 . La vera biodisponibilità di un contaminante nei vari comparti ambientali. in situazioni più complesse (come nel caso dell’utilizzo di biomarkers non-distruttivi per l'individuazione delle “specie a rischio”). 1992.LIMITI DELLA TOSSICOLOGIA CLASSICA L'utilizzo della tossicologia classica non prevede: • • • • • • La stima degli effetti tossicologici a lungo termine. i ritmi giornalieri. che al convenzionale utilizzo della bioindicazione nei programmi di biomonitoraggio sono riportati nel Box 3. Le modificazioni lungo la catena alimentare. 1993. I principali vantaggi legati all’utilizzo dei biomarkers sia rispetto a discipline quali la chimica ambientale e la tossicologia classica.Box 2 . Fossi & Leonzio. L’applicazione dei biomarkers nei programmi di biomonitoraggio classico o. Fossi 2000). Fossi. ecc. L’influenza di fenomeni biologici naturali quali il ciclo vitale. Peakall & Shugart. L’influenza della fluttuazioni di fattori chimico-fisici sulla tossicità di un contaminante. Peakall. risolve totalmente o in parte le limitazioni sopraindicate (McCarthy & Shugat. 1994. 1998.

Fornire una risposta immediata all'esposizione al tossico (ore-giorni).ed intra-specifica ad un contaminante e/o ad una miscela di contaminanti. dell'età e del sesso dell'organismo (Fossi et al.Box 3 . può rappresentare. considerando la sommatoria sia delle diverse vie di assunzione che dell'esposizioni nel tempo entro un determinato “range” spaziale. Indicare l'effetto ecologico a lungo termine di un contaminante a seconda se l'organismo è esposto o meno ad un livello di contaminazione che eccede le sue capacità di detossificazione e riparo (livelli di omeostasi). questo dato permette di prevedere l'effetto negativo a lungo termine. Suddividere l’enorme numero di tecniche di biomarkers attualmente disponibili in categorie non è un compito semplice semplice. La conoscenza però dei cicli riproduttivi della specie bioindicatrice e delle sue caratteristiche fisiologiche permettono. con un adeguato programma di campionamento.. 1990). L'applicazione di questo approccio metodologico nei programmi di biomonitoraggio deve tenere conto però della presenza di alcuni fattori "di disturbo" che possono alterare. Ad esempio. di eliminare totalmente o in parte tali fattori di disturbo. certe reazioni multienzimatiche (il sistema delle monoossigenasi a funzione mista) subiscono modificazioni in funzione dello stato ormonale. • • • • Dare un segnale "integrato" dell'insieme delle interazioni tossicologiche e farmacocinetiche della miscela di composti a cui è sottoposto l'organismo. infatti i parametri discriminanti possono essere diversi come ad Bioindicatori e biomarkers 9 . Inoltre la presenza in certi casi di un’elevata variabilità interindividuale nella risposta dei biomarkers verso uno stesso livello di esposizione. il segnale fornito dai biomarkers. se non correttamente interpretato. Fornire indicazioni sulla suscettibilità inter. in una certa misura.VANTAGGI DELL’UTILIZZO DEI BIOMARKERS NEI PROGRAMMI DI BIOMONITORAGGIO I biomarkers correttamente applicati in un programma di biomonitoraggio sono in grado di: • Fornire una risposta "integrata" dell'esposizione complessiva della specie biondicatrice. un fattore di disturbo nella comprensione dei dati statistici.

esempio il livello di complessità strutturale investigato (Hugget et al. I biomarkers vengono classificati da Hugget e collaboratori (1992). 1990). Shugart & Peakall (1993). il tempo di risposta dell’organismo. il tempo di risposta dopo il contatto con il tossico (McCharthy & Shugart. Per questo andiamo da risposte estremamente specifiche come l’inibizione dell’acido amminolevulonico deidratasi (ALAD). in funzione della diversa risposta a livello gerarchico nelle seguenti categorie: • • • • • • • Alterazioni del DNA Risposte di proteine Prodotti metabolici Variazioni del sistema immunitario Alterazioni istopatologiche Biomarker non specifici e fisiologici Biomarkers comportamentali Il segnale che da essi si ricava. 1992).. nella quale vengono riportati alcuni dei principali biomarkers utilizzati nei programmi di biomonitoraggio. o ancora la classe di contaminanti responsabile di una certa serie di risposte (Peakall. BIOMARKERS PER COMPOSTI ESTROGENICI Negli ultimi anni l’attenzione sia del mondo scientifico che degli organi regolatori si e’ rivolta con particolare insistenza sulla capacita’ di alcuni contaminanti ambientali di origine antropica di alterare i processi ormonali e conseguentemente interferire con la salute dell’uomo e della fauna degli ecosistemi naturali. è dato dalla diversa risposta temporale dell'organismo che. è "precoce" (ore o giorni) nel caso delle risposte molecolari e "ritardata" (settimane. mesi. Esiste quindi in sintesi una serie di fattori che devono essere presi in considerazione nello studio e nella classificazione dei biomarkers quali: la classe di contaminanti responsabile della risposta biologica. in linea generale. Walker e collaboratori (1995). Sebbene fosse noto da piu’ di 50 anni che numerosi composti chimici Bioindicatori e biomarkers 10 . Tutti questi parametri vengono sintetizzati in Tabella 1. la sua applicazione come biomarker di esposizione o di effetto ed infine il significato interpretativo del “segnale”. I biomarkers possono essere distinti inoltre in funzione della loro specificità di risposta rispetto ad una determinata classe d’inquinanti. 1992). a seconda del livello strutturale interessato. 1995). fino a giungere a risposte estremamente aspecifiche nei confronti di varie categorie di contaminanti come le variazioni del sistema immunitario (Walker et al. che rappresenta un biomarker d’altissima specificità nei confronti della contaminazione da piombo. anni) nel caso delle risposte cellulari e fisiologiche.

Bioindicatori e biomarkers 11 . Questi composti possono agire direttamente od indirettamente. I composti che hanno la capacita’ di alterare i sistemi endocrini (“endocrine disrupters” . Gli effetti di esposizioni durante periodi critici dello sviluppo dell’organismo. stimolando il recettore ed il conseguente effetto biologico (effetto agonista) oppure può bloccare o ridurre la capacità di legame e l’attività biologica degli ormoni naturalmente presenti (effetto antagonista). 1993.. I composti estrogenici appartengono a classi di contaminanti molto diverse tra loro. 1993. Effetti indiretti possono essere causati dall’induzione od inibizione di enzimi metabolici che causano modificazioni nella produzione o metabolizzazione di ormoni endogeni o alterazioni nelle loro proteine di trasporto del sangue. che interferiscono in particolare con i sistemi degli ormoni sessuali (composti estrogenici). malformazioni del tratto genitale.e. questo processo può riprodurre l’azione dell’ormone. 1995. Anche se l’esposizione avviene nelle prime fasi di sviluppo gli effetti si evidenziano solo successivamente. sono definiti come “sostanze esogene che provocano effetti negativi relativi alle funzioni riproduttive in organismi intatti. o nelle generazioni successive. 1996). i policlorobifenili (PCBs). 1997). Non sempre quando viene osservata un’alterazione nell’attività ormonale risulta chiaro se e’ dovuta ad un’azione diretta sulla secrezione ormonale e sulla successiva interazione con i recettori o a meccanismi indiretti. alcuni fungicidi. Colborn et al. erbicidi ed alchilfenoli. Quella categoria di ED. Sharpe e Skakkebaek. le diossine.ED) sono stati recentemente definiti come “ sostanze esogene che provocano effetti negativi in organismi intatti. 1992). perdita di fertilità. Anon.. o nelle generazioni successive. gli insetticidi organofosforici. Nello studio degli effetti dei composti estrogenici è di fondamentale importanza considerare la specie su cui vengono valutate le risposte ed anche lo stato di sviluppo nel quale avviene l’esposizione. questi processi non erano stati valutati nella loro pericolosita’ fino a meta’ degli anni ‘90 (Colborn e Clement. DDT e DDE). in conseguenza di modificazioni nelle funzioni endocrine (OECD. se simili strutturalmente a composti endogeni. inversioni di sesso in diverse specie di vertebrati ed alterazioni nei comportamenti riproduttivi (Davis et al. I composti estrogenici ed i loro metaboliti possono. in conseguenza di modificazioni nelle funzioni endocrine”.possono mimare l’effetto degli ormoni. Un’altra modalità di azione è la modificazione della trasmissione del segnale a livello post-recettore nelle cellule. (ad esempio durante lo sviluppo dell’embrione) sono stati definiti come “effetti sull’organizzazione” poiché possono portare a modificazioni strutturali permanenti in diversi organismi. tra queste vi sono gli insetticidi clorurati (p. segnali che sono stati interpretati come un campanello di allarme del reale rischio legato a questi composti. Da quella data sono stati pubblicati studi su modificazioni nella concentrazione degli spermatozoi. interagire direttamente con i recettori fisiologici nelle cellule delle gonadi o degli organi sessuali. richiedendo nel secondo caso un’attivazione metabolica successiva all’assunzione da parte dell’organismo. i pentaclorofenoli.

può essere indotto. 1978). in seguito ad esposizione a composti estrogenici. sia naturali che di sintesi.. DDT. subiscono un accumulo superiore ai livelli fisiologici in presenza di composti organoclorurati. 1988). Nei maschi e negli organismi immaturi il gene della vitellogenina è normalmente silente poiché le concentrazioni di estrogeni sono molto basse (Copeland et al. 1987. molti dei quali considerati estrogenici.. Dopo la sintesi entra nel circolo sanguigno e raggiunge le ovaie dove viene trasformata in lipovitelline e fosvitine (Clemens. Esperimenti di laboratorio con maschi adulti di trota hanno mostrato come il nonilfenolo sia capace di indurre la formazione di vitellogenina ed anche il decremento nella crescita dei testicoli e nella spermatogenesi (Jobling et al. Inoltre mentre esistono alcuni biomarkers per segnalare l’esposizione degli organismi a queste sostanze. Il sistema epatico detossificante delle monossigenasi a funzione mista (MFO) risulta indotto. in genere l’estradiolo -17β. riguardo ai composti estrogenici. L’induzione della vitellogenina e’ stato utilizzato come biomarker per testare le capacita’ estrogeniche di effluenti sia industriali che urbani su organismi ittici (Sumpter e Jobling. si è però visto che.spesso nelle fasi adulte. lindano. ecc. Questi biomarkers possono essere utilizzati come sensibili strumenti diagnostici della presenza di sostanze estrogeniche negli organismi oggetto di studio. (1995) hanno mostrato come alcuni composti (alchilfenoli. Una ricerca bibliografica on-line ha evidenziato che pochi lavori sono stati fatti. Le porfirine. selettivamente nei suoi diversi isoenzimi da composti lipoaffini. Bioindicatori e biomarkers 12 . Se l’esposizione avviene in organismi adulti. ma insieme potrebbero esercitare una attività estrogenica. La vitellogenina è una fosfolipoproteina sintetizzata nel fegato delle femmine ovipare di vertebrati in risposta ad un estrogeno. arochlor. Studi in vitro condotti da Harries et al. da ciò si può ipotizzare che composti singoli potrebbero essere presenti nell’ambiente a concentrazioni inferiori a quelle necessarie per produrre un effetto estrogenico. Fossi e Leonzio. come i composti organoclorurati (DDE. a tutt’oggi. 1994). metaboliti intermedi della sintesi dell’eme. Di seguito viene presentata una sintesi dei test utilizzati fino ad oggi su organismi ittici. 1990). L’esposizione di esemplari maschi di pesci a diverse concentrazioni di estrogeni. ha determinato delle risposte dose-effetto molto pronunciate (Bromage e Cumaranatunga. 1986) . Gli enzimi esterasici sono inibiti nella loro funzionalità da composti quali gli insetticidi organofosforici e tale inibizione è un indice molto sensibile di esposizione (McCarthy e Shugart.. Uno dei biomarkers piu’ utilizzati per l’individuazione degli effetti estrogenici e’ l’induzione della vitellogenina. bisfenolo A) presenti anche in dosi molto basse possano produrre effetti estrogenici agendo in sinergia .) (Payne et al. 1996). sono pochissimi gli strumenti a disposizione per la valutazione dei loro reali effetti tossicologici. gli effetti sul sistema endocrino sono più frequentemente transitori e sono stati definiti come “effetti sulla attivazione”.

Più di recente c'è stato un Bioindicatori e biomarkers 13 . il nitrofenolo. richiedendo per la loro applicazione l'uso di tessuti o organi ottenuti attraverso il sacrificio degli animali studiati. Landner et al. la maturazione sessuale. 1986.. ulteriore evoluzione del concetto di biomarker è data da Fossi (1994). Vi sono diverse ragioni per cui è desiderabile lo sviluppo di un approccio di indagine non distruttivo. la orfologia dell’apparato riproduttore. Recentemente si sono sviluppate tecniche di campionamento ed analitiche che consentono di ottenere analoghe informazioni ma che non alterano l'integrità degli organismi e popolazioni oggetti di studio tramite l'utilizzo di biomarkers non distruttivi (Peakall. 1989. Thompson et al.. 1982. anche se la loro applicazione era quasi totalmente limitata al sangue o alle sue frazioni. nella valutazione di ormoni o della vitamina A nel plasma. (1995) hanno effettuato uno studio misurando le elterazioni dei livelli degli ormoni riproduttivi a seguito di somministrazione di alcuni composti estrogenici. alterazioni del DNA nelle cellule del sangue. 1985). Wester e Canton. il tempo di sopravvivenza della prole.. la velocita’ di fertilizzazione. 1989). casi in natura in cui la specie oggetto di studio presenta un numero esiguo di esemplari. in queste indagini i bioindicatori erano mantenuti in gabbie a varia distanza dalla fonte di contaminazione. cellulare. alcuni metalli. 1992. Motivazioni di tipo etico. ad esempio nello studio delle attività esterasiche. Harries et al.1995. l’esaclorocicloesano la cloroanilina. Fairbrother et al. fisiologica o comportamentale che può essere misurata in tessuti. A seguito della somministrazione venivano valutati alcuni markers quali il numero di uova.. In certi tipi di indagini può essere di grande utilità effettuare campionamenti in sequenza sullo stesso organismo per studiare le variazioni dipendenti dal tempo (Fossi et al. l’Arochlor. Bresch et al. Mac Latcy e Van der Kraak.. 1990. Sono in numero estremamente ridotto anche le pubblicazioni riguardanti gli effetti morfologico funzionali dei composti estrogenici sui pesci (Bresch. Una definizione di biomarker non distruttivo. l’effetto estrogenico era prodotto dalla miscela di contaminanti presenti e quindi non era possibile risalire ad uno o piu’ composti specifici. 1988. Ancora prima della loro teorizzazione e definizione alcuni dei biomarkers non distruttivi venivano comunemente usati.. 1996). 1994). BIOMARKERS NON DISTRUTTIVI La maggior parte dei biomarkers usati comunemente nei programmi di biomonitoraggio sono a carattere distruttivo . Walker. quando è necessario studiare una specie protetta o in via di estinzione è chiaro che l'approccio non distruttivo risulta l'unico ragionevolmente proponibile. Alcuni tra i composti studiati sono i PCP. "Un biomarker non distruttivo è una variazione biochimica. fluidi corporei o nell'intero organismo o popolazione che indica l'esposizione e/o effetto di uno o più composti inquinanti senza causare danno o stress prolungato all'organismo o alla popolazione.

Bioindicatori e biomarkers 14 . 1994).grande sforzo nella messa a punto di nuove tecniche di campionamento su nuovi materiali biologici con nuovi tests (Fossi et al..

fisiologiche e chimiche 8.Individuazione delle specie a rischio Bioindicatori e biomarkers 15 .Selezione dei biomarkers (generali e specifici) 6. e descritte estesamente nei capitoli successivi: 1.Definizione del livello di salute della popolazione e comunità 10.3.Definizione area di studio e selezione area di controllo 2.Studi di laboratorio 5.Pianificazione e realizzazione del piano di campionamento (controllo) 7.Selezione delle specie bioindicatrici (diversi livelli trofici) 4. PROGETTAZIONE DI UN PROGRAMMA DI BIOMONITORAGGIO La Progettazione di un programma di biomonitoraggio attraverso l’utilizzo di biomarkers richiede la realizzazione di diverse fasi operative riportate schematicamente di seguito.Realizzazione analisi biochimiche.Analisi statistica 9.Caratterizzazione dell’area di studio 3.

nelle quali dovranno essere indicati. Specie.2). Progetto BioAgri Bioindicatori e biomarkers 16 . numero di esemplari) vengono riportati in apposite schede tecniche (Fig 1). 23P) Specie Sesso (stato sviluppo gonadi) Lunghezza (totale) Peso Peso Fegato Materiali biologici prelevati (Bile. Sangue. Tecniche di Campionamento.Operazione di dissezione degli organismi bioindicatori: (A) in campo. Cervello) Note Al momento del sacrificio. gli esemplari degli organismi bioindicatori subirano la seguente successione cronologica (Fig 3): • • • Anestesia dell’ organismo bioindicatore Valutazione del peso totale Valutazione della lunghezza totale A B Fig 2 . durante la fase della dissezione: • • • • • • • • Sigla di riconoscimento del campione (es. (B) in laboratorio. TECNICHE DI DISSEZIONE E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI Tutti i dati relativi alla situazione sperimentale di campionamento (Stazione. Data. a seconda delle condizioni climatiche esterne e della lontananza dalla base operativa. che può svolgersi o direttamente in loco o in laboratorio (Fig.4.

Fig 1 SCHEDE TECNICHE ESPERIMENTO IN CAMPO CAMPIONAMENTO BIOINDICATORI DELL’ITTIOFAUNA Stazione Data Campionamento Data Analisi N di individui Campionati Specie Tecnica di Campionamento N° Specie Sesso PESO Lung Fegato Peso Fegato Aliquot. Bile Plasma Ep. Bioindicatori e biomarkers 17 . Micron Cerv.

conservata in eppendorf in azoto liquido (Fig. pesato. (B) Lunghezza Totale. conseravto in carta alluminio in azoto liquido (Fig. Fegato.5). subaliquotato.7). si deve procedere al prelievo dei seguenti materiali biologici. Cervello. conservato in eppendorf in azoto liquido. Una frazione di sangue intero viene strisciata per la preparazione di vetrini (Fig. immediatamente centrifugato per la separazione del plasma.Valutazioni biometriche sugli organismi bioindicatori: (A) Peso Totale.A Fig 3 .36 °K) o in congelatore a -80°C. che devono essere conservati immediatamente in azoto liquido a circa -195 °C (77.5): • • • • • Sangue (estratto dalla vena caudale). dopo essere stati adeguatamente siglati (Vedi scheda dissezione – Fig. pesato.5). Progetto BioAgri B Successivamente. Rene. Bioindicatori e biomarkers 18 . conservato in eppendorf in azoto liquido Le carcasse vengono conservate a -20°C (Fig. conservato in carta alluminio in azoto liquido (Fig. dopo la determinazione del sesso e dello stato di maturazione delle gonadi.4).6) Bile.

• Una frazione di sangue intero viene strisciata per la preparazione di vetrini.A Vena caudale Fig. • Centrifugazione per la separazione del plasma • Conseravazione in eppendorf in azoto liquido. 4 Sangue: • Estrazione del sangue dalla vena caudale con microsiringhe (eparinizzate). Bioindicatori e biomarkers 19 .

protoporfirine) epatiche.L.Scheda Dissezione Pesci Fegato Uova Bile Pinna pettorale Fig 5 . • Analisi degli IPA negli organismi sperimentali. Bioindicatori e biomarkers 20 .Scheda Dissezione Bioindicatori dell’ittiofauna(Salmo trutta trutta) I vari organi e tessuti verrannno successivamente sottoposti alla valutazione dei seguenti parametri: Fegato • Calcolo del Somatic Liver Index (S. Rene • Analisi degli elementi in tracce.I) • Valutazione della concentrazione di proteine totali epatiche • Valutazione attività MFO (BPMO. Sangue • Valutazione della Vitellogenina (Vtg) nel plasma. uro. Cervello • Valutazione attività Acetilcolinesterasi (AChE) cerebrale. • Misurazione della concentrazione delle porfirine (copro. Carcasse • Analisi degli elementi in tracce negli organismi sperimentali. • Valutazione della presenza di micronuclei in campioni di sangue. • Misurazione della concentrazione di metaboliti IPA nella bile. • Valutazione della Butirrilcolinesterasi (BChe) nel plasma. EROD) epatiche. • Valutazione delle Proteine della Zona Radiata (Zrp) nel plasma.

5 Fegato • Estrazione del fegato dall’organismo bioindicatore • Valutazione del peso totale • Subaliquotato e conservato in carta alluminio in azoto liquido. Bile • Estrazione della bile dalla vescicola biliare con siringa • Conservazione in eppendorf in azoto liquido Bioindicatori e biomarkers 21 .Fig.

6 Cervello • • Estrazione del cervello dall’organismo bioindicatore Conservazione in carta alluminio in azoto liquido.Fig. Fig. 7 Carcassa • Conservazione della carcassa (con sigla ) a –20°C Bioindicatori e biomarkers 22 .

Bioindicatori e biomarkers 23 .5. EROD) epatiche. • Valutazione della concentrazione di proteine totali epatiche. TECNICHE ANALITICHE Vengono di seguito riportate le principali tecniche analitiche utilizzate in un programma di biomonitoraggio basato sull’utilizzo di biomarkers ed analisi di residui nell’organismo bioindicatore (Fig.40. • Valutazione della Butirrilcolinesterasi (BChe) nel plasma • Valutazione della presenza di micronuclei. Rene • Analisi degli elementi in tracce Carcasse • • Analisi degli elementi in tracce. protoporfirine) epatiche. • Misurazione della concentrazione delle porfirine (copro.L. indicati in Fig. • Valutazione delle Proteine della Zona Radiata (Zrp) nel plasma. • Calcolo del Somatic Liver Index (S. • Misurazione della concentrazione di metaboliti IPA nella bile. P O RP H Y R IN S B PM O ER O D AChE HAEVY M E TA L S K ID N E Y B R A IN L IV E R M U SC LE G IL L S HEAV Y M ET A LS V IT E L L O G E N IN ZO N A R A D IA TA P R O TE IN S G A L L BL A D D E R P L ASM A PAHs M ET A B O L ITE S PAHs Fig. Analisi degli IPA. Sangue • Valutazione della Vitellogenina (Vtg) nel plasma. 8 – Tecniche analitiche (Biomarkers ed analisi dei residui) applicate all’organismo bioindicatore I vari organi e tessuti dell’organismo bioindicatore.8). uro.I) Cervello • Valutazione attività Acetilcolinesterasi (AChE) cerebrale. possono essere sottoposti alla valutazione dei seguenti parametri: Fegato • Valutazione attività MFO (BPMO.

anche una flavoproteina denominata NADPH-citocromo P450 reduttasi. 1994. il substrato si lega al citocromo nello stato ferrico. Questo complesso sistema multienzimatico comprende. In seguito al legame con il substrato. il citocromo P450. grazie al suo gruppo prostetico contenente un atomo di ferro che ha la funzione di legare ossigeno. 1995). -SH e –COOH. Il suo nucleo funzionale è rappresentato da un’emoproteina. Figura 7. svolge un ruolo chiave nei processi iniziali (Fase I) della detossificazione dei composti xenobiotici (Nebert e Gonzalez. Infatti. La sede cellulare dell’MFO è rappresentata dal reticolo endoplasmatico liscio di molti tessuti. ossigeno molecolare e citocromo ferroso.citocromo b5 reduttasi) al complesso e nella formazione di un intermedio Bioindicatori e biomarkers 24 .citocromo P450 reduttasi. che è composta da una porzione proteica (apoproteina) e da una porzione prostetica responsabile del processo ossidativo (il gruppo eme). Lo step successivo consiste nell’aggiunta di un secondo elettrone (nella maggior parte dei substrati fornito dalla NADPH. ma principalmente delle cellule epatiche. Il funzionamento del sistema MFO. cosicché i tre reagenti sono legati insieme a formare un complesso formato da substrato. che inizia con il legame del substrato al citocromo P450 nello stato ferrico e che si conclude con la rigenerazione della ferroproteina libera nello stato ferrico. svolge un’azione ossidante nei riguardi dei composti lipofili inserendo nella molecola gruppi funzionali come –OH. il NADPH e il citocromo b5. devoluto alla detossificazione di contaminanti ambientali di sintesi. Evolutosi circa 400 milioni di anni fa per difendere gli organismi viventi da composti tossici di origine naturale (animal-plant warfare). 1987).. Ciclo del citocromo P450. presente nel regno animale. Tale attivazione del substrato rende possibile il successivo attacco da parte degli enzimi coniuganti (Fase II) e la conseguente eliminazione del tossico dall’organismo. può essere visto come un processo ciclico diviso in diversi step ( Stegeman and Hahn. 1995. Goeptar et al. l’atomo di ferro del complesso viene ridotto dallo stato ferrico allo stato ferroso mediante l’aggiunta di un elettrone fornito dalla flavoproteina NADPH. Questo è un punto critico in quanto il processo potrebbe essere interrotto portando al rilascio di molecole reattive dell’ossigeno (superossido). oltre al citocromo P450. L’emoproteina ridotta quindi lega l’ossigeno.MONOOSSIGENASI A FUNZIONE MISTA (MFO) Significato Biologico Il sistema delle monoossigenasi a funzione mista rappresenta il principale sistema enzimatico. Nel primo step. Bucheli and Fent.

5 mg/kg p. sono stati sacrificati ad intervalli variabili (2 giorni per BaP. mantenuti in condizioni sperimentali in acquario. L’attività del CYP1A (misurata tramite il test EROD e il test ELISA) è risultata significativamente indotta (rispettivamente 5 e 10 volte rispetto ai valori del controllo) e significativamente correlata ai livelli di metaboliti nella bile. ELISA) ma con risultati differenti da quelli ottenuti da Hylland. sia “substratospecifico”: ciò significa che una determinata classe di composti inquinanti è responsabile dell’induzione di una sola classe enzimatica. di B(a)P si è avuta una massima risposta dopo 2 giorni dall’inizio del trattamento (EROD >500 pmol/mg prot/min) ed un ritorno a valori di controllo dopo 16 giorni. Il sistema delle monoossigenasi a funzione mista è il biomarkers con la più alta specificità oggi conosciuto. Nello step finale l’atomo di ossigeno.5 mg/kg p.) sono responsabili dell’induzione del citocromo P4502B (CYP2B). Kleinow et al. ad esempio. La presenza di una certa tipologia di inquinanti può indurre in maniera specifica una particolare famiglia del citocromo. Anche Goksøyr et al. Il sistema MFO come biomarker: casi di studio mesi in nasse poste su fondali (Sorfjorden. Livelli simili di induzione sono stati misurati anche da Hylland et al. Le iniezioni di BaP e di PCB 156 hanno causato un significativo incremento nell’attività EROD. ossia la presenza di determinati composti xenobiotici stimola la sintesi di nuove proteine funzionali. per misurare l’induzione del CYP1A (EROD. scoperto da Axelrod nel 1955. 1987. Le diverse isoforme isolate attraverso elettroforesi su SDS.c. PCB 156 e Cd. PCB 156 (2. etc. Norvegia) caratterizzati da elevati livelli di IPA. (1996) che hanno trattato esemplari di passera di mare (Platichthys flesus) con iniezioni intramuscolari di (2. Sono state ad oggi individuate fino a 300 isoforme del citocromo P450 suddivise in 36 famiglie e sottofamiglie in base alla loro funzionalità. 1964). i PCBs (policlorobifenili). PCBs e metalli pesanti nei sedimenti.. Ogni isoforma ha una diversa struttura del sito attivo che può così legare composti diversi.c. Suteau & Narbonne. dall’atomo di ferro nello stato ferrico e dall’anione perossido. in particolare relativa ai derivati del petrolio oggetto di studio della tesi. (1996) hanno mantenuto esemplari di passere di mare (Platichthys flesus) per tre . Payne et al. mentre alcuni insetticidi organoclorurati (DDTs.c. Di seguito riportiamo in sintesi alcuni dei principali studi basati sull’utilizzo dell’MFO come un biomarkers di esposizione alla contaminazione ambientale.) e Cadmio (1 mg/kg p. I pesci. Il trattamento Bioindicatori e biomarkers 25 Laboratorio Beyer et al. può essere indotto in maniera specifica da una grande varietà di contaminanti chimici con struttura molecolare planare come gli IPA (idrocarburi policiclici aromatici).c. Per dosi di 1 mg/kg p.(perossido) molto instabile costituito dal substrato. Andersson et al. 1987.. Il citocromo epatico P4501A (CYP1A). mentre i trattati con Cd non hanno mostrato alcun incremento significativo. Per prima cosa si forma un composto intermedio contenente al centro un radicale di carbonio. deve il suo nome alla lunghezza d’onda (450 nm) di massimo assorbimento dello spettro del suo complesso con il monossido di carbonio (Omura e Sato. quindi in una fase successiva il radicale carbonio subisce una ricombinazione che determina l’inserzione di un ossidrile all’interno del substrato. Tale composto intermedio si decompone. perde una molecola d’acqua e forma un atomo di ossigeno attivato legato ad un atomo di Fe3+. precedentemente attivato.).). hanno peso molecolare che va da 45 a 57 Kda. 1987. viene quindi inserito all’interno del substrato mediante una reazione che si suppone avvenga in due fasi distinte. lindano. Le analisi svolte hanno evidenziato alti valori di composti aromatici fluorescenti nella bile (5-20 volte più alti rispetto ai controlli). Il citocromo P450. (1996) hanno trattato esemplari di passera di mare (Platichthys flesus) con B(a)P. 15 giorni per Cd ed 8 giorni per PCB 156). 1988 ). Il sistema delle monoossigenasi a funzione mista è sia “substrato-inducibile”.. i PCDDs (policlorodibenzo-p-diossine) e i PCDFs (dibenzofurani) (Stegeman e Klopper-Sams.. aldrina.. Tutti i gruppi trattati con benzo(α)pirene hanno inoltre evidenziato un contenuto di metaboliti IPA nella bile 50-100 volte maggiore rispetto al controllo. 1987..

Tecniche analitiche Sono state messe a punto fino ad ora numerose metodologie per lo studio dell’induzione del sistema MFO. E' un indice della presenza di induttori come i derivati del petrolio ed altri idrocarburi policiclici. con valori compresi tra 2202 pmol/mg prot/min e 5534 pmol/mg prot/min. (2001) hanno testato vari biomarkers in esemplari immaturi sessualmente di Solea ovata campionati in un’area portuale di Hong Kong contaminata da IPA. (2003) hanno studiato la risposta del CYP1A in 88 esemplari di sogliola (Pleuronectes vetulus) campionati in 5 differenti siti nel porto di Vancouver Harbour. I valori trovati nelle sogliole trattate con β-NF..con PCB 156 (2. • Dealchilazione di resorufine: Questi tests fluorimetrici quantificano la trasformazione in resorufina della 7-etossiresorufina (mediata da una reazione di o-deetilazione citocromo P448 dipendente). • Idrossilazione della benzo(a)pirene: Questo test quantifica con indagini fluorimetriche la trasformazione della benzo(a)pirene in 3-idrossibenzo(a)pirene. Western Blots). ha evidenziato una forte induzione in tutti i siti. aldrina epossidasi (ALDE). della pentossiresorufina (reazione dipendente dal citocromo P450) e della benzilossiresorufina (reazione dipendente sia dal cit P450 che dal cit P448). • Attività enzimi reduttasici Seguono.c. Nei pesci trattati con Cd le risposte ottenute in termini di metallotioneine raggiungevano i massimi valori dopo 15 giorni. gli animali sono stato sacrificati. le principali tecniche da utilizzare per la valutazione dell’attività del sistema MFO: • • • Isolamento Frazione Microsomiale Epatica Concentrazione proteine totali Attività NADPH citocromo C reduttasi Bioindicatori e biomarkers 26 . Dopo una settimana di esposizione. PCBs e altri composti organici. Miller et al. benzopirene monoossigenasi (BPMO). che vanno dai semplici dosaggi enzimatici (valutazione dell’attività etossiresorufina O-deetilasi (EROD). ecc.. Natura Au et al. misurati attraverso il test EROD. non è stata osservata alcuna differenza significativa nell’attività misurata in organismi sessualmente maturi. Per confronto. L’attività del CYP1A. attraverso una singola iniezione intraperitoneale (50 mg/kg). è stato condotto uno studio di laboratorio su 20 sogliole campionate nel porto. sono 15-22 volte più alti rispetto a quelli trovati nelle sogliole trattate con olio di grano e concordano con quelli misurati in natura nel sito più inquinato del porto. Al contrario. un tipico induttore del CYP1A. successivamente la metà di queste sogliole è stata trattata con β-NF (β-naptoflavone) in olio di grano. mentre l’altra metà è stata trattata con olio di grano (0. fino alle più complesse valutazioni immunochimiche basate sull’utilizzo di anticorpi specifici per le diverse isoforme del citocromo P450 (ELISA. L’attività EROD misurata in pesci immaturi sessualmente prelevati dal sito contaminato era notevolmente più alta rispetto a quella misurata negli esemplari prelevati dal sito di controllo (rispettivamente 66.). il più grande porto del Canada.25 ml/100 g). che è contaminato da metalli pesanti.5 mg/kg p. in dettaglio analitico.) determinava massima induzione dopo 8 giorni (700 pmol/mg prot/min) mantenendosi persistente nel tempo. OPs e IPA. misurata tramite il test EROD.52 pmol/mg prot/min).78 pmol/mg prot/min e 23. I pesci sono stati messi in vasche con acqua salata ad una temperatura di 8 °C e acclimatati per 5 giorni.

Isolamento della frazione microsomiale epatica Gli enzimi del sistema delle monossigenasi a funzione mista (MFO) sono localizzati principalmente al livello della frazione microsomiale epatica o reticolo endoplasmatico liscio. • • • • • Tutte le operazioni riportate di seguito vengono svolte a +4°C.25 M pH 7. Il sovranatante ottenuto viene eliminato mentre il pellet viene congelato a – 80°C con tampone KCl 1.5. L’omogenato è poi centrifugato a 9000 x g per 20 minuti.6 g/ml fino al momento delle analisi. per 10 passaggi. Ogni aliquota viene omogenata in Potter. L’estrazione di tale frazione è quindi il primo step nella valutazione delle attività enzimatiche MFO. (B) centrifugazione.5 nel rapporto 1:2.15% pH 7.000 x g per 60 minuti.500 mg a seconda delle dimensioni dei campioni nelle diverse specie. in Tampone Saccarosio 0. Bioindicatori e biomarkers 27 . A B Fasi operative della preparazione della frazione microsomiale epatica: (A) omogenizzazione tessuto epatico. Step operativi: • Per l’isolamento della frazione epatica microsomiale vengono utilizzate aliquote di tessuto epatico del peso di 300. Il pellet risultante viene eliminato ed il sovranatante ulteriormente centrifugato a 100.

5 mg/ml. Fasi operative del dosaggio delle proteine microsomiali: lettura della soluzione (BIORAD-PROTEIN) allo spettrofotometro (Shimadzu UV visibile recording spectrometer). Step operativi: • Utilizzando albumina di plasma bovino (BSA).5 ml a 1 ml di soluzione BIO-RAD PROTEIN diluita 1:5. viene preparata una curva standard di calibrazione con le seguenti concentrazioni: 0.4 mg/ml 0. Da ogni campione diluito vengono prelevati 20µl e aggiunti in cuvetta di plastica da 1.2 mg/ml 0. • • • • I campioni sono opportunamente diluiti in TRITON 0.02% prima del test. Bioindicatori e biomarkers 28 .1 mg/ml 0. Le soluzioni utilizzate e le diverse fasi della metodologia sono descritte di seguito.Concentrazione delle Proteine Microsomiali Per la determinazione della concentrazione proteica negli estratti epatici viene utilizzato un metodo spettrofotometrico che si avvale del colorante BioRad Protein Assay. Dopo agitazione.3 mg/ml 0. viene effettuata la lettura della soluzione allo spettrofotometro (Shimadzu UV visibile recording spectrometer). Viene preparato il colorante BIO-RAD PROTEIN diluito in proporzione 1:5 in H2O bidistillata.

Questo test quantifica. tramite lettura fotometrica. Per l’enzima NADPH la miscela di reazione consisteva in: • 500 µl di tampone Tris-HCl 100 mM • 50 µl di KCN 20 mM • 50 µl di citocromo C 1. quindi. obbligati ad attraversarlo. SPETTROSCOPIA UV/VIS L’interazione delle radiazioni elettromagnetiche con la materia è essenzialmente un fenomeno quantico che dipende dalle proprietà della radiazione e dalla struttura della materia stessa. CALCOLO CONCENTRAZIONE PROTEICA La concentrazione proteica. Il risultato del test veniva espresso come nmol/ mg prot/ min. la riduzione del citocromo C. I diversi componenti della materia daranno origine e saranno sensibili a radiazioni in regioni specifiche dello spettro.2 mM • 325 µl di acqua distillata • 25 µl di frazione microsomiale • 50 µl di NADPH Il cambiamento di assorbanza è stato letto con uno spettrofotometro a doppio raggio con cella termostatata a 30 °C (Perkin Elmer Lamda EZ 201) ad una lunghezza d’onda di 550 nm per 120 secondi. La spettroscopia in UV/Vis prevede l’uso di spettrofotometri in grado di generare fasci di luce ad una singola lunghezza d’onda indirizzati verso il campione in analisi e. Lo spettrofotometro registra l’assorbimento di luce da parte del Bioindicatori e biomarkers 29 . espressa in mg/ml viene calcolata in rapporto alla curva standard di BSA. Attività reduttasi L’attività dell’enzima NADPH citocromo C reduttasi viene valutato con il metodo Livingstone e Farrar (1984). corrispondente alla lunghezza d’onda di assorbimento del complesso BIO-RAD PROTEIN-proteine. successivamente si procede alla lettura in doppio dei campioni. La prima lettura viene effettuata del bianco (soluzione di BIO-RAD PROTEIN) disposto in due cuvette ed ha funzione di riferimento (autozero dello strumento).• • La lettura viene effettuata a una lunghezza d’onda pari a 595 nm.

infine esprime la proporzionalità diretta tra l’assorbanza e la concentrazione della sostanza che assorbe la luce e lo spessore del campione. cioè nessuna radiazione viene assorbita. Bioindicatori e biomarkers 30 . I0 l’intensità della radiazione incidente (per intensità si intende il numero di fotoni che interagiscono nell’unità di tempo). Per valori intermedi di assorbimento della luce possiamo definire l’assorbanza (A) che è uguale al log del reciproco della trasmittanza: A= LOG 10(1/T)= LOG 10 (I/I0) La legge di Lambert Beer. Una sostanza completamente trasparente presenta un valore di T pari al 100%. A= ελ cl Dove ελ è il coefficiente di estinzione molare della sostanza che assorbe la luce ad una data lunghezza d’onda λ .campione. La legge fondamentale che governa l’assorbimento di luce da parte di un’analita è la legge di Lambert-Beer espressa come: T= I/I0 Dove T è la trasmittanza. c è la concentrazione molare della soluzione che assorbe la luce. mentre un valore di T=0 indica una sostanza totalmente opaca che assorbe completamente la luce. I l’intensità della radiazione trasmessa. ed l è il cammino ottico della radiazione nella soluzione.

questo è inoltre legato alla rapida velocità di degradazione di questi composti nei vari comparti ambientali. irreversibile (OPs). economico. Tali biomarkers vengono comunemente misurati con tests enzimatici spettrofotometrici.1998). in casi estremi. Step operativi: PREPARAZIONE CAMPIONI • • Aliquote di tessuto cerebrale vengono omogenate in tampone TRIS / HCl 0. le esterasi di tipo "A". L’omogenato viene quindi centrifugato a 600 x g per 10 minuti ed il sovranatante utilizzato per la determinazione della attività enzimatica.06:1 g/ml tramite 10 passaggi in Potter (Fig. L'inibizione delle esterasi cerebrali (acetilcolinesterasi .CbE) rappresenta un biomarker specifico della presenza di insetticidi organofosforici (OPs) e carbammati (CBs). 1996. L’inibizione della BChE ematica è stata inoltre recentemente proposta come biomarker non-distruttivo per evidenziare l’esposizione a tali insetticidi neurotossici in rettili ed uccelli (Fossi et al. Bioindicatori e biomarkers 31 . disfunzioni motorie ed.0 nel rapporto 0. Attività Acetilcolinesterasi cerebrale (AChE) Il test per la determinazione della attività acetilcolinesterasica cerebrale (Elmann et al..AChE) ed ematiche (butirrilcolinesterasi . si presenta come un metodo estremamente rapido. morte..LE ESTERASI Significato Biologico La famiglia delle esterasi è costituita da due classi fondamentali.1 M pH 8. modificato) quantifica la velocità di idrolisi del substrato specifico (acetiltiocolina) da parte degli enzimi esterasici cerebrali a formare tiocolina. che reagendo con un colorante (DTNB) sviluppa una reazione colorimetrica con con massimo di assorbanza del prodotto di reazione a 410 nm di lunghezza d’onda. Fossi. Questi insetticidi generano il loro effetto provocando un’inibizione. responsabili della detossificazione degli organofosforici e le esterasi di tipo "B". e maggiormente attendibile rispetto alla più comune valutazione chimica della presenza di tali contaminanti. o reversibile (CBs). che vengono al contrario inibite da questi insetticidi.12). 1961.BChE e carbossilesterasi . dell’attività dell’acetilcolinesterasi con conseguente accumulo di acetilcolina a livello delle sinapsi nervose e sintomi di tremore. La valutazione dell’inibizione dell’AChE come segnale d’esposizione e d’effetto a tali insetticidi.

Prima dell’inizio della lettura viene effettuato l’autozero dello strumento con due bianchi contenenti la miscela di reazione senza omogenato.875 ml tampone TRIS/CaCl2 (TRIS/HCl 25 mM. • • La cinetica di reazione viene registrata per 5 minuti a 410 nm di lunghezza d’onda.14).13): 2. Bioindicatori e biomarkers 32 . CaCl2 1 mM. pH 7.Fig 12 – Fasi operative della valutazione dell’attivita’ Acetilcolinesterasica cerebrale: omogenizzazione del tessuto cerebrale. Fig 13 – Fasi operative della valutazione dell’attivita’ Acetilcolinesterasica cerebrale: miscela di incubazione. VALUTAZIONE DELL’ATTIVITÀ ENZIMATICA • La seguente miscela di reazione viene introdotta in una cuvetta di plastica dello spessore di 1 cm (Fig. utilizzando uno spettrofotometro a doppio raggio (Fig.6). 5-10 µl di omogenato. 100 µl DTNB. 20 µl Acetiltiocolina (ATCI).

Attività Butirrilcolinesterasica (BChE) Il test per la determinazione della attività butirrilcolinesterasica (Elmann et al. 37°C per i mammiferi e 42°C per gli uccelli.. 1961.. and Featherstone RM. Courtey KD. modificato) quantifica la velocità di idrolisi del substrato specifico (butirriltiocolina) da parte degli enzimi esterasici del plasma a formare tiocolina. Fig 14 – Fasi operative della valutazione dell’attivita’ Acetilcolinesterasica cerebrale: lettura spettrofotometrica della cinetica enzimatica. Pharmac. CALCOLO ATTIVITA’ L’attività enzimatica si esprime come µmoli substrato/ g tessuto/ minuto. A new rapid colorimetric determination of cholinesterase activity. 7:88-98. che reagendo con un colorante (DTNB) sviluppa una Bioindicatori e biomarkers 33 . Andreas V Jr. Biochem. BIBLIOGRAFIA Ellman L. 1961.• La cella dello strumento viene termostatata a 30 °C per le specie ittiche.

utilizzando uno spettrofotometro a doppio raggio (Fig. Step operativi: PREPARAZIONE CAMPIONI • Aliquote di sangue vengono prelevate dagli organismi da analizzare ed immediatamente centrifugate in assenza di eparina al fine di separare il plasma che viene conservato a – 80°C fino al momento del test (Fig. • Prima dell’inizio della lettura viene effettuato l’autozero dello strumento con due bianchi contenenti la miscela di reazione senza plasma. 100 µl DTNB.875 ml tampone TRIS/CaCl2 (TRIS/HCl 25 mM. 20 µl Butirriltiocolina (BTCI). CaCl2 1 mM.52): 2. Bioindicatori e biomarkers 34 . pH 7.6). VALUTAZIONE DELL’ATTIVITÀ ENZIMATICA • La seguente miscela di reazione viene introdotta in una cuvetta di plastica dello spessore di 1 cm (Fig.reazione colorimetrica con massimo di assorbanza del prodotto di reazione a 410 nm di lunghezza d’onda.51). Fig 51 – Fasi operative della valutazione dell’attivita’ Butirrilcolinesterasica plasmatica: centrifugazione dei campioni di sangue per l’isolamento del plasma.53). 5-10 µl di plasma. • La cinetica di reazione viene registrata per 5minuti a 410 nm di lunghezza d’onda.

Le cellule possiedono un complesso sistema di difesa che tenta di inibire la formazione dei radicali dell’ossigeno: tale sistema include enzimi antiossidanti come la catalasi (CAT). causando un fenomeno conosciuto con il nome di stress ossidativo (Davies. CALCOLO ATTIVITA’ L’attività enzimatica si esprime come µmoli substrato/ ml plasma/ minuto. che sono presenti nei tessuti di tutti gli organismi. possono derivare non solo dalla biotrasformazione dei composti inquinanti. Tali enzimi. HO2▪. Zn. ma allo stesso tempo. glutatione reduttasi). 37°C per i mammiferi e 42°C per gli uccelli. la cui funzione è quella di catalizzare la conversione di due molecole di O2Bioindicatori e biomarkers 35 . inclusi i pesci. ma anche dalla parziale riduzione dell’ossigeno molecolare utilizzato dagli organismi (autoossidazione dei componenti della catena di trasporto degli elettroni nel mitocondrio. possono danneggiare componenti cellulari come il DNA. presenti in tutte le cellule viventi che utilizzano ossigeno molecolare. che comprendono specie radicali e non-radicali (O2▪-. RO2▪. Fe e Mn nel suo sito attivo. il citocromo P450 e gli enzimi coniuganti giocano un ruolo chiave nella metabolizzazione di molti inquinanti organici. RO▪. la superossido dismutasi (SOD) e il glutatione perossidasi (GPX). 1995). Le superossido dismutasi (SODs) sono un gruppo di metalloenzimi. 1999). le proteine e le membrane. Nei vertebrati. H2O2 ). essendo altamente reattivi con le macromolecole. formano intermedi di reazione detti ROS (specie reattive dell’ossigeno).• La cella dello strumento viene termostatata a 30 °C per le specie ittiche. il citocromo P450 e le reduttasi) (Winston 1991. I ROS. Tali composti. Winston e Di Giulio. OH▪. 1991). Questa batteria di enzimi antiossidanti è supportata da sistemi accessori che forniscono equivalenti ridotti necessari per l’attività di detossificazione (glucosio 6-fosfato deidrogenasi. che contengono Cu. E’ stato stimato che circa l’1-3% dell’O2 consumato nei sistemi animali è convertito a ROS (Halliwell e Gutteridge. sono fondamentali nella trasformazione dei radicali in molecole non reattive. Attività enzimi antiossidanti Significato biologico Tutti gli organismi animali contengono diversi tipi di enzimi per proteggersi dagli effetti negativi degli xenobiotici.

1993. Fahimi e Cajaraville. Cajaraville et al. 2000). Tale attività è stata misurata come decremento della concentrazione di perossido di idrogeno tramite lettura fotometrica a 290 nm.. Qui di seguito saranno riportati in sintesi alcuni studi che utilizzano gli enzimi antiossidanti come biomarkers di stress alla contaminazione da derivati del petrolio. Nella maggior parte dei tessuti animali ci sono due forme di superossido dismutasi: una. Date le loro caratteristiche. Attività Catalasi L’attività enzimatica della catalasi viene valutata nel citosol epatico tramite la metodica di Aebi. 1994.. 1995.ad ossigeno molecolare e perossido di idrogeno (H2O2) . Bioindicatori e biomarkers 36 .. Grazie alla riduzione dei perossidi. 1984. 1996). Livingstone. localizzata nel mitocondrio. localizzata nel citosol. che contiene un atomo di rame e uno di zinco (Cu/Zn-SOD).Zn-SOD e GPX sono localizzati nei perossisomi dei mammiferi e nelle cellule epatiche dei pesci (Dhaunsi et al. 1993). Le catalasi (CATs) sono emoproteine localizzate esclusivamente nei perossisomi. che nella matrice mitocondriale (Boveris e Cadenas.. Cancio and Cajaraville. Nonostante le catalasi siano gli enzimi perossisomali più abbondanti. La glutatione perossidasi (GPX) è un enzima che converte il perossido di idrogeno in acqua.. 1997. 1982). ed un’altra. implicando una contemporanea ossidazione del glutatione ridotto (GSH) nella sua forma ossidata (GSSG).. la glutatione perossidasi protegge l’organismo dai danni ossidativi e dall’accumulo dei prodotti dei radicali liberi. Inoltre catalizza la riduzione glutationedipendente degli idroperossidi (ROOH) in GSSG (glutatione disolfuro) ed acqua. 1992. gli enzimi antiossidanti sono stati proposti come indicatori precoci dell’esposizione a composti xenobiotici organici (Di Giulio et al. che viene metabolizzato ad ossigeno molecolare ed acqua. Singh et al. 2000). Questa diminuzione in assorbanza è stata registrata ad intervalli di 10 secondi per il tempo di 1 minuto. che in un secondo momento viene detossificato da due tipi di enzimi: catalasi e glutatione perossidasi. 1989. la cui funzione è quella di facilitare la rimozione dell’ H2O2 . I perossisomi sono organelli cellulari che hanno molteplici funzioni (Mannaerts e Van Veldhoven. che contiene un atomo di manganese (Mn-SOD). Tale sistema è localizzato sia nel citoplasma. in quanto è molto reattiva con i radicali superossidi. 1985). ma in particolare giocano un ruolo chiave nel metabolismo dei ROS (Singh. altri enzimi come Cu. Orbea et al. La superossido mitocondriale può contribuire fino al 60% di attività totale di un tessuto (Radi et al.

1979) comprende “quelle tecniche immunologiche in cui il rilevatore è costituito da un antigene o un anticorpo marcato con un enzima. Dopo che l’antigene si è legato ad una fase solida.I. di seguito. Tale lettura corrispondeva al bianco.In una cuvetta al quarzo sono stati posti 3 ml di tampone fosfato 50 mM pH 7.S. In una cuvetta di quarzo stata poi posta la seguente miscela di reazione: • • • 2 ml di tampone fosfato 50 mM pH 7.5 50 µl di campione 1 ml di perossido di idrogeno al 30 mM. In questo modo è possibile misurare i livelli di anticorpo primario Bioindicatori e biomarkers 37 . specifico per l’anticorpo primario e. rappresentata dal fondo dei pozzetti della piastra E.S.L. I valori della catalasi. il substrato per l’enzima. l’E. espressi in nmolxmin-1. Vitellogenina e Proteine dalla Zona Radiata (vedi anche il paragrafo composti estrogenici) Test ELISA Per rilevare le concentrazioni di Vitellogenina (Vtg) e delle Proteine della Zona Radiata (Zrp) viene utilizzata una tecnica immunoenzimatica. il grado di legame tra il reagente marcato ed il suo immunoreattivo e quindi la concentrazione della sostanza oggetto del dosaggio che con tale reagente è in competizione. è stata effettuata la lettura del campione in doppio.L. nella sua definizione più generale (Messeri. viene aggiunto l’anticorpo policlonale “primario” che si lega al corrispondente immunoreattivo. L’enzimoimmunologia. La stessa procedura è stata seguita per ogni campione analizzato. allo Dopo opportuna agitazione. Il metodo indiretto si basa sulla reazione tra l’antigene ricercato (Vtg o Zrp) con un anticorpo policlonale ad esso specifico. viene calcolato mediante la misura dell’attività enzimatica”. L’aggiunta del substrato genera una reazione rilevabile spettrofotometricamente.A. L’unità di misura finale è quindi espressa come nmol/ min/ mg prot.A.. sono ottenuti tramite la seguente formula: K/ml = (2. Si aggiunge quindi un secondo anticorpo marcato con un enzima. Dopo un’opportuna agitazione è stata effettuata la lettura spettrofotometro (Perkin Elmer. Lambda SZ 201).5 e 50 µl di citosol epatico.I.3/ ∆t) x [log (Ai/Af)] x 3/ Vcampione Il risultato è stato normalizzato dividendo il valore ottenuto per la concentrazione (mg/ml) di proteine totali determinate nel campione. (Enzyme-Linked-ImmunoSorbent-Assay) con il metodo indiretto.

24 pozzetti sono stati seminati come bianchi solo con coating buffer.L. per poi ripetere di nuovo le operazioni di lavaggio sopradescritte. sono stati aggiunti 100 µl di soluzione di sviluppo (0. al buio.3). indirettamente. Microplate Reader Model 550). diluito 1:1000 per la Vtg e 1:3000 per la Zrp.A.012% H2O2 ) contenenti il substrato specifico per la perossidasi coniugata all’anticorpo “secondario”. tutta la notte.S. Norvegia) specifico per ciascuna delle due proteine. Il giorno successivo le piastre sono state lavate tre volte con tampone TPBS (0. vedi par. sono stati calcolati sottraendo al valore medio ottenuto per ciascun campione. il valore medio dei pozzetti bianchi. pH 9. risalire alla concentrazione che l’antigene ad esso legato (Goksøyr.A. Passati 10 minuti la reazione di sviluppo è stata bloccata con una soluzione di acido solforico 4N e si è passati alla lettura dell’assorbanza della piastra a λ=490 nm al lettore E.4.I. per un’ora. Le piastre sono state lasciate al buio.04% di diidrocloruro di ofenilendiammina (DOF).5. 4. (BIO-RAD. Successivamente sono stati aggiunti ad ogni pozzetto 200 µl di blocking solution (2% Albumina di siero bovino (ASB) in PBS) lasciando riposare la piastra. espressi come unità di assorbanza. 1976. Ad ogni pozzetto sono stati aggiunti 100 µl di soluzione contenente l’anticorpo primario policlonale (BIOSENSE. I campioni di plasma da analizzare sono stati quindi diluiti in coating buffer (50mM carbonato/bicarbonato. da 96 pozzetti.5% Tween 20 in phosphate buffered saline (PBS). Bioindicatori e biomarkers 38 . a temperatura ambiente per un’ora. la piastra è stata quindi mantenuta a 4°C per tutta la notte. a temperatura ambiente.).e.6) fino ad ottenere concentrazioni di 100 µg proteine totali/ml e seminati in doppio (100 µl per pozzetto) in piastre E. Il giorno seguente sono state ripetute le operazioni di lavaggio in TPBS ed aggiunti 100 µl di soluzione contenente l’anticorpo “goat anti rabbit IgG” della BIO-RAD coniugato con l’enzima perossidasi rafano e diretto contro gli anticorpi di coniglio. pH 7. a 4°C. I risultati.S. 0. Il primo step comprende la misurazione della concentrazione delle proteine plasmatiche che è stata effettuata con il metodo precedentemente illustrato (Bradford.1. 1991).L.I. la piastra è stata lasciata a riposo. permettendo così l’assorbimento delle proteine da parte del setto poroso presente sul fondo di ogni pozzetto. Dopo aver effettuato 5 lavaggi in TPBS.

i metaboliti saranno poi temporaneamente immagazzinati nella cistifellea in attesa di essere eliminati attraverso l’intestino. 1988). Una volta assunti.. gli IPA attraverso il circolo sanguigno. formano addotti. A questo corrisponde un’alta frequenza sia di addotti del DNA che di lesioni al fegato nella sogliola sole rispetto alla sogliola stellata (Collier et al. Ariese et al. gli IPA possono essere trasformati in specie molto reattive. nelle specie esposte a varie forme di contaminazione da prodotti petroliferi. 1991). al materiale sospeso.Metaboliti IPA della bile Significato Biologico In ambiente acquatico.. che legandosi al DNA.. il potenziale cancerogenico aumenta con il crescere delle dimensioni delle molecole degli IPA (Malins et al. ha dimostrato la presenza dei metaboliti IPA nella bile. 1996). Uno studio effettuato da Aas nel 1999 su esemplari di merluzzo (Gadus morhua) e passere di mare (Platichthys flesus). E’ stato dimostrato che la potenzialità di sviluppare effetti tossici in risposta all’esposizione degli IPA. 1989. Tale assunzione dipende da una serie di fattori. il contenuto lipidico. Tale processo è diviso in due fasi: nella fase I (bioattivazione) viene aggiunto un gruppo OH. il cibo. Sono stati eseguiti molti studi su diverse specie ittiche esposte a varie concentrazioni di IPA. provenienti da aree contaminate (Canale del Mare del Nord e Rotterdam). 1980). mostravano una relativamente più bassa attività di detossificazione delle reazioni della fase II comparate alle reazioni di bioattivazione della fase I nella sogliola sole (Pleuronectes vetulus) e nella sogliola stellata (Platichthys stellatus). La bile è una secrezione digestiva. può dipendere dal sistema di biotrasformazione di ciascuna specie. Studi condotti da Puget Sound. o si accumulano nel pesce distribuendosi secondo il contenuto dei lipidi nei differenti tessuti.. acido glucuronico o glutatione. la bile con i suoi metaboliti non viene scaricata. mentre nella fase II (coniugazione) vengono aggiunte molecole come amminoacidi. ed è stato osservato come l’accumulo di questi contaminanti o dei loro metaboliti. rilasciata saltuariamente nel tubo digerente. Lin et al. In alcuni casi.. 1993). come la concentrazione degli IPA nell’ambiente. indipendentemente dal loro normale percorso di assunzione ( Varanasi & Stein. Stegeman & Lech. Il tipo di alimentazione. 1991). 1993. 1976). Kurelec. giocano un ruolo importante nei confronti dell’assunzione e del bioaccumulo degli IPA (Varanasi. gli IPA sono resi più idrosolubili e quindi facilmente escreti. se il pesce non mangia. USA. la loro lipofilia e solubilità ed il loro adsorbimento al particolato organico. Questi studi hanno dimostrato che i livelli dei metaboliti IPA nella bile riflettono l’assunzione di questi contaminanti da parte delle specie e quindi possono essere considerati un valido biomarker di esposizione (Aas.. 1986. In genere. 1997) mostrano che i livelli dei metaboliti IPA nella bile di alcune specie di Pleuronettiformi. I dati provenienti dal Biomarker Workshop (Ariese. che il sistema riproduttivo possono essere danneggiati in seguito all’esposizione agli IPA. Attraverso l’aggiunta di gruppi funzionali idrofilici nella molecola. Il modo e la velocità di eliminazione dipendono dai diversi composti degli IPA. Bioindicatori e biomarkers 39 . gli IPA non sono presenti nella fase disciolta. attraverso un processo che ne facilita l’escrezione. 2000). rispetto all’area di controllo. incrementando la densità della bile. di un ordine di grandezza. Finito tale processo. 1989.. fosse quasi esclusivamente a carico della bile (Roubal et al. le caratteristiche specie-specifiche di assunzione da parte dell’epitelio (struttura e funzione) e il sistema di biotrasformazione. che si sono dimostrati essere i predecessori degli effetti mutagenici e cancerogenici (Varanasi et al. il particolato sospeso. generalmente quelli a basso PM vengono eliminati più velocemente di quelli ad alto PM (Neff et al. come risultato della loro bassa solubilità. 1977. Inoltre l’analisi dei metaboliti IPA nella bile nei pesci si è dimostrato essere un metodo sensibile per studiare la contaminazione degli IPA che hanno origine sia petrolifera sia pirolitica (Krahn et al.. Per le specie bentoniche esistono diverse vie di assunzione degli IPA: l’acqua. 1992). sono più elevati. Nava e Engelhardt. arrivano nel fegato dove verranno metabolizzati o biotrasformati dal sistema enzimatico del citocromo P450. ma si legano al sedimento. Sia il sistema immunitario. le branchie e il diretto contatto con il sedimento.

che variavano da 2100 unità di fluorescenza nel sito più contaminato a 67 unità di fluorescenza in quello meno inquinato. hanno evidenziato un incremento lungo tutto il periodo di esposizione. di cui sono metaboliti intermedi o loro prodotti di ossidazione. tra i quali la limanda (Limanda aspera). (1986) hanno campionato esemplari di sogliola inglese (Parophrys vetulus) in 11 siti di Puget Sound. Nell'uomo e in alcuni altri organismi superiori l'origine di tali interferenze può essere ricondotta più di frequente a malattie genetiche (porfirie) che possono avere talvolta evoluzioni drammatiche. FAC-PHN: 18 µg equiv. Washington. Dopo il primo anno dallo sversamento i livelli di metaboliti del fenantrene (FAC-PHN) e del naftalene (FACNPH) sono elevati (FAC-NPH: 23 µg equiv. quindi risulta essere un campione fisiologico quasi ideale per controllare lo stato di salute di un ambiente acquatico.25 ppm. (2000) hanno selezionato un set di biomarkers per studiare il merluzzo Atlantico (Gadus morhua) esposto in maniera cronica a derivati del petrolio. I biomarkers scelti per questo lavoro sono stati: i metaboliti IPA nella bile. Tutti i biomarkers utilizzati. Porfirine Significato Biologico Le porfirine sono pigmenti tetrapirrolici ampiamente distribuiti in natura. Per la sua natura. ad esempio in gusci e penne negli uccelli. (2000) hanno misurato i metaboliti IPA (fenantrene e naftalene) nella bile in seguito all’esposizione cronica al petrolio derivante dallo sversamento in mare della Exxon Valdez. I livelli dei composti aromatici fluorescenti biliari diminuiscono con il passare del tempo dallo sversamento. inoltre il gruppo di controllo e quello trattato con 1 ppm sono stati esaminati anche una settimana dopo la fine dell’esperimento. come deposizione pigmentata dove svolgono una funzione per l'ornamento e il camuffamento. nel gruppo trattato con 1 ppm. Natura Su varie specie di pesci teleostei. come dimostrato da Collier e Varanasi (1991).. Sono presenti in alcuni tessuti animali.aumenta la concentrazione biliare dei metaboliti IPA. l’attività EROD e il livello di addotti sul DNA nel fegato e nel sangue. I metaboliti IPA come biomarker: casi di studio Laboratorio Aas et al. Di fondamentale Bioindicatori e biomarkers 40 . Gli esemplari sono stati esaminati cinque volte durante il periodo di esposizione. Krahn et al. i livelli di fenantrene si abbassano più rapidamente rispetto a quelli del naftalene. 1 ppm).06 ppm. 1989../mg bile prot. Nei due anni successivi. la bile non ha bisogno di subire dei pretrattamenti.. Quando il processo di sintesi dell'eme subisce interferenze si possono creare alterazioni nel profilo delle porfirine che sono prodotte./mg bile prot). come omogenizzazione o estrazioni varie. Qui di seguito saranno riportati in sintesi alcuni dei lavori più significativi che utilizzano i metaboliti IPA come biomarkers di esposizione a derivati del petrolio. In tutti i siti campionati sono stati rilevati alti valori di concentrazione dei metaboliti. Gli organismi sono stati mantenuti in condizioni sperimentali in acquario per 30 giorni a concentrazioni differenti di petrolio (0. per misurare la concentrazione dei metaboliti dei composti aromatici nella bile. Sol et al. accumulate ed escrete. Il loro ruolo fisiologico fondamentale è comunque legato al processo di sintesi dell'eme. per essere sottoposta ad analisi. 0.

(Elder. in 5 di essi i livelli di uroporfiria erano ancora estremamente elevati dopo 20 anni. POLICLOROBIFENILI E POLIBROMOBIFENILI Bioindicatori e biomarkers 41 . 1978). Si scoprì che il suo principale meccanismo di azione si esplica tramite la inibizione della uro'geno decarbossilasi (UROG-D) del fegato e ciò spiega la prevalenza di uro e altre porfirine altamente carbossilate nel fegato e nelle urine.importanza per gli studi ecotossicologici è la capacità che hanno molte classi di contaminanti ambientali di interferire con la sintesi dell'eme sia nei vertebrati che negli invertebrati. 1983). Jirasek et al. La notevole ubiquità di materiali biologici disponibili per la loro identificazione fa sì che le porfirine possano essere proposte per indagini di tipo nondistruttivo (De Matteis e Lim. Il profilo delle porfirine (coproporfirine. Anche la TCDD ha mostrato in vitro potere di inibire la UROG-D (Jones e Sweeney. 1962.5 triclorofenossiacetico (2. Le porfirine possono quindi essere utilizzate come biomarkers di esposizione a composti tossici.5 T) (Bleiberg et al.4. 1961). La TCDD è uno dei composti più tossici in assoluto e gli studi di Poland e Glover (1973) e Goldstein et al. pesticidi organoclorurati.3. Infatti grandi quantità di porfirine si accumulano nel fegato e vengono escrete nelle urine al punto che le urine assumono un colore rosso scuro (Cam e Nigogosyan. altri distretti di accumulo possono essere rappresentati dalle urine e dalle feci. il fegato (dove l'eme costituisce il gruppo prostetico del citocromo P-450) ed il rene. organofosforici.3.4 D)e acido 2.. uroporfirine. 1982). dal pelo per i mammiferi e dalle penne per gli uccelli. Studi a lungo termine effettuati su ratti fornirono interessanti indicazioni su questo fenomeno di persistenza nella inibizione della UROG-D. 1994). La responsabilità dell'HCB fu confermata da esperimenti di laboratorio su roditori (De Matteis et al. (1973) ne mostrarono chiaramente in potente potere porfirinogenico...5.4..7. 1964. sono il tessuto eritropoietico ( in cui l'eme viene sintetizzato ed inserito come gruppo protetico nell'emoglobina)... Alcuni contaminanti agiscono molto selettivamente su alcuni enzimi della catena biosintetica alterando il metabolismo porfirinico anche se solitamente senza produrre drammatici effetti macroscopici.4 diolo e il pentaclorotiofenolo (Koss et al. Tra i metaboliti dell' HCB i più importanti sono i pentaclorofenoli. 1980). 1977).4 diclorofenossiacetico (2. 1968). I principali distretti di sintesi dell'eme e di potenziale accumulo di porfirine.. 1963). 1978) che coinvolse più di 3000 persone(Dogramaci et al. DIOSSINE Negli anni sessanta furono riportati casi di PCTS in lavoratori di due industrie che producevano gli erbicidi acido 2. L’accumulo di porfirine epatiche è un indice della contaminazione da parte di PCBs. Studi successivi hanno indicato che la 2. avendo un sistema di metabolizzazione più rapido. Si ipotizzo infatti che gli agenti responsabili dell'inibizione fossero o dei metaboliti persistenti dell'HCB o le stesse porfirine e porfirinogeni che si producevano (Koss et al. Nel 1977 vennero riesaminati 29 pazienti turchi che erano stati originariamente coinvolti nell'epidemia (Cripps et al. HCB Dal 1955 al 1959 si verificò in Turchia una epidemia di porfiria cutanea tarda sintomatica (PCTS) (Elder. il 2. 1973). A confermare la tesi dei metaboliti vi fu anche il lavoro di Rizzardini e Smith (1982) in cui le femmine di ratto si mostrarono più sensibili nello sviluppo di porfiria rispetto ai maschi . Riportiamo di seguito alcuni esempi di composti dal potere porfirinogenico. Schmid. Questo tipo di patologia che si manifesta con lesioni della pelle dovute alla fotosensibilizzazione è cusata dalle porfirine. protoporfirine) viene valutato fluorimetricamente dopo estrazione acida di subfrazioni di tessuto epatico. Successivamente si è individuato un ruolo chiave nello sviluppo della porfiria da HCB anche da parte del ferro che non è legato all'eme.6 tetraclorobenzene-1. diossine e metalli pesanti.8 tetraclorodibenzo-p-diossina (TCDD) è un sottoprodotto della produzione del 2.4 D (Hay. si scoprì in seguito che una partita di grano trattata con il fungicida esaclorobenzene (HCB) era stata utilizzata come alimento piuttosto che come semenza e che esso ne era causa. 1960). Studi su ratti di Cantoni et al. (1981) stimarono che il suo potere di indurre porfiria fosse 14000 volte più elevato rispetto all'HCB.

L'inibizione della copro'geno ossidasi fu proposta come spiegazione di questo fenomeno. Nel 1973 alcuni contadini del Michigan (Kay.. Un esperimento successivo con ratti confermò la capacità porfirinogenica dei PBB (Gupta et al. 69 pazienti furono analizzati per il pattern di escrezione delle porfirine e dei loro precursori nell'urina (Chang et al. Fossi : “Biomarkers: strumenti di diagnosi e prognosi ambientale” Rosini Editrice s. Livelli elevati di di coproporfirine furono misurati in soggetti che mostravano danni epatici indotti dal PVC. 1977) furono esposti accidentalmente a polibromobifenili (PBB). Si riscontrò un aumento di ALA e di uroporfirine.l. TESTO CONSIGLIATO: M. (1979) studiarono l'escrezione di porfirine e dei loro precursori in soggetti che lavoravano in una fabbrica che produceva e processava polivinilcloruro (PVC).C.A Taiwan nel 1979 fu identificata la presenza di PCBs nell'olio da cucina consumato da soggetti che avevano sviluppato cloracne.. 1980). in tal caso non ci fu un aumento sostanziale nell'accumulo di porfirine ma il “pattern” era significativamente alterato.r. 1983). Doss et al. Firenze Bioindicatori e biomarkers 42 . per cui le porfirine e gli altri metaboliti dell'eme furono proposti come indici di contaminazione da PCBs.