Histoqumica de los Carbohidrats (Kiernan).

Aunque los carbohidratos se aplican a todos los azcares y sus derivados, algunas sustancias estn disponibles en secciones de tejidos fijados son aquellos en los que parte de los azucares forman lpidos, cidos nuclecos y mucosubstancias. Entre Mucosubstancias, desde un trmino colectivo se encuentran: polisacridos, glicoprotenas y proteoglicanos que forman parte de este captulo. Azucares constituyentes de las mucosustancias. Las mucosustancias son identificadas histoqumicamente y en virtud de sus propiedades de los azucares que la constituyen. Los monosacridos, son las unidades que con mayor frecuencia se encuentran en polisacridos, glicoprotenas, y proteoglicanos. La formula estructural de los monocaridos se muestran como anillos que se encuentran en un plano perpendicular al papel (fig 11.1). Todos los azucares ilustrados existen como 6 eslabones de anillos de piranosa . El sistema de numeracin es mostrado por la -D-glucosa. En los -anmeros los azucares de la D-serie. , el grupo hidroxilo que se encuentra en la posicin C1 se dirige hacia abajo. La formula de los L-enantimeros se obtienen al prever las imgenes en un espejo en el plano del anillo. En los -L azucares, el grupo hidroxilo encontrado en la posicin C1 se dirige hacia arriba y C6 se encuentra por debajo en lugar de por encima de C5. Los anmeros difieren slo en la configuracin de la posicin del carbono C1. Los epimeros difieren en la direccin del grupo hidroxilo en uno de los tomos de carbono que no sea C1. Por lo tanto, -D-glucosa y -D-glucosa son anmeros. Galactosa y Manosa son epimeros de la glucosa, pero no el uno del otro. Otras estucturas dan una falsa impresin de que los anillos son planos, pero l simplifica el reconocimiento de unidades de monosacridos y los o enlaces , y la presencia de azucares L-serie ( como la fucosa y el acido idurnico) en algunas mucosustancias de importancia biolgica. En los carbohidratos complejos, las unidades de monosacridos se unen por enlaces glicosdicos. Cada una de las unidades o residuo pueden ser llamados como grupo glicosdico. El tomo del carbn C1 de un azcar se conecta a travs de un tomo de oxigeno a uno de los carbonos ( comnmente C3,C4, o C6) de otra azcar. En los glucsidos el enlace indicado en su forma abreviada tales como -1 4, que muestra a que tomo de carbono se une y que

configuracin est en C1. En los monosacridos libres o en el trmino de la cadena con C1 que no participa del enlace glicosdico, la estructura del anillo (hemiacetal) esta en equilibrio con la cadena abierta (aldehdo) ismero, como se muestre en la -D-glucosa. Clasificacin y composicin de mucosustancias. Los hidratos de carbono moleculares pueden ser clasificados en base a su qumica, su comportamiento en determinados test histoqumicos, o bien su distribucin en la naturaleza. Pears (1985) present un sistema de clasificacin en que se hizo un intento de correlacionar la composicin qumica con propiedades histoqumicas discernibles, pero con el advenimiento de tcnicas para la demostracin individual de residuos de monosacridos, este sistema es un poco anticuado. Clasificaciones basadas nicamente en las propiedades de la tincin son utilizadas en el diagnstico patolgico, pero conducen a identificaciones que no se corresponden con saber de entidades qumicas. En efecto, se sabe que no todas las mucosustancias pueden ser distinguidas a travs de mtodos histoqumicos. Los diferentes enfoques de las dos disciplinas han llevado tambin a una gran cantidad de terminologa confusa. Polisacridos. Compuestos enteramente por Hidratos de carbono (poliglicosidos) Proteoglicanos. Largas cadenas laterales de polisacridos (glicosaminoglicanos) que Poseen unidades repetidas de Disacridos, unido a un ncleo Proteico relativamente pequeo. Glicoprotenas Protenas que contienen covalentemente cadenas de oligosacridos. (*) Compuestos macromoleculares, formados en su totalidad o en parte por hidratos de carbono. a) Polisacridos: Un polisacrido consiste en muchas unidades de monosacridos unidos por enlaces glicosdicos. Los hidratos de carbono

Mucosustancias(*)

macromoleculares no se unen covalentemente a protenas. Los polisacridos siguientes son homopolisacridos, compuestos por muchas unidades idnticas de monosacridos. Las cadenas pueden ser ramificadas, tpicamente cuando el mismo enlace glicosidico ocurre en toda la molcula, o ramificado cuando algunas de las unidades estn conectadas a travs de mas de un grupo hidroxilo. **Glicgeno: -D-Glc(-14)D-Glc( -14)-. La cadena se ramifica por que hay algunos -D-Glc(-16)D-Glc- unidos en cada molcula de glicgeno. Este polisacrido es bastante soluble en agua, y es el mejor preservado por los fijadores alcohlicos. El nico grupo funcional en el glicgeno es OH. Adyacentemente los grupos hidroxilos se producen en C2 y C3 en todas las unidades de monosacridos (como por ejemplo -glucosa), esto se conoce como formacin de glicol (tambin llamado vicinal diol, vic-glicol o 1-,2-diol) y se presenta en muchas otras Mucosustancias. **Almidn: el polisacrido de las plantas posee la misma estructura qumica que el glicgeno, difieren slo en el tamao, ramificacin y conformacin de estas molculas. Su forma ramificada es la amilasa, y el tipo de ramificacin, que es similar al glicgeno es la amilopectina (Pectina: el principal polisacrido de la lmina media de las paredes celulares de plantas, se compone principalmente por unidades de cido galactournico). **Celulosa: -D-Glc(-14)D-Glc( -14)-. Este es el principal componente de las paredes celulares de las plantas, ausente en el tejido animal, con excepcin en el exoesqueleto de los tunicados. Se diferencia del glicgeno y el almidn en ser un en lugar de un poliglucsido. La celulosa es insoluble en reactivos comnmente utilizados en microtcnicas. **Quitina: -D-GlcNac(-14)D-GlcNac( -14)-. Este es el principal componente del exoesqueleto de los insectos, crustceos y varios otros invertebrados. Tambin se produce en algunos hongos y algas. Aproximadamente la mitad del peso seco es material del exoesqueleto, con un balance consistente en gran medida de protenas y sales insolubles de calcio. B) Proteoglicanos: Los componentes de los hidratos de carbono que forman los proteoglicanos son heteropolisacridos, cada uno de largas cadenas compuestas de unidades repetidas de 2 o mas unidades de monosacridos diferentes. Las cadenas de polisacridos de los proteoglicanos, considerada de forma aislada, son a menudo nombradas como glicosaminoglicorunanos o Glicosaminoglicanos (GaGs). El termino mucopolisacrido fue utilizado formalmente como sinnimo ya sea para proteoglicano o el componente del

heteropolisacrido. Las unidades repetidas siempre incluye un nitrgeno que contiene azcar y un cido del azcar. Este ltimo puede ser cido urnico o un ster-sulfato de una hexosa, que le confiere afinidad catinica al colorante. Las unidades de repeticin que figuran a continuacin de alguno GAGs individuales no son completamente constantes: pequeas cantidades de otros monosacridos esta presentes en la molcula y la distribucin de los grupos ster-sulfato son un poco variables. 1- Hialuronan (cido Hialurnico): La unidad repetida es: -D-GlcUa (-13)D-GlcNAc(-14); (-D cido glucornico y D-aceitlglucosamina). Este GAG existe en estado variable de polimerizacin. Este polmero de bajo peso molecular es soluble en agua y tiene una baja viscosidad. Los polmeros altos son ms viscosos y menos fciles de extraer con agua. Glicol y los grupos carboxilos se presenta en el -D-cido Glucornico componente de cada unidad repetida. 2- Condroetn 4-Sulfato: (sinnimo Condroetn sulfato A), La unidad repetida es : -D-GlcUa(-13)D-GalNac-4-OSO.3H(-14).( -D cido glucornico y N-acetilgalactosamina-4-Sulfato). Insoluble en todos los reactivos de uso histolgico general y en glicol, carboxilo, y grupos ster-sulfato. 3- Condroetn 6-Sulfato: ( sinnimo: condroetn sulfato C): La edad repetida es : -D-GlcUa(-13)D- GalNac-6-OSO.3H(-14).( -D cido glucornico y N-acetilgalactosamina-6-Sulfato), Qumica y fsicamente este es similar al condroetn 4-sulfato, difiriendo solo en la posicin del grupo ster-sulfato. 4- Dermatn Sulfato: (antiguamente Condroetn sulfato C), La unidad repetida es: -L-ldUA(-13)D-GalNac-4-OSO.3(->4)-.( L cido idurnico y Nacetilgalactosamina-4-Sulfato), este es otro proteoglicanos sulfatado , difiriendo del condroetn 4-sulfato solo en la configuracin de la posicin de C5 en el cido urnico. 5. Queratn Sulfato: La unidad repetida es: -DGal(-14)D-GlcNAc-6OSO.3H(-13), (Galactosa y N-acetilgalactosamina-6-Sulfato), el tipo I estas unido por un enlace N-glicosidico de aspargina en asociacin a un ncleo o core de protenas del proteoglicano galactosamina. El tipo II est unido desde serina a galactosamina, y la molcula base de la protena es mayor que la de tipo I. El queratn sulfato tambin contiene pequeas cantidades de manosa, mucosa y cido sialico. Estos proteoglicanos estrechamente relacionados son insolubles en todos los reactivos histolgicos de uso comn. Los grupos stersulfato estan presentes pero las formaciones de glicol estan ausentes en la porque en la posicin C3, la galactosa participa de un enlace glicosidico. 6. Heparina: La base de la molcula de protena tiene varias cadenas largas de heteropolisacridos., las principales unidades repetidas son: (scanear) Todos los enlaces glicosdicos son -14. Las unidades de monosacridos son varios derivados sulfatados de los cidos L-idurnico y L-glucornico y

N-acetil-D-glucosamina. Pequeas cantidades de D-Galactosa y D-Xilosa estn presentes. Todos los grupos funcionales orgnicos que se producen en las mucosustancias estn presentes en la heparina, pero predominantemente en los grupos ster-sulfato. La Heparina se produce principalmente en los grnulos citoplasmticos de los mastocitos, pero es posible que la reduccin de las concentraciones tambin estan presentes en otras clulas y en el tejido conectivo. La heparina es utilizada clnicamente como anticoagulante. 7- Heparn Sulfato: Este es un grupo se sustancias que se producen dentro y en las superficies de las clulas animales. El heparn sulfato ha sido estudiado principalmente por mtodos qumicos y farmacolgicos .Es un subproducto de la fabricacin de la heparina de los tejidos animales. Al menos 4 diferentes tipos de GaGs unidos por nombres. Ellos son similares con la heparina pero contienen menos Sulfato y mas grupos N-Acetil. El heparn sulfato, que tambin ha sido llamado como heparitina sulfato y cido heparina monosulfrico, es producida en la gran mayora de las clulas animales y no es considerado como un precursor metablico de la heparina. En al menos el 1% del poder del anticoagulante es heparina. Una molcula de proteoglicanos consiste en molculas de condroetn, dermatn, queratn o heparn sulfato, que tpicamente poseen un largo de 50-200 nm, unidos a un core (o ncleo) de protenas de unos 300 nm de largo. Las cadenas de oligosacridos similares a las glicoprotenas (5-15 unidades de azcar), se adjuntan al core de protenas. En la matriz extracelular (MEC), las molculas de proteoglicanos de unen a travs de pequeas molculas de protenas, a las hebras de hialuronan (>2m) de longitud indefinida. La mayor parte de los enlaces protena-hidratos de carbono corresponden a enlaces glicosdicos lateral a una cadena de serina, pero tambin a algunos de ellos se unen a aminocidos bsicos. Proteoglicanos y el hialuronan en su forma macromolecular tridimensional de mall ocupa espacios entre las fibrillas de colgeno. La MEC de los tejidos vara en sus proporciones de colgeno, proteoglicanos y hialuronan, y en abundancia relativa de diferentes glicosaminoglicanos. Los Proteoglicanos se preservan qumicamente intactos por todos los fijadores no oxidantes, aunque puede haber extraccin de algunos heteropolisacridos, casa uno polmeros mas pequeos de hialuronan.(cido hialurnico). Un proteoglicanos encontrado en el cerebro de una rata, por ejemplo, se ha demostrado histoqumicamente despus de la fijacin con formalina-cido actico o Bouin, pero no despus de la fijacin en soluciones puras de formaldehdo. El cloruro de cetilpiridinio , ha sido propuesto como fijador especial para la precipitacin de proteoglicanos, a pesar de que puede disminuir la tincin por competicin con las coloraciones catinicas. El cloruro cianrico se combina covalentemente con los grups hidroxilos , tambin ha

sido utilizado como fijador para mucosustancias, aunque se espera que impida muchas reacciones histoqumicas. Glicoprotenas. Estas mucosustancias son unos de los variados polisacridos y proteoglicanos. La cadenas de oligosacdiso consiste en unidades de 2-12 monosacridos. Los azcares mas comunes en las glicoprotenas son : D-galactosa, -D-manosa, y -N-acetilglucosamina, y N*acetilgalactosamina, -L-fucosa y cido sialico. Los dos ltimos nombres siempre ocupan posiciones terminales ( ms lejanas desde las protenas). En el lado de la cadena ramificada, sin embargo, estos azcares terminales pueden estas mas cercanos a un core de polipptidos que hacia algunos residuos del interior de la cadena. Ejemplos de estas glicoprotenas son: Suero Protenas: Estas incluyen a las inmunoglobulinas. Sustancias especficas de los grupos sanguneos: Esto ocurre en la superficie de los eritrocitos. c) Productos de secrecin: Ambas glandulas, endocrinas y exocrinas, secretan glicoprotenas. Algunas de ellas, especialmente las que se encuentran en el canal digestivo, contienen azcares sulfatadas y cido sialico. Los Mtodos histoqumicos , no pueden determinar si tales sustancias son solo protenas o mezclas de ellas. d) Constituyentes de Glicocalix: Las glicoprotenas forman capas de celulas por fuera de la superficie del plasmalema de cada clula. El glicocalix es una parte integral de as membranas celulares. e) Colgeno: Es inusual que en las unidades de glucosilo se forman una gran parte de los componete de los hidratos de carbono. La histoqumica tradicional demuestra que las glicoprotenas se basan la presecia de grupos carboxlios, hridroxilos y grupos ster-sulfato. Estos se preservan en la gran mayora de los fijadores, pero las mezclas de fijadores contienen agentes oxidantes ( que podrian atacar la formacin de glicol), no deberan ser utilizados. Los componentes de los hidratos de carbono de los glicolpidos son similares a las de las glicoprotenas, y dos de los grupos de sustancias pueden ser confundidos uno con el otro cuando se utilizan cortes congelados. En muchos sitios, especialmente el mucus que recubre y lubrica superficies epiteliales, varias glicoprotenas estas presentes.La histoqumica puede identificar y localizar varios grupos funcionales y algunos residuos de monosacridos individuales, pero no puede determinar si esto ocurre molculas iguales o distintas.
a) b)

Amiloide. El amiloide es llamado de esta forma por su parecido al almidn, ambas sustancias dan una reaccin de color azul con el yodo. Ha sido considerado en ste captulo por conveniencia, a pesar de que es el componente predominante de las protenas, Los depsitos acumulativos de amiloide in varios rganos trae como consecuencia enfermedades inflamatorias crnicas y en enfermedades cerebrales como el alzheimers. Una rara enfermedad conocida como amiloidosis primaria se encuentra de vez en cuando por los patlogos. Estos depsitos consisten en protenas fibrilares y otras, incluyendo bsicamente componentes de la membrana como colgenos tipo 4 y perlecan, y un proteoglicano como el heparn sulfato. Las protenas estn -plegadas en la conformacin de hoja y estn organizadas como fibrillas de 7-13 nm de dimetro, que se producen en paquetes entrelazados. Uno de los principales componentes de las protenas es el amiloide P, el cual es diferente de cada uno de los ms de 20 tipos de amiloidosis. Las tcnicas histoqumicas para hidratos de carbono caen en tres categoras: aquellos en que los colorantes y reactivos estn relacionados cuando son utilizados, mtodos qumicos y mtodos relacionados con el uso de lectinas. Todos los tipos de mtodos pueden ser utilizados en conjunto con el bloqueo qumico de procedimientos de grupos de reactivos y con degradacin enzimtica de mucosustancias especficas. Varias tcnicas existen que no han sido descritas en este captulo. Tambin es posible demostrar muchas mucosustancias a travs de mtodos inmunohistoqumicos, que pueden detectar proteoglicanos y glicoprotenas 11.3 Mtodos histoqumiocs utilizados en coloraciones. Cuatro tcnicas sern discutidas: el uso de azul de alcin, la observacin de metacromcia, tincin con coloraciones catinicas en conjunto con sales de metales, y el uso de colorantes aninicos con molculas grandes. a) Azul de Alcin: este colorante se une a los grupos carboxilos y sulfatoster a un Ph de 2.5, pero solo esta ltima a pH 1.0. Con la solucin de cido mas fuerte, los grupos carboxilos no estn ionizados y por lo tanto no puede atraer electroestticamente los cationes del colorante. Por lo tanto, es posible identificar con algn grado de certeza que la acidez total de las mucosustancias se debe a su grupo carboxilo, pero no es posible saber si sustancia tie a un nivel de pH, por lo tanto se debe su acidez solo a los grupos sulfatos o bien ambos sulfato o carboxilos. Sin embargo si una seccin se somete antes de la tincin a un adecuado tratamiento en caliente, el

metanol acidificado, los grupos Ester-sulfato y probablemente la gran mayora de los cidos sialicos podrn ser removidos, asimismo los grupos carboxilos se encontrarn esterificados (** Proceso mediante el cual se sintetiza un ster(*)) (* Ester: compuesto derivado formalmente de la reaccin qumica entre un grupo carboxlico y un alcohol). Nada va a ser teido por el Azul de Alcin. La siguiente seccin puede objeto de un procedimiento de saponificacin, lo que generar una hidrlisis de los esteres de metilo y la restauracin de los grupos carboxilos. Estos recuperarn su coloracin con azul de Alcin a un pH de 2.5. Los esteres de sulfato, sin embargo, se han eliminado irreversiblemente y ya no sern detectables. Por lo tanto, siempre que al menos 6 secciones del mismo tejido est disponible, es posible determinar su afinidad con el azul de Alcin un pH 1.0 y 2.5 es solamente a los esteres de sulfato o a ambas grupos sulfato Ester y grupos carboxilos coexistiendo en el mismo sitio. Es factible para estudiar mucosustancias cidas por tincin con coloraciones catinicas que no sea con azul de Alcin. La principal razn para utilizar azul de Alcin en histoqumica de carbohidratos es el hecho de que esta coloracin por lo general no tie ncleos o depsitos de citoplasma de secciones de RNA, aunque se sabe que es capaz de unirse con los cidos nucleicos en solucin. Estudios con modelos moleculares, han revelado que cuatro grupos tetrametil Isothiouronium adjuntos a un anillo de ftalociacina del azul de Alcin 8G, puede hacer que la molcula de colorante en forma muy grande entre las bobinas de la hlice de ADN. La atraccin electroesttica entre los grupos fosfato y el auxocromo est debilitado por la distancia y no puede haber una corta distancia de interaccin (fuerzas de Van der Waals) entre los anillos aromticos del colorante y los anillos de purinas y pirimidinas del DNA. El acceso de catines grandes del azul de Alcin a los grupos fosfatos de los cidos nucleicos en el tejido fijado se ve dificultada por la presencia de la asociacin a nucleoprotenas. El impedimento estrico tambin puede explicar el fracaso del azul de alcin para teir ARN. En algunas ocasiones, especialmente en tejidos de animales muy jvenes, los ncleos se tien con azul de alcin a Ph2.5. Esta coloracin puede deberse en parte a mucosustancias cidas presentes en cromosomas de clulas en divisin. Otra ventaja del azul de alcin sobre la mayora de los colorantes catinicos la solubilizacin de los grupos tetrametilisothiouronium se pierde, teniendo como resultado la hidrlisis catalizada por una base, cuando las secciones teidas son lavada con agua destilada. El pigmento resultante ( ftalocianina de cobre), no es extraido por el agua, alcoholes, cidos, u otras soluciones de colorantes utilizadas para la contratincin. El procedimiento de PAS es frecuentemente aplicado en tejidos ya teidos con azul de Alcin.

Soluciones Requeridas: Algunos lotes de Azul de Alcian son insatisfactorios cuando se encuentra nuevo. El uso de colorantes certificados BSC es muy recomendado. Algunos lotes inicialmente satisfactorios se deterioran con el almacenamiento, incluso en forma de polvo seco.
1) -

Azul de Alcian, Ph 1.0: Alcian Blue 8G ( CI 74240) . 1.0g Acido Clorhdrico 0.1 M .. 100 ml

La estabilidad de esta coloracin es variable. A veces todo el material coloreado precipita despus de 2 a 3 semanas. Otros lotes son estables por mas de 1 ao. Filtrar antes de utilizar.
2) -

Azul de Alcian, Ph 2.5 : Alcian Blue 8G ( CI 74240) Agua Acido Actico Glacial

. 1.0g 97 ml 3.0 ml

Toma alrededor de un hora disolver (agitador magntico). Filtre en una botella limpia, Se mantiene por varios aos pero eventualmente se descompone y precipita. Si el almacenamiento de la solucin necesita filtrado, probablemente se ha deteriorado lo suficiente, por lo cual es necesario reemplazarla. Procedimento: 1Desparafinar e hidratar las secciones. 2Teir en cualquiera de las soluciones A o B por 30 min. 3Enjuague en HCl 0.1 M o en Acido Actico al 3% (el solvente de la coloracin), luego lavar con agua directamente del grifo por 3 min. 4**Opcional: Aplicar contraste rosado o rojo si se desea. 5Deshidrate en concentracin de alcoholes. El azul de Alcian no es removido por el alcohol, pero el contraste puede ser diferenciado. 6Limpiar con Xilol y montar. Resultados: Todas las mucosustancias Acidas son teidas a un Ph 2.5, solo las mucosustancias sulfatadas son teidas a un Ph 1.0.

Notas:

1) Una colorancon marcada con la variante Azul de Alcian-Piridina es mas efectiva que el mtodo azul de Alcian 8 G. 2) Las mucosustancias con grupos carboxilos o sulfato-ester se pueden distinguir si el control de las secciones han sido metiladas y saponificadas. Neuroaminidasas y leves hidrlisis acidas pueden ser utilizadas para identificar glicoprotenas debido a su acidez por presencia de acido sialico. 3) Colorantes Cationicos rojos ordinarios como la safranina, puede ser utilizado en conjunto con el azul de Alcian. Los efectos de la tincin diferencial han sido descritos en estructuras que contienen carbohidratos tales como los grnulos de los mastocitos. 4) El Azul de Alcian a sido tambin utilizado en mesclas con sales inorgnicas (usualmente clorhidrato de magnesio) con diferentes fuerzas inicas. Los cationes de la sal compiten con los del colorante para los sitios de unin en el tejido. La coloracin es utilizada a un alto Ph (5-6) para que los resultados no sean tan complicados por ionizacin incompleta de los grupos carboxilos. Los cidos altamente disociados (OSO en este caso) puede obligar a la tincin en presencia de altas concentraciones de sal, mientras que el acido mas dbil (COO) no puede. La afirmacin constituye la base de la Concentracin de Electrolitos Crtica (CEC), con la que cada mucosustancia acida se le puede asignar una concentracin de MgCl2 por encima del cual no se puede teir con azul de Alcian. Esta interpretacin qumica de los efectos del CEC ha sido cuestionada (Horobin y Goldestein 1974). Horobin sugiere que esa coloracin al aumentar la fuerza inica estan obligados por sustancias que aumentan la porosidad en lugar de aumentar la acidez. Soluciones de azul de Alcian 8G con MgCl2 a Ph 5-6 son estables solo por un par de horas. La variante Azul de AlcianPiridina es mas estable y funciona mejor en mtodos CEC. b) Metacromcia: Cuando las coloraciones catinicas imparte su propio color a un objeto, se dice que la tincin es ortocromtica. En algunas circunstancias el lmite de iones en un colorante tienen una alterada longitud de onda de absorcin, de modo que el color mostrado del objeto teido es diferente de la coloracin. Este fenmeno es conocido como Metacromaciay las sustancia que tien metacromticamente son denominados Cromtropos. En la mayora de los casos el color metacromtico de la coloracin es mayor que la longitud de onda del colorante ortocromtico. Tinciones Azules como la thionina y el Azul de Toluidina tien materiales cromotropicos en tonos rojos y purpuras. Los colores rojo y purpura producidos por esas tinciones ha sido denominados como y - metacromasia, respectivamente, pero esta distincin es probablemente de menor importancia. Solo la -metacromasia posee importancia en histoqumica de muscosustancia. El cambio de color es debido

al cambio de (un cambio hipsocromico) en la absorcin del espectro de la coloracin y asociado a una reduccin en la intensidad del color. Los efectos metacromticos son producidos cuando los iones coloreados de la tincin se presentan en las proximidades de uno y el otro. Esto ocurre cuando radicales ionicos del sustrato estn juntos, como en algunos proteoglicanos. El complejo colorante-sustrato de la tincin metacromtica se muestra en la fig 11.3 Las molculas de Agua interpuestas entre los colorantes inicos apilados, se cree que necesariamente modifican la distribucin de los electrones en el sistema de cromforos de tal manera que reduce la en la que la luz aborbida es mxima. La coloracin con efectos metacromticos puede ser obtenida con tiazinas, oxazinas, xantenos y azinas. Estos son molculas planas capaces de apilarse muy cerca fig 11.3 y pueden ser formulados con la posibilidad de cambiar los grupos auxocromicos en cada lado de los sistemas de anillos fusionados. Cuando los Auxocromos son ms voluminosos que el grupo N(CH3)3, la tincin metacromtica no puede ocurrir, probablemente por que no hay espacio para la interposicin para las molculas de agua. El agua ligada se ve obligada a resistir la extraccin por agentes deshidratados, de hecho, es generalmente aceptado que la metacromacia debe persistir deshidratada, las preparaciones aclaradas si es que tiene alguna importancia en relacin a las macromolculas de carbohidratos. Otra causa de la metacromacia puede ser la formacin de dmeros por las molculas de la coloracin en la solucin y la posterior colocacin de estos dmeros en los sitios anicnicos del tejido. Esto no parece un mecanismo muy probable, sin embargo, debido a la metacromacia de la solucin colorante se genera una pantalla nica cuando se concentran, pero la tincin histolgica metacromtica es fcilmente obtenida de soluciones muy diluidas. Las mucosustancias cidas no son las nicas fuentes de metacromacia encontrada en el tejido animal. Los cidos nucleicos son cromtropos en algunas ocasiones, aunque su metacromacia revierte la ortocromacia despus de la deshidratacin. A pesar de la baja especificidad histoqumica de la tincin metacromtica con colorantes catinicos, el mtodo es til para estudiar la morfologa de estructuras que se sabe que contienen glicoprotenas sulfatadas ( alguno tipos de mucus), heparina (grnulos de los mastocitos) y proteoglicanos en la matriz intracelular del cartlago y en algunos otros tejidos conectivos.

Soluciones Requeridas.

1.Solucin de Azul de toluidina ( CI 52040) 0.05-0.25% 2. Azure A ( CI52005) o tionina (52000) al 1% en solucin Acuosa de Acido Actico. Esta solucin se puede mantener por varios aos, pero este pierde la potencia con el uso repetido. Filtrar ante de cada utilizacin.
A)

Procedimiento: 1. Desparafinar e hidratar las secciones de parafina. 2. Teir por 1-5 minutos ( ver la nota 1) 3. Lavar en agua 4. Deshidratar en alcohol al 70%, 90% y en dos cambios de etanol absoluto ( ver la nota 2) 5. Limpiar en Xilol y montar. Resultados: Coloracin Ortocromtica ( ncleo, citoplasma de alguanas clulas u los cuerpos de Nissl de las neuronas): Azul Coloracin Metacromtica: Rojo.
-

Notas: Si se colorea excesivamente, adicionar al azul de toluidina mas acido actico ( tinciones de soluciones envejecidas pierden la acidez con el almacenamiento). El Ph de la solucin puede ser aproximadamente de 4.0. U n Ph mas bajo puede dar una coloracin ortocromtica dbil. 2. La coloracin es diferenciada en etanol de 70%. Las secciones deben ser azul plida antes de ser limpiadas. Si la coloracin es inicialmente dbil, tomar las cintas directamente del agua al primero de los tres cambio de alcohol al 100%. Alternativamente, manchar las seeciones despus del lavado y deshidratacin en dos cambios ( cada 3-5 minutos) en N-butanol.
1.

11.3.3 Mtodo de coloracin de Aluminio Bsico segn Heath. Una dilucin (aproximadamente 10- M) de una solucin catinica de sulfato de aluminio a la 0.1-0.5 M da una tincin selectiva de estructuras que contienen mucosustancias sulfatadas. Heath (1962), investig este fenmeno a fondo. Los colorantes afectivos resultaron ser los N-metil azinas y tiazinas incluyendo el rojo neutro y el azul de toluidina. Las coloraciones

con largas molculas incluyendo los triarilmetanos, dan una coloracin especfica para mucosustancias sulfatadas, pero el color se pierde rpidamente con e lavado y la deshidratacin. Heath tambin encontr el mismo resultado que puede ser obtenido por el tratamiento de las secciones con sal de aluminio antes de la tincin, y ese aluminio puede ser reemplazado por otros metales forman fcilmente compuestos por coordinacin. La especificidad por los esteres sulfatos se confirm por determinacin que la coloracin puede prevenirse por metilacin del tejido, y no se restaura por saponificacin. Los grupos cidos fuertes artificialmente introducidos en los tejidos (por sulfatacin de hidroxilos u oxidacin de cistina) tambin se tieron por combinaciones de la coloracin de aluminio bsico. Solucin Requerida. A) -

Solucin de la tincin de Aluimnio: Rojo Neutro ( CI 50040) o Azul de Toluidina ( CI 52040): 0.1g. Agua 100ml Sulfato de Aluminio (Al2(SO4)3.18H2o): 5.0g.

Hervir, dejar enfriar, y filtrar para eliminar el material insoluble, luego adicionar (Al2(SO4)318H2o) acuoso al 5%, para hacer 300ml. B) Etanol al 70% , para la diferenciacin de las secciones teidas.

Procedimiento: 1. Desparafinar e hidratar las secciones. Recuerde remover los depsitos de mercurio, si es necesario. 2. Teir por 5-30 minutos 3. Lavar en agua. 4. Diferenciar en etanol al 70% por 20-30 segundos, o hasta que el fondo ( nucleo, citoplasma, colgeno) este coloreado 5. Si desea, aplicar un contraste adecuado, tal como eosina o Fast Green FCF 6. Completar la deshidratacin, en 95% y 2 cambios de alcohol de 100%, limpiar con Xilol y cubrir , utilizando medio de montaje. Resultados: Stios de mucosustancias sulfatadas ( mastocitos , matriz del catlago, clulas caliciformes, etc) rojo con el rojo neutro, o rojo a purpura ( metacromasia) con azul de toluidina.
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Nota: Heath (1962) prob 57 coloraciones utilizando este mtodo y es fuertemente recomendado el denominado Fast red Nuclear. Probablemente esta coloracin es realmente un rojo neutro. La coloracin de antraquinona es usualmente conocida como fast red nuclear (CI 60760), no es adecuadamente, sin embargo, debido a que no es un colorante catinico y el complejo de aluminio tie el ncleo. La confusin sobre la identidad de una adecuada coloracin puede explicar la falta de popularidad del mtodo de Heath sea simple y seguro, que utiliza reactivos baratos y que merece ser utilizado extensamente.
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11.3.4 Mtodos de Coloracin para Glicgeno y Amiloide. Las coloraciones aninicas existen en solucin como largas molculas o agregados de molculas son utilizadas para teir colgeno, como fue explicado en el capitulo 5 y 7. Algunas de estas coloraciones pueden ser tambin utilizadas para la demostracin de polisacridos. Los polisacridos neutros como el glicgenono posee grupos cargados, asi que se vinculan y retienen la coloracin necesariamente por mecanismos no inicos. La clsica tincin de este tipo de glicgeno es la Tecnica de Bests Carmin, en donde la coloracin se disuelve una mescla de agua y alcohol. La formula estructural del carmn, muestra una gran molcula con numerosos sustituyentes hidroflicos (carboxlicos, fenlicos, hidroxlicos,