UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

Facultad de Ingeniera Qumica e Industrias Alimentaras Escuela Profesional de Industrias Alimentaras

ASIGNATURA: NUTRICION HUMANA TEMA:
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

DOCENTE:

Pacherres Mogollon Leoncio

ALUMNO:

SANDOVAL BANCES RICARDO.

CICLO:

2009 II

Lambayeque 21 de Abril del 2010

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

INTRODUCCIN En las clulas de los organismos vivos se producen numerosas reacciones qumicas de sntesis y degradacin de un gran nmero de sustancias. La mayor parte de estos procesos son efectuados por la accin de molculas orgnicas que catalizan dichas reacciones y se denominan enzimas (E). Un catalizador es una sustancia que acelera reacciones qumicas. Su presencia permite que las reacciones qumicas se produzcan a una dada velocidad, en el interior de las clulas a temperaturas normales del organismo (comparativamente bajas), con moderada concentracin inica y dentro de lmites estrechos de pH. La estructura de una enzima no se modifica al final de una reaccin, por lo que puede ser utilizada en forma reiterada. Generalmente poseen un alto grado de especificidad por el sustrato (S), es decir, cada enzima reconoce y acta sobre una molcula determinada un nmero de molculas determinadas (sustrato). Son efectivas en bajas concentraciones. La actividad enzimtica est regulada principalmente por los siguientes factores: concentracin de la enzima, concentracin del sustrato, temperatura y pH del medio. El propsito de este trabajo prctico es evaluar la actividad de una enzima y analizar los factores que intervienen en su actividad.

I. OBJETIVOS El propsito de este trabajo prctico es evaluar la actividad de una enzima y analizar los factores que intervienen en su actividad. II. FUNDAMENTO El mtodo se basa en la hidrlisis del almidn (sustrato), en condiciones de pH y temperatura fisiolgicos, por accin de una amilasa presente en la saliva. Los productos de reaccin son polisacridos de menor peso molecular hasta llegar a disacridos (maltosa), no evidenciables con el reactivo de Lugol (pero s con Benedict).

(*) S + E [SE] P + E
La -Amilasa: Es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la degradacin del almidn, que es un polisacrido de reserva vegetal. El almidn esta formado por dos tipos de molculas: la amilosa y la amilopectina, ambos polisacridos de glucosa. La amilosa se conforma por cadenas lineales de glucosas unidas por enlaces a- C1-C4, mientras que la amilopectina tiene, adems de estos ltimos enlaces, uniones C1 con C6, formando cadenas ramificadas. La -amilasa rompe uniones C1-C4, tanto en la amilasa como en la amilopectina, dejando dextrinas lineales y ramificadas (oligosacaridos) como productos. Para medir la actividad enzimtica de la -amilasa: Se utilizara un test LUGOL que detecta el almidn, ya que el almidn en presencia de esta solucin adquiere una coloracin azulada caracterstica. Esto tiene una explicacin fsica: el iodo se coloca en el interior de la hlice que forma la amilosa (en las regiones hidrofobicas), formando un complejo de color azul. Cuando la -amilasa acta, degrada la amilosa, se desintegra la hlice y por tanto en presencia de Lugol ya no dar una coloracin azul.

El almidn y dextrinas complejas al ser tratados con una solucin de yodo dan un complejo de coloracin azul, mientras que las dextrinas ms simples, la maltotriosa y maltosa no dan una reaccin positiva. As, la accin de la amilasa sobre polisacridos puede ser seguida midiendo la decoloracin del complejo azul hasta alcanzar el punto acrmico (solucin incolora). La maltosa y otros carbohidratos reductores producidos en la reaccin pueden ser detectados por el test de Benedict. Este mtodo es cualitativo, consiste en una solucin alcalina de Cu2+ que se encuentra formando un complejo con

citrato. El in cprico es reducido a Cu1+ por compuestos reductores con formacin de hidrxido cuproso amarillo o de xido cuproso rojo. El cambio de coloracin o la formacin de un precipitado rojo-ladrillo (Cu2O) indica la presencia de un compuesto reductor. Carbohidratos reductores tambin pueden detectarse y cuantificarse por los ensayos de Somogyi-Nelson y de la o-toluidina.

Prueba de Benedict Algunos azcares tienen la propiedad de oxidarse en presencia de agentes oxidantes suaves como el ion Fe3+ o Cu2+. Esta caracterstica radica en la presencia de un grupo carbonilo libre, el cual es oxidado y genera un grupo carboxilo. Por lo tanto, aquellos azcares con un grupo carbonilo libre son llamados azcares reductores y aquellos en los que el grupo carbonilo se encuentra combinado en unin glicosdica se conocen como azcares no ductores. Existen varias reacciones qumicas que permiten determinar si se est en presencia de un azcar reductor o no. La prueba de Benedict es una de ellas y se basa precisamente en la reaccin o no de un azcar con el ion Cu 2+. El reactivo de Benedict contiene soluciones de carbonato de sodio, sulfato de cobre, y citrato de sodio. El Na2CO3 confiere a la solucin un pH alcalino necesario para que la reaccin pueda llevarse a cabo. El citrato de sodio mantiene al ion Cu2+ en solucin ya que tiene la propiedad de formar complejos coloreados poco ionizados con algunos de los metales pesados. Con el cobre produce un complejo de color azul. Si se le agrega al reactivo una solucin de azcar reductor y se calienta hasta llevar la mezcla a ebullicin, el azcar en solucin alcalina a elevadas temperaturas se convertir en D-gluconato y su ene-diol, rompindose luego en dos fragmentos altamente reductores, los cuales con sus electrones expuestos, reaccionarn con el Cu++. Se obtiene entonces un azcar oxidado y dos iones Cu+. Posteriormente el Cu+ producido reacciona con los iones OH- presentes en la solucin para formar el hidrxido de cobre: Cu + + OH - Cu(OH) (precipitado amarillo) El hidrxido pierde agua 2Cu(OH) Cu2O (precipitado rojo ladrillo) + H2O La aparicin de un precipitado amarillo, anaranjado, o rojo ladrillo evidencia la presencia de un azcar reductor.

Prueba de yodo para Almidn El polisacrido almidn est constituido de dos polmeros, amilosa y amilopeptina. La amilosa est constituida de largas cadenas lineales de glucosa unidas en enlace glicosdico alfa 1,4 (Figura). Estas cadenas no poseen un tamao determinado sino que pueden variar desde unos miles de unidades de glucosa hasta un milln. Por otro lado, la amilopeptina posee, al igual que la amilosa, cadenas lineales de glucosa unidas en enlace alfa 1,4 pero adems posee una gran cantidad de ramificaciones, las cuales se presentan cada 24 a 30 residuos de glucosa y en enlace glicosdico alfa 1,6.

El almidn es la molcula de reserva energtica en las plantas por excelencia. Debido a que muchos organismos superiores poseen las enzimas necesarias para su degradacin, este polmero puede ser convertido durante el proceso de digestin en diferentes intermediarios metablicos que generan energa. El glucgeno a su vez es la contraparte del almidn en el reino animal, con la diferencia de que esta molcula posee una mayor cantidad de ramificaciones que el almidn y es ms compacta. La conformacin de los enlaces alfa 1,4 presentes en estas molculas causa que estos polmeros asuman una estructura helicoidal muy estrecha. La prueba del almidn: es una prueba muy sencilla pero que todava se utiliza para determinar la presencia de almidn en algunos alimentos. La prueba se basa en una reaccin fsica y no qumica, en la cual el almidn reacciona con el yodo para formar un complejo de color azul intenso. Bajo las mismas condiciones, el glucgeno da una coloracin caf.

III. MATERIALES:
Agua destilada Solucin de almidn. Solucin Buffer(NaCl) Enzima (amilasa) Gradillas con tubos de ensayo Termmetro Reloj Bao mara(35C) Pipetas de 2, 5 y 10 Ml. Tubos de ensayo Reactivo de Benedict. Lugol. IV. METODOLOGIA: Se tomo dos tubos de ensayo, al primer tubo se le llamara tubo 1 y al segundo tubo 2. A ambos tubos 1. 2. 3. 4. A ambos tubos se le agregara 0.5 ml de solucin de almidn (amilo). Adicionar 1ml de solucin Buffer, medir en pH de la solucin, agitar bien. Adicionar 1 ml de agua destilada. Llevar ambos tubos a bao maria a 35C por 5min.

Solo a tubo 2 5. Luego se agrega la enzima 0.5ml solo al tubo 2 en este caso la amilasa.

A ambos tubos 6. Nuevamente llevar ambos a bao maria a 37 C por 10 min.

Solo a tubo1 7. Retirar de bao maria y al tubo 1 se agrega la solucin de Lugol para presenciar la presencia de almidn.

Solo a tubo 2 8. Y al tubo 2, separar en dos tubos de ensayo para que a una se le adicione Lugol y al otro el reactivo de Benedict.

Con Solucin De Lugol

Con Reactivo Benedict

V. RESULTADOS: TUBO 1 TUBO 2

PRESENCIA DE ALMIDON
prueba del Lugol HAY PRESENCIA DE ALMIDON NO HAY PRESENCIA DE ALMIDON,

PRESENCIA DE AZUCARES
Reactivo de Benedict

--------SI AZUCARES (GLUCOSA, MALTOSA, ETC.)

Formacin de complejo enzimtico

NO NO HAY CATALISIS

SI HAY CATALISIS

VI. CONCLUSIONES
1. En el caso del tubo 1, como no se agrego -amilasa ,por lo tanto no degrado el almidn, y en presencia del Lugol dar una coloracin azul, indicando que no hubo actividad enzimtica sobre el almidn. 2. En el caso del tubo 2, cuando la -amilasa acta, degrada el almidn, se desintegra la hlice y por tanto en presencia de Lugol ya no dar una coloracin azul, indicando que no hay la presencia de almidonen la solucin.

3. En el caso del tubo 2, La aparicin de un color amarillo, anaranjado, o rojo ladrillo evidencia la presencia de un azcar reductor, producto de la actividad enzimtica de la -amilasa sobre el almidn, y por lo tanto hay
un complejo enzimtico formado. 4. La prueba del almidn se basa en una reaccin fsica y no qumica, en la

cual el almidn reacciona con el yodo para formar un complejo de color azul intenso.

VII. DISCUSIONES:

Como la a actividad enzimtica est regulada principalmente por los factores: concentracin de la enzima, concentracin del sustrato, temperatura y pH del medio, se debe tener cuidado el la incubacin en bao maria ya que a temperatura mayores a 37 C se podra desactivar las enzimas.
VIII. BIBLIOGRAFIA: 1. ALBERTS, B., BRAY, D., LEWIS, J., RAFF, M., ROBERTS, K., WATSON J.D. 1992. Biologa molecular de la clula. Ediciones Omega, S.A., Barcelona. 1300 pp. 2. CURTIS, H., BARNES, N.S. 2000. Biologa. 6 Ed. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires. 1498 pp. 3. DE ROBERTIS, E.M.F., HIB, J., PONZIO, R. 1996. Biologa celular y molecular de Eduardo D.P. De Robertis. 12 Ed. El Ateneo. Buenos Aires. 469 pp. 4. DE ROBERTIS, E.D.P., DE ROBERTIS, E.M.F. 1991. Biologa celular y molecular. 11 Edicin. El Ateneo. Buenos Aires. 628 pp. 5. PURVES, W.K., SADAVA, D., ORIANS, G.H., HELLER, G.H. 2003. Vida. La Ciencia de la Biologa. 6 Ed. Editorial Mdica Panamericana, Bs. As. 1133 p. 6. SOLOMON, E.P., BERG, L.R., MARTIN, D.W., VILLEE, C. 1996. Biologa de Villee. 3 Ed. Interamericana Mc. Graw-Hill. Mxico. 1193 pp.