Bioqumica I Primeira aula pratica: Protenas 1

Sumrio
Sumrio.................................................................................................................. 1 OBJETIVOS.............................................................................................................. 2 INTRODUO..........................................................................................................2 2.2 Estruturas......................................................................................................3 2.2.1 Estrutura primria......................................................................................3 2.2.2 Estrutura secundria...............................................................................3 2.2.3 Estrutura terciria...................................................................................3 2.2.4 Estrutura quaternria..............................................................................4 2.3 Reao da Ninhidrina....................................................................................4 2.4 Reao do Biureto.........................................................................................5 2.5 Precipitao de protenas com desnaturao................................................5 2.6 Precipitao por reao com os reagentes para alcalides ..........................5 2.7 Precipitao por reao com metais pesados...............................................5 2.8 Precipitao por reao com solventes orgnicos.........................................6 2.9 Efeito da fora inica sobre a solubidade (Salting In)....................................6 2.10 Reaes de precipitao sem desnaturao (Salting Out)..........................6 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL.............................................................................6 3.1 Materiais a serem utilizados nos procedimentos a seguir.............................6 3.2 Reaes de colorao de protenas..............................................................7 3.2.1 Reao com ninhidrina............................................................................7 3.2.2 Reao do biureto...................................................................................7 3.3 Reaes de precipitao de protenas..........................................................8 3.3.1 Reaes de precipitao com desnaturao...........................................8 3.3.2 Reaes de precipitao sem desnaturao ..........................................9 RESULTADOS E DISCUSSES..................................................................................9 CONCLUSES....................................................................................................... 11

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OBJETIVOS A presente atividade experimental tem a finalidade de identificar e caracterizar a presena de protenas em material biolgico. Verificar, experimentalmente, a precipitao de protenas com e sem desnaturao e relacionar as observaes prticas com a teoria de propriedades gerais como estrutura e isolamento de protenas. INTRODUO 2.1 O que so protenas As protenas so as molculas orgnicas mais abundantes e importantes nas clulas e perfazem 50% ou mais de seu peso seco. So encontradas em todas as partes de todas as clulas, uma vez que so fundamentais sob todos os aspectos da estrutura e funo celulares. Existem muitas espcies diferentes de protenas, cada uma especializada para uma funo biolgica diversa. Alm disso, a maior parte da informao gentica expressa pelas protenas. Pertencem classe dos peptdeos, pois so formadas por aminocidos ligados entre si por ligaes peptdicas. Uma ligao peptdica a unio do grupo amino (-NH 2 ) de um aminocido com o grupo carboxila (-COOH) de outro aminocido, atravs da formao de uma amida.

So os constituintes bsicos da vida: tanto que seu nome deriva da palavra grega "proteios", que significa "em primeiro lugar". Nos animais, as protenas correspondem a cerca de 80% do peso dos msculos desidratados, cerca de 70% da pele e 90% do sangue seco. Mesmo nos vegetais as protenas esto presentes. A importncia das protenas, entretanto, est relacionada com suas funes no organismo, e no com sua quantidade. Todas as enzimas conhecidas, por exemplo, so protenas; muitas vezes, as enzimas existem em pores muito pequenas. Mesmo assim, estas substncias catalisam todas as reaes metablicas e capacitam aos organismos a construo de outras molculas - protenas, cidos nuclicos, carboidratos e lipdios - que so necessrias para a vida. Todas contm carbono, hidrognio, nitrognio e oxignio, e quase todas contm enxofre. Algumas protenas contm elementos adicionais, particularmente fsforo, ferro, zinco e cobre. Seu peso molecular extremamente elevado. Todas as protenas, independentemente de sua funo ou espcie de origem, so construdas a partir de um conjunto bsico de vinte aminocidos, arranjados em vrias seqncias especficas.

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2.2 Estruturas As protenas podem ter 4 tipos de estrutura dependendo do tipo de aminocidos que possui, do tamanho da cadeia e da configurao espacial da cadeia polipeptdica. As estruturas so: 2.2.1 Estrutura primria dada pela seqncia de aminocidos ao longo da cadeia polipeptdica. o nvel estrutural mais simples e mais importante, pois dele deriva todo o arranjo espacial da molcula. So especficas para cada protena, sendo, geralmente, determinadas geneticamente. A estrutura primria da protena resulta em uma longa cadeia de aminocidos, com uma extremidade "amino terminal" e uma extremidade "carboxi terminal". Sua estrutura somente a seqncia dos aminocidos, sem se preocupar com a orientao espacial da molcula. Suas ligaes so ligaes peptdicas e pontes dissulfeto. Representada pela sequncia de aminocidos unidos por meio das ligaes peptdicas. ligada a carboidratos assim como outro.

2.2.2 Estrutura secundria dada pelo arranjo espacial de aminocidos prximos entre si na sequncia primria da protena. o ltimo nvel de organizao das protenas fibrosas, mais simples estruturalmente. Ocorre graas possibilidade de rotao das ligaes entre os carbonos alfa dos aminocidos e os seus grupos amina e carboxilo. O arranjo secundrio de uma cadeia polipeptdica pode ocorrer de forma regular; isso acontece quando os ngulos das ligaes entre carbonos alfa e seus ligantes so iguais e se repetem ao longo de um segmento da molcula. So dois os tipos principais de arranjo secundrio regular:

alfa-hlice: presente na estrutura secundria dos nveis de organizao das protenas. So estruturas cilindricas estabilizadas por pontes de hidrognio entre aminocidos. As cadeias laterais dos aminocidos encontram-se viradas para fora. Existem vrias formas de como as hlice alfa podem organizar-se. folha-beta: padro estrutural encontrado em vrias protenas, nas quais regies vizinhas da cadeia polipeptdica associam-se por meio de ligaes de hidrognio, resultando em uma estrutura achatada e rgida

2.2.3 Estrutura terciria Resulta do enrolamento da hlice ou da folha pregueada, sendo estabilizada por pontes de hidrognio e pontes dissulfeto. Esta estrutura confere a atividade biolgica s protenas.

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A estrutura terciria descreve o dobramento final de uma cadeia, por interaes de regies com estrutura regular ou de regies sem estrutura definida, podendo haver interaes de segmentos distantes de estrutura primria, por ligaes no covalentes. Enquanto a estrutura secundria determinada pelo relacionamento estrutural de curta distncia, a terciria caracterizada pelas interaes de longa distncia entre aminocidos, denominadas interaes hidrofbicas, pelas interaes eletrostticas, pontes de hidrogenio e de sulfeto. Todas tm seqncias de aminocidos diferentes, refletindo estruturas e funes diferentes. Efetua interaes locais entre os aminocidos que ficam prximos uns dos outros.

2.2.4 Estrutura quaternria Algumas protenas podem ter duas ou mais cadeias polipeptdicas. Essa transformao das protenas em estruturas tridimensionais a estrutura quaternria, que so guiadas e estabilizadas pelas mesmas interaes da terciria.A juno de cadeias polipeptdicas pode produzir diferentes funes para os compostos. Um dos principais exemplos de estrutura quaternria a hemoglobina. Sua estrutura formada por quatro cadeias polipeptdicas.

Figura 1 - Estrutura da Hemoglobina

2.3 Reao da Ninhidrina A reao da Ninhidrina de extrema importncia na Bioqumica e utilizada na deteco de aminocidos por ter a caracterstica amina primria. Por ser um agente oxidante muito poderoso, a ninhidrina reage com o aminocido da cadeia, dando origem a um composto de cor prpura.

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2.4 Reao do Biureto O reagente de biureto um reagente analtico feito de hidrxido de potssio (KOH) e sulfato de cobre (II) (CuSO4), junto com tartarato de sdio e potssio (KNaC4H4O64H2O). Este reagente de colorao azul torna-se violeta na presena de protenas, e muda para rosa quando combinado com polipeptdeos de cadeia curta. O esquema abaixo representa um modelo da formao desse complexo:

Figura 2 - Estrutura do complexo

2.5 Precipitao de protenas com desnaturao A temperatura um fator importante na solubilizao das protenas. Em geral, entre O e 40C o aumento da temperatura favorece a solubilidade. Isto decorre do fato do calor provocar um aumento da energia cintica das molculas de protena, facilitando a interao destas com o solvente. Entretanto, acima de 40C, as protenas comeam a precipitar: os movimentos moleculares se tornam to intensos que os grupamentos qumicos se afastam alm da distncia permitida para se reassociarem, aproximando-se de outros com os quais se associam. Assim, ocorre o rompimento das estruturas secundria, terciria e quaternria e a protena adquire outra conformao, uma conformao inativa (desnaturada).

2.6 Precipitao por reao com os reagentes para alcalides Os nions de alcalides (TCA) so capazes de se combinar com protenas que possuam resduos de aminocidos na forma de ctions, formando complexos insolveis que se precipitam e caracterizam a desnaturao.

2.7 Precipitao por reao com metais pesados Os ctions de metais pesados como Hg2+, Pb2+, Cu2+, Fe2+, Cd2+ e Zn2+ formam precipitados insolveis de protenas, denominados de acordo com o elemento formador (exemplo: proteinato de mercrio, proteinato de chumbo, etc.). Essa precipitao mais intensa quando o pH est acima do ponto isoeltrico (pI). Isso porque, acima do pI, a carga

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lquida sobre a protena negativa (ver determinao do ponto isoeltrico da casena), favorecendo a interao com os ctions provenientes do sal.

2.8 Precipitao por reao com solventes orgnicos A solubilidade das protenas em solventes orgnicos menor do que em gua. Isso acontece porque a capacidade de interao com as partculas de soluto diferente para cada solvente. A grandeza que mede a capacidade de interao do solvente com o soluto denominada constante dieltrica. A gua apresenta constante dieltrica bastante elevada A precipitao por solventes orgnicos depende muito da temperatura. Os solventes orgnicos, quando utilizados a temperaturas baixas, so bastante teis na separao de misturas de protenas. A temperaturas mais elevadas esses solventes podem levar desnaturao por rompimento das pontes de hidrognio e estabelecimento de interaes apolares, importantes na manuteno da conformao protica.

2.9 Efeito da fora inica sobre a solubidade (Salting In) Em baixas concentraes de sais (baixa fora inica), a solubilidade em geral aumenta, pois os ons salinos tendem a se associar s protenas contribuindo para uma hidratao e/ou repulso entre as molculas, aumentando a solubilidade salting in.

2.10 Reaes de precipitao sem desnaturao (Salting Out) A capacidade dos sais neutros de influenciar a solubilidade das protenas uma funo de sua fora inica, que tanto depende de sua concentrao como da valncia de ctions e nions que formam o sal. Em altas foras inicas, conseguidas pela adio de grandes quantidades de um sal muito solvel (por exemplo, o sulfato de amnio) a uma soluo de protena, pode ocorrer remoo de molculas de gua de hidratao das protenas, o que leva predominncia das interaes protena-protena, resultando em precipitao, fenmeno conhecido como salting-out

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 3.1 Materiais a serem utilizados nos procedimentos a seguir 10 Tubos de ensaio
01 Bquer de 50 mL 04 pipetas graduadas de 5 mL 04 pipetas graduadas de 2 mL

Estante para tubos de ensaio Prendedor de tubos de ensaio (para aquecimento) Pipetas de Pasteur Peras Bico de Bunsen

01 pipeta graduada de 10 mL 01 basto de vidro

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Caneta hidrogrfica

Pisseta com gua destilada

3.2 Reaes de colorao de protenas 3.2.1 Reao com ninhidrina Reagentes: Soluo de ninhidrina a 0,1% em tampo fosfato pH 7,0 (10mM) Soluo de protenas: clara de ovo a 10% v/v e, soluo salina 0,9% Soluo de glicina 0,1%

Procedimento:

Numerou-se 02 tubos de ensaio em que no primeiro adicionou-se 2 mL da soluo de ninhidrina e 5 gotas de protenas e aqueceu em chama direta durante aproximadamente 2 minutos. Observou-se o aparecimento de colorao;

No segundo tubo de ensaio colocou-se 2 mL da soluo de ninhidrina com 5 gotas de glicina e ferveu em chama direta durante aproximadamente 2 minutos. Observou aparecimento de colorao.

3.2.2 Reao do biureto Reagentes: Soluo de hidrxido de sdio 2,5 M Soluo de sulfato de cobre 1% Soluo de protena: clara de ovo a 10% v/v em soluo salina 0,9% Soluo de glicina 0,1%

Procedimento: Numerou-se 03 tubos de ensaio e colocou-se no primeiro tubo, 1 mL da soluo de protenas com 5 gotas de NaOH 2,5 M e 3 gotas de sulfato de cobre 1%. Observou-se se houve aparecimento de colorao; No segundo tubo adicionou-se 1 mL de soluo de glicina com 5 gotas de e NaOH 2,5 M e 3 gotas de sulfato de cobre 1%. Observou-se o aparecimento de cor e comparou-se esta com a do tubo 03;

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No terceiro tubo colocou-se 1 mL de gua estilada juntamente com 5 gotas de com 5 gotas de NaOH 2,5 M e 3 gotas de sulfato de cobre 1%. Observou-se o aparecimento de colorao e comparou-se esta com o tubo 02. Este tubo corresponde ao branco.

3.3 Reaes de precipitao de protenas 3.3.1 Reaes de precipitao com desnaturao Reagentes:

Soluo de protenas preparada pela diluio de clara de ovo a 10% v/v com soluo salina (NaCl 0,9g% (p/v)) cido tricloroactico (TCA) a 10% (p/v) lcool etlico absoluto - Precipitao por ao do calor

Procedimento: Em um tubo de ensaio colocou-se 2 mL da soluo de protenas e este tubo foi aquecido diretamente na chama e observou-se. - Precipitao por reao com reagentes para alcalides Procedimento: Em um tubo de ensaio colocou-se 1 mL da soluo de protenas e 1 mL de cido tricloroactico (TCA) e observou-se. - Precipitao com metais pesados Procedimento: Em um tubo de ensaio colocou-se 1 mL da soluo de protenas e 1 mL de acetato de chumbo a 5% e observou-se o ocorrido. - Precipitao por ao de solventes orgnicos Procedimento: Em um tubo de ensaio colocou-se 1 mL da soluo de protenas e de 1 a 3 volumes (at o aparecimento de precipitado) de lcool etlico e observou-se.

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3.3.2 Reaes de precipitao sem desnaturao (efeito fora inica sobre a solubilidade das protenas) Reagentes:

Clara de ovo in natura Cloreto de sdio 1 M Soluo saturada de sulfato de amnio 76,6 g% (p/v) - Solubilizao (salting in)

Procedimento:

Colocou-se em um bquer 3 mL de clara de ovo e diluiu-se este com um pequeno volume de gua destilada, sob agitao suave com o basto de vidro at o aparecimento de precipitado. Aps foi adicionado gota a gota a soluo de NaCl at a redissoluo deste precipitado. - Precipitao (salting out)

Procedimento: Pipetou-se 2 mL da soluo do procedimento anterior (salting in) em um tubo de ensaio.Foi adicionado 2 mL de soluo saturada de sulfato de amnio e observou a formao de um precipitado. Aps colocou-se de 6 mL de gua destilada at a redissoluo deste precipitado.

RESULTADOS E DISCUSSES 1.1 Reaes de colorao de protenas

1.1.1 Reao com ninhidrina

Tabela 01 Dados experimentais reao com ninhidrina.

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Tubos 01 02

Evidncias Logo no inicio do aquecimento observou-se a mudana de colorao da soluo que antes era incolor e tornou-se violeta opaco (tom claro) Observou-se a mudana de colorao da soluo que antes era incolor e tornou-se violeta opaco (tom escuro, quase azul)

1.1.2

Reao do biureto

Tabela 02 Dados experimentais reao com biureto Tubos 01 02 03 Evidncias Observou-se a mudana de colorao: de incolor para violeta transparente. Portanto, a resposta positiva para a reao precipitao de protenas Observou-se a mudana de colorao: de incolor para azul opaco (tom claro) BRANCO. Observou-se novamente a mudana de colorao: de incolor para azul opaco (tom claro) Comparao das reaes do tubo 2 com o 3: O tubo 03 o branco, ou seja, o teste com os reativos necessrios para precipitao de protenas, mas sem as protenas presentes, apenas para comparar caso os testes sejam positivos (precipitao de protenas cor violeta) ou negativos (no precipitao de protenas cor azul). O tubo 02 apresentou a mesma colorao do branco, entretanto o sistema do tubo 02 continha 1 mL de glicina que o aminocido mais simples que existe e portanto ele tem grupamentos amina disponveis para reao.

Figura 3 - Estrutura da Glicina

1.2 Reaes de precipitao de protenas

1.2.1

Reaes de precipitao com desnaturao

Tabela 03 Dados experimentais das reaes de precipitao com desnaturao Reaes precipitao Ao do calor Reagentes para alcalides Evidencias Com pouco aquecimento j se observou a formao do coagulo de colorao branca leitosa No momento da adio j se observou a formao do precipitado de colorao branca

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Sais de metais pesados Solventes orgnicos

Observou-se a formao do precipitado na forma de pequenos fios, mas a soluo continuou com cor inicial Com a adio de 1 mL j foi possvel observar a formao do precipitado de cor branca (aspecto leitoso)

1.2.2

Reaes de precipitao sem desnaturao (efeito fora inica sobre a solubilidade das protenas)

Tabela 04 Dados experimentais das reaes de precipitao sem desnaturao Reaes Solubilizao (salting in) Evidencias Com aproximada mente 10 gotas de gua, j foi possvel observar pequenos fios brancos na clara do ovo precipitado. Com a adio de um volume muito maior que o de gua, de NaCl foi possvel a redissoluo do precipitado anteriormente formado. A soluo com a adio do sulfato de amnio ficou turvada. Pode-se Precipitao (salting out) identificar o precipitado de cor branca formado. Com a adio de gua a soluo que era turva voltou a ser transparente, mas ainda continha alguns precipitados dispersos na soluo CONCLUSES As reaes de colorao e precipitao de protenas permitem a caracterizao dessas pela anlise de suas propriedades qumicas e fsicas, como ligaes peptdicas, solubilidade e estrutura molecular. Vrias reaes especficas so empregadas para detectar cada tipo de protena, de forma qualitativa e, posteriormente, quantitativa. As reaes de colorao no alteram a estrutura da protena, ao contrrio das reaes de precipitao que podem alterar vrios tipos de estruturas proticas. J as denominadas de Salting in e Salting out precipitam material sem ocorrer desnaturao. 6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS Kehl, Anderson & Langbeck, Carmem. Caracterizao de Protenas. Centro Federal de Educao Tecnolgica do Amazonas. Manaus, 2008. Lehninger, A. Lester. Fundamentos de Bioqumica. 4 ed. So Paulo: Sarvier, 2006

Sites:

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