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Bloque II

QBI 2011
BLOQUE 2

Bloque II CATALISIS BIOLGICA: ENZIMAS 1Para sobrepasar la barrera energtica entre reactivos y productos, se debe proveer energa para que la reaccin comience. Esta energa se denomina: a) Energa de activacin c) Energa de reaccin e) Energa potencial b) Energa de iniciacin d) Energa cintica

2- Las enzimas: a) Estn compuestas primariamente de polipptidos, que son polmeros de amino cidos. b) Pueden unirse a grupos prostticos tales como iones metlicos que participan en las reacciones enzimticas. c) Se unen al sustrato en los sitios activos d) Todos los estamentos son ciertos 3- Cul/es de los siguientes estamentos acerca de la velocidad de una reaccin no son ciertos? a) La velocidad de reaccin es la velocidad a la cual la reaccin procede hacia el equilibrio. b) La velocidad de reaccin esta gobernada por la barrera de energa entre reactivos y productos c) Las enzimas pueden acelerar la velocidad de una reaccin d) La velocidad de reaccin no es sensible a la temperatura e) Ninguno 4- Muchas enzimas se inhiben irreversiblemente por iones de metales pesados (Hg2+, Cu2+ o Ag+), los que reaccionan con los grupos sulfhidrilos esenciales para formar mercptidos: Enz----SH + Ag+ Enz----S----Ag + H+

La afinidad de Ag+ por los grupos sulfidrilos es tan grande que la Ag+ puede ser utilizada para titular los grupos SH cuantitativamente. A 10 ml de una solucin 1 mg/ml de enzima pura se le agreg una cantidad suficiente de AgNO3 para inactivar completamente la enzima. Se utilizaron un total de 0.342 umoles de AgNO3. Calcule el peso molecular mnimo de la enzima. Por qu el valor obtenido de esta forma es el PM mnimo? 5- La actividad enzimtica de la lisozima es ptima a pH 5,2. El sitio activo de la lisozima contiene dos amino cidos esenciales para la catlisis: Glu35 y Asp52. Los valores de pKa de los grupos R carboxilos de estos dos residuos son 5,9 y 4,5, respectivamente. Cul es el estado de ionizacin (protonado o deprotonado) de cada residuo al pH ptimo de la lisozima? En funcin del estado de ionizacin de estos dos residuos explique el perfil de actividad-pH que se muestra.

Bloque II 6- Una mutacin produce un cambio de Ala a Val en el interior de una protena, y esto conduce a la prdida de actividad. Sin embargo, la actividad se recupera cuando una segunda mutacin en otra posicin cambia una Ile por Gly. Cmo puede esta segunda mutacin restaurar la actividad? 7- Aunque habitualmente se utilizan mtodos grficos para una determinacin precisa de los parmetros cinticos, estos valores pueden ser estimados simplemente por observacin de los valores de V0 para diferentes concentraciones de sustrato. a- Estime, sin hacer clculos ni grficos, el valor aproximado de V max y Km para una reaccin enzimtica de la que se obtuvieron los siguientes datos: [S] (M) 2,5 x 10-6 4,0 x 10-6 1 x 10-5 2 x 10-5 V0 (M/min) 28 40 70 95 [S] (M) 4 x 10-5 1x 10-4 2 x 10-3 1 x 10-2 V0 (M/min) 112 128 139 140

b- Determine grficamente los valores de Km y Vmax.

8- Dibujar en un mismo grfico las curvas de tiempo que corresponden a los puntos A, B
y C de la curva v = f([S]) que se muestra. Justificar.

9- Sea la reaccin enzimtica: E + S


a- [S]= 0,2M b- [S]= 0,03M c- [S]= 0,03M d- [S]= 2 x 10-4M [E]= E1 [E]= E1

ES E + P, siendo Km= 0.2mM. Suponiendo que la enzima no se inactiva durante la incubacin, dibujar en un mismo grfico las curvas de tiempo correspondientes a las siguientes situaciones:

[E]= E1/2 [E]= E1/2

Bloque II 10- Una determinada cantidad de enzima cataliza, en 15 minutos, la conversin del 0,5 % del sustrato, cuando la concentracin es 0,2M. La misma cantidad da, en el mismo tiempo, 1 % de conversin cuando la concentracin de sustrato es 100 mM. La mitad de la concentracin de enzima cataliza la conversin del 25 % del sustrato, en el mismo tiempo, cuando su concentracin es 1 mM. Cul es, aproximadamente, la Km de la enzima? Rta: Km: 1mM

11- Una reaccin enzimtica E + S ES E + P

tiene una Vm = 20 m/h (aparicin de producto), cuando la concentracin de protenas es 0,2 mg/ml (la concentracin de protenas es una medida de la concentracin de enzima). a- Cunto producto aparecer en 30 minutos con una concentracin de protenas de 0,3 mg/ml, siendo iguales las restantes condiciones?, Por qu? bCunto aparecer en 6 horas?, Por qu? c- Se pueden asegurar los resultados en (a) y (b)?, Qu limitaciones tienen dichos clculos? Rta: a) 15 moles, b) 180 moles 12- Se detect una determinada actividad enzimtica en extractos de hgado y cerebro. Para dilucidar si la actividad detectada era atribuible a la misma enzima o a especies distintas, propias de cada rgano, se llevaron a cabo estudios cinticos con distintos sustratos. Uno de los sustratos, ensayado en idnticas condiciones que incluan 0,1 ml de extracto de cada rgano- present las siguientes velocidades iniciales: Concentracin del sustratod (mol/ml) 1 2 5 10 velocidad (mol P / min x ml ext) hgado cerebro 0,14 0,085 0,23 0,140 0,39 0,230 0,50 0,300

Qu caractersticas de la enzima pueden ser determinadas a partir de estos datos?, cules de ellas son de inters en la relacin con la cuestin de la identidad de ambas actividades?, qu explicaciones encuentra para las diferencias halladas? Qu experiencias sugiere para confirmarlas? 13- En el grfico que se muestra a continuacin, la razn por la cual la curva alcanza un plateau es: a) El sitio activo de la enzima est saturado con sustrato. b) Hay un inhibidor competitivo presente c) Hay un inhibidor no competitivo presente d) Todo el sustrato se ha convertido en producto.

[S]

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14- La reaccin enzimtica

A B es inhibida por la sustancia X. Los estudios cinticos de dicha inhibicin dieron los resultados siguientes: [A] mM 10 10 5 5 2,50 2,50 1,25 1,25 [X] mM 0 10 0 10 0 10 0 10 [B] (mM) 10 min 20 min 0,33 0,65 0,18 0,35 0,25 0,51 0,12 0,24 0,17 0,34 0,08 0,17 0,09 0,18 0,05 0,09 Rta: a) 4,76 mM b) Vm: 0,045 mM/min Vm(i): 0,024 mM/min. c) Ki: 11,43 mM.

abcd-

Calcular la Km para A. Calcular la Vm para las condiciones del estudio. Indicar que tipos de inhibidor es X. Calcular la Ki.

15- En el grfico la curva A fue obtenida a una concentracin de enzima de 0,2 mg/ml; la
B con [E] = 0,4 mg/ml, y la C fue obtenida con [E] = 0,2 mg/ml en presencia de 5 mM de un inhibidor.

a) Dibujar las curvas P = f (t) correspondientes a los puntos 1 a 6. Indicar claramente los cambios de escala. b) Trazar las curvas V-1 en funcin de [S]-1 correspondientes a las curvas A, B y C. c) Calcular el Ki e indicar qu tipo de inhibidor se trata. Rta: Ki: 1,67 mM.

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16- Trabajando con una enzima mikaeliana


se obtuvo el siguiente diagrama Vo vs. [S]: 1- Una parte del diagrama se realiz con una concentracin de enzima = [E]1 y una concentracin de inhibidor [I]1. 2- Otra parte se obtuvo con una concentracin de enzima = [E]1 y una concentracin del inhibidor = [I]1x5. 3- El segmento restante se obtuvo con una concentracin de enzima = [E]1x1,5 y una concentracin de inhibidor = [I]1. Indique en qu condiciones (1, 2, 3) se obtuvieron los segmentos A-B, C-D y E-F, justificando su respuesta e indicando de que tipo de inhibidor se trata. 17- Indique a cules puntos (A, B, C, D, E y F) del grfico v vs [S] corresponden cada una de las curvas (1, 2, 3, 4, 5 y 6) del grfico P vs t. Justifique su respuesta.

18- La enzima X cataliza la reaccin A

B, su comportamiento es michaeliano y la

Km es 1 mM. Se ensayaron distintos volmenes de distintas diluciones de la solucin A, de la cual lamentablemente, no se conoca la concentracin. La mezcla de reaccin contena, adems del sustrato, 2 ml de buffer 40 mM pH 7,5 y 0,8 ml de un sobrenadante de 100000g que contena 25 mg/ml de protena. El volumen de reaccin fue de 5 ml (se obtuvieron completando con H2O destilada). Aprovechando que el compuesto B absorbe a 550 nm (coeficiente de extincin molar = 10 6), fue medida la absorbancia a esa longitud de onda a distintos tiempos directamente en le tubo de reaccin.

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Ensayo n 1 2 3 4 5 6 7

sustrato (A) dilucin volmen 1 0,5 1 0,5 1 0,5 0,1 0 ----------------1/10 1/10 1/100 1/100 1/100

D.O. 550 10 20 0,430 0,427 0,430 0,378 0,267 0,211 0,160 30 0,760 0,754 0,706 0,656 0,433 0,322 0,191 1,090 1,080 1,009 0,933 0,600 0,433 0,100 0,100 0,100 0,100 0,100 0,100 0,100 0,130

aDetermine las concentraciones de buffer , sustrato y protena en cada uno de los ensayos. bCalcule la cantidad de producto formado en 20 en el ensayo 5. Cunto producto se hubiera formado con la misma [A] y en el mismo tiempo con una concentracin de protenas, en el ensayo de 10 mg/ml. cCalcule la Vmax, expresada en umoles de B/ 10 (para un vol. de reaccin de 5 ml), y la Km, expresada en moles de A ( en el mismo volumen de reaccin), para una concentracin de protenas de 8 mg/ml. Rta: a) Buffer: 16 mM; protena; 4 mg/ml; sustrato: 1) 100 Mm 5) 1mM 2) 50 mM 6) 0,5 mM 3) 10 mM 7) 0,1 mM. 4) 5 mM b) Producto (20, 5): 1,66 x 10-3 m; Producto (20, 10 mg/ml): 4,15 x 10-3 m c) Vmax: 3,3 x 10-3 m/10; Km = 1 mM.

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19- Se est estudiando en hojas y semillas de arroz, la actividad enzimtica que cataliza la
reaccin S P. En un primer experimento, se midi actividad enzimtica en ambos tejidos, utilizando distintas concentraciones de S y se determin su desaparicin midiendo la absorbancia a 510 nm (coeficiente de extincin molar de S= 105) directamente en el tubo de reaccin. La mezcla de reaccin contena, adems de extracto y sustrato S, buffer HEPES pH7.5 20 mM. El volumen de reaccin fue de 5 ml. NOTA: La absorbancia detectada a 510 nm es nicamente debida al sustrato; ninguno de los reactivos utilizados ni el producto absorben a esa longitud de onda. Experimento N 1 Ensayo N 1 2 3 4 5 6 7 8 Ext. Hoja ml 0.5 0.5 0.5 0.5 --------Ext. Semilla ml --------0.5 0.5 0.5 0.5 Abs 510 nm 0` 1.003 0.502 0.249 0.152 1.001 0.500 0.251 0.151 10` 0.753 0.322 0.124 0.068 0.846 0.386 0.177 0.098 20` 0.503 0.142 0.004 0.000 0.692 0.280 0.103 0.046 30` 0.253 0.002 0.002 0.003 0.541 0.171 0.029 0.000

a-Confeccione un protocolo de trabajo para realizar el experimento anterior especificando: volumen de sustrato, buffer, extracto y agua para cada ensayo, teniendo en cuenta los siguientes datos: Solucin madre de buffer: 50 mM Solucin madre de S: 100 M b- Utilizando los datos del experimento N 1 determine los parmetros cinticos correspondientes a las reacciones enzimticas de hoja y semilla. Cree que se trata de la misma enzima? Justifique. En un segundo experimento, se determin la actividad enzimtica presente en extractos de hoja, adicionando extracto de semilla previamente calentado a 100 C durante 5 min. Para este ensayo, se emplearon 0.8 ml de extracto de hoja (el mismo extracto que se utiliz en el experimento 1) y se midi la actividad enzimtica agregando 0.5 ml del extracto de semilla calentado, utilizando las mismas concentraciones de sustrato que en el experimento 1 y el mismo volumen de reaccin. A partir de estos datos, se calcul una Vmx= 0.58 0.05 M/min. c-Con qu objeto cree que se realiz el segundo experimento? Qu puede concluir a partir de ste resultado? d- Cul cree que ser el valor de Km obtenido en el segundo ensayo? Justifique.

Bloque II ENZIMAS: Problemas opcionales I- Se estudi el efecto de dos inhibidores A y B (A permeable, B impermeable a membranas biolgicas) sobre la actividad de una enzima, unida a membrana, en vesculas microsomales de rin. Los estudios cinticos realizados arrojaron los siguientes resultados: Sustrato (mM) 0,20 0,50 1,0 2,0 5,00 Sin inhibidor 16,67 33,33 50,00 66,67 83,33 Velocidad inicial (mol/min) Con inhibidor A (6M) B (6M) 6,25 16,50 14,29 33,33 25,00 49,70 40,00 66,60 62,50 83,00

Posteriormente se extrajo la enzima de la membrana y se estudi el efecto del inhibidor B sobre su actividad.

Sustrato (mM) 0,20 0,25 0,33 0,50 1,00 2,00 2,50 3,33 4,00 5,00 16,67 20,00 24,98 33,33 50,00 66,67 71,40 76,92 80,00 83,33

Velocidad inicial (nmol/min) Sin inhibidor Con inhibidor B (6uM) 4,68 5,77 7,60 10,70 20,40 34,48 40,00 47,60 52,60 58,80

a) Interprete los resultados obtenidos en cada experimento con respecto a la inhibicin por A y B. b) Qu puede concluir acerca de la localizacin del sitio activo de esta enzima unida a membrana? Justifique. c) Qu tipo de inhibidor es B? Justifique.

Bloque II

II- Dada la siguiente reaccin enzimtica S

3P + Q, se obtuvieron las siguientes curvas:

- La curva 1 se obtuvo utilizando 2 concentraciones de sustrato (S1 y S2) siendo S2 = 2S1. la mezcla de reaccin contena adems, buffer borato 40 mM pH 7,5 y 3 mg/ml de protena.

- Para la curva 2 se utiliz una concentracin de sustrato inicial (S3)= 20 mM. - La accin del inhibidor (I), se ensay con dos concentraciones de sustrato: [S]= S2 (curva 1) [S]= S3 (curva 3) - Luego de transcurridos 30 minutos de reaccin con una concentracin de sustrato inicial =S1, la velocidad se mantuvo constante. A partir de ese momento se diluy la mezcla de reaccin 1/500 manteniendo constantes las concentraciones de buffer y enzima (curva 4). Calcule: a) las constantes de Michaelis Menten b) cul es la concentracin de sustrato S1? c) qu tipo de inhibidor es I? Justifique. De ser posible calcule Ki, Kmi y Vmi. Rta: a) Km: 59 mM; b) S1: 49,2 M; c) Kmi: 143 mM, Vmi: 3.6 M/min.

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Bloque II III- A partir de una solucin de enzima pura, que cataliza la reaccin S P, se realizaron ensayos de actividad mantenindose la dilucin de la enzima y la temperatura constantes y variando el pH del medio de incubacin. Se obtuvieron los siguientes resultados: [S] (mM) 2 5 10 pH 5 9,1 17,9 26,3 moles de P/ min . mg de enzima pH 6 14,3 25,0 33,3 pH 7 8,3 16,7 25,0 pH 8 7,2 14,7 22,7

a) Explique cul es el efecto del pH sobre la actividad de esta enzima. Justifique su respuesta. b) Qu concentraciones de sustrato debera utilizarse para alcanzar una velocidad inicial de 10 umoles de P/min.mg de enzima a pH 5 en condiciones similares a las empleadas para elaborar la tabla? c) Cul ser la velocidad mxima a pH 8 si se empleara el doble de concentracin enzimtica que la empleada en la confeccin de la tabla? Justifique su respuesta. Rta: b) [S]= 2,5mM c)Vmax = 74 moles/min.mg enzima. IV- Disee un experimento que permita determinar: a) si una enzima sigue una cintica de Michaelis-Menten. b) si un inhibidor es competitivo o no competitivo.

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ESTRUCTURA DE HIDRATOS DE CARBONO


1- a) La lactosa es un disacrido de la leche. Muchas personas no pueden ingerir leche porque no pueden digerir la lactosa. Aqullas personas que son intolerantes a la lactosa (tienen un defecto en la lactasa, la enzima que hidroliza la lactosa) , acumulan la lactosa en el lumen del intestino delgado porque no existe un mecanismos de transporte para el disacrido. Por qu la lactosa no puede atravesar la membrana de las clulas epiteliales del intestino en ausencia de un sistema de transporte? b) Ud. decide estudiar ms en profundidad esta enzima y ver si es capaz de clivar otro disacrido como la maltosa (maltosa = glucosa + glucosa). Ud determina que la lactasa no puede hidrolizar la maltosa, y por el contrario, la maltosa muestra cierto grado de inhibicin sobre la habilidad de la lactasa de hidrolizar la lactosa. Es la maltosa un candidato mas probable para ejercer una inhibicin competitiva o no competitiva? Justifique. c) Para confirmar su hiptesis, se llev a cabo un estudio cintico con los siguientes resultados:
[Lactosa] moles/litro 0.3 x 10-5 0.5 x 10-5 1.0 x 10-5 3.0 x 10-5 9.0 x 10-5 Velocidad (moles/min) Slo lactosa Lactosa + maltosa 10.4 4.1 14.5 6.4 22.5 11.3 33.8 22.6 40.5 33

Grafique 1/V en funcin de 1/S. Los grficos confirman o contradicen su hiptesis? 2- Una muestra de glucgeno tiene un peso molecular promedio de 8 x 106. Mediante el anlisis con cido peridico se determino que el nmero de residuos de glucosa en los extremos no reductores es el 8% del total de glucosas. Con -amilasa se hidroliza el 45% de la molcula. Calcular: a) Nmero total de glucosas por molcula de glucgeno. b) Micromoles de grupos reductores por kg. de glucgeno. c) Nmero total de glucosas que hay en las ramas exteriores. d) Longitud promedio de cada rama externa. Rtas: a) 49.383 glucosas c) 22.222 glucosas b) 125 moles/kg de glucgeno d) 5.61 glucosas/rama exterior

3- La amilosa es un glucano (1-4) lineal. 5 ml de una alcuota de una solucin de amilosa 125 mg/ml fue tratada con periodato produciendo 172.5 g de cido frmico. Calcular el PM de esa amilosa Decir qu compuestos y en qu cantidad se producen al tratar 10 ml de dicha solucin con agua de bromo, metilacin exhaustiva y posterior hidrlisis. Rta: 5 x 105 g/mol.

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Bloque II 4- Se sacrific un ratn para analizar el contenido de glucgeno de su hgado (peso hgado=1.5 g). Se prepar un homogenato 1:4 en agua destilada. Luego del aislamiento se obtuvo una solucin de glucgeno de 6 ml que proviene de todo el hgado. Se tomaron 0,5 ml de esa solucin y se diluyeron hasta 2 ml durante la hidrlisis y neutralizacin. Se efectu la reaccin de Somogy-Nelson sobre varias alcuotas, segn el esquema de la tabla. Tubo n 1 2 3 4 5 6 Glucosa (1mM) (ml) -0.1 0.3 0.5 --Muestra (ml) Agua (ml) ----0.04 0.08 2 1.9 1.7 1.5 1.96 1.92 Abs -0.054 0.145 0.250 0.080 0.165

a) Confeccione la curva estndar. b) Indique si las alcuotas utilizadas para determinar el contenido de glucgeno son las adecuadas. Justifique. c) Exprese los resultados obtenidos en: g de glucgeno en el hgado y en g de glucgeno/100 g de hgado. d) Calcule el n promedio de restos de glucosa por molcula de glucgeno.(PM= 3 x 106) Rtas: c) 15,7 mg total en hgado 1.046 g/100 de hgado d) 1.8 x 104 glu / mol de glucgeno

5- Un polisacrido de alto peso molecular y estructura desconocida fue sometido a metilacin exhaustiva e hidrlisis. El anlisis de los productos revel tres azcares metilados: 2,3,4-tri-Ometil-D-glucosa, 2,4-di-O-metil-D-glucosa y 2,3,4,6-tetra-O-metil-D-glucosa, en una relacin 20:1:1. Cul es la estructura del polisacrido?

6- Se aisl un compuesto bacteriano partiendo de 300 gramos de peso fresco de clulas,


que se homogeneizaron con 200 ml de buffer fosfato y se llevaron a 10% de TCA final. Se centrifug y al sobrenadante (250 ml) se lo deshidrat con alcohol 95%, sal y calor. Se centrifug nuevamente y el precipitado se solubiliz en 3 ml de agua destilada. Se realizaron los siguientes estudios: a) 0.4 ml de la muestra se trataron con H2O/Br2, metilacin exhaustiva e hidrlisis y se identificaron y cuantificaron los productos: Acido 2, 3, 4, 5 tetrametil-O-glucnico .............................................0,282 moles 2, 3, 4 trimetil-O-glucopiranosa ...................................................... 1.918 moles 3, 4 dimetil-O-glucopiranosa ........................................................... 0.580 moles 2, 3, 4, 6 tetrametil-O-glucopiranosa .............................................. 0.850 moles

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Bloque II b) A 0.5 ml se los trat con una solucin de (1-6) glucosidasa (exoglucosidasa). Despus de una incubacin prolongada se liberaron 3.177 moles de glucosa. Sabiendo que el PM del compuesto es aproximadamente 2100. i. Proponga tres estructuras posibles, justificando su respuesta. ii. Calcule los mmoles de polisacrido por gramo de peso fresco bacteriano iii. Calcule los mmoles de cido peridico gastados si se hicieran reaccionar totalmente 0.5 ml de muestra, y los mmoles de cido frmico que se produciran en dicho tratamiento. Rta:i) 7 x 10-3 moles polis/g peso fresco ii. 9.05 moles periodato; 4.87 moles frmico.

7-

Un grupo de investigadores que est estudiando la cadena glicosdica de una glicoprotena, aisl un oligosacrido unido a un pptido por el aminocido asparagina. Para su anlisis el glucopptido fue sometido a distintos tratamientos: Tratamiento con glicosidasas * Enzima Moles de azcar obtenidos/mol de glicopptido Galactosa Manosa Glucosa ---1) -manosidasa 0.97 --2) -galactosidasa --0.9 3) -glucosidasa -0.87 -4) -manosidasa (despus de 3) 0.93 -2.1 5) -galactosidasa + -glucosidasa -1.8 -6) -manosidasa (despus de 5) -0.82 1.81 7) -manosidasa + -glucosidasa (despus de 6) *todas las glucosidasas son tipo exoglucosidasas, incapaces de romper enlaces glicosdicos si los monosacridos especficos se encuentran unidos por dos o ms enlaces glicosdicos. Metilacin exhaustiva, hidrlisis, separacin, identificacin y cuantificacin de los metil derivados despus de distintos tratamientos con enzimas. Tratamiento previo a la metilacin Moles de O-metil derivados obtenidos/mol de glicopptido Galactosa Manosa (2,3,4,6) (2,3,4,6) (3,4,6) Glucopptido sin tratar -galactosidasa y despus glucosidasa -galactosidasa + glucosidasa + -manosidasa 0.97 --0.09 2.03 1.00 2.00 0.1 0.09 (2,4) 0.91 0.88 -Glucosa (2,3,6) (2,3,4) (2,3,4,6) 1.02 --1.87 1.88 1.92 1.02 ---

Obtenga la estructura del polisacrido que deduzca de estos resultados, justificando su respuesta (esquema indicando el nombre del azcar y el tipo de enlace)

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Bloque II

Metabolismo energtico:
Los problemas propuestos para contribuir al conocimiento y comprensin del metabolismo energtico de clulas animales y vegetales se han organizado en cuatro guas que se detallan a continuacin. Finalizada cada una de ellas se recomienda al estudiante integrar los conceptos aplicados con los utilizados previamente dentro del bloque. Para realizar esta integracin se propone seguir el esquema de las figuras 1 y 2. Conocimientos y conceptos a utilizar para la resolucin de las guas de problemas: a- Estructura de Hidratos de carbono: mtodos para su anlisis b- Enlaces de alta energa: ATP, transporte de electrones: fosforilacin oxidativa, fotosntesis: Fase lumnica y fase oscura c- Ciclo de Krebs: reacciones de oxidorreduccin y coenzimas de nicotinamida, localizacin y funcin biolgica. Termodinmica, sistemas acoplados d- Gluclisis y Gluconeognesis: regulacin, balance energtico. Figuras 1, 2 y 3obtenidas de Molecular Cell Biology Albert y col. Figura 1

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Bloque II Figura 2

Figura 3

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Bloque II

GLUCLISIS: Descripcin, la va, destinos del piruvato, rendimiento energtico, regulacin de la gluclisis
1-Tomando la ruta anablica y catablica de glucosa a piruvato indicar: a.- Si son qumicamente distintas b.- Cmo se regulan? c.- Cul es su localizacin? d.- Calcule su gaste energtico. 2- Un homogenato de hgado se centrfuga a 105.000 xg durante 1 hora. Se separan el pellet y el sobrenadante y se incuban separadamente con glucosa. En un tercer tubo se incuba una alcuota del homogenato inicial. Calcular el nmero de moles de ATP que se pueden obtener por la oxidacin de un mol de glucosa en cada tubo.

3- Qu procesos se llevan a cabo y cul es el rendimiento energtico, cuando se agregan


para su oxidacin los siguientes sustratos a las preparaciones que se indican ms abajo? I- PIRUVATO II- NADH+H III- GLICEROL a- homogenato de hgado cuidadosamente preparado. b- Fraccin del mismo que sedimenta a 10.000 xg. c- Sobrenadante de 100.000 xg 4- Considere la siguiente interconversin que ocurre en la gluclisis Fructosa-6-fosfato glucosa-6-fosfato Keq = 1.97

a) Cul es el G para la reaccin (a 25C)? b) Si la concentracin de fructosa-6-fosfato se ajusta a 1.5 M y la de glucosa-6-fosfato a


0.5 M, cul es el G? c) Por qu Gy G son diferentes? 5- Suponga que Ud. descubre una mutante de levadura cuya va glicoltica es ms corta por la presencia de una nueva enzima que cataliza la reaccin: Gliceraldehdo-3-fosfato + H2O + NAD+ 3-fosfoglicerato + NADH + H+ Aunque en esta mutante la gluclisis es ms corta, cmo se ver afectada la produccin anaerbica de ATP? Y la produccin aerbica?

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Bloque II 6- Durante la actividad intensa, el tejido muscular demanda grandes cantidades de ATP comparado con el resto de los tejidos. En los msculos de las patas de los conejos o en los msculos involucrados en el vuelo de muchas aves, este ATP se produce casi exclusivamente por fermentacin lctica. El ATP se produce en la fase final de la gliclisis por dos reacciones enzimticas, catalizadas por las fosfoglicerato quinasa y la piruvato quinasa. Si el msculo esqueltico no tuviera lactato deshidrogenasa, podra llevar adelante es intensa actividad fsica?

7- Un cultivo de levaduras es suplementado con [U14

C]-glucosa para examinar la produccin de CO2 bajo condiciones aerbicas y anaerbicas. Los valores obtenidos se graficaron en funcin del tiempo.

14

a) Qu rutas metablicas convierten glucosa en CO2? b) Asumiendo que en el tiempo cera hay un bajo nivel de nutrientes, cul es el estado energtico de las clulas? Qu pasa con las concentraciones de ATP y AMP relativas? c) Cules son los puntos de control de la gluclisis? d) Cmo pueden las clulas producir ATP metabolizando glucosa? e) Por qu la velocidad de produccin de CO2 disminuye con el tiempo? f) Por qu puede producirse CO2 bajo condiciones anaerbicas? (cuando el ciclo de Krebs no puede funcionar) g) Qu enzimas convierten piruvato a etanol en las levaduras? h) La glucosa produce 2 molculas de CO2 por fermentacin alcohlica, mientras que bajo condiciones aerbicas pueden producirse tericamente 6 molculas de CO2. Por qu se produjo ms CO2 bajo condiciones anaerbicas? i) Cul es la funcin de la fermentacin alcohlica? j) Por qu hay que agregar fosfato inorgnico en estas incubaciones?

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Bloque II

8- La gluclisis es la ruta metablica que permite la conversin de glucosa en piruvato.


A continuacin se muestran los valores de G'y G (los G fueron determinados en base a las concentraciones intracelulares de los sustratos de cada una de las reacciones) a- Indique si las reacciones 6 y 7 estn termodinmicamente favorecida en condiciones estndar y en las condiciones fisiolgicas utilizadas para el clculo de G. Proponga una justificacin para las diferencias observadas entre ambas condiciones. b- Sabiendo que las concentraciones de ATP y ADP citoplasmtico asociadas a los valores de G mostrados en la tabla son cercanas a 1.5mM y 0.5 mM respectivamente y la de glu-6-P es aproximadamente 0.1mM, estime la concentracin de glucosa que haran que la gluclisis estuviera termodinmicamente desfavorecida (Considere que se conservaron todas las concentraciones de los metabolitos involucrados detectadas durante la determinacin de G). c- Compare el rendimiento energtico (moles de ATP) y el poder reductor (NADH) de la ruta glucolitica en condiciones de aerobiosis y anaerobiosis.
Reaccion# 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Enzyme Hexokinase Phosphoglucoisomerase Phosphofructokinase Aldolase Triose phosphate isomerase Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Phosphoglycerate kinase Phosphoglycerate mutase Enolase Pyruvate kinase G' G (kJ/mol) (kJ/mol) -16.7 +1.7 -14.2 +23.9 +7.6 +12.6 -37.6 +8.8 +3.4 -62.8 -33.5 -2.5 -22.2 -1.3 +2.5 -3.4 +2.6 +1.6 -6.6 -33.4

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Bloque II

CICLO DE KREBS: Reacciones de oxidorreduccin y coenzimas de nicotinamida, localizacin y funcin biolgica. Rendimiento energtico, regulacin, rutas biosintticas
1- Las coenzimas de nicotinamida sufren reacciones de xido-reduccin reversibles con sustratos especficos en presencia de las deshidrogenasas adecuadas. El anillo de nicotinamida es la porcin de la coenzima involucrada en la reaccin redox; el resto de la molcula sirve para el reconocimiento y unin de la deshidrogenasa. Para cada una de las siguientes reacciones, determine si el sustrato ha sido oxidado o reducido o si su estado de oxidacin no ha cambiado. Para aqullos sustratos que han sufrido cambios redox, indicar cul es la coenzima encesaria (NAD+, NADH). O EtOH Etanol
=

CH3 C H Etanal
=

OH O O3PO CH2 CH C O PO3= 1,3 - bifosfoglicerato O CH3 C COOPiruvato


-

OH O O3PO CH2 CH C H + HPO4= Gliceraldehdo - 3P O CH3 C H + CO2 Acetaldehido


-

O OOC CH2 C COOOxalacetato

OH OOC CH2 C COOH Malato

O CH3 C CH2 COO- + H+ AcetoAcetato

O CH3 C CH3 + CO2 Acetona

2- En la ltima reaccin del ciclo del cido ctrico, el malato es deshidrogenado para regenerar el oxalacetato necesario para la entrada del acetil-CoA va la reaccin de la citrato sintetasa. L-Malato + NAD+ oxalacetato + NADH + H+ G= 30 kJ/mol

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Bloque II a) Calcule la constante de equilibrio para la reaccin a 25 C. b) La medida de la concentracin de L-malato en la mitocondria de hgado de rata es aproximadamente de 0.20 mM cuando [NAD+]/[NADH] es 10. Calcule la concentracin de oxalacetato a pH 7 en la mitocondria. Rta:a) 5.51 10-6 b) 0,11 M 3- Calcular el G fisiolgico de la reaccin de la isocitrato deshidrogenasa a 25C y pH 7, sabiendo que: [NAD+]/[NADH] = 8; [-oxoglutarato] = 0.1 mM; [isocitrato] = 0.02 mM; suponer condiciones estndar para el CO2 ( G= -2,1 Kcal/mol ). Esta reaccin es un sitio probable de control metablico? Por qu? 4- El citrato se forma por la condensacin de acetil-CoA con oxalacetato. En mitocondrias de corazn de rata a pH 7 y 25C, la concentracin de reactantes y productos son: oxalacetato 1 uM; acetil-CoA 1 uM; citrato 220 uM y CoA 65 uM. Sobre la base de estas concentraciones y el valor del cambio de energa libre estndar para la reaccin de la citrato sintetasa (-32.2 kJ/mol), determine la direccin del flujo de metabolitos a travs de la reaccin de la citrato sintetasa en la clula. Explique.

5- La respiracin celular puede estudiarse utilizando mitocondrias aisladas y midiendo el


consumo de oxgeno bajo diferentes condiciones. Si se agrega malonato de sodio 0.01 M a mitocondrias respirando activamente utilizando piruvato como combustible, la respiracin se detiene rpidamente y se acumulan intermediarios metablicos. a) Cul es la estructura de los intermediarios que se acumulan? b) Explique por qu se acumulan. c) Explique por qu se detiene el consumo de oxgeno. d) Krebs hall que la inhibicin del ciclo del cido ctrico por malonato poda ser contrarrestada elevando la concentracin de oxalacetato. Explicar el mecanismo de este proceso . 6- Aunque el oxgeno no participa directamente en el ciclo del cido ctrico en la clula, el ciclo slo opera en presencia de oxgeno. Por qu? 7- El malonato es un inhibidor competitivo del succinato en la reaccin de la succinato deshidrogenasa. Dibujar las grficas que se obtendran al representar 1/v en funcin a 1/ [succinato] para tres concentraciones diferentes de malonato. Indicar las lneas correspondientes a [malonato] baja, media y alta.

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Bloque II

TRANSPORTE DE ELECTRONES: fosforilacin oxidativa y fotosntesis


Potencial redox, donores y aceptores de electrones (NADH y FADH), formacin del gradiente de protones, inhibidores del transporte electrnico, desacoplantes, fosforilacin oxidativa, ATP sintetasa, acoplamiento y control respiratorio. 1- Si se aslan mitocondrias y se colocan en un buffer de bajo pH ellas comienzan a fabricar ATP. Por qu?

2- El grado de reduccin de cada transportador en la cadena respiratoria est determinado


por las condiciones existentes en la mitocondria. Para cada una de las condiciones que se indican a continuacin, prediga el estado de oxidacin de cada transportador en la cadena respiratoria (ubiquinona y citocromos b, c1, c y a + a3).

a)
b) c) d)

Abundante abastecimiento de NADH y O2 pero con el agregado de cianuro. Abundante abastecimiento de NADH pero O2 agotado. Abundante abastecimiento de O2 pero NADH agotado Abundante abastecimiento de NADH y O2.

3- La energa libre requerida para la sntesis de ATP a partir de ADP y Pi es de 30.5


kJ/mol cuando los reactivos y productos estn a una concentracin 1M (estado estndar). Debido a que en condiciones fisiolgicas las concentraciones de ATP, ADP y Pi no son 1 M, la energa libre requerida para sintetizar ATP en condiciones fisiolgicas es diferente al G. a) Calcule la energa libre requerida para sintetizar ATP en los hepatocitos humanos cuando las concentraciones de ATP, ADP y Pi son 3.5, 1.5 y 5 mM, respectivamente. b) Un adulto normal de 68 kg requiere una ingesta diaria de 2000 cal (8.36 kJ). El alimento es metabolizado y la energa libre es utilizada para la sntesis de ATP. Asumiendo que la eficiencia de conversin del alimento en ATP es del 50 %, calcule el peso de ATP utilizado por un adulto en un da. Qu porcentaje del peso del cuerpo representa? Aunque los adultos sintetizan grandes cantidades de ATP diariamente, el peso del cuerpo no cambia significativamente durante este perodo. Explique esta aparente contradiccin.

4- En mitocondrias normales la velocidad del transporte electrnico est ntimamente


acoplada a la demanda de ATP. En estas condiciones, el nmero de molculas de ATP producidas por tomo de oxgeno consumido (relacin conocida como P/O), cuando el NADH es el dador de electrones, es aproximadamente 3. a) Prediga el efecto de concentraciones relativamente bajas y altas de un agente desacoplante sobre la velocidad de transporte electrnico y sobre la relacin P/O. b) La ingestin de desacoplantes causa el incremento de la temperatura corporal. Explique este fenmeno en trminos moleculares. Qu ocurre con la relacin P/O? c) El dinitrofenol se prescriba como droga para reducir el peso corporal. Cmo esta droga, en principio sirve para ese objetivo? El DNP dej de utilizarse con ese fin debido a varias muertes producidas despus de su uso. Por qu el DNP puede producir la muerte?

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Bloque II 5- Relacionar los compuestos con su actividad: (1) rotenona, (2) dinitrofenol y (3) antimicina A. (a) inhibe la fosforilacin oxidativa cuando el sustrato es piruvato pero no cuando es sustrato es succinato. (b) inhibe la fosforilacin oxidativa cuando el sustrato es piruvato o succinato. (c) permite que el piruvato se oxide en las mitocondrias, incluso en ausencia de ADP. NOTA: La rotenona y el amital inhiben el transporte electrnico a la NADH deshidrogenasa; la antimicina A inhibe el complejo citocromo bc1 y el cianuro, la azida y el monxido de carbono, inhiben la citocromo oxidasa. 6- Explicar por qu: (a) las partculas submitocondriales de las cuales se ha extrado la F1 son permeables a los protones. (b) la adicin de oligomicina a partculas submitocondriales exentas de F1 disminuye varias veces esta permeabilidad.

7- Tanto la oligomicina como el cianuro inhiben la fosforilacin oxidativa, cuando el


sustrato es piruvato o succinato. El dinitrofenol puede usarse para distinguir entre estos dos inhibidores. Por qu? 8- Por qu la oxidacin de succinato a fumarato est asociada a la produccin de slo dos ATPs durante la fosforilacin oxidativa, mientras que la oxidacin de malato a oxalacetato est asociada a la produccin de tres ATPs? 9- Compare la produccin de ATP en cloroplastos y mitocondrias. - Qu enzima sintetiza ATP en ambas organelas? - Cul es la orientacin de F0 y F1 en cada caso? - Los electrones son transferidos al ATP? - Qu es el gradiente de protones o el pH? -De qu molculas provienen los protones en mitocondrias y cloroplastos? - Qu compartimiento celular se acidifica durante el transporte electrnico? 10- Dnde se llevan a cabo las reacciones de la fase lumnica y oscura de la fotosntesis? Indique las diferencias entre plantas verdes y bacterias.

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Bloque II

11- Con el fin de estudiar el flujo de electrones en membranas se aislaron cloroplastos y


mitocondrias y se incubaron en buffers adecuados dentro de una celda polarogrfica que permite cuantificar el contenido de O2 en la solucin. Los reactivos indicados se agregaron en los tiempos sealados y se observ su efecto sobre la concentracin de O2.

Figura 1
A O2 B O2 C

Figura 2
B

seg

seg

A, B y C representan luz, oxalacetato y nigericina aunque no necesariamente en ese orden. a. Proponga una correspondencia para los mismos e identifique la figura obtenida en la incubacin con cloroplastos. Justifique. b. Proponga un reactivo cuyo efecto sea similar al del oxalacetato. Justifique c. Cunto se modific la velocidad de transporte de electrones en mitocondrias en presencia de nigericina? d. Prediga las modificaciones en la concentracin de ATP asociadas a los grficos de las figuras 1 y 2. e. El herbicida diquat tiene un potencial redox de - 0.4 volts. Cul es el estado redox de la plastocianina en presencia del herbicida? f. Cmo se modificaran las curvas de las figuras 1 y 2 si se usan lisados mitocondriales y cloroplsticos en lugar de las organelas intactas?

12- Cuando una suspensin de algas verdes se ilumina en ausencia de CO


14 14 14

y luego se incuba con CO2 en oscuridad, el CO2 se convierte en C-glucosa durante un corto perodo. Cul es el significado de esta observacin en relacin al proceso de fijacin de CO2 y cmo se relaciona con las reacciones lumnicas de la fotosntesis? Por qu la conversin de 14CO2 en 14C-glucosa se detiene despus de un corto perodo?
2

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Bloque II

GLUCONEOGNESIS: Descripcin, gasto energtico, transporte de oxalacetato, activacin de la piruvato carboxilasa, regulacin recproca de la gluclisis y gluconeognesis, el ciclo de Cori VA DE LAS PENTOSAS FOSFATO: Descripcin, principales reacciones, regulacin METABOLISMO DEL GLUCGENO: Funcin, degradacin, sntesis

1- En un laboratorio dedicado al estudio del metabolismo del glucgeno en hgado


de ardilla, se detectaron dos cepas con menor contenido del mismo en iguales condiciones. Cepa mg glucgeno / hgado A 5.2 B 2.4 C 2.3 (Nota: la cepa A es considerada normal) Se ensay entonces la capacidad de sntesis de glucgeno en homogenatos de hgado de cada una de las cepas, mediante la incorporacin de glucosa radiactiva antes de realizar un precipitado con TCA. Cepa Radiactividad incorp. / 10' A 10180 B 9870 C 10240 Se saba por datos anteriores que en el sistema degradativo de glucgeno en estas cepas slo pueden existir diferencias con respecto a la enzima amilasa. Se ensay entonces, la actividad de esta enzima en homogenatos de hgado y con la enzima purificada de los mismos. Cepa A B C Actividad u.a./homogenato u.a./ug enzima 70 5 172 5 168 12

Nota: u.a. = unidades arbitrarias a- Indique las diferencias halladas entre las cepas B y C con respecto a la A. b- Interprete los resultados explicando a qu podran deberse las diferencias halladas. c- Seale qu experiencias deberan realizarse para corroborar o decidir entre su(s) interpretacin(es).

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Bloque II

2- Es posible obtener sntesis neta de glucosa a partir de piruvato si el ciclo del cido ctrico y la fosforilacin oxidativa estn totalmente inhibidas? 3- Aunque los animales no pueden sintetizar glucosa a partir de acetil-CoA, si se administra a una rata acetato marcado con 14C, algo de marca radiactiva aparecer en el glucgeno extrado de sus msculos. Por qu? 4- Las actividades metablicas relativas en un organismo de la gluclisis + el ciclo del cido ctrico frente a la ruta de las pentosas fosfato + gluconeognesis, pueden medirse comparando las velocidades de produccin de 14CO2 por administracin de glucosa marcada con 14C en el C(1) con la de la glucosa marcada en el C(6). Por qu? 5- La Vmax de la glucgeno fosforilasa de msculo es mucho mayor que la de hgado. Discutir el significado funcional de este fenmeno. 6- Explicar las consecuencias que produce la enfermedad de von Gierke (los pacientes son deficientes en la enzima glucosa-6-fosfatasa). 7- Calcular el costo energtico en nmero de ATPs para convertir la G6P citoslica en glucgeno y nuevamente en G6P, es decir, el costo energtico que supone almacenar la glucosa en forma de glucgeno. Qu fraccin del nmero mximo de ATPs que se producen por el catabolismo completo de la G6P a CO2 representa este costo?

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Bloque II PROBLEMAS DE PARCIALES


1) Llega a la guardia de un hospital un paciente alcoholizado con deficiencias nutricionales. Se le inyecta glucosa por via intravenosa y finalmente el paciente muere por acidosis. Se le hicieron estudio en sangre de las actividades de diversas enzimas del metabolismo de hidratos de carbono, como la piruvato deshidrogenasa (PDH), gliceraldehdo 3-P deshidrogenasa (G3PD) y piruvato kinasa (PK) y se la compararon con valores normales. Prediga como estaran los valores (aumentados o disminuidos) de estas enzimas en el paciente. Justifique. Cul sera el defecto enzimtico que le produjo la muerte? Cul sera el compuesto que gener la acidosis?

2) Se estn estudiando las caractersticas respiratorias de un alga para analizar su proliferacin. Para ello se la cultiva en oscuridad o luz continua en medio mnimo durante una semana. Luego se mide la velocidad de variacin del tenor de oxgeno en el medio en presencia o ausencia de varios inhibidores utilizando un electrodo de O2 por 10 min. Paralelamente se somete a los mismos tratamientos a un cultivo de clulas de ratn. Los resultados obtenidos son los siguientes:

A
100

ninguno

Cianuro de K

Rotenona

Paraquat

-100

Medida de variacin de tenor de oxgeno en medio de cultivo. A: algas verdes crecidas en oscuridad (barras negras) o luz (barras blancas) B: clulas de hgado de ratn crecidas en condiciones semejantes. En ambos casos el tenor de oxgeno fue medido por 10 min con un electrodo de oxgeno. Cianuro de Potasio: inhibe al Complejo IV de la cadena de electrones mitocondrial Rotenona: inhibe al Complejo I Paraquat: Inhibe al fotosistema I de la cadena de electrones cloroplstica

B
100

-100

nmoles de O/min 2

nmoles de O/min 2

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Bloque II

1-Explique brevemente cada caso 2-Cul es la razn del consumo de oxgeno medido con cianuro en algas crecidas en oscuridad? Por qu no es igual en las clulas de ratn? 3-Por qu considera que aumenta la evolucin de oxgeno incubando con cianuro o rotenona? 4-Cul sera el experimento que prueba que su suposicin es correcta? 3) Se est estudiando la capacidad fotosinttica de una bacteria recientemente identificada. Para ello se la compara con la capacidad fotosinttica de Synechocystis sp., una cianobacteria de referencia. Se midi el tenor de oxgeno en el medio donde cercen ambas bacterias con un electrodo de oxgeno durante 10 min. en oscuridad y en presencia de luz. Los resultados fueron los siguientes:

A 100
% Tenor de oxgeno

Figura 1: medicin del tenor de oxgeno a travs del tiempo en A: cianobacterias Synechocystis sp. B: bacteria fotosinttica recientemente descubierta. A los 10 min10dio se 10 20 un impulso de luz contnua durante otros 10 minutos.

20

tiempo

tiempo

Luego se incuba a estas bacterias con medio de cultivo sin azcares y burbujeado con dixido de carbono marcado con el istopo radioactivo del oxgeno 18O en erlenmeyers con agitacin y luz continua. Se mide luego de 30 min. en un contador de centelleo el medio lquido, extractos de ambas bacterias y el aire. 1-Interprete los grficos del Figura 1 2-Cul podra ser la explicacin del comportamiento de la bacteria nueva? 3-Cmo podra verificar que su interpretacin es correcta? 4-En el segundo experimento, en qu muestra piensa que encontrar marca radioactiva en cada caso? justifique. 28