M.C.

Gutirrez SEPARACIN DE COLORANTES POR CROMATOGRAFA DE CAPA FINA

LA CROMATOGRAFA LQUIDA: APLICACIN DE LA TLC A LA SEPARACIN DE COLORANTES

M.C. Gutirrez*

0.1.

Resumen

Se describen las principales modalidades de cromatografa lquida, siguiendo tres clasificaciones distintas: segn la fase estacionaria, segn los fenmenos que intervienen en la separacin y segn el mtodo de operativo. Se estudia con ms detalle la cromatografa en capa fina (TLC) por tratarse de una tcnica muy simple, tanto desde el punto de vista de procedimiento experimental como del equipo y material requerido. Se aplica la cromatografa en capa fina (TLC) a la separacin de los diversos colorantes contenidos en 6 tintes comerciales con eluyentes especficos de los diversos grupos tintreos. Los resultados obtenidos indican que la mayora de los tintes estudiados estn compuestos por mezclas de 3-5 colorantes, principalmente de tipo disperso. Esta tcnica cromatogrfica es una herramienta til desde el punto de vista cualitativo. Tambin permite, en algunos casos concretos, seleccionar el eluyente ms adecuado para un posterior anlisis cuantitativo por cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC).
Palabras clave: Cromatografa, cromatografa lquida, cromatografa de capa fina, TLC, (thin layer chromatography), tintes, colorantes, colorantes dispersos

contained in 6 commercial tints and to the identification of the dyeing group of the dyes. The results obtained indicate that most of the studied tints are constituted by 3-5 dyes, mainly of disperse type. This chromatographic technique is a useful tool from the qualitative point of view. In some cases, it also allows to select the most appropriate eluent for a later quantitative analysis using high resolution liquid chromatography (HPLC).
Key words: Chromatography, liquid cromatography, thin layer chromatography, TCL, tints, dyes, disperse colorants

0.3.

Rsum: LA CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE. APPLICATION DE TLC LA SPARATION DE COLORANTS

0.2.

Summary: LIQUID CHROMATOGRAPHY. APPLICATION OF TLC TO THE SEPARATION OF DYES

The main types of liquid chromatography are described, following three different classifications: according to the stationary phase, according to the phenomena which occur in the separation and according to the operative method. The thin layer chromatography (TLC) is studied in more detail since it is a very simple technique from the point of view of experimental procedure as also from the equipment and material required. The thin layer chromatography (TLC) is applied to the separation of the diverse dyes

Les principales modalits de chromatographie en phase liquide sont dcrites, en suivant trois classifications diffrentes: d'aprs la phase stationnaire, d'aprs les phnomnes qui interviennent dans la sparation et d'aprs la mthode d'opration. La chromatographie sur couche mince (TLC) est tudie avec plus de dtail, car il sagit dune technique trs simple, tant du point de vue de procdure exprimentale comme de l'outillage employ. La chromatographie sur couche mince (TLC) est applique la sparation de divers colorants contenus dans 6 teintes commerciales et l'identification du groupe de teinture de ces colorants. Les rsultats obtenus indiquent que la plupart des teintes tudies sont composes par 35 colorants, principalement de type dispers. Cette technique chromatographique est trs utile du point de vue qualitatif. Aussi, dans quelques cas concrets, elle permet de slectionner l'luent le plus appropri pour une analyse quantitative postrieure par chromatographie liquide haute rsolution (HPLC).
Mots cls: Chromatographie, chromatographie liquide, chromatographie sur couche mince, TCL, teintes, colorants disperss

M.C. Gutirrez Bouzn, Dra. en Qumica, Investigadora de la Universidad Politcnica de Catalunya, en el Laboratorio de Control de la Contaminacin Ambiental, INTEXTER (U.P.C.)

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1.

INTRODUCCIN

La cromatografa es un mtodo de anlisis rpido que permite separar los constituyentes de una mezcla utilizando las diferencias de estas sustancias entre sus constantes de equilibrio durante su distribucin entre una fase mvil y una fase denominada estacionaria que ejerce sobre ellas un efecto retardador. Esta operacin elemental de distribucin se repite un gran nmero de veces de una forma continua. Bajo la influencia de dos efectos antagnicos, efecto de arrastre ejercido por la fase mvil y efecto de retencin ejercido por la fase estacionaria, los constituyentes de la mezcla se desplazan a velocidades diferentes y se separan. Los mtodos cromatogrficos se dividen en dos grandes grupos: cromatografa lquida, si la fase mvil es un lquido (denominado eluyente) y cromatografa de gases, cuando la fase mvil es un gas. Mucho ms reciente y menos extendida es la cromatografa de fluidos supercrticos, en la cual el fluido trabaja por encima de su presin y temperatura crticas. La cromatografa lquida fue la primera en aparecer cronolgicamente. Fue utilizada por primera vez en 1903-1906 por el botnico ruso Mikhail Tswett para separar los componentes coloreados de un extracto de plantas. Pero tuvieron que pasar 25 aos para que este descubrimiento fuera plenamente apreciado y desarrollado. En las primeras aplicaciones, el procedimiento se limit a la separacin de sustancias coloreadas, de ah el nombre de la tcnica. La cromatografa lquida se puede clasificar de tres maneras diferentes: 1) Segn la naturaleza de las fases estacionarias La fase estacionaria puede ser un slido con propiedades adsorbentes (CLS: cromatografa lquido-slido), un lquido que impregna un slido (CLL: cromatografa lquido-lquido), un lquido que solvata un slido formando parte integrante de l (CLG: cromatografa lquido-gel), o bien un slido en cuya superficie se enlazan qumicamente las molculas apropiadas (BPC: cromatografa de fases qumicamente ligadas o "bonded phase chromatography"). 2) Segn la naturaleza de los fenmenos que intervienen en la separacin - Cromatografa de adsorcin cuando la fase estacionaria es un slido adsorbente (CLS) y la separacin se basa en las diferencias de adsorcin de las molculas en esta fase. - Cromatografa de reparto cuando la separacin se basa en las diferencias de solubilidad de las molculas a separar en la fase lquida que impregna la slida (CLL) o bien en las diferencias de interaccin con las molculas ligadas sobre el slido (BPC). - Cromatografa de intercambio inico: la fase estacionaria es un slido capaz de intercambiar

iones de su estructura por otros iones de la fase mvil. - Cromatografa de par inico (PIC): se forman pares de iones entre los constituyentes (ionizados) de la mezcla a separar y un contrain adecuado que se aade a la fase mvil. Los pares inicos formados son los que se distribuyen entre la fase mvil y la estacionaria. - Cromatografa de intercambio de ligandos. La fase estacionaria contiene una especie capaz de formar complejos con los solutos a separar. - Cromatografa de exclusin denominada tambin cromatografa de permeacin sobre gel (GPC): La fase estacionaria es un slido poroso cuya dimensin de los poros es similar a las dimensiones de ciertas molculas a separar. Las molculas grandes no pueden penetrar en los poros y se excluyen de la fase estacionaria, siendo eludas primero. Las que pueden penetrar en los poros se eluyen ms tarde. 3) Segn el mtodo de operativo - Cromatografa en columna clsica - Cromatografa de superficie (cromatografa de capa fina y cromatografa sobre papel). - Cromatografa lquida de alta resolucin (CLAR o HPLC, "high performance liquid chromatography"). Se utilizan bombas de alta presin para impulsar la fase mvil lquida a travs de la fase estacionaria dispuesta en columnas relativamente cortas rellenas con partculas de pequeo tamao. La resolucin que se consigue con esta tcnica es muy elevada, aunque la instrumentacin requerida es mucho ms compleja y costosa.

1.1.

La cromatografa de capa fina

Esta tcnica es un tipo de cromatografa lquida en la cual la fase estacionaria es una capa uniforme y homognea aplicada sobre un soporte inerte (generalmente plstico). Tambin se utiliza el trmino de "cromatografa plana" que engloba la cromatografa de capa fina y la cromatografa en papel. Normalmente se emplean adsorbentes como fases estacionarias, aunque tambin se pueden emplear fases qumicamente ligadas. Actualmente, se suelen utilizar placas prefabricadas de dimensiones 20 cm x 20 cm. Son lminas relativamente rgidas que se recortan con tijeras a la medida requerida. La tcnica operativa consiste en los siguientes pasos: 1) Recortar la placa a la medida adecuada. 2) Depositar sobre la placa una gota de los componentes a separar con la ayuda de un capilar a una distancia de 1 cm del extremo de la placa. Esta operacin es particularmente delicada, pues es importante que la gota depositada no se extienda. Tambin debe tomarse la precaucin de no tocar la fase estacionaria con el extremo del capilar para no

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3)

4) 5)

6)

separarla del soporte. Si la muestra a analizar es muy diluida, se coloca una gota encima de otra, sucesivas veces, hasta alcanzar una mayor concentracin. Debe tenerse la precaucin de dejar evaporar el disolvente entre cada aplicacin. El secado puede acelerarse mediante un secador de mano, si los componentes a analizar no son voltiles. Introducir la placa en un recipiente hermtico, previamente acondicionado con el eluyente seleccionado. Generalmente, se trata de cmaras de vidrio rectangulares diseadas para este fin, en las cuales las placas se depositan de forma ligeramente inclinada. Algunas de ellas disponen de un soporte que permite mantener las placas totalmente verticales. Se mantiene la placa en la cmara el tiempo necesario para que se produzca la elucin de la muestra. Se extrae la placa de la cmara y se deja secar al aire. Si las diferentes sustancias separadas son incoloras, debe procederse a determinar su posicin relativa mediante un mtodo de revelado (con luz ultravioleta o con reactivos qumicos especficos para las sustancias analizadas). En el caso de colorantes, este paso se omite. En caso necesario, se procede a la determinacin del Rf de las sustancias separadas, parmetro que caracteriza la migracin de un soluto (abreviacin de "factor rate") definido por:
Rf = distancia recorrida por el soluto distancia recorrida por el frente del disolvente

para evitar su extensin. Las placas se colocaron dentro del recipiente en posicin vertical con una muy ligera inclinacin. Una vez finalizado el proceso cromatogrfico, se dejaron secar al aire y se procedi a la comparacin de los resultados. No se determin el Rf de cada uno de los colorantes separados, por no disponer de patrones de los mismos.

3.

RESULTADOS Y DISCUSIN

Las diferentes separaciones cromatogrficas obtenidas se muestran en las figuras 1-5. Con el eluyente A (adecuado para colorantes cidos) la distancia recorrida por los colorantes es casi idntica al frente del eluyente (figura 1). A pesar de que la separacin obtenida es muy baja, se puede apreciar la presencia de 2-4 colorantes en cada tinte. El tinte 2 presenta una separacin mejor que los dems tintes.

El Rf de las sustancias separadas permite la identificacin de las mismas por comparacin con el Rf correspondiente a los patrones de los compuestos identificados.

FIGURA 1: Separacin de los colorantes mediante el eluyente A El eluyente B (para colorantes directos) muestra tambin una falta de selectividad para los diferentes tintes (figura 2). Nuevamente, es el tinte 2 el que tiene un comportamiento diferenciado del resto, ya que se aprecia una mejor separacin de sus componentes. El eluyente C (adecuado para separar colorantes bsicos) no mejora los resultados obtenidos en los dos casos anteriores (figura 3). Al observar todas placas obtenidas, se observa que las mejores separaciones las proporcionan los eluyentes D y E (figuras 4 y 5). Estos dos eluyentes son apropiados para separar colorantes dispersos. A su vez, la separacin de los distintos componentes de los tintes es mejor con el eluyente D que con el E.

2.

EXPERIMENTAL
se prepararon las

Como eluyentes, siguientes mezclas: A) B) C) D) E)

acetato de butilo - piridina - agua 40+40+20 n-propanol - hidrxido amnico 60+30 n-butanol - etanol - agua 90+10+10 cloroformo - acetona 90+10 cloroformo- metanol 95+5

Se estudi el comportamiento frente a estos eluyentes de 6 tintes comerciales, constituidos por diferentes mezclas de colorantes. En todos los casos, se emplearon placas cromatogrficas comerciales recubiertas con slica gel G. La separacin se llev a cabo en un recipiente de vidrio previamente acondicionado. Se depositaron las gotas de los 6 tintes sobre cada una de las placas y se secaron con la ayuda de un secador,

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FIGURA 2: Separacin de los colorantes mediante el eluyente B

FIGURA 5:. Separacin de los colorantes mediante el eluyente E La informacin obtenida a partir de los distintos eluyentes se recopila en la tabla 1. Se observa que los tintes estn compuestos como mnimo por 3 colorantes (tinte 6), aunque en algunos se consiguen separar hasta 6 colorantes distintos (tinte 4). En los dems tintes, se detecta la presencia 4-5 colorantes. TABLA 1 Colorantes separados en el anlisis de los tintes por capa fina (TLC). FIGURA 3: Separacin de los colorantes mediante el eluyente C
TINTE 1 A Rojo Amarillo Pardo Rojo Azul Violeta Naranja Amarillo Amarillo Pardo Naranja Azul Rojo Pardo Azul Naranja Amarillo B Amarillo Pardo C Amarillo Pardo D Violeta Amarillo Azul Pardo Naranja Azul Rojo Azul Violeta Rojo Amarillo Rojo Naranja Azul Rojo Amarillo Pardo Violeta Naranja Rojo Azul Rojo Pardo Amarillo Rojo Naranja E Rojo Amarillo Pardo Naranja Rojo Rojo

Rojo Rojo Violeta Naranja Amarillo Rojo Pardo Amarillo

Rojo Azul

Amarillo Naranja Amarillo Pardo

Rojo Amarillo Amarillo Naranja Azul Rojo Amarillo Pardo Naranja Rojo Rojo Azul Naranja Pardo Rojo Amarillo Naranja

Rojo Pardo

Pardo Rojo

FIGURA 4: Separacin de los colorantes mediante el eluyente D

Naranja Amarillo

Naranja Amarillo

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Se puede apreciar adems que los tintes 3 y 6 tienen una composicin bastante similar, aunque en el primero se identifica una pequea cantidad de un amarillo adicional. Por otra parte, algunos de los colorantes separados son comunes a varios tintes, ya que el color de la mancha obtenida y su posicin en la placa cromatogrfica es la misma. En lo que respecta a la clase tintrea de los colorantes que componen los tintes estudiados, es muy probable que se trate mayoritariamente de colorantes dispersos, pues la separacin obtenida es notablemente mejor con los eluyentes especficos de este tipo de colorantes (D y E). Sin embargo, los componentes del tinte 2 muestran tambin una separacin aceptable con los eluyentes A y B, por lo que podran contener colorantes cidos y/o directos. Nota: Pueden solicitarse copias de las figuras en color en la siguiente direccin de correo electrnico: gutierrez@intexter.upc.es

3.1.

Extrapolacin de los resultados de cromatografa en capa fina a HPLC

Al comparar la cromatografa en capa fina con la cromatografa lquida de alta resolucin, se aprecia que ambas tcnicas presentan unas caractersticas muy diferenciadas: La cromatografa en capa fina es una tcnica muy sencilla, para la cual slo se requiere en general un material elemental, muy asequible econmicamente, mientras que la instrumentacin utilizada en cromatografa lquida de alta resolucin es mucho ms compleja y en consecuencia, notablemente ms costosa. En HPLC, el gasto de eluyente es mucho mayor, ya que ste fluye continuamente a travs de la columna, la cual debe acondicionarse antes del anlisis y limpiarse al final del mismo. En cromatografa de capa fina, las cantidades de eluyente empleadas son de unos pocos mililitros. Adems, se pueden analizar varias muestras simultneamente, tantas como permita la anchura de la placa. En contrapartida, el anlisis cuantitativo es mucho fcil en HPLC, ya que la cuantificacin en cromatografa de capa fina presenta dificultades considerables. As mismo, la HPLC es una tcnica ms automatizada, mientras que la capa fina es un mtodo en el cual slo se pueden automatizar cada una de las etapas individualmente. Es evidente que, en general, las prestaciones de la HPLC son mayores que las de la cromatografa en capa fina. Sin embargo, en muchas ocasiones resulta ms ventajoso recurrir a esta ltima tcnica, ya que, como se ha indicado anteriormente, el material requerido es extremadamente simple. Adems, la existencia en BOLETN INTEXTER (U.P.C.) 2002. N 122

el mercado de capas finas de slice qumicamente ligadas (bonded phases) ha ampliado notablemente el campo de aplicacin de esta modalidad de cromatografa, puesto que ya no slo pueden efectuarse separaciones por cromatografa de adsorcin, sino tambin por cromatografa de reparto y por cromatografa de pares inicos. En consecuencia, frente a una mezcla de compuestos desconocidos o bien cuando se trata de mezclas muy complejas, antes de proceder a una separacin por HPLC puede resultar muy til un estudio inicial por cromatografa de capa fina. La extrapolacin de resultados de una tcnica a otra ha sido comprobada en numerosas separaciones. Cualitativamente, es posible calcular a priori los tiempos de retencin de HPLC a partir de los valores de Rf de capa fina. Para ello, es necesario calcular previamente el coeficiente de extrapolacin, analizando una misma sustancia patrn con las dos tcnicas. Sin embargo, para que esta extrapolacin sea cuantitativa es necesario que numerosas condiciones sean respetadas (fases estacionarias y mviles rigurosamente idnticas, separacin de solutos de una misma familia qumica, condiciones de saturacin de las placas reproducible, etc). Por todo ello, la extrapolacin debe plantearse nicamente desde un punto de vista cualitativo, como una etapa previa para facilitar la seleccin de la fase mvil. En el caso de los tintes estudiados, una separacin por HPLC permitira cuantificar cada uno de los colorantes separados, a condicin de disponer de patrones de los mismos. Si se utiliza una columna de slica gel y uno de los eluyentes estudiados (D o E, preferentemente) se obtendra un cromatograma con tantos picos como colorantes identificados por capa fina. El rea de los picos cromatogrficos sera funcin del flujo de eluyente que pasa a travs de la columna y de la longitud de onda seleccionada en el detector (cuando se emplea un detector de absorbancia). Si se requiere un anlisis de todos los colorantes, debe seleccionarse una longitud de onda comn a todos ellos (probablemente 254nm, ya que son compuestos aromticos). En caso de superposicin de picos o de concentraciones de colorante muy bajas, puede ser interesante efectuar tambin otras detecciones adicionales a las longitudes de onda del espectro visible caractersticas de los propios colorantes a analizar. Otra opcin mejor consiste en utilizar un detector diode array, el cual registra el espectro completo de UV-visible en cada punto del cromatograma.

4.

CONCLUSIONES

4.1. La cromatografa de capa fina (TLC) es una tcnica muy simple, que presenta una gran utilidad en separaciones de compuestos para llevar a cabo un anlisis cualitativo.

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4.2. Resulta particularmente til en la separacin de colorantes, puesto que al tratarse de sustancias detectables a simple vista, no se requiere la etapa de revelado de las manchas. 4.3. En los tintes comerciales estudiados, esta tcnica ha permitido detectar la presencia de hasta 6 colorantes distintos en una misma formulacin y comparar los constituyentes de los diferentes tintes. 4.4. Dado que la cuantificacin de los compuestos separados por TLC presenta una dificultad notable, los resultados obtenidos por esta tcnica pueden emplearse como etapa previa a un estudio por HPLC.

6
1. 2. 3.

BIBLIOGRAFA
R.Rosset, M.Caude, A.Jardy. Manuel pratique de chromatographie en phase liquide. Masson, Pars, 374p. (1982) M. Lpez-Mesas. Tesis doctoral. Universitat Politcncia de Catalunya (UPC), Terrassa (2002). J.M.Casas, J.Garca, J.M:Guadayol, J.Oliv. Anlisi instrumental 2: Cromatografa i electroforesi. Edicions UPC, Barcelona, 250p.(1994). E.Stahl. Thin- Layer Chromatography: A Laboratory Handbook. Springer-Verlag, Berlin, 1041p. (1969). J.Sherma. Thin-Layer Chromatography. In R.A. Meyers. Encyclopedia of analytical Chemistry). Wiley, Chichester (2002). T.Cserhati, E.Forgacs. Trends in Thin Layer Chromatography. J.Chromatogr. Sci., 35, 383-391 (1997).

4. 5.

5.

AGRADECIMIENTOS
6.

La autora agradece a la Sra. Montserrat Raspall la realizacin de las fotografas de las placas cromatogrficas.

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