IL PROGETTO GENOMA UMANO

Nature 431, 931 - 945 (21 October 2004); doi:10.1038/nature03001

Finishing the euchromatic sequence of the human genome

INTERNATIONAL HUMAN GENOME SEQUENCING CONSORTIUM

A list of authors and their affiliations appears in the Supplementary Information

Correspondence and requests for materials should be addressed to F .S. Collins

(fc23a@nih.gov), E. S. Lander (lander@broad.mit.edu), J. Rogers (jrh@sanger.ac.uk)
or R. H. Waterston (waterston@gs.washington.edu).
The sequence described here has been deposited in public databases, with the 24
human chromosomes having accession numbers NC000001 to NC000024.

The sequence of the human genome encodes the genetic instructions for human physiology, as
well as rich information about human evolution. In 2001, the International Human Genome
Sequencing Consortium reported a draft sequence of the euchromatic portion of the human
genome. Since then, the international collaboration has worked to convert this draft into a
genome sequence with high accuracy and nearly complete coverage. Here, we report the result
of this finishing process. The current genome sequence (Build 35) contains 2.85 billion
nucleotides interrupted by only 341 gaps. It covers 99% of the euchromatic genome and is
accurate to an error rate of 1 event per 100,000 bases. Many of the remaining euchromatic gaps
are associated with segmental duplications and will require focused work with new methods.
The near-complete sequence, the first for a vertebrate, greatly improves the precision of
biological analyses of the human genome including studies of gene number, birth and death.
Notably, the human genome seems to encode only 20,000–25,000 protein-coding genes. The
genome sequence reported here should serve as a firm foundation for biomedical research in the
decades ahead.
 LA MAPPA FISICA DEL GENOMA

Si usano vettori ad inserti lunghi (es. Library in YAC)

Per prima cosa, si determinano i CONTIG, cioè

set di cloni che si sovrappongono parzialmente.
Via via che l’assemblaggio va avanti, i contig
diventano equivalenti ad un unico cromosoma

Il processo è agevolato se,

invece di digerire tutto il
DNA genomico, si digerisce Fluoroforo 1: AT
il DNA di uno specifico tipo di Fluoroforo 2: GC
cromosoma, separato mediante
FACS
 Come si assemblano i contig?

DETERMINAZIONE DELL’ORDINE ATTRAVERSO Sequence-Tagged Sites

(STS) E EST

STS: corta sequenza di DNA UNICA che viene ottenuta da inserti clonati più lunghi (es: genoteca in fago λ).
λ)

Si disegnano coppie di primers per PCR in grado di amplificare ciascuna TAG

La presenza di un amplificato
indica che nel clone da YAC
è presente la TAG
Se uno stesso amplificato compare
in due diversi cloni da YAC vuol dire
che si sovrappongono e si costituisce
il contig
IL SEQUENZIAMENTO AUTOMATIZZATO DEL DNA
 Un
Un esempio:
esempio: ilil clonaggio
clonaggio ee la
la mappatura
mappatura del
del cromosoma
cromosoma

Y
Purificazione di cromosomi Y mediante FACS

Digestione Digestione più incompleta

Genoteca in cloni di YAC

Genoteca in cloni di fago λ
(10368 cloni; inserti ≈650 kb
Ogni regione rappresentata in
media 4 volte)
Sequenziamento parziale e disegno
di coppie di primers per STS
(160 paia di primers)
Suddivisione in 18 pool
e amplificazione con le
coppie di primers

Ulteriore suddivisione dei pool

positivi fino ad assegnare una
STS ad uno YAC
Sequenziamento dei cloni=
sequenziamento del cromosoma
L’attribuzione del contenuto totale
Di STS di ogni YAC permette
La sovrapposizione e l’allineamento
nei contig
La tecnica della PCR, unitamente alle recenti acquisizioni sulla sequenza del genoma umano,
consente di clonare direttamente un gene specifico, senza bisogno di costruire delle genoteche

-Devono essere note le sequenze che fiancheggiano la regione da clonare

-La regione da clonare non deve essere troppo lunga
I VETTORI DI ESPRESSIONE
 L’ESPRESSIONE DI UN GENE CLONATO

Produzione di proteine di Studio della funzione

Interesse commerciale, di una proteina
(farmacologico, terapeutico,
Industriale, ecc.)

VETTORE DI ESPRESSIONE

E’ un vettore di clonazione
Deve permettere, sia la TRASCRIZIONE (=PROMOTORI
trascrizionali),
sia la TRADUZIONE (=SITO DI ATTACCO DEL RIBOSOMA)
del gene
-GLI OSPITI FINALI PIÙ COMODI PER LA PRODUZIONE COMMERCIALE
SONO I BATTERI, IN PARTICOLARE E.coli.

PROTEINE RICOMBINANTI IMPORTANTI PER L’USO TERAPEUTICO UMANO PRODOTTE IN E. coli E APPROVATE DALL’FDA

Categoria terapeutica Prodotto Indicazioni in breve

Ormone di interesse terapeutico Insulina umana Trattamento del diabete

Insulina glargine
Insulina lispro Derivati dell’insulina
mutagenizzati
Insulina glucolisine
Somatotropina Trattamento delle deficienze
della crescita

Fattori di crescita ematopoietici Filgrastim Derivato del G-CSF

Riduzione della durata della neutropenia
e dell’incidenza della neutropenia
febbrile in pazienti neoplastici trattati
con chemioterapici citotossici

Agenti trombolitici Reteplase Derivati dell’attivatore del

plasminogeno. Infarto miocardico
Saruplase acuto

Interferoni umani Interferone alfa-2b Trattamento di: leucemia a hairy cells; epatite
cronica B e C; AIDS; cancro

Interferone beta 1-b Trattamento della sclerosi multipla

Interferone gamma Trattamento della granulomatosi cronica

Interleuchine umane IL-2 Carcinoma renale

IL-11 Trattamento della trombocitopenia
COME SI CONVINCE UN BATTERIO A PRODURRE UNA PROTEINA DI
ORIGiNE EUCARIOTA??

1) Il gene deve essere sotto forma di cDNA

2) Bisogna adattare l’accoppiata cDNA/vettore in modo da

consentire al batterio di effettuare la trascrizione e la
traduzione

-Promotore
-Inizio della trascrizione RNAm
-Terminazione della trascrizione
-Inizio della traduzione proteina
L’inizio e la fine della trascrizione sono molto diversi nei batteri e negli eucarioti

NUCLEO (β
β,β , 2α)
2α)
I batteri hanno un’unica RNA polimerasi
Fattore σ

Il nucleo dell’RNA pol ha bassa processività

Il fattore σ riconosce il promotore e induce

RNA polimerasi = l’assocoazione del nucleo dell’RNA pol con il DNA
Nucleo pol + fattore
L’RNA pol trova un segnale di termine
σ
e si stacca dal DNA stampo

L’RNA pol inizia a svolgere il DNA…..

L’RNA pol polimerizza l’RNA rapidamente

(50 NTP/sec) con alta processività

…e comincia a trascrivere (inizio abortivo)

5’ 3’ Il fattore si stacca. L’RNA pol

cambia conformazione
 Segnali di inizio della trascrizione (promotori) nei batteri

Sequenza di consenso

-E’ ad essi (DNA a doppio filamento) che si lega il fattore σ

-Le regioni più conservate (che interagiscono con il fattore σ) sono nelle regioni -10 e -35

-Le alternative nucleotidiche nelle posizioni -10 e -35 determinano la forza con cui il fattore σ si lega
al promotore e quindi la frequenza con cui il gene verrà trascritto.
E’ un meccanismo regolativo
I promotori sono asimmetrici: l’orientamento del promotore indica quale dei
due filamenti di DNA verrà trascritto

La terminazione della trascrizione nei batteri

Segnale di termine (TERMINATORE) del DNA:

E’ costituito da una sequenza simmetrica di DNA seguita da una fila di coppie A-T

Legame debole DNA/RNAm

Forza la pinna ad aprirsi

 L’inizio della trascrizione negli eucarioti

TYPE OF POLYMERASE GENES TRANSCRIBED

RNA polymerase I 5.8S, 18S, and 28S rRNA genes

RNA polymerase II all protein-coding genes, plus snoRNA

genes and some snRNA genes

RNA polymerase III tRNA genes, 5S rRNA genes, some snRNA

genes and genes for other small RNAs

-La RNA-polimerasi II, anche in vitro, non può iniziare a trascrivere senza l’aiuto dei
FATTORI GENERALI DI TRASCRIZIONE

-In vivo, bisogna anche tenere conto del compattamento del DNA nei nucleosomi e in forme
di ordine di struttura superiore
Ingredienti per la trascrizione in vitro in una cellula eucariota

Ingredienti per la trascrizione in vivo in una cellula

eucariota

Più di cento singole subunità!!!

L’allungamento della trascrizione negli eucarioti La terminazione della
è strettamente accoppiata alla modificazione trascrizione negli eucarioti
dell’RNAm è completamente diversa da
quella dei procarioti

La RNA-polII continua a
polimerizzare anche dopo il taglio
dell’RNAm. Come perde la
processività?
BOH?!?
Anche l’inizio della traduzione è diverso tra batteri ed eucarioti
Negli eucarioti il ribosoma riconosce l’AUG in prossimità del cap presente in 5’ dell’RNAm

I°° RNAt
Lega direttamente
Il Cap

Il complesso si sposta
in 5’ 3’ per cercare
il 1°° AUG
Il sito di attacco del ribosoma nei batteri:
le sequenze Shine Dalgarno

5’-AGGAGGU-3’

Segnala al ribosoma la posizione dell’AUG giusto da

cui iniziare la traduzione.

E’ posta a poche basi a monte dell’AUG

Forma coppie di basi con l’rRNA 16S della subunità

30S del ribosoma

Permette l’inizio della traduzione da siti AUG

Interni all’RNAm
 Riassumendo: i batteri

1) Non fanno splicing

2) Hanno promotori diversi (riconosciuti dal fattore σ)
3) Hanno una terminazione della trascrizione diversa
4) Hanno un inizio della traduzione diverso (sequenze Shine-
Dalgarno)

terminatore

Si inganna il batterio utilizzando

il cDNA ed inserendo opportu- pro = promotore batterico
namente le sequenze regolatrici
nel vettore di espressione SD = sequenza Shine-Dalgarno

T= terminatore batterico
T
 COME SI REGOLA L’ESPRESSIONE GENICA NEI PROCARIOTI?

1) La scelta del PROMOTORE

FORTE REGOLABILE

Per produrre tanta proteina Per produrla al momento giusto

Sigma
Factor Promoters Recognized Promoter Consensus
−35 Region −10 Region
σ70 Most genes TTGACAT TATAAT
σ32 Genes induced by heat shock TCTCNCCCTTGA CCCCATNTA
σ28 Genes for motility and chemotaxis CTAAA CCGATAT
σ38 Genes for stationary phase and stress response ? ?
−24 Region −12 Region
σ54 Genes for nitrogen metabolism and other functions CTGGNA TTGCA

Si usano promotori riconosciuti dal fattore σ70

 Alcuni promotori utilizzati nei vettori di espressione per batteri

plac

IPTG (isopropil-b-D-tiogalattopiranoside): induttore gratuito di plac

placUV5: derivato di plac: ha mutazioni in -10 che lo rendono più forte del wild-type
 ptrp

Il fago ha un controllo genetico operone-simile che regola i due stati vitali

PL
cI: repressore di cro, PL e PR
Impedisce la produzione delle proteine
della fase litica

cIts: mutante temperatura-sensibile del repressore cI

28°°C 42°°C
PLinattivo cIts PL attivo
 Come si regola l’espressione genica nei procarioti?

2) IL NUMERO DI COPIE DEL PLASMIDE

ORI1 Sostituzione dell’ORI

ORI2
ORI2

Plasmide con ORI

efficiente

Plasmide efficiente nella regolazione

della trascrizione e traduzione ma con
ORI poco efficiente

Ulteriore incremento dell’espressione

 L’INTEGRAZIONE DEL DNA NEL CROMOSOMA BATTERICO

1) Le cellule possono perdere il plasmide per SOVRACCARICO METABOLICO

Utilizzare marcatori di selezione può essere costoso per preparazioni su larga scala

Fermentatore con unità di dispersione di microbolle

2) I batteri devono essere rilasciati nell’ambiente

 Si effettua per GENE TARGETING

Definizione
Definizione generale
generale
GENE
GENE TARGETING
TARGETING: :pilotare
pilotarelalaricombinazione
ricombinazioneDel
DelDNA
DNAininsiti
sitispecifici
specificidel
delDNA
DNAgenomico
genomico
SiSirealizza
realizzainserendo
inserendonel
nelvettore
vettorenavetta
navettadelle
delleregioni
regionididiomologia
omologiacon
conilil
sito
sitodel
delcromosoma
cromosomainincui
cuisisivuole
vuoleavere
averericombinazione
ricombinazione

≈50bp

-Il gene scelto come sito di ricombinazione non

deve essere essenziale per E. coli

-Il plasmide non si deve poter propagare in

Gene non essenziale
E. Coli (es. ORI di B. subtilis)

-Il promotore deve essere inducibile (controllo

dall’esterno)

Gene non essenziale

 Le PROTEINE DI FUSIONE

1) Diminuire la suscettibilità 2) Agevolare la purificazione 3)Aumentare la solubilità

proteolitica

1) DIMINUZIONE DELLA SUSCETTIBILITA’ PROTEOLITICA

linker
Gene E.coli Gene estraneo

RNAm p. di fusione

Proteasi specifica
 2) AGEVOLARE LA PURIFICAZIONE

Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys

Viene tagliato dall’enterochinasi bovina

es:flag
 3) AUMENTO DELLA SOLUBILITA’

Si ottiene fondendo geni codificanti proteine poco solubili con proteine o peptidi altamente solubili
 La MUTAGENESI SITO-SPECIFICA

Permette di generare cambiamenti della codificazione degli amminoacidi di una proteina

agendo a livello del DNA del gene clonato

Determinazione di residui importanti per processi

Ottenimento di proteine con
quali la regolazione post-traduzionale, il folding
nuove proprietà
proteico, l’interazione con altreproteine, la catalisi
enzimatica, ecc.

MUTAGENESI MIRATA AGLI OLIGONUCLEOTIDI: Permette di introdurre mutazioni puntiformi

-Si deve sapere esattamente l’esatta sequenza nucleotidica della regione del DNA che codifica il
codone dell’RNAm da modificare

-Il tipo di cambiamento che si vuole apportare (es: GCA ACA=ser ala nello studio della p-Ser)

Si usa un oligonucleotide di
sintesi che ha un nucleotide
discordante dove si vuole
mutagenizzare
 LA MUTAGENESI MIRATA AGLI OLIGONUCLEOTIDI CON IL DNA DI M13

Metodo per arricchire il DNA di M13 mutato

Il ceppo dut ung

dUTPasi: abbassa il
livello di dUTP

Uracile-N-glucosilasi:
Rimuove il dUTP
Incorporato nel DNA

ATT CTT
Ile Leu
LA MUTAGENESI MIRATA AGLI OLIGONUCLEOTIDI CON DNA PLASMIDICO

In realtà l’efficienza è bassa

50/50?
METODO PER ARRICCHIRE IN PLASMIDI MUTAGENIZZATI

NaOH

Klenow+T4+lig
 LA MUTAGENESI CASUALE CON INNESCHI OLIGONUCLEOTIDICI
DEGENERATI

Permette di generare tutti i possibili cambiamenti di un amminoacido in un certo sito

Si usa quando non sono note le sostituzioni in grado di modificare la proteina bersaglio

VANTAGGI

Non è necessario conoscere in dettaglio il ruolo

di particolari aminoacidi nel funzionamento
di una proteina

Si possono ottenere mutanti inattesi dotati di

proprietà utili, poiché vengono sostituiti più
amminoacidi