CENTRO DE INVESTIGACIN Y DE ESTUDIOS AVANZADOS DEL INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD ZACATENCO

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGA Y BIOINGENIERA

Biorremediacin de un Suelo Contaminado con Hidrocarburos, empleando cidos Hmicos y Lombrices (Eisenia andrei)

Tesis que presenta:

Csar Garca Daz

Para obtener el grado en: MAESTRO EN CIENCIAS EN LA ESPECIALIDAD DE BIOTECNOLOGA

Codirectores: Dra. Josefina Barrera Corts

Dr. Ronald Ferrera Cerrato

Mxico, D.F.

2008

Comit Tutorial

Dra. Josefina Barrera Corts (Biotecnologa y Bioingeniera, CINVESTAV-IPN) Dr. Ronald Ferrera Cerrato (Colegio de Postgraduados) Dr. Hector Mario Poggi Varaldo (Biotecnologa y Bioingeniera, CINVESTAV-IPN) Dr. Miguel ngel Melndez Lira (Fsica, CINVESTAV-IPN)

II

Agradecimientos

Agradezco al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACyT) por el apoyo econmico otorgado para la realizacin de esta tesis a travs de la beca de estudios No.199742 y a el proyecto SEMARNAT-2002-C01-0154.

Agradezco al CINVESTAV por la beca terminal otorgada para la conclusin de la tesis.

III

A la Dra. Josefina por el apoyo incondicional tanto personal como acadmico, que me brindo a lo largo de la realizacin del proyecto.

Al Dr. Ronald por sus consejos acadmicos y personales que me brind en cada ocasin que tuve la oportunidad de reunirme con l, de manera incondicional.

Al Dr. Hector por sus comentarios valiosos para llevar a buen trmino este proyecto.

Al Dr. Miguel por sus comentarios sobre las posibles formas de analizar los resultados obtenidos.

Al Dr. Frdric Thalasso y al Dr. Luc Dendooven por permitirme el acceso ilimitado a sus laboratorios en la Planta Piloto del Departamento, para llevar a cabo los anlisis de la caracterizacin de los materiales empleados en este proyecto.

A los auxiliares de investigacin M. en C. Joel Alba Flores y M. en C. Marcos Luna por su apoyo tcnico para la realizacin de la tesis.

Al Dr. Fernando Esparza por su consejos; as como, el auxiliar de investigacin M. en C. Carlos Cruz y el auxiliar tcnico Teresa Rodrguez.

A los auxiliares de investigacin Ing. Calixto Ortega y la M. en C. Beatriz Altamirano por su gran apoyo tcnico, acadmico y personal; as como, al auxiliar tcnico Humberto Moreno.

A la especialista Elvira Rios Leal y el auxiliar tcnico Cirino Chvez, por su apoyo tcnico cromatogrfico y consejos acadmicos brindados.

IV

A mis padres y hermano

Por estar siempre conmigo y apoyarme nuevamente en cada momento en esta etapa de mi vida y seguir orientndome para ser una mejor persona, gracias.

A mi novia

Claudia Ivonne por apoyarme en cada momento, compartir buenos momentos a su lado y brindarme su amor, gracias.

A mis amigos

Miguel ngel Rodrguez Mesa e Ivonne Esquivel Ros, que me brindaron infinidad de consejos para mi superacin personal y acadmica; y que me permitieron pasar buenos momentos con ustedes, gracias.

A mis compaeros

Por su compaa y amistad que me brindaron; y porque con su compaa el camino recorrido fue mucho ms sencillo, gracias.

CONTENIDO

1.

INTRODUCCIN........................................................................................................................................... 1 1.1. SUELO ..................................................................................................................................................... 1 Componentes del suelo .............................................................................................................. 3 Suelo y su dinmica .................................................................................................................... 4 Humus....................................................................................................................................... 5

1.1.1. 1.1.2.

1.1.2.1

1.1.2.1.1. Tipos de humus.............................................................................................................. 6 1.1.2.2. Composicin del Humus (Substancias Hmicas) .............................................................. 6 1.1.2.3. Substancias Hmicas y sus propiedades............................................................................ 8 1.1.2.3.1. Propiedades detergentes de las Substancias Hmicas ......................................... 12 1.1.2.4. Humificacin de HTPs ......................................................................................................... 13 1.2. CONTAMINACIN DE SUELOS CON HIDROCARBUROS .......................................................................... 13 Petrleo y produccin................................................................................................................ 14 Composicin del Petrleo ......................................................................................................... 14

1.2.1. 1.2.2.

1.2.2.1. Complejos Altamente Recalcitrantes (Asfaltenos) ........................................................... 15 1.2.3. 1.2.4. 1.2.5. Transporte de los HTPs en el ambiente ................................................................................ 16 Migracin de la mezcla de HTPs ............................................................................................ 17 Toxicidad de las fracciones recalcitrantes del petrleo........................................................ 19

1.2.5.1. Hidrocarburos Alifticos (HAs) ........................................................................................... 19 1.2.5.2. Hidrocarburos Policclicos Aromticos (HPAs)................................................................ 19 1.2.5.3. Compuestos heterocclicos con azufre o nitrgeno ......................................................... 19 1.2.5.4. Efecto de los HTPs en la salud .......................................................................................... 20 1.2.6. Biodegradacin de los Hidrocarburos Totales del Petrleo ................................................ 21

1.2.6.1. Microorganismos degradadores de hidrocarburos .......................................................... 21

VI

1.3.

TECNOLOGAS DE REMEDIACIN DE SUELOS CONTAMINADOS (IN-SITU, EX-SITU) ............................... 23 Lavado de suelo ......................................................................................................................... 24

1.3.1.

1.3.1.1. Surfactantes ........................................................................................................................... 24 1.3.2. Tecnologas de biorremediacin de suelos contaminados .................................................. 26

1.3.2.1. Bioestimulacin ..................................................................................................................... 27 1.3.2.2. Residuos agroindustriales ................................................................................................... 28 1.3.2.3. Vermicomposteo ................................................................................................................... 29 1.3.2.3.1. Las lombrices ............................................................................................................... 30 1.3.2.3.2. Las excretas de lombriz .............................................................................................. 30 1.3.2.3.3. Agregados de excretas ............................................................................................... 30 1.3.2.3.4. Canales o galeras formados por la lombriz ............................................................ 31 1.3.2.3.5. Enzimas de la lombriz ................................................................................................. 31 1.3.2.3.6. Efecto de fuentes orgnicas e inorgnicas de N sobre la poblacin de lombrices del suelo............................................................................................................................................. 33 1.3.2.3.7 1.3.3. Remocin de HTPs empleando lombrices ............................................................... 33

Factores que afectan la biorremocin de hidrocarburos en el suelo ................................. 34

1.3.3.1. Relacin Carbono Nitrgeno (C/N) .................................................................................... 35 2. 3. 4. JUSTIFICACIN ......................................................................................................................................... 38 HIPTESIS .................................................................................................................................................. 38 OBJETIVOS ................................................................................................................................................. 39 4.1. 4.2. 5. OBJETIVO GENERAL .............................................................................................................................. 39 OBJETIVOS ESPECFICOS ...................................................................................................................... 39

MATERIALES Y MTODOS ..................................................................................................................... 40 5.1. 5.2. 5.3. SUELO ................................................................................................................................................... 40 EXTRACTO DE LEONARDITA ................................................................................................................. 41 LOMBRIZ ................................................................................................................................................ 41

VII

5.4. 5.5. 5.6.

VERMICOMPOSTA .................................................................................................................................. 40 BAGACILLO DE CAA ............................................................................................................................. 40 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL ................................................................................................................ 42 Caracterizacin del suelo contaminado, bagacillo de caa, extracto de leonardita y

5.6.1.

vermicomposta............................................................................................................................................. 43 5.6.2. 5.6.3. Seleccin de la fuente de nitrgeno y relacin C/N .............................................................. 44 Fermentacin slida del suelo contaminado ......................................................................... 45

5.6.3.1. Dispositivo experimental ...................................................................................................... 45 5.6.3.2. Diseo experimental factorial general ............................................................................... 46 5.6.3.3. Acondicionamiento de los tratamientos ............................................................................. 47 5.6.4. Lavado de suelo con substancias hmicas ........................................................................... 48

5.6.4.1. Diseo experimental factorial completo............................................................................. 48 5.6.5. Fermentacin slida del suelo lavado .................................................................................... 49

5.6.5.1. Acondicionamiento del suelo lavado .................................................................................. 49 5.6.6. 5.6.7. 6. Lixiviado....................................................................................................................................... 49 Anlisis estadstico .................................................................................................................... 49

RESULTADOS Y DISCUSION.................................................................................................................. 50 6.1. 6.2. 6.3. 6.4. 6.5. CARACTERIZACIN DEL SUELO CONTAMINADO ................................................................................... 50 CARACTERIZACIN DEL BAGACILLO DE CAA ...................................................................................... 57 CARACTERIZACIN DE LA VERMICOMPOSTA ........................................................................................ 58 CARACTERIZACIN DEL EXTRACTO DE LEONARDITA ........................................................................... 59 SELECCIN DE LA FUENTE DE NITRGENO (EN FUNCIN DE LA SOBREVIVENCIA DE LA LOMBRIZ,

EISENIA ANDREI) ................................................................................................................................................ 61 6.6. FERMENTACIN SLIDA DEL SUELO CONTAMINADO ........................................................................... 63 Remocin de HTPs de acuerdo al DEFG planteado ........................................................... 63

6.6.1.

6.6.1.1. Efecto del bagacillo de caa en la remocin de HTPs ................................................... 66 6.6.1.2. Efecto del extracto de leonardita (cidos hmicos) en la remocin de HTPs ............ 68

VIII

6.6.1.3. Efecto de la presencia de la lombriz (Eisenia andrei) en la remocin de HTPs......... 74 6.6.1.4. Efecto de la vermicomposta en la remocin de HTPs ................................................... 79 6.6.1.5. Efecto de la humedad (blanco a) en la remocin de HTPs ........................................ 80 6.6.1.6. Efecto de la bioestimulacin con sales minerales (blanco c) en la remocin de HTPs ......... 80 6.6.2. 6.6.3. 6.6.4. 6.6.5. 6.6.6. 6.6.7. 6.6.8. Eficiencia de remocin de HTPs en los diferentes tratamientos........................................ 81 Niveles de remocin de HTPs libres de la fraccin de asfaltenos ..................................... 82 Remocin HTPs a largo plazo (11 meses) ........................................................................... 83 Remocin de asfalteno contenidos en la mezcla compleja de HTPs ............................... 84 Fraccionamiento de los HTPs residuales .............................................................................. 88 Anlisis Estadstico de la Fermentacin Slida del Suelo ................................................... 90 Monitoreo de la poblacin microbiana .................................................................................... 93

6.6.8.1. Carbono de biomasa ............................................................................................................ 93 6.6.8.2. Cuenta total para Bacterias ................................................................................................. 95 6.6.8.3. Cuenta total para Levaduras ............................................................................................... 98 6.6.8.4. Cuenta total para Hongos .................................................................................................. 101 6.6.8.5. Cuenta total para Actinomicetos ....................................................................................... 103 6.6.9. 6.6.10. 6.6.11. 6.7. Correlacin de la poblacin microbiana hidrocarbonoclasta y la remocin de HTPs... 105 Formacin de cidos hmicos ............................................................................................... 108 Correlacin de la formacin de cidos hmicos y la remocin de HTPs ....................... 110

LAVADO DE SUELO CON SUBSTANCIAS HMICAS................................................................................ 112 Anlisis Estadstico de la remocin HTPs del suelo lavado ............................................. 112 Determinacin de la Concentracin Micelar Crtica (CMC) del EL en solucin ............. 115

6.7.1. 6.7.2. 6.8.

FERMENTACIN SLIDA DEL SUELO LAVADO ..................................................................................... 119 Eficiencia de remocin de HTPs en los diferentes los tratamientos ................................... 122 Niveles de remocin de HTPs libres de la fraccin de asfaltenos ...................................... 123 Fraccionamiento de los HTPs residuales ............................................................................... 126 Monitoreo de la poblacin microbiana...................................................................................... 128

6.8.1. 6.8.2. 6.8.3. 6.8.4.

6.8.4.1. Carbono de biomasa (Cb) ................................................................................................. 128

IX

6.8.4.2. Cuenta total para Bacterias y Carbono de biomasa (Cb) ............................................. 129 6.9. 7. 8. 9. TRATAMIENTO DEL LIXIVIADO.............................................................................................................. 130

CONCLUSIONES...................................................................................................................................... 133 BIBLIOGRAFA .......................................................................................................................................... 135 ANEXO........................................................................................................................................................ 153

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Columna de suelo y la organizacin de sus diferentes horizontes Figura 2. Componentes principales de los agregados del suelo Figura 3. Propiedades fisicoqumicas de las substancias hmicas (SH), Figura 4. Fragmento estructural hipottico de las Substancias Hmicas del suelo Figura 5. Regeneracin de la capacidad oxido-reduccin de las quinonas Figura 6. Regiones susceptibles de fragmentacin y biodegradacin en los asfaltenos Figura 7. Migracin de los HTPs en el ambiente Figura 8. Estrategia experimental para la remocin de HTPs del suelo Figura 9. Dispositivo experimental para llevar a cabo la fermentacin slida del suelo Figura 10. Diseo Experimental Factorial General Figura 11. cidos hmicos presentes en el suelo Figura 12. Asfaltenos e hidrocarburos libres de asfaltenos, contenidos en el suelo Figura 13. Perfil cromatogrfico del hidrocarburo libre de asfaltenos Figura 14. Perfil cromatogrfico de los asfaltenos del suelo contaminado sin biotratar Figura 15. Flora microbiana total asociada al suelo Figura 16. Flora microbiana hidrocarbonoclasta asociada al suelo Figura 17. Flora microbiana total asociada a la vermicomposta Figura 18. cidos hmicos y cidos flvicos aislados de la vermicomposta Figura 19. Estructura hipottica de los cidos hmicos Figura 20. Flora microbiana hidrocarbonoclasta asociada al extracto de leonardita Figura 20. Lombriz Eisenia andrei en los microcosmos Figura 21. Lombriz Eisenia andrei Figura 22. Hidrocarburos totales del petrleo remanentes Figura 23. Efecto de la presencia de bagacillo de caa en la remocin de HTPs Figura 24. Efecto de la ausencia de bagacillo de caa en la remocin de HTPs Figura 25. Representacin tridimensional de los cidos hmicos Figura 26. Efecto de la presencia de extracto de leonardita en la remocin de HTPs

1 2 7 11 11 16 18 42 45 46 51 54 54 55 56 57 58 59 60 60 61 62 64 67 67 68 69

XI

Figura 27. Efecto de la ausencia de extracto de leonardita en la remocin de HTPs Figura 28. Modelo de interaccin de los cidos hmicos con xenobiticos Figura 29. Estructura de los agregados de asfalteno y floculacin de estos Figura 30. Efecto de la presencia de cidos hmicos en los suelos compactos Figura 31. Remocin de HTPs en presencia de lombrices Figura 32. Remocin de HTPs en presencia de lombrices y extracto de leonardita Figura 33. Remocin de HTPs en presencia de lombrices y bagacillo de caa Figura 34. Remocin de HTPs en presencia de lombrices, bagacillo de caa y extracto de leonardita Figura 35. Cocn de la lombriz Eisenia andrei y lombrices recin nacidas Figura 36. Efecto de la vermicomposta en la remocin de HTPs Figura 37. Remocin de HTPs despus de 11 meses de tratamiento Figura 38. Perfil cromatogrfico de los asfaltenos Figura 39. Perfiles cromatogrficos del mejor tratamiento Figura 40. Fraccionamiento de los HTPs residuales antes y despus del tratamiento Figura 41. Interaccin BC-L en presencia de EL Figura 42. Interaccin BC-L en ausencia de EL Figura 43. Interaccin BC-EL sin lombrices Figura 44. Interaccin BC-EL en presencia de 20 lombrices Figura 45. Interaccin BC-EL en presencia de 40 lombrices Figura 46. Comportamiento del carbono de biomasa para los tratamientos del DEFG Figura 47. Comportamiento del carbono de biomasa para los blancos a y c Figura 48. Efecto del BC, EL y lombrices en las cinticas de crecimiento de las bacterias Figura 49. Efecto del BC, EL y lombrices en las cinticas de crecimiento de las levaduras Figura 50. Efecto del BC, EL y lombrices en las cinticas de crecimiento de los hongos Figura 51. Efecto del BC, EL y lombrices en las cinticas de crecimiento de los actinomicetos Figura 52. Correlacin entre el crecimiento microbiano y la remocin de HTPs Figura 53. Sntesis de AHs para los tratamientos sin EL del DEFG, a lo largo del proceso Figura 54. Sntesis de AHs para los tratamientos con EL del DEFG, a lo largo del proceso Figura 55. Correlacin entre la formacin de cidos hmicos y la remocin de HTPs

69 72 73 73 75 75 76 76 78 79 83 85 87 89 91 91 92 92 92 93 94 96 99 102 103 106 109 109 111

XII

Figura 56. Superficie de respuesta de la interaccin S-EL, en presencia de 50ml de agua Figura 57. Superficie de respuesta de la interaccin S-EL, en presencia de 100ml de agua Figura 58. Superficie de respuesta de la interaccin S-EL, en presencia de 150ml de agua Figura 59. Determinacin de la CMC del EL Figura 60. Posible interaccin de los cidos hmicos con las molculas de suelo y HTPs Figura 61. Cintica de remocin de HTPs del suelo lavado Figura 62. Hidrocarburos totales del petrleo remanentes Figura 63. Perfil cromatogrfico del tratamiento del suelo lavado Figura 64. Fraccionamiento de los HTPs del suelo lavado antes y despus del biotratamiento

113 114 114 116 118 119 121 125 127

Figura 65. Fraccionamiento de los HTPs del suelo lavado biotratado y el mejor biotratamiento del suelo sin lavar Figura 66. Comportamiento del carbono de biomasa para los blancos y el suelo lavado Figura 67. Efecto del lavado de suelo en las bacterias del tratamiento Figura 68. Efecto del lavado de suelo en el nivel de remocin de HTPs Figura 69. Lixiviado del proceso de lavado Figura 70. Perfil cromatogrfico del lixiviado antes (A) y despus (B) del tratamiento 127 128 129 129 130 132

XIII

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Clasificacin general de los compuestos del petrleo Tabla 2. Facilidad de degradacin de HTPs y productos de su metabolismo Tabla 3. Tecnologas de remediacin Ex situ de acuerdo a la USEPA Tabla 4. Tecnologas de remediacin In situ de acuerdo a la USEPA Tabla 5. Tecnologas de Biorremediacin Ex situ e In situ, de acuerdo a la USEPA Tabla 6. Actividad enzimtica detectada en la flora microbiana intestinal de la lombriz Tabla 7. Efecto de diversos hidrocarburos sobre la lombriz Tabla 8. Factores limitantes en la remocin de hidrocarburos totales del petrleo Tabla 9. Determinaciones analticas aplicadas a los materiales empleados Tabla 10. Factores y niveles usados en el diseo factorial 3 3 Tabla 11. Caracterizacin fsica y qumica de los materiales empleados Tabla 12. Caracterizacin biolgica de los materiales empleados Tabla 13. Hidrocarburos identificados en el suelo contaminado Tabla 14. Porcentaje de remocin de HTPs al termino del tratamiento (94 das)

14 21 23 24 27 32 34 35 43 48 52 53 55 64

Tabla 15. Velocidad de remocin de HTPs (mgHTPs/cm 3da) durante el tratamiento (94 das) 65 Tabla 16. Disminucin de la eficiencia de remocin de los tratamientos del DEFG Tabla 17. Remocin de HTPs con y sin asfaltenos Tabla 18. Eficiencia de remocin de asfaltenos en los tratamientos seleccionados Tabla 19. Tipo y concentracin de hidrocarburos residuales Tabla 20. Porcentaje de remocin de HTPs del DEFG Tabla 21. Porcentaje de remocin de HTPs del DEFC para el lavado de suelo Tabla 22. HTPs removidos mediante lavado con cidos hmicos 81 82 86 86 90 112 117

Tabla 23. Velocidad de remocin de HTPs (mgHTPs/cm 3da) durante el tratamiento (94 das) 120 Tabla 24. Porcentaje de remocin de HTPs al termino del tratamiento (94 das) Tabla 25. Disminucin de la eficiencia de remocin de los tratamientos del DEFG y el suelo lavado 121 122

XIV

Tabla 26. Niveles de remocin de HTPs en funcin de la presencia de asfaltenos Tabla 27. Tipo y concentracin de hidrocarburos residuales, para el suelo lavado Tabla 28. Tipo y concentracin de hidrocarburos residuales, para el lixiviado

123 124 131

XV

INDICE DE ANEXOS

Anlisis estadsticos

153

A1. A2.

Porcentaje de contribucin de los trminos del DEFG al modelo

153

Anlisis de varianza de los efectos seleccionados como principales contribuyentes del 153 154 156

anlisis estadstico del DEFG A3. A4. A5. Graficas de residuales del DEFG Graficas de residuales del DEFC

Porcentajes de remocin de los diferentes tratamientos y el suelo lavado, respecto a 158

los blancos a, b y c

Determinaciones analticas

B1. B2. B3. B4. B5. B6.

Extraccin de HTPs (EPA 3550b) Recuperacin de Asfaltenos Fraccionamiento de Hidrocarburos Ligeros (sin asfaltenos) Anlisis cromatogrfico Capacidad de Retencin de Agua (CRA)

159 160 160 161 162

Mtodo de extraccin de Substancias Hmicas del Suelo, mtodo de la IHSS 162 164 165 165 166

(International Humic Substances Society) modificado B7. B8. B9. B10. Cuenta total en placa Microorganismos hidrocarbonoclastas Carbono de Biomasa (Islam and Weil, 1998) Elaboracin del alimento de lombriz

XVI

NOTACIN

SHs AHs M.O.S. HPAs HTPs S EL BC VC CRA

Substancias hmicas cidos hmicos Materia Orgnica del Suelo Hidrocarburos Policclicos Aromticos Hidrocarburos Totales del Petrleo Suelo Extracto de Leonardita Bagacillo de Caa Vermicomposta Capacidad de Retencin de Agua

XVII

RESUMEN

Las Interacciones fsico-qumicas y la estimulacin biolgica son la base de algunas tecnologas aplicadas actualmente a la remediacin de suelos contaminados. Se ha sugerido que el desarrollo de una tecnologa combina de estos dos principios aumentar la eficiencia de recuperacin de suelos contaminados. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de las lombrices de tierra (L) y los cidos hmicos (AH), en la biorremediacin de un suelo arcilloso muy contaminado con complejas mezclas de hidrocarburos totales del petrleo (HTP) intemperizados. Debido a la alta toxicidad de las sales minerales en las lombrices de tierra, fue usada vermicomposta (VC), como fuente de nitrgeno y de fsforo. Cuatro kg de suelo contaminado con 83000 mg HTP/kg de suelo (28.5% alifticos, 15% aromticos, 21.5% saturados y 35% asfaltenos) fueron bioestimulados con agua (60% de la capacidad de retencin de agua, CRA) y VC; Relacin C:N:P de 100:25:1. A continuacin, L y AH, as como el bagacillo de caa (BC), se incorporaron de acuerdo a un diseo factorial 3 2 2, de la siguiente manera: L, tres niveles: 0, 20, 40; BC, dos niveles: 0%, 6%, y AH, dos niveles: 0%, 1%. Por otra parte, cuatro kg de suelo contaminado con 83000 mg HTP/kg de suelo, fueron lavados con una solucin de cidos hmicos (3g / L), con una relacin 1:10 (suelo: solucin) obtenindose suelo contaminado con 50000 mg HTP/kg de suelo (35.7% de remocin de HTPs). Este suelo se bioestimul de acuerdo con el mejor tratamiento del suelo sin lavar (con BC, AH y 40 L). Los tratamientos se incubaron a temperatura ambiente (25 2C) y pH 7 0.5, durante 94 das, airendolos diariamente. Las muestras fueron analizadas peridicamente para HTP residuales, produccin de AH y crecimiento microbiano, como carbono de biomasa y unidades formadoras de colonias (UFC/g suelo). Segn el ANDEVA, las variables L, AH y BC tienen un efecto significativo en la remocin de HTP con una p(F) <0,05. El mayor porcentaje de remocin de HTP (64 2% en 94 das) se obtuvo con el tratamiento compuesto por BC, AH y 40 L. Este tratamiento removi el 35% de los asfaltenos, 85% de alifticos, 78% de aromticos y 73% saturados. En trminos generales, los porcentajes de eliminacin de HTP estuvieron en el rango de 64% a 28%, el ms bajo correspondi a una prueba control preparada con agua y VC. El crecimiento microbiano y la produccin de AH, se correlacionaron con la remocin de HTP. Estos resultados se pueden explicar desde dos puntos de vista: i) una mejor disponibilidad de todas las fracciones de hidrocarburos degradables, cuando se aadieron AH, ii) la presencia de una microflora (del BC y VC) con la capacidad de consumir hidrocarburos. El suelo lavado biotratado, tuvo una remocin de TPH de slo 472% en 94 das. Este tratamiento removi el 15.7% de los asfaltenos, 69.9% de alifticos, 64.3% aromticos y 52.6% saturados. Este resultado se puede explicar debido a la prdida de microorganismos hidrocarbonoclastas, despus de lavar el suelo.

XVIII

ABSTRACT

Physico-chemical interaction and microbial stimulation are the base of some technologies currently applied to the remediation of polluted soils. It has been suggested that the development of a hybride technology combining these two cleaning principles would increase the efficiency of polluted soil recuperation. The purpose of this work was to evaluate the effect of earthworms (EW) and humic acids (HA), on bioremediation of clay soi l highly polluted with complex mixtures of weathered total petroleum hydrocarbons (TPH). Due to the highly toxic effect of the mineral salts on the earthworms, vermicomposta (VC) was used as nitrogen and phosphorous source.

Four kg of soil polluted with 83,000 mg TPH/kg of dry soil (28.5% aliphatics, 15% aromatics, 21.5% saturates and 35% asphaltenes) were biostimulated with water (60% of the water holding capacity, CRA) and VC; relation C:N:P of 100:25:1. Next, EW and HA, as well as sugar cane bagasse (SCB), were incorporated according to a factorial design 322, as follows: EW, three levels: 0, 20, 40; SCB, two levels: 0%, 6%; and HA, two levels: 0%, 1%. On the other hand, Four kg of soil polluted with 83,000 mg TPH/kg of dry soil, were washed with a sol ution of humic acids (3g/L) with a ratio 1:10 (soil:solution) obtaining soil polluted with 50,000 mg TPH/kg of dry soil (35.7% of TPH removal). This soil were biostimulated according to the best treatment from the soil unwashed (with SCB, HA and 40 EW). The treatments were incubated at environmental room temperature (25 2C) and pH 7 0.5, during 94 days; the treatments were daily aerated. Samples were periodically analyzed for residual TPH, HA production and microbial growth as biomass carbon and colony forming units (UFC/g of dry soil).

According to the ANOVA, the EW, HA and SCB factors have a significant effect on the TPH removal with a p(F)<0.05. The highest TPH removal percentage (64 2% in 94 days) was obtained with the treatment composed by SCB, HA and 40 EW. This treatment removed 35% of asphaltenes, 85% of aliphatics, 78% aromatics and 73% saturates. In general terms, the TPH removal percentages were in the range 64% to 28%, the lowest one corresponded to the control test prepared with polluted soil, water and VC. The microbial growth and HA production, were correlated with the TPHs removal. These results could be explained from two points of view: i) a better availability of all degradable hydrocarbon fractions, when HA were added. ii) the presenc e of a microflora (from SCB and VC) with the ability to consume hydrocarbons. The soil washed and biotreated has a TPH removal of only 472% in 94 days. This treatment removed 15.7% of asphaltenes, 69.9% of aliphatics, 64.3% aromatics and 52.6% saturates. This result could be explained due to the loss of hydrocarbonoclast microorganisms, after soil washing.

XIX

1. INTRODUCCIN

1.1. Suelo

El suelo es definido como el manto de roca erosionada que contiene materia orgnica, minerales y nutrientes capaces de soportar el crecimiento de plantas, mientras que la fertilidad del suelo, es atribuida a la actividad de los microorganismos.

El suelo se encuentra formado por capas denominadas horizontes. Estos horizontes van a variar tanto en su estructura como en su poblacin microbiana. Los horizontes se encuentran ordenados empezando por el "0" y luego por letras en orden alfabtico (Figura 1). El horizonte "0" es el formado por desechos animales y plantas, es el horizonte orgnico; los horizontes A y B son los principales depsitos de compuestos como xidos y salicilatos; en ellos se llevan a cabo los fenmenos de lixiviacin y deposito de materiales orgnicos e inorgnicos. El horizonte C se caracteriza por una baja actividad biolgica y contienen acumulaciones de carbonatos de Ca y Mg, es el ltimo horizonte y colinda con la roca madre. La actividad microbiana se da principalmente en los 15-20 cm superiores de la columna del suelo, despus de esta profundidad, el nmero as como la actividad microbiana disminuye (Sylvia, 1998)

Figura 1. Columna de suelo y la organizacin de sus diferentes horizontes.

El suelo, posee caractersticas fsicas y qumicas como: textura, densidad, porosidad, estructura, pH, intercambio inico, humedad y nutrientes, que le confieren sus propiedades (Sylvia et al, 1999). La textura est dada principalmente por las proporciones de arcilla, limo y arena, que influyen en la densidad y porosidad de los suelos; los cuales son un factor importante en la ecologa de los microorganismos, debido a que determinan el rea superficial disponible para el crecimiento microbiano (Atlas-Bartha, 1998).

La composicin heterognea (slido, lquido, gaseoso) tanto a lo largo como a lo profundo del suelo, permite el crecimiento microbiano formando un hbitat complejo (Figura 2), en donde existe una gran competencia de los microorganismos por nutrientes, espacio y humedad. Los microorganismos que conforman el suelo son numerosos y diversos, los ms pequeos (bacterias, actinomicetos, levaduras y hongos) son denominados microflora (Sylvia, et al, 1999). De los microorganismos que forman la microflora, las bacterias son los ms abundantes (10 ), seguidos por actinomicetos (10 -10 ) y hongos (104-106) (Sylvia, 1999).
8 6 7

Figura 2. Componentes principales de los agregados del suelo.

1.1.1.

Componentes del suelo

Los componentes primarios del suelo son: 1) compuestos inorgnicos no disueltos, producidos por la meteorizacin y la descomposicin de las rocas superficiales; 2) los nutrientes solubles utilizados por las plantas; 3) distintos tipos de materia orgnica, viva o muerta y 4) gases y agua requeridos por las plantas y por los microorganismos. La naturaleza fsica del suelo est determinada por la textura. Los suelos con un porcentaje elevado de arcilla, tienen baja porosidad (30-45%) y capacidad de retencin de agua. Si el suelo tiene mayor contenido de arcilla que arena con la misma cantidad de limo, el suelo es cohesivo, teniendo una mayor capacidad de retencin de agua y por lo tanto velocidades de infiltracin y aireaciones bajas. Esto se debe a que los poros de mayor tamao son vaciados rpidamente y la cantidad de agua que queda en la matriz del suelo es pequea. En los suelos arcillosos, el agua es absorbida en los poros pequeos y la disminucin de su contenido es ms gradual. Por otro lado, la superficie neta negativa de las arcillas favorece la formacin de agregados que ocasionan el secuestramiento de nutrientes. Los agregados se forman por los enlaces inicos mediante catines polivalentes presentes en el suelo, entre arcillas y materia orgnica. Estos complejos favorecen una gran adsorcin de compuestos orgnicos hidrofbicos (Soderstrom, 2000).

Las grandes partculas del suelo, como la arena y la grava, son en su mayor parte qumicamente inactivas; mientras que las pequeas partculas inorgnicas, como las arcillas, presentan actividad inica, y adems determinan en gran medida la capacidad de un suelo para almacenar agua. La parte orgnica del suelo est formada por restos vegetales y animales, junto a cantidades variables de materia orgnica amorfa llamada humus. Se forma a partir del proceso metablico de los microorganismos, al consumir compuestos orgnicos complejos que constituyen la materia viva. La fertilidad de un suelo est relacionada directamente con el contenido de materia orgnica; ya que mejora la estabilidad del suelo, aumentando su porosidad y capacidad de retencin de agua; lo que favorece el intercambio de gases y agua para los microorganismos. El humus adems, favorece la fijacin de nutrientes y los mantiene ms tiempo a disposicin de los vegetales y los microorganismos.

La materia orgnica presenta una gran rea superficial con propiedades de intercambio inico, donde se lleva a cabo la adsorcin de compuestos orgnicos, lo cual puede limitar su biodisponibilidad. Las componentes del suelo determinan la zona donde los microorganismos estarn adheridos. El 60% de las bacterias se localizan en partculas recubiertas con materia orgnica; y solo se encuentran en el 0.02% de la superficie de partculas arenosas (Mihelcic, 1993). El componente liquido o solucin de

suelo, est formado por agua con varias sustancias minerales, oxgeno y dixido de carbono disueltos. A travs de esta solucin, los nutrientes son absorbidos por los microorganismos. Los principales gases contenidos en el suelo son oxgeno, nitrgeno y dixido de carbono.

1.1.2.

Suelo y su dinmica

El suelo es un organismo vivo: un consorcio de clulas vivas en una matriz orgnico-mineral. Ni las clulas vivas, ni la composicin de esta matriz son constantes: ambas varan con el tiempo y el lugar.. De hecho, existen muchas y variadas interacciones entre el suelo, los microorganismos y las plantas, que influyen en gran medida sobre el crecimiento y el desarrollo de estas ltimas. La macrofauna conduce a la depredacin de los microbios, a la estructura del suelo y a la descomposicin de la materia orgnica. Por ejemplo, las lombrices de tierra afectan en gran medida a la estructura fsica del suelo: fomentan el crecimiento de las races y la ventilacin del suelo gracias a las galeras que fabrican en l, al tiempo que remueven la materia orgnica.

El suelo es una matriz compleja donde interacta permanentemente el agua y el aire (Schwarzenbach et al., 2003) y por lo tanto su contaminacin puede propagarse directamente a las superficies, aguas subterrneas y aire (Fent, 2003).

Cuando se sobrepasa la capacidad detoxificadora natural de la tierra, se alteran los ciclos biogeoqumicos y la calidad del suelo se ve seriamente afectada, debido a una disminucin de la micro y macrofauna autctona (Martn, 2004). La cual tiene la funcin de acelerar la descomposicin de la materia orgnica (mineralizacin que involucra la transformacin de compuestos orgnicos en inorgnicos) y su fijacin a estructuras complejas estables como las substancias hmicas

(humificacin que es la sntesis y/o unin qumica y/o biolgica de compuestos de degradacin de residuos de origen vegetal y animal), que constituyen un 80% de la materia orgnica del suelo, y es denominada Humus (Frnd, 1994).

1.1.2.1. Humus

En toda materia orgnica se deben presentar los procesos de mineralizacin (transformacin de compuestos orgnicos en inorgnicos) y humificacin (sntesis y/o unin qumica y/o biolgica de compuestos de degradacin de residuos de origen vegetal y animal), que conducen a la produccin de humus. Estos procesos son lentos, de varios meses a decenas de aos, en funcin del tipo de materia orgnica y los factores del medio ambiente (Perminova, 2005).

El humus se encuentra en la capa superior del suelo. Es producto de transformaciones, descomposiciones y resntesis de molculas orgnicas, en las cuales no quedan vestigios microscpicos visibles de los tejidos o clulas originales. Su color es oscuro y est conformado

bsicamente por carbono, oxgeno, hidrgeno y nitrgeno, lo que contribuye a la agregacin del suelo (formacin de terrones). El humus favorece la accin microbiana y su alta capacidad de intercambio catinico le permite retener nutrientes (Tan, 2003).

La composicin del humus depende en parte del tipo de suelo, ya que ste puede favorecer el desarrollo de las sustancias orgnicas. Tiende a favorecer la aireacin o, por el contrario, puede paralizarla, originando condiciones de anaerobiosis (por ejemplo en suelos hidromorfos o arcillosos). Tambin participan en su formacin la microflora, micro y mesofauna del terreno. El principal factor que determina la composicin del humus es el tipo de vegetacin existente, pues de ella deriva la materia prima cuyas sucesivas descomposiciones originan el humus. Tambin el clima resulta decisivo en este proceso, ya que la humedad y la temperatura influyen esencialmente sobre la composicin del humus y sobre los microorganismos que transforman la sustancia orgnica. Puede ocurrir que la oxidacin del producto bacteriano sea incompleta y los azcares se caramelizan y formen sustancias parecidas a las melaninas, de naturaleza cclica, que engrosan el grupo aromtico

de los precursores hmicos. Tambin se producen condensaciones entre los aminocidos y los cidos alcohlicos para generar cadenas alifticas que constituirn los terminales activos de las sustancias hmicas. (Perminova, 2005)

Las paredes bacterianas pueden dar lugar, mediante un proceso de carbonizacin en ambientes reductores, a unas sustancias oscuras y poco activas que se conocen como huminas microbianas o huminas heredadas, ya que se sitan al margen del proceso general de humificacin.

Los compuestos aromticos, por la accin de grupos de bacterias especficas se fragmentan y generan quinonas que son susceptibles de polimerizarse y generar ncleos aromticos, de masa molecular elevada, que son la base de todas las sustancias hmicas. Sobre estos ncleos aromticos se insertan la cadenas alifticas ya citadas, ricas en grupos carboxlicos, amnicos y alcohlicos, para generar los cidos flvicos, cidos hmicos y huminas de condensacin que son los componentes primordiales del humus (Tan, 2003).

1.1.2.1.1.

Tipos de humus

Desde un punto de vista global (evolucin, morfologa, propiedades, unin a la fraccin mineral) el material orgnico se clasifica en tres tipos bsicos de humus (Tan, 2003): Mor. Materia orgnica muy poco transformada. Moder. Mayor transformacin de la materia orgnica (Flvicos y precursores). Mull. Materia orgnica evolucionada (cidos hmicos, coloracin del horizonte muy oscura).

1.1.2.2. Composicin del Humus (Substancias Hmicas)

El humus suele fraccionarse en tres compuestos, siguiendo su extraccin del NaOH: humina, cido flvico y cido hmico (Figura 3). La humina es la fraccin que no contiene NaOH y que es susceptible de ser dispersada. El cido hmico, por su parte, es una fraccin de humus soluble en NaOH, que resulta insoluble cuando el pH es 2. El peso molecular del cido hmico vara de 10.000 a 100.000

Daltones y est compuesto por anillos aromticos, compuestos cclicos de nitrgeno y cadenas peptdicas de estructura indeterminada. El cido hmico presenta una composicin general de 57% de carbono y 4% de nitrgeno. Los grupos funcionales del cido hmico son el COOH, el OH fenlico, el OH alcohlico y las cetonas. El cido flvico es soluble en NaOH y a un pH 2. Resulta ms pequeo que el cido hmico, con un peso molecular que va de 1.000 a 30.000 Daltones. No obstante, los procedimientos de extraccin slo recuperan de un 10 a un 20% de los cidos hmico y flvico que hay en el suelo. Durante la extraccin de los cidos fulvicos, podemos recuperar tambin una gran variedad de carbohidratos del suelo, como monosacridos (hexosas como la glucosa y la galactosa, as como pentosas como la arabinosa y la xilosa), disacridos (sacarosa y celobiosa), olisacridos (celotriosa) polisacridos (celulosa y hemicelulosa), aminoazcares (glucosamina), alcoholes del azcar (como el manitol), cidos azucarados (como los cidos, galacturnico y glucurnico) y azcares mediados (Tan, 2003).

Figura 3. Propiedades fisicoqumicas de las substancias hmicas (SH), Stevenson

1.1.2.3. Substancias Hmicas y sus propiedades

La caracterstica ms importante de cidos hmicos recae en su capacidad de unir iones metlicos insolubles, los xidos e hidrxidos, y liberarlos lenta y continuamente a las plantas cuando son requeridos (Tan, 2003). Debido a estas propiedades, los cidos hmicos son conocidos por producir tres tipos de efectos: fsico, qumico y biolgico.

Fsicos

Los cidos hmicos modifican fsicamente la estructura del suelo. Mejorar la estructura del suelo: Previenen la perdida elevada de agua y nutrientes en das calurosos y suelos arenosos. En suelos pesados y compactos, la aireacin del suelo y retencin de agua se mejora Previenen el agrietamiento y la erosin de suelo, aumentando la capacidad de de la formacin de agregados. Incrementan la capacidad de retencin de agua y previenen la sequa. Obscurecen el color del suelo y as ayudan a la absorcin de la energa del sol.

Qumicos

Los cidos hmicos qumicamente cambian las caractersticas de fijacin del suelo. Neutralizan los suelos cidos y alcalinos; regulan el pH de los suelos. Mejoraran y optimizan la absorcin de nutrientes; as como, agua por las plantas. Aumentaan la caracterstica reguladora del suelo. Actuar como quelador natural para iones metlicos bajo condiciones alcalinas y promueven su transporte a las plantas. Ricos tanto en sustancias orgnicas y minerales esenciales para el crecimiento vegetal. Conservan los fertilizantes inorgnicos solubles en agua en las zonas de la raz y reducen su lixiviacin.

Poseen capacidades extremadamente altas de intercambio catinico. Promueven la conversin de los nutrientes (N, P, K + Fe, Zn y otros oligoelementos) en las formas disponibles para las plantas. Realzan la absorcin del nitrgeno por las plantas. Reducen la reaccin del fsforo con: Ca, Fe,Mg y Al de manera que los liberan en una forma que sea disponible y beneficiosa a las plantas. La productividad de fertilizantes minerales se aumenta considerablemente. Liberan el dixido de carbono del carbonato de calcio del suelo y permitir su uso en fotosntesis. Ayudar a eliminar la clorosis debido a la deficiencia de hierro en plantas. Reducir la disponibilidad de sustancias txicas en suelos.

Biolgicos

Los cidos hmicos estimulan la planta y la actividad de los microorganismos. Estimulan las enzimas de la planta y aumentar su produccin. Actuan como catalizadores orgnicos en muchos procesos biolgicos. Estimulan el crecimiento y la proliferacin de microorganismos en suelo. Realzan la resistencia natural de la planta contra enfermedades y parsitos. Estimulan el crecimiento de la raz, especialmente verticalmente y permitir una mejor absorcin de alimentos. Aumentan la respiracin de la raz y la formacin de la raz. Promueven el desarrollo de la clorofila, de los azcares y de los aminocidos en plantas y ayuda en la fotosntesis. Aumentan las vitaminas y el contenido mineral de plantas. Espesan las membranas celulares en frutas y prolongan el tiempo de anaquel. Aumentan la germinacin y la viabilidad de semillas.

Estimulan el crecimiento vegetal (una produccin ms alta de la biomasa) acelerando la divisin de clula, aumentando el ndice de desarrollo en sistemas de la raz y aumentando la produccin de la materia seca. Aumentan la calidad de producciones; mejorar su aspecto fsico y valor alimenticio.

La gran mayora de los investigadores de las substancias hmicas, concuerdan en que gracias a los grupos funcionales de stas, se debe su actuacin en las propiedades fsicas y qumicas del suelo, as como en las funciones fisiolgicas de las plantas y en la nutricin vegetal.

Se cree que las substancias hmicas intervienen directamente en una gran cantidad de procesos fisiolgicos involucrados con el crecimiento de las plantas e indirectamente en la nutricin vegetal en forma similar a los intercambiadores de iones sintticos (agentes quelatantes), sin embargo, este mecanismo no est bien dilucidado (Schnitzer, 2000).

En la estructura de los AH, una de las formas muy interesantes, es la presencia de vacos de variadas dimensiones, los cuales pueden atrapar o unir otros componentes orgnicos como carbohidratos, protenas y lpidos o bien inorgnicos como arcillas minerales y oxihidrxidos. Adems, los carbohidratos y las protenas, son adsorbidos en la superficie externa y en los vacos internos, los puentes de hidrgeno juegan un importante papel en su inmovilizacin, junto con el agua (Tan, 2003). Los grupos funcionales, principalmente los oxigenados, estn involucrados en reacciones con metales y minerales, los que proveen elementos nutrimentales para las races de los vegetales. Los AH y los AF pueden complejar y/o quelatar cationes, debido a su alto contenido de grupos funcionales libres (Figura 4). La reduccin de humus fue reconocida como un camino respiratorio en 1996 (Lovley, et. al., 1996) y que las sustancias hmicas pueden desempear un papel importante en la biodegradacin anaerobia y la biotransformacin de compuestos orgnicos as como inorgnicos. El humus puede servir como un aceptador de electrones terminal que apoya la oxidacin microbiana anaerobia de una amplia variedad de substratos orgnico. El humus microbianamente reducido puede transferir electrones a xidos metlicos, como Fe (III) y Mn (IV), teniendo la regeneracin humus a la forma

10

oxidada. As, las sustancias hmicas puede mediar tanto oxidacin anaerobia como la reduccin de xido metlica (Figura 5).

Figura 4. Fragmento estructural hipottico de las Substancias Hmicas del suelo (Kleinhempel, 1970). Los crculos indican algunos de los grupos funcionales de la molcula como son: pptidos, carbohidratos, quinonas, molculas aromticas, etc.
OH

Fe3+ Acetato CO2

Microorganismos
OH R

Proceso Abitico

Fe2+

Bacterias reductoras de humus

Humus Reducido
O

Bacterias oxidantes de humus

Nitrato

R O

Microorganismos

Humus Oxidado

Amoniaco o N2

Figura 5. Regeneracin de la capacidad oxido-reduccin de las quinonas, mediante bacterias oxidantes y reductoras de humus; as como, procesos anaerbicos.

11

Adems, las substancias hmicas reducidas tambin pueden servir como un donante de electrones para conseguir la reduccin microbiana de aceptadores de electrones ms oxidados, como el nitrato, fumarato y clorato. Diversas pruebas indican que las quinonas en el humus pueden desempear papeles diferentes que contribuyen a la biodegradacin anaerobia y la biotransformacin de substratos ecolgicamente importantes, as como contaminadores de prioridad (Field and Cervantes, 2005). Los cidos Hmicos y los compuestos de modelo de quinona apoyaron la oxidacin microbiana anaerobia de varios substratos importantes sirviendo como un aceptador de electrones terminal en muchos ambientes diferentes. Los consorcios que respiran humus tambin mostraron la capacidad de mineralizacin de contaminantes, como el tolueno, cuando el humus y quinonas fueron proporcionados como un aceptador de electrones final (Field and Cervantes, 2005). As, una tecnologa basada en la inyeccin substancias hmicas en acuferos y sedimentos para estimular la biorremediacin de sitios contaminados puede ser considerada. Las substancias hmicas no necesariamente tienen que ser suministradas en abundancia para estimular el biorremediacin de estos sitios (Tan, 2003).

1.1.2.3.1.

Propiedades detergentes de las Substancias Hmicas

Recientemente se ha sugerido que los cidos de hmicos son especies anfipticas, cuyo comportamiento en solucin sugiere que forman pseudomicelas y agregados semejantes a las micelas formadas por las familias de surfactantes sintticos. Un modelo alternativo recientemente concebido sugiere que los cidos hmicos consisten en subunidades relativamente pequeas que se asocian a travs de las interacciones moleculares dbiles formando pseudomicelas (Conte, 2005; Quagliotto et. al., 2006). Se piensa que las pseudomicelas de los cidos hmicos pueden ser formadas por enrollamiento y asociacin intermolecular, dependiendo del peso molecular, caractersticas estructurales y la polidispersin del cido hmico en cuestin (Wandruszka, 2000).

12

1.1.2.4. Humificacin de HTPs

Diversos estudios han demostrado la posibilidad de polimerizar y humificar los HPAs como el pireno en periodos de un ao (Nieman, 1998). Otros investigadores han demostrado que un cambio en los grupos funcionales de los compuestos aromticos permiten que estos sean ms susceptibles a la polimerizacin, en presencia o no de enzimas como la lacasa o polifenoloxidasa. Por otro lado, se ha demostrado que estos compuestos pueden ser humificados o incorporados a precursores de sustancias hmicas como ubiquinonas, compuestos fenlicos o compuestos derivados de la celulosa y la lignina (Nieman, 1998). Estos experimentos han sido llevados en laboratorio en la mayora de los casos en forma muy controlada, como es el empleo de substratos de estudio marcados radiactivamente y su cuantificacin posterior mediante el anlisis de seguimiento de la molcula marcada. Sin embargo, este proceso de humificacin no solo esta limitado a condiciones controladas, ya que; en la naturaleza ocurre este proceso de humificacin dando como resultado el denominado humus. La importancia de promover la formacin y el uso de substancias hmicas en la remediacin de suelos altamente contaminados es evidente por s misma. Las substancias hmicas pueden mejorar la actividad de la biomasa en suelos lavados y contribuir a una adicional atenuacin natural despus de haber sido sometido a un proceso de biorremediacin.

1.2. Contaminacin de Suelos con Hidrocarburos

La contaminacin del suelo puede ser debida a los accidentes industriales tales como: derramamientos, goteras, escapes de tanques de almacenamiento subterrneos (Ballarin-Denti et al., 1999; Lee et al., 2002; Kiem et al., 2003) y actividades antropognicas (combustin de combustibles fsiles) (Simcik et al., 1999; Venkataraman et al. 2002) los cuales representan una fuente de contaminacin del medioambiente a largo plazo.

13

1.2.1.

Petrleo y produccin

En todo el mundo, aproximadamente 4 billones de toneladas mtricas por ao son producidas, y se ha estimado que del 0.08 al 0.4% de la produccin mundial termina por contaminar los ocanos (Bartha, 1986, BP, 2008). No se tienen estimados de la cantidad de HTPs que contaminan los suelos, pero se considera que gran parte del petrleo producido se derrama de manera accidental, as como tambin gran parte; se vierte al ambiente de manera ilegal. Aproximadamente el 90% de la contaminacin ocasionada por los HTPs se debe a la actividad antropognica, el otro 10 % se debe a derrames accidentales tales como accidentes ocasionados durante su transporte, desastres en tanques de almacenamiento, as como tambin por la ruptura de algunas tuberas.

1.2.2.

Composicin del Petrleo

Los hidrocarburos del petrleo crudo son clasificados como alcanos (iso y normal), cicloalcanos y aromticos. Los alquenos (compuestos insaturados anlogos a los alcanos) raramente se encuentran en el petrleo crudo. Frecuentemente estos se producen como consecuencia de los procesos de craque. Los heterocompuestos que tienen en su estructura tomos de oxgeno (fenoles, cidos naftnicos), nitrgeno (piridina, pirrol, indol) y azufre (alquiltiol y tiofeno); son denominados resinas. El petrleo crudo tambin contiene una fraccin altamente asfltica condensada que se encuentra parcialmente oxigenada. En la Tabla 1 se enlista una clasificacin de los componentes del petrleo.

Tabla 1. Clasificacin general de los compuestos del petrleo. Fuente: Machin-Ramrez, 2000

Nombre
Hidrocarburos saturados Hidrocarburos naftnicos Hidrocarburos aromticos Resinas Asfaltenos

Formula General
CnH2n + 2 CnH2n Variable Variable Variable

Algunos compuestos representativos

Metano, etano, butano,hexano Ciclopentano, ciclohexano Benceno, tolueno, xileno, etilbenceno Piridinas, quinolinas, carbazoles, tiofenos Agregados de poliaromticos, como cido naftnico, metaloporfirinas

14

1.2.2.1. Complejos Altamente Recalcitrantes (Asfaltenos)

Los asfaltenos del petrleo son

hidrocarburos que presentan

una estructura molecular

extremadamente compleja, los cuales estn conformados por diferentes proporciones de nitrgeno, azufre y oxgeno (Pineda and Mesta-Howard, 2001). Estos compuestos ocasionan diversos problemas como el bloqueo de tuberas de extraccin y transporte de crudo, reduccin de su aprovechamiento econmico y contaminacin de los ecosistemas. La biodegradacin de los asfaltenos es un proceso que constituye un importante mtodo para eliminar a estos compuestos y tratar de reducir los problemas que ocasionan, sin embargo es un proceso que ocurre en proporciones muy reducidas. La eliminacin de la estructura micelar por la aplicacin de solventes no polares o surfactantes y la fragmentacin de los asfaltenos por fotooxidacin son los procesos iniciales necesarios para poder degradar a estos compuestos.

Las estructuras que conforman a los asfaltenos como: los hidrocarburos lineales y ramificados, heteropoliaromticos y aromticos, podran degradarse en este orden a travs de reacciones bioqumicas como oxidaciones omega, beta y aromticas respectivamente, que son procesos distribuidos en una variedad importante de microorganismos (Pineda and Mesta-Howard, 2001).

Uno de los problemas ms graves relacionados con stos compuestos en el medioambiente, reside en su resistencia a la biodegradacin por actividad metablica microbiana. Debido a ste hecho, las rutas metablicas involucradas en este proceso son de las menos conocidas en estos das, aunque, hay ciertas evidencias que sugieren que algunos microorganismos tienen la capacidad potencial de transformar asfaltenos y el mejor de los casos, eliminarlos (Figura 6).

Las comunidades microbianas en ecosistemas contaminados de esta manera tienden a ser dominadas por aquellos organismos capaces de utilizar y/o de sobrevivir en presencia de los compuestos txicos. Como resultado, estas comunidades son menos diversas que aquellos sistemas de referencia no contaminados, aunque la diversidad tambin puede estar influenciada por la

15

complejidad de la mezcla de compuestos presentes y por el tiempo que las poblaciones han estado expuestas.

Figura 6. Regiones susceptibles de fragmentacin y biodegradacin en los asfaltenos. 1: fotoxidacin, 2: -oxidacin, 3: Ruta metablica del dibenzopireno, 4: Ruta metablica similar al benzopireno, 5: Ruta metablica del pireno, 6: Ruta metablica similar a la del benzo(a)pireno, 7: Ruta metablica similar a los carbazoles.

1.2.3.

Transporte de los HTPs en el ambiente

Los HTPs dispersados en el ambiente migran a travs del suelo como: a) mezcla completa que se infiltra en el suelo por la fuerza de la gravedad y accin capilar; b) componentes individuales que se separan de la mezcla y se disuelven en el aire o el agua contenida en el suelo.

16

1.2.4.

Migracin de la mezcla de HTPs

Cuando migra la mezcla completa, se tiene poca o nula separacin de los componentes individuales y la infiltracin es normalmente rpida en comparacin con la velocidad de disolucin (Eastcott, et al., 1989). Muchos compuestos del suelo que son insolubles en agua, son solubles en la mezcla y migran junto con ella. Los factores que afectan la velocidad de infiltracin son: tipo de suelo, tamao de partcula, contenido de humedad del suelo, vegetacin, temperatura, y viscosidad de la mezcla. Conforme la mezcla migra a travs de la columna de suelo, pequeas cantidades son adsorbidas/absorbidas por partculas de este; producindose el fenmeno conocido como saturacin residual. Dependiendo de la resistencia de permanencia de la mezcla, el suelo puede estar saturado por aos (Dragun, 1988). La saturacin residual determina el grado de contaminacin del suelo, y puede convertirse en una fuente continua de contaminacin por los compuestos individuales que se separen de la mezcla (Bauman, 1988).

Si el derrame es persistente, una extensa rea puede verse afectada conforme los compuestos individuales continan separndose y migran lejos de la zona inicialmente contaminada. Cuando la cantidad derramada es pequea en comparacin con la extensin de suelo disponible, se produce una saturacin residual y la migracin de la mezcla normalmente cesa, antes de afectar los mantos acuferos. Si el agua pluvial se infiltra a travs del suelo que contiene saturacin residual, existe la posibilidad de que se contaminen las aguas subterrneas debido a la migracin de los componentes individuales.

Si la cantidad derramada es grande en relacin con el suelo disponible, la migracin cesa conforme llega a espacios porosos saturados con agua. En este caso, si la densidad de la mezcla es menor que la del agua, el producto tiende a flotar a lo largo de la interface entre las zonas saturadas de agua y las insaturadas, dispersndose horizontalmente en una capa delgada, normalmente en la direccin de la corriente de agua subterrnea, (Knox, 1993; Mackay, 1988). Si la densidad es mayor, la mezcla migra hasta el manto acufero por gravedad y cesa cuando ocurre saturacin residual o cuando la mezcla alcanza una superficie impermeable.

17

Conforme la mezcla migra a travs de la columna de suelo, los componentes pueden separarse de la mezcla y migrar independientemente, dependiendo de su volatilidad, solubilidad, potencial de sorcin y coeficiente de particin carbono orgnico-agua (Figura 7).

Figura 7. Migracin de los HTPs en el ambiente.

18

1.2.5.

Toxicidad de las fracciones recalcitrantes del petrleo

1.2.5.1. Hidrocarburos Alifticos (HAs)

Se ha encontrado que los hidrocarburos alifticos con cinco o ms carbonos presentan propiedades toxicas, causando efectos narcticos, a causa de inhalaciones prolongadas o por exposicin a altas concentraciones de los mismos. Asimismo, se sabe que los hidrocarburos alifticos no saturados y cclicos exhiben propiedades toxicas un poco menores que los de cadena lineal. No obstante, los efectos anestsicos que presentan stos ltimos afectan seriamente el sistema nervioso central.

1.2.5.2. Hidrocarburos Policclicos Aromticos (HPAs)

Se ha observado que en suelos contaminados con hidrocarburos existe un grupo de compuestos sumamente recalcitrantes como los hidrocarburos policclicos aromticos (HPA), los cuales independientemente del porcentaje que representan con respecto a la totalidad de compuestos de que sta constituido el petrleo, se ha comprobado su carcinogenicidad o mutagenicidad en seres vivos. En Estados Unidos, la Agencia de Proteccin al Ambiente (EPA) regula actualmente 16 de estos HPA como compuestos altamente peligrosos, como contaminantes de prioridad en agua y suelo. Estos compuestos son nocivos al ambiente aun en pequeas cantidades, como lo marcan los experimentos que se han realizado con microorganismos y animales. En ratas se presentan problemas mutagnicos con 2 ppm o efectos tumorognicos con 3.5 ppm (ATSDR, 1995), los cuales son solo un ejemplo de la diversidad de reportes existentes.

1.2.5.3. Compuestos heterocclicos con azufre o nitrgeno

Aun cuando existen muy pocos trabajos sobre la toxicidad de los compuestos heterocclicos con azufre y nitrgeno, McFall et al. (1984) los han reportado como compuestos txicos con propiedades mutagnicas y carcinognicas. Por otro lado, un derrame de hidrocarburos en el suelo, interrumpe en todos los casos, la vocacin natural o uso antropognico del suelo.

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1.2.5.4. Efecto de los HTPs en la salud

Los efectos en la salud se basan en compuestos especficos y dependen de factores como son: tipo de compuesto (o fracciones presentes en los HTPs), tiempo de exposicin, concentracin y cantidad de compuestos detectados. Las fracciones de HTPs se clasifican en grupos con caractersticas similares de movilidad en el ambiente, determinadas por sus propiedades fsicas y qumicas (densidad, solubilidad, presin de vapor, y tendencia a enlazarse con el suelo o partculas orgnicas).

Las fracciones de HTPs con densidad menor o cercana a la del agua, como los compuestos no acuosos en fase liquida (NAPLs), flotan formando capas superficiales muy delgadas (Mackay, 1984). Dadas sus propiedades fisicoqumicas, pueden afectar a algunos organismos de la superficie; mientras que, algunas clases de bacterias y hongos, degradan estas fracciones en compuestos ms simples. Las fracciones ms pesadas de los hidrocarburos, como los poliaromticos (PAHs), son ms densas que el agua, y se acumulan en los substratos afectando a la fauna y flora marina de la zona.

La degradacin parcial de HTPs presenta efectos nocivos, como son la bioconcentracin, la cual aumenta en forma proporcional al peso molecular (PM) de los HTPs, bioacumulacin especialmente PAHs; alifticos y aromticos de bajo PM no son bioacumulables (Farrington, et al., 1982), y biomagnificacin. En algunos casos, estos efectos pueden ser eliminados, si la fuente contaminante es removida (Cox et al., 1975; Williams et al., 1989).

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1.2.6.

Biodegradacin de los Hidrocarburos Totales del Petrleo

La degradacin microbiana de HTPs se inicia por el ataque a fracciones aliftica y aromtica ligeras. Los compuestos aromticos de alto peso molecular, las resinas y los asfaltenos se consideran recalcitrantes, o en el mejor de los casos son biodegradados muy lentamente (Shiaris, 1989). En la Tabla 2 se muestra una clasificacin de hidrocarburos, en trminos del nivel de transformacin y recalcitrancia. De acuerdo a la facilidad de degradacin, los hidrocarburos pueden ser secuenciados de la siguiente manera (Perry and Cerniglia 1973): Alcanos lineales (C10 - C19) Alcanos lineales (C12 - C18) Gases (C2 C4) Alquenos (C5 - C9), Alquenos ramificados hasta C12 Alquenos (C3 - C11) Alquenos ramificados Aromticos Cicloalcanos.

Tabla 2. Facilidad de degradacin de HTPs y productos de su metabolismo.

Facilidad de degradacin

Productos

Compuestos fcilmente degradables

Alifticos voltiles, n-parafinas, aromticos Alquenos, alcadienos, alquinos Alifticos pesados, aromticos Alcanos saturados, hidrocarburos cclicos Compuestos fenlicos Fenol, cresol, naftol, xilenol

Compuestos intermedios
Hidrocarburos poliaromticos Residuos pesados Alquitranes, ceras
Fuente: Lapinskas, J., 1989.

Aromticos mono-, di- y trinucleares

Recalcitrantes
Asfaltos, resinas Ceras parafnicas

1.2.6.1. Microorganismos degradadores de hidrocarburos

La preferencia en el consumo de HTPs est determinada por la fisiologa del microorganismo, as como por las caractersticas fsicas y qumicas del ambiente donde se desarrolla. De estos tres factores, se considera que el primero es el ms importante; ya que las condiciones ambientales pueden ser controladas de alguna manera. Los diversos componentes de los HTPs son degradados principalmente en condiciones aerobias y la presencia de oxigenasas, mediante diversas rutas metablicas. Los microorganismos con capacidad degradadora de HTPs han sido aislados en zonas contaminadas. Puede considerarse que los microorganismos aclimatados, preferentemente de

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naturaleza endgena, generaran mejores resultados que floras microbianas externas (Leahy and Colwell, 1990). La aclimatacin puede llevarse a cabo por un enriquecimiento selectivo de nutrientes, o mediante la ingeniera gentica; insercin de genes que favorezcan el catabolismo de hidrocarburos. Algunos microorganismos que utilizan HTPs como fuente de carbono, son Alcaligenes, Nocardia, Pseudomonas, Mycobacterium. Es importante mencionar que las comunidades microbianas aclimatadas, estn conformadas principalmente por bacterias.

Se ha identificado una gran variedad de microorganismos con capacidad para degradar compuestos derivados del petrleo; interesantemente, casi todos son eubacterias, aunque en algunos casos se encontraron arqueobacterias y eucariotes (Vzquez-Duhalt, 2000). Aunque no han sido caracterizados en su totalidad, muchos de estos microorganismos poseen actividades de peroxidasas y oxigenasas, que permiten la oxidacin ms menos especficas de algunas fracciones del petrleo. Esta oxidacin cambia las propiedades de los compuestos, hacindolos susceptibles de ataques secundarios y facilitando su conversin a bixido de carbono y agua. En algunas ocasiones no es necesario llegar a la mineralizacin, sino que basta una oxidacin para disminuir notablemente su toxicidad o aumentar su solubilidad en agua, incrementando su biodisponibilidad (Vzquez-Duhalt, 2000).

Uno de los gneros bacterianos ms explotados en bioprocesos no-convencionales es Rhodococcus, un grupo nico consistente en microorganismos que presentan una gran diversidad metablica, particularmente hacia la utilizacin de compuestos hidrofbicos tales como hidrocarburos, fenoles clorados, esteroides, lignina, carbn y petrleo (Finnerty, 1992; Warhurst and Fewson, 1994).

Las bacterias del gnero Rhododoccus poseen una gran variedad de vas metablicas para la degradacin y modificacin de compuestos aromticos, incluyendo las actividades de di-oxigenasa y mono-oxigenasa sobre anillos as como la actividad de ruptura de catecol. Algunos aislados presentan tambin la va del 3-oxoadipato. La tolerancia de stas bacterias a la falta de nutrientes, su carencia de un sistema de represin catablica y su persistencia ambiental las hace excelentes candidatas para los tratamientos de biorremediacin (Warhurst and Fewson, 1994).

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Por otra parte, la inoculacin con microorganismos exgenos, incluso cuando estos microorganismos hayan sido aislados del mismo emplazamiento contaminado, no es en general efectiva (Martn, 2004). Los microorganismos endgenos resultan efectivos, siempre y cuando, dispongan de los nutrientes adecuados y se les suplemente con oxgeno, como tal o en forma de perxido de hidrgeno. La mayor eficiencia se obtiene probablemente optimizando la capacidad de la microflora indgena que es prcticamente ubicua.

1.3. Tecnologas de remediacin de suelos contaminados (in-situ, ex-situ)

La necesidad de restaurar los sitios contaminados con hidrocarburos, propicio el desarrollo de tecnologas fsicas y qumicas, exclusivamente. Posteriormente despus de la dcada de los 70's se inicio el desarrollo de la biorremediacin. De esta manera en la actualidad, la remediacin de un suelo puede llevarse a cabo por dos diferentes mtodos, la Agencia de Proteccin Ambiental de Estados Unidos (USEPA por sus siglas en ingls) clasifica a las tecnologas de remediacin en dos grandes grupos: las tecnologas ex-situ, y las tecnologas in-situ (USEPA 2008). En la primera se requiere de excavacin, o de cualquier otro proceso para remover el suelo contaminado antes de su tratamiento que puede realizarse en el mismo sitio (on site) o fuera de l (off site) y las tecnologas in-situ, que se refieren al tratamiento del sitio contaminado en el mismo lugar. En la Tabla 3 y 4, se presentan las tecnologas de remediacin ex-situ e in-situ respectivamente, comprendidas dentro de la EPA (USEPA 2008).
Tabla 3. Tecnologas de remediacin Ex situ de acuerdo a la USEPA.

Tecnologas (Ex situ)

Tratamiento qumico Incineracin On-site Biorremediacin Incineracin Off-site Solidificacin y estabilizacin Neutralizacin Vitrificacin Aireacin mecnica Separacin fsica Lavado de suelos

Principio
Se basa en la adicin de agentes qumicos oxidativos Tratamiento trmico hasta CO2 en el mismo tugar Empleo de organismos vivos Tratamiento trmico hasta CO2 en incineradores especiales fuera del rea Empleo de materiales de la construccin, cemento, limos hidratados entre otros para inmovilizar al contaminante Empleo de agentes alcalinos para neutralizar suelos cidos y permitir la remediacin. El suelo contaminado se mezcla con arena de vidrio y se hace pasar una corriente elctrica; para formar bloques de vidrio con el suelo contaminado. Se emplea para eliminar compuestos voltiles empleando la aireacin. Los contaminantes se extraen y/o separan del medio contaminado, aprovechando sus propiedades fsicas o qumicas (volatilizacin, solubilidad, carga elctrica). Los contaminantes adsorbidos en las partculas finas del suelo son removidos con el uso de soluciones acuosas en un suelo excavado

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Tabla 4. Tecnologas de remediacin In situ de acuerdo a la USEPA.

Tecnologas (In situ)

Extraccin de vapor Solidificacin y extraccin Biorremediacin Lavado de suelo Recuperacin trmica Fitorremediacin

Principio
Recuperacin de componentes voltiles empleando corrientes de vapor Empleo de materiales de la construccin, cemento, limos hidratados entre otros para inmovilizar al contaminante Empleo de organismos vivos para la desintoxicacin de los suelos contaminados Los contaminantes sorbidos en las partculas finas del suelo son removidos con el uso de soluciones acuosas en un suelo excavado Utilizan calor para incrementar la volatilizacin (separacin) de los contaminantes en un suelo La fitorremediacin es un proceso que utiliza plantas para remover, transferir, estabilizar, concentrar y/o destruir contaminantes (orgnicos e inorgnicos) en suelos, lodos y sedimentos Este tipo de procesos, utiliza solventes orgnicos para disolver los contaminantes y as removerlos del suelo.

Extraccin doble fase

1.3.1.

Lavado de suelo

Se utiliza para remover y/o concentrar contaminantes absorbidos en suelo, como son los metales, hidrocarburos y PAHs (Preslo, 1989). El suelo contaminado es excavado y alimentado a un sistema que contiene una solucin de lavado y algunos aditivos de pH controlado. Si el suelo tiene un alto contenido de humus y/o arcilla, se deben realizar pre-tratamientos de separacin y cribado, lo cual incrementa Ios costos de operacin. Estos tambin son incrementados por Ios post-tratamientos de las corrientes acuosas.

1.3.1.1. Surfactantes

Los detergentes, tambin conocidos como surfactantes debido a que reducen la tensin superficial del agua, son molculas anfipticas formadas por grupos polares (cabeza) y largas cadenas carbonadas hidrofbicas (cola). Sus grupos polares forman puentes hidrgeno con las molculas de agua, mientras que las cadenas carbonadas se agregan debido a interacciones hidrofbicas. En soluciones acuosas, los surfactantes forman estructuras esfricas organizadas llamadas micelas, que por su naturaleza anfiptica, tienen la capacidad de solubilizar compuestos hidrofbicos (Bhairi, 2001).

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El empleo de surfactantes, se ha propuesto como una tcnica para incrementar la biodisponibilidad de contaminantes orgnicos hidrofbicos (HOCs) como HTPs, PCBs, explosivos, clorofenoles, pesticidas, entre otros, y as facilitar su biodegradacin (Majer et al..1999). Los surfactantes pueden ser sintetizados qumicamente o bien por algunos microorganismos, en este ltimo caso se les conoce como biosurfactantes. Estos compuestos incrementan la solubilidad de los HOCs a travs de una fase micelar (hidroflica/hidrofbica), la cual propicia la desorcin de los contaminantes del suelo hacia la fase lquida, logrndose as un incremento en la biodisponibilidad de los HOCs. La solubilizacin de los contaminantes se lleva a cabo solamente cuando se forma la fase micelar, la cual se obtiene cuando la concentracin del surfactante es superior a la concentracin micelar critica (CMC), es decir, arriba de la concentracin mxima a la cual el monmero del surfactante an se mantiene en solucin (Ko et al., 2000).

La CMC es una propiedad muy sensible a la temperatura y polaridad del medio, y generalmente su valor se reporta a temperaturas entre 20 y 25C. El nmero de agregados para formar una micela, es el valor promedio del nmero de monmeros en una micela. Los diferentes tipos de surfactantes que son empleados para lavar el suelo, estn en funcin de la naturaleza del contaminante a ser removido. Por ejemplo, los pesticidas son eliminados por surfactantes no-inicos como el Tritn X-100 y biosurfactantes como los ramnolpidos (Noordman et al. 2000; Mata-Sandoval, 2002). Los Hidrocarburos Policclicos Aromticos (PAH) pueden ser lavados por alquilfenol etoxilato (Garon et al., 2002), (Cuypers et al., 2002) y otro surfactantes aninicos como SDS (Chun et al.2002).

El uso de surfactantes no inicos, es una de las prcticas ms comunes y efectivas empleadas para la desorcin de compuestos orgnicos hidrofbicos (HOCs) (Kotterman at al., 1998; Ghosh, 1997). La eficiencia de desorcin de un surfactante depende de su naturaleza, de la dosis empleada, de la hidrofobicidad del contaminante, de la interaccin surfactante-suelo y del tiempo de contacto surfactante-suelo (Guha et al., 1996).

Sin embargo, la mejor eficiencia de desorcin no est siempre relacionada con la mejor eficiencia de degradacin, debido principalmente a que el empleo de una alta concentracin de surfactante puede

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inhibir la degradacin (Laha y col., 1992). Stelmack y col. (1999), demostraron que el uso de surfactantes reduce la adhesin de las bacterias en la superficie hidrofbica, dando como resultado una baja actividad de biodegradacin. Para solucionar este tipo de problema, algunos investigadores recomiendan la utilizacin de surfactantes fcilmente biodegradables, como el Brij 30, Brij 35 y Tween 80 (Ghosh, 1997).

Abiola y col. (1997), determinaron que el uso de surfactantes favorece la remocin de HTP en un suelo contaminado con 20,000 mg/kg de suelo. Los sistemas experimentales fueron biopilas estticas y alargadas con y sin surfactante. El grupo observ que solamente en las biopilas alargadas adicionadas de surfactante se favoreci la biodegradacin de hidrocarburos.

Kotterman y col. (1998), evaluaron la oxidacin de PAHs utilizando diversos surfactantes. En este estudio se determin que el surfactante Tween 80 (1 - 2.5 g/L), present la menor toxicidad sobre el sistema ligninoltico de la bacteria Bjerkandera sp., as como un mayor estmulo en la velocidad de oxidacin del antraceno y del benzo(a)pireno. Por su parte, Ghosh en 1997, evalu la biodegradacin de PAHs en suelos utilizando cuatro diferentes surfactantes no inicos, en este estudio observ degradaciones de fenantreno de 70 - 80% en 98 das, al emplear concentraciones de surfactantes de 2.5 g/L o mayores; este resultado fue atribuido principalmente a que arriba de este valor se presenta la formacin de micelas, adems de que se aumenta el tiempo de vida del surfactante en el suelo.

1.3.2.

Tecnologas de biorremediacin de suelos contaminados

En lo que se refiere a la Biorremediacin, esta tiene como antecedente el tratamiento biolgico de efluentes, lo cual permiti que la investigacin en esta rea se desarrollara de manera rpida. El termino biorremediacin, se utiliza para describir una variedad de sistemas que utilizan organismos vivos (plantas, hongos, bacterias entre otros, para remover (extraer), degradar (biodegradar) o transformar (biotransformar) compuestos orgnicos txicos en productos metablicos menos txicos o inocuos.

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Dentro de los procesos biolgicos que suceden en la biorremediacin, las enzimas funcionan como catalizadores, dado que pueden modificar molculas orgnicas (contaminantes) produciendo cambios en su estructura as como en sus propiedades toxicolgicas incluso, dar como resultado la completa conversin de dichos compuestos en productos inorgnicos como agua, CO 2 o formas inorgnicas de N, P y S (Alexander 1994). En lo que se refiere a las tecnologas de Biorremediacin, la Tabla 5 resume estas empleando el mismo criterio de las tecnologas de remediacin: Ex-situ e In-situ.

Tabla 5. Tecnologas de Biorremediacin Ex situ e In situ, de acuerdo a la USEPA.

Tecnologa (Ex-situ)
Biopila Bioreactores

Principio
Es un tratamiento en fase solida, aerobio en el que se trata fuera del sitio contaminado, utiliza equipo para airear mecnicamente, mezclar el suelo y nutrientes. Se basa en la remocin de contaminantes empleando reactores en un sistema de lodos. Permite la combinacin controlada y eficiente de procesos qumicos, fsicos y biolgicos, que mejoran y aceleran la biodegradacin. El composteo es un proceso biolgico mediante el cual es posible, convertir residuos orgnicos en materia orgnica estable, gracias a la accin de diversos microorganismos o el efecto de las lombrices. El suelo contaminado se mezcla con agentes de volumen y nutrientes, y se remueve (labra) peridicamente para favorecer su aireacin.

Composta o vermicomposta Biolabranza

Tecnologas (In situ)

Lagunas Bioventeo Fitorremediacin

Principio
Se basa en el tratamiento de suelo inundndolos con agua para recuperar compuestos voltiles. Se basa en la aireacin a travs de columnas, para estimular la actividad microbiana y la degradacin del contaminante Es un proceso que utiliza plantas junto con microorganismos para remover, transferir, estabilizar concentrar y/o destruir contaminantes (orgnicos e inorgnico) en suelos o sedimentos

1.3.2.1. Bioestimulacin

De las tecnologas de biorremediacin, la bioestimulacin es una tecnologa atractiva ya que utiliza los microorganismos autctonos para la remocin de hidrocarburos y es in situ. En esta tecnologa de biorremediacin, se suministran nutrientes a los microorganismos capaces de degradar hidrocarburos, lo que les permite llevar a cabo tanto un crecimiento, como una actividad metablica. En suelos contaminados con hidrocarburos, la deficiencia de N y P en relacin al C, generada por la contaminacin, es un factor limitante para que los microorganismos autctonos puedan llevar a cabo la remocin de hidrocarburos (Atlas, 1981; Leahy and Colwell, 1990). Esta deficiencia de nutrientes

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puede ser balanceada utilizando como mtodo de remediacin a la bioestimulacin (Boopathy et al, 1997; Leahy and Colwell, 1990).

Los nutrientes son clasificados en macronutrientes y micronutrientes. Los macronutrientes son aquellos compuestos requeridos en grandes cantidades y que forman parte de las macromolculas de las clulas como carbohidratos, lpidos y cidos nucledos; entre los macronutrientes se tiene al C, seguido del N, P y S (Atlas 1981; Sylvia et al, 1999). Los micronutrientes, a diferencia de los macronutrientes, son requeridos en menor cantidad y sirven como componentes estructurales o bien como elementos que favorecen la actividad enzimtica capaz de degradar los contaminantes. Entre estos elementos se encuentran el Ca, Zn, Mo, Cu, Mn, y Mg (Sylvia et al, 1999).

Algunos microorganismos pueden sintetizar todos sus componentes a partir de una fuente de carbono como los hidrocarburos y algunos nutrientes minerales, mientras que otros requieren nutrientes ms complejos e inclusive de compuestos ms especficos como aminocidos, purinas, pirimidinas y/o vitaminas (Atlas, 1981; Sylvia et al, 1999). Para que estos componentes puedan ser asimilados por los microorganismos, se necesita que estos sean disponibles, se encuentren en cantidades suficientes y como molculas fciles de asimilar. En la bioestimulacin el N y el P son los nutrientes frecuentemente adicionados a suelos contaminados (Atlas 1981; Leahy and Colwell, 1990).

1.3.2.2. Residuos agroindustriales

El adicionar un texturizante al suelo contaminado con hidrocarburo permite incrementar la actividad microbiana, debido a que mejora el transporte de los contaminantes hacia los microorganismos; adems incrementa la porosidad en la mezcla suelo-agua-texturizante. La adsorcin con carbn activado puede ser altamente eficiente en la remocin de muchos elementos traza en el agua, pero su alto costo prohbe su aplicacin a gran escala, adems de los problemas que presenta en cuanto a su disposicin una vez que ha sido usado. Los desechos agrcolas representan recursos naturales no utilizados y en algunos casos presentan serios problemas de disposicin final, de ah que se busquen alternativas para convertirlos en productos tiles. El aserrn ha merecido diversos estudios para la

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remocin de contaminantes tales como colorantes, sales y metales pesados a partir de agua y efluentes acuosos (Shukla et al., 2002). Las paredes celulares del aserrn consisten principalmente de celulosa y lignina, adems de muchos grupos hidroxilos provenientes de taninos u otros compuestos fenlicos. Esos grupos a un pH apropiado son intercambiadores inicos efectivos. La lignina, un componente de la madera, es un hetreopolmero constituido por unidades de fenilpropano. La interaccin con los grupos funcionales de este compuesto da la capacidad de adsorcin de la madera hacia compuestos orgnicos (Kubick and Apitz, 1999). En un estudio realizado para la eliminacin de cobre con aserrn de mango se encontr que el tamao de partcula mas apropiado para la adsorcin fue de 100 m, logrando una eficiencia de adsorcin del 81% en una solucin que contena 17 mg/L de Cu (II) a pH de 6.25C y 50 g/L de aserrn (Ajmal et al., 1998). Gupta et al., (2002), usaron residuos de la industria azucarera (bagacillo de caa), para la remocin de lindano y malatin, para un tiempo de contacto de 60 min a pH de 6 la remocin fue del 97-98%. Resultados similares obtuvieron utilizando DDT y DDE. Se ha reportado que cuando se utilizan soportes en procesos biolgicos, la eficiencia del proceso se mejora cuando los contaminantes son adsorbidos reversiblemente (Fava, 1996).

1.3.2.3. Vermicomposteo

El vermicompostaje es una forma alternativa de generar abono y eliminar desechos orgnicos. La accin de la lombriz en su proceso digestivo produce un agregado notable de bacterias que actan sobre los nutrientes macromoleculares, elevndolo a estados directamente asimilables por las plantas, lo cual se manifiesta en notables respuestas de las cualidades organolpticas de frutos y flores, como as tambin resistencia a los agentes patgenos (Ferruzzi, 1994).

El vermicompostaje de hecho es la actividad de alimentar lombrices con restos vegetales y recoger los excrementos, de alto poder fertilizante. Es una actividad limpia que no produce mal olor y que genera un fertilizante seco.

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Durante el proceso de vermicompostaje se generan compuestos bioactivos que son de importancia para los procesos bioqumicos y reguladores de los suelos, como las enzimas: amilasa, celulosa, lipasa, invertasa, proteasa, amidasa, ureasa, monoestereasa (fosfatasa acida y alcalina), arilsulfatasa y deshidrogenase. Adems, se generan distintos tipos de antibiticos, vitaminas, hormonas y substancias hmicas (cidos hmicos, flvicos y huminas), de gran valor (Quintero, 2002).

1.3.2.3.1.

Las lombrices

El cuerpo de las lombrices, interna y externamente, es el sitio de los procesos metablicos, como son la produccin interna y externa de moco, respiracin, paso de material por su intestino y excrecin de compuestos nitrogenados. A este nivel la actividad microbiana es estimulada en el intestino por un sistema mutualstico de digestin, que aumenta la capacidad de las lombrices para ingerir residuos orgnicos. Similarmente, la produccin de moco externo acta como un estimulador para el crecimiento y produccin de microorganismos (Ferruzzi, 1994).

1.3.2.3.2.

Las excretas de lombriz

Las excretas de lombriz son productos del material que pasa a travs de su intestino de la lombriz son excretados en dos principales formas: globular y granular, las cuales tienen diferentes tamaos, estabilidad y duracin, contenido de nutrientes y sus efectos sobre la dinmica de la materia orgnica y la actividad microbiana es muy diferente (Ferruzzi, 1994).

1.3.2.3.3.

Agregados de excretas

Los agregados de excretas son creados por lombrices ancicas (lombrices que viven dentro del suelo, cavan galeras verticales y durante la noche suben a la superficie del suelo alimentndose de materia orgnica) y consisten en la acumulacin de excretas depositadas en la superficie y material orgnico dentro y fuera de las galeras o canales abiertos en la superficie del suelo. Estas estructuras pueden

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ser consideradas como hbitat de los microorganismos y fauna del suelo, as como aceleradoras de la descomposicin de la materia orgnica (Ferruzzi, 1994).

1.3.2.3.4.

Canales o galeras formados por la lombriz

Los canales formados son producidos por el trabajo de las lombrices por su trayecto en el suelo, llegan a ser permanentes (algunos aos) o temporales, tambin pueden ser abiertos o llenos de excretas y son principalmente importantes por su intercambio de agua, gases y movimiento de suelo. Adems, sirven como ruta preferencial para la expansin de las races de las plantas (Ferruzzi, 1994).

1.3.2.3.5.

Enzimas de la lombriz

Las lombrices tienen un sistema digestivo muy completo, debido a la asimilacin y al impacto en la actividad microbiana, este proceso de digestin es muy importante en la regulacin de la dinmica de la materia orgnica. A travs del paso por su intestino, los materiales ingeridos son rpidamente reestructurados de manera fsica, qumica y biolgica hasta convertirlos en las excretas. Esto lo logran por medio de la ayuda de diferentes enzimas que producen (Tabla 6). De las principales enzimas encontradas en el intestino se pueden citar: quitinasas, proteasas, fosfatasas, celulasas, y algunas otras enzimas glucosdicas (Lattaud et al., 1999).

Estas enzimas les permiten digerir bacterias, protozoarios, hongos y descomponer parcialmente residuos de plantas. Algunas especies pueden participar en la descomposicin de lignina y el proceso de humificacin ya que poseen peroxidasas, las cuales destruyen el enlace aromtico de la lignina, las enzimas peroxidasas han sido encontradas en el intestino de Eisenia foetida (Hassett et al., 1988; Quintero, 2002).

El origen de estas enzimas, ya sea por la lombriz o por microorganismos, han sido encontradas en diferentes gneros; sin embargo, el complejo enzimtico es distinto para cada especie y su origen

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puede ser de la pared intestinal y as presumiblemente, propia de la lombriz o de la microbiota que vive en el intestino de la lombriz (Hassett et al., 1988).

Se ha encontrado que las lombrices posee citocromo P-450, actividad monooxigenasa, que son enzimas responsables del metabolismo de HPAs en hongos y algas (Cerniglia, 1993). Adems Eisenia foetida presenta un complejo glicolipoproteinico (G-90) con actividad mitogenica y antioxidante esto hace pensar que la lombriz se sirve de dicho complejo para protegerse del dao celular contra contaminantes como los xenobiticos (Grdisa et at, 2001).

Se han reportado diferentes bacterias asociadas al intestino, a las excretas o en el fluido interno de sus huevecillos, como son: Pseudomonas, Acidobacterium, Nocardia, Alcaligenes, Rhodococus, Azotobacter y algunos hongos como son Penicillum, Mucor, Aspergillus entre otro gran nmero de microorganismos (Morgan and Burrows, 1982; Singleton et al., 2003; Pizl and Novkov, 2003). Algunos de estos microorganismos pueden degradar HPAs, tal es el caso de Pseudomonas, Alcaligenes, Nocardia, Rhodococus, Azotobacter y Penicillum (Cerniglia, 1993; Johnsen et al., 2005).

Tabla 6. Actividad enzimtica detectada en la flora microbiana intestinal de la lombriz.

Especie
E. andrei E. andrei

Enzimas
Fosfotriesterasa Catalasa, citocromo reductasa acetil colin esterasa, Glutatin Citocromo P-450, Peroxidacin lipdica Complejo glicolpido protenico (G-90) Complejo glicolpido protenico (G-90) Citocromo P-450, monooxigenasa

Observaciones
Hidroliza fosfotriesteres pesticidas Actividad con metales: Pb, Cu, Zn, Hg, Co, Fe, Cd

Referencia
Lee et al., 2001 Denis-Saint et al., 2001 Saint-Denis et al., 1999 Hrzenjak et al., 1998 Grdisa et al., 2001 Achazi et al., 1998

E. andrei E. fetida E. fetida E. fetida

Con benzo(a)pireno la actividad aumenta Actividad anticoagulante y fibrinoltica Aumenta la proliferacin celular, actividad mitognica y actividad antioxidante Citocromo P-420 y Citocromo P-450, NADPH citocromo Creductasa y actividad monooxigenasa

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1.3.2.3.6.

Efecto de fuentes orgnicas e inorgnicas de N sobre la poblacin de lombrices del suelo

Investigaciones realizadas por Edwards and Lofty (1982) en Rothamsted, y otros trabajos citados por Lampkin, (2002) encontraron que la remocin de la paja y ciertas tcnicas de cultivo afectan a las lombrices y otros organismos del suelo. Tambin se encontr un mayor nmero de especies de lombrices en suelos tratados con fertilizantes orgnicos que en suelos no tratados. Se observ una alta correlacin positiva entre dosis de N inorgnico y poblacin de lombrices, probablemente por la mayor produccin de races y residuos, aunque tambin se observ que las fuentes orgnicas de N aumentaban ms la poblacin que fuentes inorgnicas. Sin embargo, los suelos que recibieron ambas fuentes de N, orgnico e inorgnico resultaron con las ms alta poblacin de lombrices. Edwards and Lofty (1982) consideran que el efecto prejudicial de fertilizantes informado en otras publicacin se puede deber al aumento de la acidez del suelo causada por su uso.

1.3.2.3.7.

Remocin de HTPs empleando lombrices

La lombriz en su hbitat natural est expuesta a una variedad de compuestos alcaloides de plantas, hidrocarburos policclicos aromticos (HPAs) y pesticidas que inducen sistemas de citocromo P-450 (enzima que inicia la ruta de degradacin de los HPAs en algunas algas, bacterias y hongos; as como, compuestos persistentes en el ambiente producidos por el hombre), y otros sistemas enzimticos que las protegen y ayudan a metabolizar diferentes compuestos (Achazi et al., 1998). Las lombrices acumulan muchos contaminantes orgnicos lipoflicos (xenobiticos y metales pesados, entre otros) de su medio ambiente. Son capaces de acumular compuestos lipoflicos no solo por absorcin pasiva de la fraccin disuelta en el agua intersticial a travs de la pared del cuerpo (Belfroid et al., 1993), tambin por asimilacin intestinal durante el paso de suelo contaminado a travs del intestino (Belfroid et al., 1994).

Liste and Alexander (2002) encontraron que las lombrices son capaces de asimilar HPAs de la porcin remanente en suelos, que no son disponibles por otras tcnicas de extraccin convencionales.

33

Est demostrado que la desaparicin de fenantreno y fluoranteno en suelos se acelera por la presencia de lombrices del tipo Lumbricus rubellus (Ma et al., 1995). Belfroid et al. (1995) reportaron que compuestos del tipo PCBs (Bifenilos policlorados) son asimilados por lombrices de E. andrei, despus de la exposicin alimenticia a pesar de su gran tamao molecular y que un aumento en la concentracin de dichos compuestos en el alimento, resulta en un aumento proporcional en la concentracin en las lombrices.

La capacidad de un nmero de especies poliquetes y oligoquetos para metabolizar en vivo una variedad de xenobiticos, incluyendo hidrocarburos policclicos aromticos (HPAs) y aromticos clorados, sugieren que sistemas de citocromo P-450 son activos en este grupo de anlidos, los cuales pudieran facilitar la eliminacin de estos compuestos de la lombriz (Lee, 1985), en el Tabla 7 se muestran algunos estudios que demuestran la capacidad enzimtica de las lombrices para vivir en presencia de hidrocarburos y otros compuestos xenobiticos.

Tabla 7. Efecto de diversos hidrocarburos sobre la lombriz.

Especie
E. fetida Lumbricus terrestris E. fetida E. fetida Lumbricus rubellus E. andrei E. fetida

Contaminante
Petrleo crudo Petrleo crudo Antraceno, criseno, pireno y benzo(a)pireno Fenantreno, pireno y criseno Fenantreno y fluoranteno Hexabromobenceno y octacloronaftaleno CClorobencenos

Observaciones
Tolera y sobrevive a 1.5% de petrleo Es muy sensible no tolera 0.5% Asimilacin mayor en suelos con poca materia orgnica Asimila compuestos que no son disponibles por extraccin soxhlet Mayor bioacumulacin bajo estrs nutricional Mayor asimilacin y con mayor contaminante en tejidos y una lenta aliminacin La eliminacin aumenta con materia orgnica

Referencia
Safwat et al., 2002 Safwat et al., 2002 Tang et al., 2002 Liste y Alexander, 2002 Wei-Chun et al., 1995 Belfroid et al., 1995 Belfroid y Sijm, 1998

1.3.3.

Factores que afectan la biorremocin de hidrocarburos en el suelo

En las superficies activas del suelo donde prevalecen las condiciones aerobias, la biodegradacin de estos compuestos es usualmente rpida y extensiva a condiciones de temperatura y humedad favorables. Sin embargo, son muchas las limitantes para que el proceso de biodegradacin se lleve a cabo de manera eficiente. Existen otros como los asfaltenos que mediante periodos prolongados de

34

tiempo pueden se biodegradados en solo un 5 al 35% (Pineda and Mesta-Howard, 2001). El estado fsico de los HTPs determina el rea superficial inicial donde puede comenzar la biodegradacin, un incremento en el rea superficial correlaciona positivamente con la biodegradacin.

Las variables ms importantes que limitan la biorremocin de Hidrocarburos Totales del Petrleo (HTPs) son: la biodisponibilidad, la transferencia de masa, las heterogeneidades espaciales y las prdidas abiticas. Dada la baja solubilidad de estos compuestos en agua, una de las estrategias para la biorremediacin en suelo es la adicin de surfactantes naturales o sintticos, que solubilicen a los HTPs y aumenten su biodisponibilidad (Ghosh, 1997).

La escasez de nutrientes, especialmente nitrgeno y fsforo limitan el crecimiento de microorganismos degradadores de hidrocarburos. Otros micronutrientes como el hierro o azufre tambin son indispensables aunque en pequeas cantidades para mejorar el proceso de remocin. En la Tabla 8 se resume algunos de los factores que son limitantes en el proceso de biodegradacin.

Tabla 8. Factores limitantes en la remocin de hidrocarburos totales del petrleo

Factor limitante
Composicin de los hidrocarburos Estado fsico Potencial de agua Temperatura Oxidantes Nutrientes minerales Reaccin Microorganismos

Ejemplos
Estructura, cantidad, toxicidad Agregacin, propagacin, dispersin, adsorcin Fuerza osmtica, exclusin de agua de agregados hidrofbicos Influencia en la evaporacin y velocidades de degradacin O2, NO3- o SO4= N, P, Fe Valores bajos de pH son limitantes Los microorganismos degradadores por lo general se encuentran en poca cantidad

1.3.3.1. Relacin Carbono Nitrgeno (C/N)

La transformacin del N orgnico a N disponible realizada por microorganismos est influenciada por la relacin C/N de la sustancia agregada al suelo. Si la relacin C/N es menor que 20 la transformacin orgnica ocurre y se libera al suelo N disponible para las plantas. Sin embargo, si la

35

relacin C/N es mayor que 30 el desbalance debido al exceso de carbono impide que la transformacin ocurra, a no ser que exista N disponible en el suelo que pueda ser usado por los microorganismos. El resultado neto es una disminucin o inmovilizacin del N disponible del suelo. Para relacin es C/N entre 20 y 30 puede no ocurrir ni liberacin ni inmovilizacin de N disponible (Tisdale, et al., 1993).

La descomposicin de la materia orgnica es llevada a cabo por los organismos vivos, los cuales utilizan el carbn como fuente de energa y el nitrgeno para construir su estructura. Mas nitrgeno que carbono es necesario, pero si el exceso de carbono es muy grande, la descomposicin decrece cuando el nitrgeno es empleado y algunos microorganismos mueren, el nitrgeno almacenado es entonces utilizado por otros microorganismos para formar nuevo material celular, y en el proceso ms carbono es empleado. As la cantidad de carbono es reducida a un nivel ms accesible mientras que el nitrgeno es reciclado (Gotaas, 1956).

Los microorganismos utilizan cerca de 30 partes de carbono por cada parte de nitrgeno, una relacin C/N de 30 (en cantidades disponibles), por lo que esta relacin parecera ser la ms favorable para la descomposicin de la materia orgnica.

El nitrgeno es ms difcil de conservar que el fsforo, potasio, y los micronutrientes los cuales, de acuerdo a su condicin qumica en la cual estn presentes, son perdidos solo por lixiviacin. El nitrgeno puede ser perdido por lixiviacin, pero la mayor prdida viene del escape de amonio u otros gases voltiles nitrogenados a la atmsfera (Gotaas, 1956).

La prdida de nitrgeno como amoniaco durante la degradacin aerbia es afectada por la relacin C/N, el pH, el contenido de humedad, aireacin, temperatura, forma de los compuestos nitrogenados al inicio de la degradacin, y la capacidad adsorptiva y de capacidad de retencin de nitrgeno por la materia presente.

36

El contenido de humedad de los proceso de degradacin afecta la conservacin del nitrgeno. El agua sirve como solvente y diluyente del amoniaco, de manera que reduce la presin de vapor y volatilizacin. Un contenido de humedad en el rango de 50 70%, asistir a la conservacin del nitrgeno. La aireacin y volteo afectan de manera adversa la conservacin de nitrgeno. Si el amoniaco est presente, ste escapar ms fcilmente cuando el material es mezclado y expuesto a la atmsfera. Aunque, si la relacin C/N es suficientemente alta la perdida de nitrgeno durante el mezclado ser baja (Gotaas, 1956). Algunos materiales como la celulosa y materia fibrosa porosa, tienen la capacidad de absorber o mantener la humedad y las sustancias voltiles, y disminuyen su tendencia a escapar. Existe evidencia considerable que los materiales de este tipo juegan una parte en la reduccin de las prdidas de nitrgeno.

37

2. JUSTIFICACIN

La degradacin de hidrocarburos totales del petrleo (HTPs) intemperizados de suelos reales contaminados, es una prioridad mundial debido a su efecto txico sobre los seres vivos, es por esta razn que es de inters desarrollar tecnologas de remediacin efectivas y econmicamente viables. Las tecnologas de biorremediacin han demostrado ser eficientes y econmicas; sin embargo, pueden ser lentas y poco eficientes en la remocin de las fracciones ms recalcit rantes de los HTPs como son los asfaltenos e hidrocarburos policclicos aromticos (HPAs). Entre las principales limitaciones se encuentran la ausencia de nutrientes, la biodisponibilidad de los hidrocarburos y la diversidad de microorganismos hidrocarbonoclastas. La degradacin de estos hidrocarburos se puede llevar a cabo por procesos de co-metabolismo, donde participen microorganismos caractersticos de la transformacin de molculas aromticas como la lignina presente en residuos celulolticos y los microorganismos asociados a la flora intestinal de la lombriz. La desorcin de hidrocarburos de las partculas de suelo ha sido comnmente realizada a base de tensoactivos sintticos. Aunque, materiales tensoactivos de origen orgnico, tales como los biotensoactivos y cidos hmicos, son una opcin interesante. En lo que concierne a los cidos hmicos, molculas complejas que evolucionan en el curso del tiempo, existen reportes cientficos acerca de su poder tensoactivo y capacidad para incorporar estructuras aromticas en su molcula. En el presente trabajo se propuso evaluar el efecto de la presencia de lombrices (Eisenia andrei) y la adicin de cidos hmicos en forma de extracto de leonardita con el objetivo de reducir los tiempos de remediacin de suelos arcillosos contaminados.

3. HIPTESIS

Las propiedades fisicoqumicas de los cidos Hmicos; as como, la flora microbiana asociada al intestino de lombriz Eisenia andrei y su efecto mecnico sobre el suelo, permitirn reducir el tiempo de restauracin de un suelo contaminado. Se ha considerado que el lavado de suelo con cidos hmicos, reducir an ms el tiempo de restauracin del suelo contaminado.

38

4. OBJETIVOS 4.1. Objetivo general

Evaluar el efecto de la implementacin de una tecnologa en serie: lavado-fermentacin slida, enfocado a reducir los tiempos de restauracin de suelos altamente contaminados con hidrocarburos totales del petrleo (HTPs) e hidrocarburos policclicos aromticos (HPAs) intemperizados.

4.2.

Objetivos especficos

4.2.1.

Determinar la fuente de nitrgeno para bioestimular el suelo contaminado, en funcin de la sobrevivencia de la lombriz.

4.2.2.

Evaluar el efecto de la incorporacin de la lombriz (Eisenia andrei) con o sin alimento (bagacillo de caa), en el proceso de remocin de HTPs y HPAs del suelo contaminado en fermentacin slida.

4.2.3.

Evaluar el efecto de la adicin de cidos hmicos, en el proceso de remocin de HTPs y HPAs del suelo contaminado en fermentacin slida.

4.2.4.

Determinar el efecto y niveles de remocin de HTPs del suelo contaminado, mediante lavados con soluciones de cidos hmicos.

4.2.5.

Evaluar el efecto de biotratar el suelo contaminado lavado con cidos hmicos, en el proceso de remocin de HTPs y HPAs en fermentacin slida.

39

5. MATERIALES Y MTODOS

5.1. Suelo

Se utiliz un suelo proveniente del campo 10 perteneciente a la petroqumica Escolin, ubicada en el municipio de Poza Rica, Veracruz, localizada en la zona central del estado a 20 32" latitud norte y 97 27" longitud oeste, a una altura de 50 metros sobre el nivel del mar. La zona pertenece a la regin hidrolgica RH-27 "Tuxpan Nautla", que forma parte de las cuencas de los ros Nautla, Tecolutla, Cazones y Tuxpan adems de la laguna de Tamihua. La zona se considera con un clima clido, una temperatura promedio de 24.2C, su precipitacin pluvial media anual es de 1,010mm y su humedad relativa vara entre 76 y 80%. El suelo se obtuvo mediante una serie de muestras que se tomaron desde una profundidad de 50 cm de diferentes puntos del sitio y posteriormente estas muestras se secaron y mezclaron entre s para tener una muestra representativa del suelo. El suelo fue homogenizado, triturado y cribado en malla 25 para su caracterizacin.

5.2. Bagacillo de caa

Producto de desecho de un procesadora de hojas de papel (Kimberly-Clarck) del estado de Veracruz, previamente precomposteada. El bagacillo de caa fue homogenizado y triturado para su caracterizacin.

5.3. Vermicomposta

Producto de la vermicomposta de paja y estircol bovino previamente precomposteados. Proporcionada por el modulo de vermicompostaje del rea de microbiologa del Colegio de Postgraduados del Departamento de Edafologa. La vermicomposta fue homogenizada y cribada en malla 10 para su caracterizacin.

40

5.4. Extracto de Leonardita (EL)

La leonardita son depsitos de un tipo de carbn suave usualmente encontrados en conjunto con depsitos de lignita. La leonardita es el producto final del proceso de humificacin a lo largo de 70 millones de aos aproximadamente. Se empleo el producto comercial Humintech Powhumus el cual es un acondicionador natural del suelo y bioestimulante de las plantas que contiene substancias hmicas naturales incluyendo, cidos hmicos y cidos polihidroxicarboxlicos derivados de Leonardita.

5.5. Lombriz

Eisenia andrei (Bouch 1972) con clitelio, proporcionada por el Dr. Ronald Ferrera Cerrato del Colegio de Postgraduados del programa de postgrado en Edafologa.

41

5.6. Estrategia Experimental

La estrategia experimental estuvo dividida en seis etapas, como se indica en la Figura 8. El primer bloque comprende la caracterizacin fsica, qumica y biolgica del suelo, bagacillo de caa, vermicomposta y extracto de leonardita. Posteriormente se llev a cabo la seleccin de la fuente de nitrgeno para la fermentacin slida, en funcin de la sobrevivencia de la lombriz; as mismo, se establecieron las condiciones para el lavado de suelo empleando soluciones de cidos hmicos. Una vez seleccionada la fuente de nitrgeno, se llev a cabo la fermentacin slida del suelo, previo a su acondicionamiento de acuerdo a un diseo experimental indicado en la seccin 5.6.3.2. El suelo lavado, se acondicion en funcin al mejor tratamiento obtenido en la fermentacin slida. Los lixiviados fueron analizados para su posterior tratamiento.

Caracterizacin del suelo, bagacillo de caa, vermicomposta y leonardita

Seleccin de la fuente de nitrgeno Lavado de Suelo

Tratamiento de Lixiviados

Empleo de cidos hmicos Fermentacin Slida del Suelo

Fermentacin Slida del Suelo Lavado

Figura 8. Estrategia experimental para la remocin de HTPs del suelo de Poza Rica, Veracruz.

42

5.6.1.

Caracterizacin del suelo contaminado, bagacillo de caa, extracto de leonardita y vermicomposta

La caracterizacin de los elementos indicados anteriormente se llev a cabo empleando los mtodos analticos mostrados en la Tabla 9.
Tabla 9. Determinaciones analticas aplicadas a: el suelo, vermicomposta, leonardita y bagacillo de caa.
Determinacin Humedad Fsicas Capacidad de Retencin de Agua Densidad Unidades % % % Mtodo Gravimtrico Gravimtrico Gravimtrico Referencia AS-05* AS-06* AS-04* S VC EL BC

Materia orgnica Carbono total Carbono orgnico Qumicas Carbono inorgnico Nitrgeno Total Fsforo asimilable pH

% % % % % %

Oxidacin de la materia orgnica Oxidacin del carbono total Oxidacin del carbono orgnico Oxidacin del carbono inorgnico micro kjeldahl Extraccin del fsforo disponible Potenciomtrico

AS-07* TOC-Vcsn Shimadzu TOC-Vcsn Shimadzu TOC-Vcsn Shimadzu Fernndez, 2006 AS-10* AS-02*

cidos Hmicos cidos Flvicos

% %

Extraccin y asilamiento Extraccin y asilamiento Extraccin por sonicacin Extraccin

IHSS IHSS

HTP's Asfaltenos (Asf) H. Libres de Asfaltenos (HLA) H. Alifticos (HA) H. Aromticos (HAr) H. Policclicos Aromticos (HPA)

mg/Kg de suelo mg/Kg de suelo

EPA 3550b ASTM D 656000 (2005)

% % %

Fraccionamiento Fraccionamiento Fraccionamiento

Fernndez, 2006 Fernndez, 2006 Fernndez, 2006

Carbono de Biomasa Bacterias Actinomicetos Biolgicas Levaduras Bacterias hidrocarbonoclastas Levaduras hidrocarbonoclastas Hongos hidrocarbonoclastas

% UFC/g de muestra UFC/g de muestra UFC/g de muestra UFC/g de muestra UFC/g de muestra UFC/g de muestra

IrradiacinExtraccin Cuenta en placa Cuenta en placa Cuenta en placa Cuenta en placa Cuenta en placa Cuenta en placa

Islam y Weil 1998 Fernndez, 2006 Fernndez, 2006 Fernndez, 2006 Fernndez, 2006 Fernndez, 2006 Fernndez, 2006

*NOM-021-SEMARNAT-2000, S Suelo, VC Vermicomposta, EL Extracto de Leonardita, BC Bagacillo de caa

43

5.6.2.

Seleccin de la fuente de nitrgeno y relacin C/N

La metodologa empleada se bas en las Normas de la Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guidelines for the testing of chemicals: Earthworm, acute toxicity tests (207) and Earthworm reproduction test (222). Se realizaron microcosmos con 100 gramos de suelo adicionado con Sulfato de Amonio como fuente de nitrgeno y Fosfato Monobsico de Potasio como fuente de fsforo, propuesta por diversos autores para propsitos de bioestimulacin de suelos contaminados (Atlas and Bartha, 1973; Espitia, 2002; Corona e Iturbide, 2005), hasta obtener una relacin C/N/P de 100/10/1 que corresponde a una relacin C/N 10. Se prob adems una relacin C/N/P de 100/4/1 que corresponde a una relacin C/N 25, con la finalidad de que no ocurra ni liberacin ni inmovilizacin de nitrgeno disponible (Tisdale, 1993). A cada microcosmo se le incorporaron 10 lombrices y la humedad se mantuvo a 60%.CRA-Suelo. El experimento se llev a cabo por duplicado.

44

5.6.3.

Fermentacin slida del suelo contaminado

5.6.3.1. Dispositivo experimental

En un contenedor de 504020 cm aprox., se elaboraron dos compartimientos de 203020 cm aprox. de malla 40 de plstico para retener el suelo del sistema y a las lombrices, alrededor de ellas se coloc unicel de una pulgada de ancho, con la finalidad adems de formar los dos tratamientos, de aislarlos del fro y mantener una temperatura entre 15 y 20C. Se colocaron piedras de mrmol en el fondo de las cajas con la finalidad de evitar anaerobiosis en el fondo de los tratamientos, permitir flujo de aire y evitar en lo posible que se formen colonias microbianas en la superficie de este soporte y que pudieran interferir con los resultados (Figura 9).

30cm 20cm 20cm

Figura 9. Dispositivo experimental para llevar a cabo la fermentacin slida del suelo.

45

5.6.3.2. Diseo experimental factorial general

Un Diseo Experimental Factorial General (DEFG), se emple para evaluar los efectos de: Extracto de Leonardita (EL) a dos niveles: 0%/1%; la presencia de bagacillo de caa (BC) a dos niveles: 0%/6%; as como, la aplicacin y actividad de lombrices (L) a tres niveles: 0/20/40; en la remocin de HTPs (Fig 10). Los tratamientos control fueron: a) suelo al 60% CRA, b) suelo al 60% de la CRA y bioestimulado con vermicomposta (blanco del DEFG N/BC, N/EL,0) y c) Bioestimulacin con Sulfato de Amonio y Fosfato Monobsico de Potasio hasta una relacin C/N/P 100/4/1. Se realizaron blancos estriles de a y b.

Nmero de Lombrices 0 20 40
Bagacillo de Caa (BC)
Extracto de Leonardita

(EL) No Si

Si

S/BC S/EL 0

S/BC S/EL 20

S/BC S/EL 40
S/BC N/EL 40

S/BC N/EL 0
N/BC S/EL 0 N/BC N/EL 0

S/BC N/EL 20
N/BC S/EL 20 N/BC N/EL 20

Extracto de Leonardita

(EL) No Si

No

N/BC S/EL 40
N/BC N/EL 40

Figura 10. Diseo Experimental Factorial General (S Si/Presencia; N No/Ausencia)

46

5.6.3.3. Acondicionamiento de los tratamientos

Se colocaron cuatro kilogramos de suelo contaminado en un mezclador de 100 Kg de capacidad, marca Ortiz Conrado. Posteriormente dos litros de agua se adicionaron gradualmente hasta obtener una mezcla homognea con aproximadamente 60% de la capacidad de retencin de agua (CRA). Se adicion 250 g de bagacillo de caa (alimento para la lombriz, texturizante y fuente de microorganismos) cuando el tratamiento lo requera, este fue calculado de acuerdo al nmero mximo de lombrices por tratamiento (40 lombrices) y la cantidad de alimento ingerido por lombriz por da (anexo). Se mantuvo el pH en aproximadamente 7 y la temperatura del sistema alrededor de 20C. La humedad del suelo se mantuvo y monitore semanalmente empleando un medidor del contenido volumtrico de agua presente en el suelo TDR 200 Fieldscout de Spectrum Technologies. Cada semana se mezcl de forma manual todo el tratamiento, con la finalidad de homogenizar e incorporar aire al sistema. Los tratamientos fueron analizados peridicamente para determinar remocin de HTPs, produccin de cidos hmicos (AH), crecimiento microbiano como carbono de biomasa (Cb) y unidades formadoras de colonias (UFC). As mismo, se llev a cabo el fraccionamiento de los hidrocarburos al inicio y al final del tratamiento, para ser analizarlos mediante cromatografa de gases.

47

5.6.4.

Lavado de suelo con substancias hmicas

5.6.4.1. Diseo experimental factorial completo

Un Diseo Experimental Factorial Completo (DEFC) fue empleado para evaluar los efectos de la relacin EL(Extracto de Leonardita)/Agua/Suelo en la remocin de HTPs. Con la finalidad de elegir las mejores condiciones de remocin de HTPs en el lavado estas 3 variables independientes fueron consideradas a 3 niveles, que de acuerdo a los Diseos Factoriales corresponde a un diseo 3 3. La Tabla 10 resume el diseo factorial.
Tabla 10. Factores y niveles usados en el diseo factorial 3
3

Factores

Rango de los Niveles -1 0 1 X1 Extracto de Leonardita (g) 0.1 1 10 X2 Suelo (g) 5 10 15 X3 Agua (ml) 50 100 150
Cada tratamiento fue diseado de la siguiente manera: En frascos de 200 ml se adicionaron los componentes EL, suelo y agua de acuerdo al DEFC de la Tabla 10. A continuacin se llev a cabo el lavado, mediante agitacin orbital a 200 rpm durante 24 horas. Despus la mezcla se centrifug a 10 000 rpm durante 10 min. El suelo lavado (precipitado) se sec a 40C durante 24 horas. Por ltimo se cuantific HTPs residuales y extrados, del suelo lavado y el lixiviado respectivamente; empleando el mtodo EPA 3550b.

48

5.6.5.

Fermentacin slida del suelo lavado

5.6.5.1. Acondicionamiento del suelo lavado

Cuatro kilogramos de suelo fueron lavados bajo las mejores condiciones determinadas en la seccin 5.6.4.1. El suelo se seco, tritur, homogeniz y se acondicion como se describi en la seccin 5.6.3.3. A continuacin se adicion o no BC, EL y lombrices en funcin del mejor tratamiento obtenido del DEFG de la seccin 5.6.3.2.

5.6.6.

Lixiviado

Al lixiviado obtenido se le analiz contenido de HTPs, para poder tratarlo posteriormente.

5.6.7.

Anlisis estadstico

La evaluacin de los resultados de los diseos experimentales del ensayo de remocin de hidrocarburos del suelo contaminado en cultivo slido, as como; el lavado de suelo contaminado con soluciones de cidos hmicos; se realiz mediante Design Expert (versin 6.0) con un nivel de significancia del 95% (p<0.05).

49

6. RESULTADOS Y DISCUSIN

6.1. Caracterizacin del Suelo Contaminado

El suelo posee una concentracin de materia orgnica media (6.1-10.9% para suelos volcnicos), as como un contenido de fsforo disponible y nitrgeno bajos; menor a 15 mg/kg de suelo y menor a 10mg/Kg de suelo respectivamente, lo cual indica la necesidad de incorporar ambos nutrientes (Tabla 11). La baja disponibilidad de nitrgeno y fsforo puede ser causada por una relacin C/N elevada, debido a que bajo estas condiciones existe un consumo instantneo de nitrgeno por los microorganismos presentes en el suelo para generar biomasa, este fenmeno es conocido como robbing (Gotaas, 1956). Se determin una concentracin elevada de carbono inorgnico por lo cual se considera un suelo de tipo volcnico o calcreo (NOM-021-SEMARNAT-2000); debido a que tiene suficiente carbonato de calcio como para que haga efervescencia cuando se trata con una solucin de HCl al 10%, caso comn de los suelos de tipo molisol.

De acuerdo con la NOM-021-SEMARNAT-2000 por el valor del pH, el suelo contaminado es considerado neutro (pH 6.6 -7.3). En este caso el pH que presenta el suelo contaminado, presenta un pH dentro del rango sugerido (6 a 8) para crecimiento microbiano (Alexander, 1994). El pH del suelo juega un papel muy importante en el proceso de degradacin. Su magnitud determina el tipo de flora microbiana activa, la actividad enzimtica, la disociacin y solubilidad de molculas de CO 2, la disponibilidad de nutrientes y la degradacin de los contaminantes (Alexander, 1994).

La concentracin de substancias hmicas fue de 1.6% (cidos hmicos y cidos flvicos) valor considerado bajo debido a que el rango de substancias hmicas presentes en el suelo vara entre: 0-1.6% bajo, 1.6-3% medio y de 3% en adelante es alto de acuerdo a la clasificacin propuesta por Tan (2003). La concentracin y tipo de substancias hmicas en el suelo est determinada por la actividad microbiana, tipo de vegetacin y temperatura entre otros. La temperatura determina el grado de descomposicin de la materia orgnica; as como, de las substancias hmicas, ya que en un clima clido como lo es el estado de Veracruz, la degradacin de estas estructuras es ms activa. Como el

50

suelo de Poza Rica ha estado contaminado por alrededor de 30 aos relacin C/N 76 es muy elevada para propsitos de humificacin, que implica una nula o lenta formacin de cidos hmicos. Los cidos hmicos obtenidos fueron de color gris (Figura 11), los cuales estn asociados con los suelos de tipo molisol.

Figura 11. cidos hmicos presentes en el suelo

El suelo present una concentracin de hidrocarburos menor a la mxima recomendada en la Norma Oficial Mexicana para propsitos de biorremediacin <10%HTPs (NOM-138-SEMARNAT/SS-2003). La composicin de hidrocarburos en trminos de las fracciones de asfaltenos, aliftica, aromtica y policclica aromtica se presenta en la Tabla 11. Se observa una alta concentracin de las fracciones asfltica y policclica aromtica, ambos, considerados como recalcitrantes. Este suelo posee un valor promedio de 351% de asfaltenos lo que indica un proceso de intemperizacin avanzado (Figura 12). De acuerdo a la composicin de hidrocarburos considerados como degradables, la mxima remocin de hidrocarburos esperada sera del 65%. Muchos compuestos del petrleo, especialmente los alcanos lineales, son conocidos por su fcil degradacin. No obstante, su baja solubilidad en agua puede limitar su transformacin hasta su mineralizacin.

La intemperizacin podra afectar el proceso de biodegradacin, por la adsorcin/absorcin de los hidrocarburos a las partculas de suelo; as como, a la ausencia de hidrocarburos de fcil degradacin.

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Fsicas

Determinacin Humedad Capacidad de Retencin de Agua Densidad

Unidades % % %

S 3 0.5 67.6 3 1.43 0.03

VC 4 0.5 30 4 0.5 0.02

EL 14 N/A 0.6

BC 5 0.5 700 5 0.15 0.02

Qumicas

Materia orgnica Carbono total Carbono orgnico Carbono inorgnico Nitrgeno Total Fsforo asimilable pH 8.8 0.04 7.6 0.09 6.1 0.05 1.5 0.07 0.02 0.004 0.1 0.01 7 0.05 0.23 0.05 1.42 0.03 cidos Hmicos cidos Flvicos % % mg/Kg de suelo mg/Kg de suelo % % %

% % % % % %

28.8 0.5 17 0.5 16.7 0.5 0.3 0.5 1.32 0.5 2 0.02 6.9 0.05 2.34 0.5 1.86 0.5 83000 3000 35 1 65 2 28.5 1 15 1 21.5 1

81.9 42.8 42.8 N/D 0.83 < 0.1 9.85 91.5 4

82.1 0.5 47.6 0.5 47.6 0.5 N/D 0.23 0.5 0.01 0.5 6.5 0.05

HTP's Asfaltenos (Asf) H. Libres de Asfaltenos (HLA) H. Alifticos (HA) H. Aromticos (HAr) H.Saturados (HS)

52

Unidades g Cb/Kg suelo 3.12 0.23 1.5 106 2.6 105 1.15 104 8.2 103 6.7 106 8.2 104 2.7 103 1.28 109 3.2 106 5.3 105 N/D 6.8 106 2.4 104 2.6 104 9.84 0.51

VC

EL 5.52 0.32 1.51 107 2.2 107 3.4 107 N/D 4.2 103 2.3 104 N/D

BC 4.43 0.49 2.7 107 2.1 105 2.3 105 N/D 4.5 106 N/D 7.3 104

Biolgicas UFC/g muestra UFC/g muestra

Determinacin Carbono de Biomasa Bacterias Actinomicetos Levaduras Hongos Bacterias hidrocarbonoclastas Levaduras hidrocarbonoclastas Hongos hidrocarbonoclastas UFC/g muestra UFC/g muestra UFC/g muestra UFC/g muestra UFC/g muestra

53

Figura 12. Asfaltenos (A) e hidrocarburos libres de asfaltenos (B), contenidos en el suelo.

El hidrocarburo libre de asfalteno se someti a un anlisis cromatogrfico de gases, obtenindose un perfil cromatogrfico con 130 seales, de las cuales 18 fueron identificadas como: Tolueno, Xileno, C12, C14, Acenafteno, C16, Antraceno, C18, Fenantreno, C20, Fluoranteno, C22, C24, Criseno, C26, C28, Benzo(a)pireno y C30, como se muestra en la Figura 13.

Figura 13. Perfil cromatogrfico del hidrocarburo libre de asfaltenos del suelo contaminado sin biotratar.

54

Tabla 13. Hidrocarburos identificados en el suelo contaminado

Los asfaltenos mostraron un perfil cromatogrfico en su mayora, revelando compuestos con elevado peso

molecular (Figura 14). Estructuralmente los asfaltenos son molculas muy complejas que contienen cicloalcanos, alcanos de cadenas largas, naftenos, pirenos, etc. (MartnGila, 2007); lo cual se observa en el perfil cromatogrfico obtenido. La concentracin de hidrocarburos considerados potencialmente txicos, carcinognicos y mutagnicos como el Criseno y el Benzo(a)pireno se detectaron por encima de la concentracin mxima permitida por la NOM138-SEMARNAT/SS-2003. Estos datos revelan la

necesidad de remediar este suelo. As mismo se identificaron compuestos aromticos, policclicos

aromticos e hidrocarburos de cadenas largas (C28), tanto para los HTPs como para los asfaltenos (Tabla 13).

Figura 14. Perfil cromatogrfico de los asfaltenos del suelo contaminado sin biotratar.

55

La poblacin mnima requerida para llevar acabo procesos de biorremediacin es de 10 UFC/gramo de suelo (Providenti, 1993). De acuerdo a la Tabla 12, la poblacin microbiana est dentro de este parmetro. El sitio ha estado expuesto a la contaminacin por varios aos, induciendo la aclimatacin de algunos microorganismos hidrocarbonoclastas y la desaparicin de los susceptibles. Esto puede ser observado, por el contenido y variedad de microorganismos cultivados en caja petri (Figura 11).

Se ha reportado que bacterias, hongos, levaduras y actinomicetos, estn implicados en la degradacin de hidrocarburos. No obstante, gran parte de la remocin ha sido realizada mediante consorcios y actividad enzimtica presente en algunos gneros de estos microorganismos.

Figura 15. Flora microbiana total asociada al suelo: bacterias (Agar nutritivo), actinomicetos (Agar czapeck) y levaduras (Agar maltosa sabouraud) bajo una dilucin 110 .
3

La flora microbiana total asociada a este suelo no es muy variada (Figura 15); ya que, se observaron no ms de 3 cepas distintas en el caso de bacterias y levaduras; no obstante, su nmero es elevado (UFC). Estos resultados podran predecirse, dada la seleccin natural de la flora microbiana de los suelos en presencia de algn agente xenobitico. Ha sido reportado que solo sobrevivirn aquellas cepas o aquellos microorganismos con capacidad de formar consorcios y que tengan la capacidad enzimtica para emplear los xenobiticos. La flora microbiana hidrocarbonoclasta es ligeramente superior a la total (Tabla 12); sin embargo, es pobre en diversidad microbiana (Figura 15). Lo cual indica que la mayor parte de los microorganismos presentes en el suelo es tolerante al contaminante. Esta relacin de floras microbianas indica un proceso de aejamiento e intemperizacin del suelo contaminado.

56

Figura 16. Flora microbiana hidrocarbonoclasta asociada al suelo (Agar Mineral + queroseno, dilucin 110 ).

6.2. Caracterizacin del Bagacillo de Caa

El bagacillo de caa con el que se trabajo ya ha pasado por el proceso de composteo natural, lo cual permite que sea muy adsorbente como lo muestra su CRA 700% (Tabla 11). Al ser una fibra orgnica ligera posee una densidad muy baja y posee un alto contenido de carbono orgnico considerando que es prcticamente celulosa 41%, fibra 16% y lignina 21% (Alvarado 1989). El anlisis microbiolgico mostr que posee una poblacin y diversidad microbiana elevada (2107 UFC), en todos los niveles estudiados an para microorganismos hidrocarbonoclastas (Tabla 12). Como se puede observar, las bacterias hidrocarbonoclastas, son como en el caso del suelo, muy abundantes debido a que existe una presin de seleccin por substrato; la flora asociada a el bagacillo de caa debe de ser capaz de degradar lo componentes principales del bagacillo antes mencionados (Alvarado 1989). Existen diversas enzimas involucradas en el rompimiento de estructuras ligninolticas como son la polifenol oxidasa, manganeso peroxidasa o lacasa, para el caso de los hongos o en enzimas tipo oxigenasas en el caso de las bacterias. Esta actividad enzimtica sugiere que los microorganismos asociados al bagacillo de caa son capaces de consumir hidrocarburos alifticos y aromticos.

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6.3. Caracterizacin de la Vermicomposta

La vermicomposta, desecho metablico de la digestin de la lombriz, no posee tanto carbono debido al consumo de este por los microorganismos asociados. De acuerdo a la bibliografa, el pH cercano a la neutralidad, contenido de nitrgeno y fsforo est dentro de los rangos descritos para el humus de lombriz de acuerdo a Ferruzi (1994) como se observa en la Tabla 11. Una caracterstica de la vermicomposta es su alta cuenta microbiana y contenido de substancias hmicas, hecho que se comprueba en los anlisis realizados. Debido a que la vermicomposta posee un gran nmero de nutrientes; entre los cuales figuran aminocidos, vitaminas, azcares, etc. (Ferruzi, 1994); posee una elevada flora microbiana total muy diversa, con alrededor de 20 cepas distintas (Figura 17). Adems posee flora microbiana hidrocarbonoclasta (Tabla 12). La presencia de microorganismos

degradadores de hidrocarburos era de esperarse debido a la mezcla compleja de materia orgnica transformada por este tipo de flora microbiana. En el presente estudio se utiliz vermicomposta producida a partir de paja y estircol bovino, previamente precomposteados. La paja al ser un desecho agroindustrial al igual que el bagacillo de caa; poseen estructuras ligninolticas y celulolticas que determinan la flora microbiana asociada. Como se indic anteriormente el bagacillo de caa posee microorganismos hidrocarbonoclastas, es probable que la paja tambin los posea, debido a que est constituida por celulosa y lignina.

Figura 17. Flora microbiana total asociada a la vermicomposta: bacterias (Agar nutritivo), actinomicetos (Agar czapeck) y levaduras (Agar maltosa sabouraud) bajo una dilucin 110 . Flora microbiana hidrocarbonoclasta, (Agar Mineral + queroseno, dilucin 110 ).
3 3

58

Por otro lado, durante el proceso de compostaje al cual fue sometido el estircol bovino, diversos microorganismos asociados a este fueron eliminados debido a las altas temperaturas generadas durante el proceso (alrededor de 70C antes de estabilizarse la composta), dando como consecuencia la presencia de microorganismos termoflicos y que pueden adems estar involucrados en la degradacin de hidrocarburos.

Los cidos hmicos y flvicos aislados de la vermicomposta, fueron de caf oscuro y naranja/caf, respectivamente (Figura 18). El color caf oscuro indica un grado de polimerizacin avanzado; en tanto que el color naranja/caf indica la presencia del cido crnico (amarillo claro) y el cido apocrnico (amarillo-pardo) (Tan, 2003).

Figura 18. cidos hmicos y cidos flvicos aislados de la vermicomposta.

6.4. Caracterizacin del Extracto de Leonardita

La Tabla 11 resume las caractersticas del extracto de leonardita del producto comercial PowHumus de la empresa Humintech ; a excepcin de la flora microbiana analizada, los datos restantes fueron proporcionados por la empresa Humintech. Como podemos observar la flora microbiana total asociada es elevada no obstante su baja diversidad microbiana (Tabla 12). Esto podra indicar que las cepas asociadas al extracto de leonardita estn bien adaptadas a incorporar este material como fuente de carbono, nitrgeno y energa, debido a su estructura molecular altamente recalcitrante. No obstante los cidos hmicos, poseen una estructura molecular diversa (Figura 19), conformada por pptidos, oligosacridos, quinonas, hidrocarburos, anillos aromticos, etc.; que los hace adecuados para el

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consumo microbiano en procesos co-metablicos donde son reducidos u oxidados para consumir diversas molculas aledaas a estos (Tan, 2003). El extracto de leonardita posee adems flora microbiana hidrocarbonoclasta (Figura 20), que de acuerdo a lo mencionado con anterioridad acerca de la gran diversidad estructural de su molcula, es de esperarse que si soporta actividad microbiana; parte de esta, debe poseer la actividad enzimtica capaz de interaccionar con molculas altamente recalcitrantes para emplearla como fuente de carbono y energa.

Figura 19. Estructura hipottica de los cidos hmicos indicando las principales estructuras que la componen (Kleinhempel, 1970).

Figura 20. Flora microbiana hidrocarbonoclasta asociada al extracto de leonardita (Agar Mineral + queroseno, dilucin 110 ).

60

6.5. Seleccin de la fuente de nitrgeno (en funcin de la sobrevivencia de la lombriz, Eisenia andrei)

La adicin de nitrgeno a travs de sales como se indic en la seccin 5.6.2; mostraron efectos txicos en las lombrices; ya que, stas comenzaron a salirse de los microcosmos y a agruparse entre s o sobre restos de bagacillo de caa (Figura 20).

Figura 20. Lombriz Eisenia andrei en los microcosmos agrupndose debido a los efectos adversos del sustrato slido.

Si las lombrices se enterraban manualmente resurgan a la superficie. Algunas murieron en aproximadamente 1 hora. La cuenta de lombrices posterior a un tiempo de incubacin de 1 hora, mostr una mortalidad de 80%. La lombriz en contacto directo con el suelo contaminado permaneci viva, es por ello que la adicin de sales se consider como un elemento txico para sta.

La fuente de nitrgeno (Sulfato de Amonio) propuesta por diversos autores para propsitos de bioestimulacin de suelos contaminados (Atlas and Bartha, 1973; Espitia. 2002; Corona e Iturbide, 2005), provoc la muerte de la lombriz Eisenia andrei (Figura 21), con una de LD50 de 3g/kg. De acuerdo a la bibliografa, se encontr que el Sulfato de Amonio es txico por encima de 2.8g/L en ratones y por encima de 7.5g/l en bacterias (de acuerdo a la hoja de especificaciones de Merck). Al probar otras fuentes de nitrgeno como: Nitrato de Sodio, Nitrato de Potasio y Urea; el resultado fue el

61

mismo. El suelo present un fuerte olor a amoniaco un da despus de que se adicion Sulfato de Amonio (cantidad suficiente para obtener la relacin C/N/P 100:10:1). Se consider que la muerte de la lombriz pudo ser por asfixia ya que respira por la piel. Entonces se procedi a disminuir la cantidad de Sulfato de Amonio no obstante, las lombrices siguieron muriendo. Como fuente alternativa de nitrgeno se utilizaron Nitratos; ya que, estos no presentan el proceso de descomposicin y amonificacin. Con lo Nitratos se obtuvo el mismo resultado aun cuando el suelo no present olor alguno a amoniaco. Posteriormente se opt por la adicin de Urea. De acuerdo a la hoja de

seguridad, la urea no es txica para la micro y macroflora del suelo; no obstante concentraciones de 2g/kg de suelo provoc la muerte de la lombriz en un periodo de 5 das, aun cuando se adicion para una relacin C/N de 25. Valor inferior al recomendado en literatura para propsitos de remediacin de suelos contaminados (C/N de 10). Dados estos resultados, finalmente se opt por utilizar la vermicomposta disponible como fuente de nitrgeno. Su aplicacin al suelo contaminado no mostr efectos txicos. Esta se adicion a manera de fijar una relacin C/N de 25, valor que evita la liberacin e inmovilizacin del N disponible (Tisdale et al., 1993). Adicional al aporte de Nitrgeno, la vermicomposta tambin sirvi como fuente de fsforo, por lo cual ninguna sal para proporcionar estos elementos fue adicionada. La vermicomposta se adicion en aproximadamente 16% por kilogramo de suelo.

Figura 21. Lombriz Eisenia andrei

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6.6. Fermentacin Slida del Suelo Contaminado

6.6.1.

Remocin de HTPs de acuerdo al DEFG planteado

El diseo experimental factorial general (DEFG) propuesto permiti determinar el efecto de las variables independientes: bagacillo de caa, extracto de leonardita y lombrices (Eisenia andrei). Se observan niveles de remocin en el rango de 15000 a 45000ppm, que corresponden a un 29 y 63% de remocin respectivamente. El mximo nivel de remocin (63%) se obtuvo en el sistema conformado por BC, EL y 40 lombrices. La lnea punteada, indica el mximo nivel de remocin terico debido al contenido de 35% de la fraccin asfltica; es decir, 45500 mg HTPs/Kg de suelo. El tratamiento bioestimulado con EL (al 1%), BC (al 6%) y lombrices (40) produjo el porcentaje ms alto del remocin de HTPs (631.5%). El rendimiento de este tratamiento fue 117% ms, comparado con el tratamiento control b (remocin de HTPs de 292.1%) y 385% ms, si se compara con el tratamiento control a (remocin de HTPs de un 131.2%), al cual nicamente se le adicion el 60% de la CRA. El peor biotratamiento fue al que se le agreg solamente vermicomposta (VC); sin embargo, incluso su resultado inferior, demuestra un mejor comportamiento si se compara con el tratamiento del control (a). El funcionamiento relativamente bueno de la VC, se podra atribuir al cambio observado en la textura del suelo contaminado y el posible aumento de la porosidad. La VC se utiliza generalmente como fertilizante en el cultivo de cosechas debido a sus caractersticas nutrimentales (Ferruzzi, 1994); se sugiere que tales caractersticas estimularon la actividad microbiana del suelo.

La Tabla 14 muestra un resumen condensado de los porcentajes de remocin alcanzados por los 12 tratamientos en un periodo de 94 das, incluyendo los 2 blanco adicionales y en la Figura 22 se muestra a manera de resumen los HTPs residuales. Como era de esperarse y en comparacin con el blanco b, la adicin de BC y EL incrementa hasta un 59% los niveles de remocin HTPs y el tratamiento adicionado de BC, EL y 40 lombrices incrementa un 117% los niveles de remocin de HTPs. Si consideramos el blanco a, estamos hablando de un incremento del 385% en comparacin con el mejor tratamiento (BC, EL y 40 lombrices). Se obtiene un incremento del 174% de remocin en comparacin con el blanco c, cuando estn presentes el BC, EL y 40 lombrices. La incorporacin de

63

vermicomposta incrementa hasta un 123% los niveles de remocin de HTPs, respecto a blanco a, lo cual nos indica la importancia de su presencia en los tratamientos.

Tabla 14. Porcentaje de remocin de HTPs al termino del tratamiento (94 das), (S Si/Presencia; N No/Ausencia)

Remocin HTP's

N/BC, N/EL, 40 44 N/BC, N/EL, 20 36 N/BC, N/EL, 0 Blanco "b" 29

N/BC, S/EL, 40 54 N/BC, S/EL, 20 48 N/BC, S/EL, 0 40

S/BC, N/EL, 40 55 S/BC, N/EL, 20 48 S/BC, N/EL, 0 37

S/BC, S/EL, 40 63 S/BC, S/EL, 20 56 S/BC, S/EL, 0 46

Suelo Lavado 47 Blanco "a" 13 Blanco "c" 23

Remocin HTP's

Remocin HTP's

Blanco a Suelo al 60% de la CRA-S Blanco c Suelo al 60% de la CRA-S; bioestimulado con sales minerales

N/EL

S/EL

N/EL

S/EL

N/BC

S/BC
64

Figura 22. Hidrocarburos totales del petrleo remanentes antes del tratamiento y despus de ste.

En la Tabla 15, se indica la evolucin en la velocidad de remocin de HTPs a lo largo de los 94 das de tratamiento, observndose que todos los tratamientos estuvieron por encima de los indicados por Bossert and Bartha, 1984; los cuales indican que entre 5000 10000 ppm HTPs en suelos nativos la velocidad de remocin esta alrededor de 0.08 a 1.38 mgHTPs/cm da.
Tabla 15. Velocidad de remocin de HTPs (mgHTPs/cm da) durante el tratamiento (94 das), (S Si/Presencia; N No/Ausencia).
N/BC, N/EL, 40 0.095 2.16 0.88 0.67 0.46 N/BC, N/EL, 20 0.095 3.55 0.81 0.54 0.37 N/BC, N/EL, 0 Blanco (b) 0.095 1.03 0.53 0.38 0.3 N/BC, S/EL, 40 0.095 1.67 0.7 0.72 0.57 N/BC, S/EL, 20 0.095 1.56 0.77 0.71 0.51 N/BC, S/EL, 0 0.095 0.9 0.6 0.65 0.42 S/BC, N/EL, 40 0.095 2.89 1.29 0.81 0.57 S/BC, N/EL, 20 0.095 3.38 1.03 0.7 0.5 S/BC, N/EL, 0 0.095 2.76 0.86 0.54 0.34 S/BC, S/EL, 40 0.095 3.71 1.22 0.95 0.67 S/BC, S/EL, 20 0.095 3.81 1.21 0.85 0.58 S/BC, S/EL, 0 0.095 3.42 1.01 0.65 0.45 Blanco (a) 0.095 0.32 0.2 0.14 0.14 Blanco (c) 0.095 0.27 0.38 0.25 0.24
3 3

0 dias 1 semana 1 mes 2 meses 3 meses

0 dias 1 semana 1 mes 2 meses 3 meses

0 dias 1 semana 1 mes 2 meses 3 meses

Conversiones valor/1.43 = mgHTPs/gda; (valor1000)/1.43 = mgHTPs/da

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6.6.1.1. Efecto del bagacillo de caa en la remocin de HTPs

El bagacillo de caa se adicion con la finalidad de nutrir a las lombrices y con la finalidad de evaluar el efecto de su presencia en los tratamientos. No obstante, dadas sus propiedades este componente probablemente imparti textura y porosidad extra al suelo.

La presencia del bagacillo de caa estimula la remocin de los hidrocarburos ya sea por: la contribucin de su elevada carga microbiana total e hidrocarbonoclasta como se demostr durante la caracterizacin de este; a la cual seguramente estn asociados diversos grupos microbianos que secretan enzimas del tipo oxigenasas (ya que para poder sobrevivir en el bagacillo de caa deben consumir celulosa y lignina; que a su vez son precursores de las substancias hmicas) que tienen la capacidad de oxidar anillos aromticos y estructuras alifticas para poder ser metabolizadas estas estructuras menos complejas. el efecto texturizante que favorece la formacin de poros o microporos de aire. como una fuente ms de alimento que permite un co-metabolismo del contaminante.

En la Figura 23, se observar que un 6% de bagacillo de caa adicionado al suelo, increment la velocidad de remocin de HTPs, desde 0.095 mgHTPs/cm 3da (nivel basal) a 3.4

mgHTPs/cm 3da; durante la primera. Sin este componente (Figura 24) el incremento es de 0.095 mgHTPs/cm 3da (nivel basal) a 1 mgHTPs/cm 3da. Estas velocidades de remocin son superiores a las reportadas por Bossert and Bartha (1984), de 0.095 a 1.38 mgHTPs/cm 3da, no obstante que la concentracin inicial del contaminante fue mayor a la manejada por ellos de 5000 a 10000 ppm de HTPs. El incremento en la velocidad de remocin permite que estos tratamientos disminuyan el tiempo de tratamiento del suelo contaminado y por consiguiente se incremente la eficiencia de remocin. Ya se ha reportado (Pandey, 2000), que la incorporacin de bagacillo de caa incrementa los niveles de remocin (dependiendo de la composicin del tratamiento). En el presente estudio los incrementos fueron en un 25 a un 33% dependiendo del tratamiento respecto al blanco b.

66

Figura 23. Efecto de la presencia de bagacillo de caa en la remocin de HTPs, (S Si/Presencia; N No/Ausencia)

Figura 24. Efecto de la ausencia de bagacillo de caa en la remocin de HTPs, (S Si/Presencia; N No/Ausencia)

67

6.6.1.2. Efecto del extracto de leonardita (cidos hmicos) en la remocin de HTPs

La adicin de cidos hmicos (AHs) mediante el extracto de leonardita (EL) tuvo la finalidad de determinar su efecto en la remocin de HTPs. En las Figuras 26 y 27, podemos observar que la adicin de extracto de leonardita mejora la remocin de HTPs, pero no de manera inmediata. Este comportamiento puede sugerir que se est llevando a cabo interacciones del tipo fisicoqumicas sobre las de tipo biolgico. El investigador Nieman (1998) llev a cabo estudios en los que demostr que el pireno se uni ms a los cidos hmicos que a los cidos flvicos en el proceso de humificacin en un suelo contaminado artificialmente. Una parte del contaminante fue adsorbida y/o absorbida de tal manera que estos no fueron disponibles para los microorganismos como fuente de energa. Otro estudio llevado a cabo por Feificova, et. al. (2005), demostr que la presencia de cidos hmicos mejora los niveles de remocin e incrementa la tolerancia a fenol y catecol. Estos autores reportan que existe inhibicin el crecimiento microbiano ligeramente, no obstante esto podra haber sido provocado por la elevada interaccin hidrofbica de los cidos hmicos con los HPAs de acuerdo a lo expuesto por Nieman. Estos experimentos sugieren que pudo existir la incorporacin de hidrocarburos aromticos a los cidos hmicos lo cual seguramente se llev a cabo como se muestra en una representacin tridimensional en la Figura 25.

C C B C
Figura 25. Representacin tridimensional de los cidos hmicos, en donde se observan restos de pptidos (A), oligosacridos (B) e interacciones con hidrocarburos aromticos (C).

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Figura 26. Efecto de la presencia de extracto de leonardita en la remocin de HTPs, (S Si/Presencia; N No/Ausencia)

Figura 27. Efecto de la ausencia de extracto de leonardita en la remocin de HTPs, (S Si/Presencia; N No/Ausencia)

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Es por ello que se observa una fase de adaptacin en las cinticas de remocin de HTPs, lo cual parece indicar que los microorganismos consumen el contaminante de manera gradual, por lo que los niveles de remocin se ven favorecidos con el transcurso del tiempo.

La adicin de cidos hmicos tiene efectos similares a la adicin de lombrices, pero a diferencia de stas, los cidos hmicos pueden ser incorporados sobre grandes extensiones de suelo contaminado aportando muchos beneficios atribuidos a los cidos hmicos como: evitar la lixiviacin y expansin del contaminante, adems de su bajo costo y abundancia en la tierra.

La incorporacin de extracto de leonardita puede incrementar los niveles de remocin (dependiendo de la composicin del tratamiento), de un 23 a un 38% ms dependiendo del tratamiento respecto al blanco b, lo cual nos indica la importancia de la presencia de los cidos hmicos.

La Figura 26 muestra que la adicin de extracto de leonardita es un 1% incremento la velocidad de remocin de HTPs de 0.095 mgHTPs/cm 3da (nivel basal) a 1.7 mgHTPs/cm 3da en la primera semana; mientras que la ausencia de este (Figura 27) solo incrementa de 0.095 mgHTPs/cm 3da (nivel basal) a 1 mgHTPs/cm 3da. Estas velocidades de remocin son inferiores a las obtenidas cuando est presente el bagacillo de caa, no obstante, al mismo tiempo son superiores a las reportadas por Bossert and Bartha (1984); quienes han reportado incremento de 0.08 y 1.38 mgHTPs/cm da en suelos intemperizados contaminados con 5000 a 10000ppm de HTPs.
3

La flora microbiana hidrocarbonoclasta asociada al extracto de leonardita, pudo estar implicada en la remocin del hidrocarburo; debido a que su nica fuente de carbono y energa fue la estructura altamente compleja de los cidos hmicos; nos sugiere que estas deben de tener una amplia gama de maquinarias enzimticas capaces de degradar diversos tipos de estructuras aromticas presentes en stas, adems considerando que Lovley, et. al. (1996) demostr que los cidos hmicos pueden ser empleados como aceptores finales de electrones durante procesos aerobios o anaerobios en suelo contaminado con HPAs; estos pueden contribuir a la oxidacin o reduccin de los hidrocarburos presentes; de esta manera favorecer la remocin ms eficientemente ya sea debido a la flora

70

microbiana proporcionada por los cidos hmicos o por el empleo de stas por lo microorganismos presentes en el suelo. Los cidos hmicos contiene estructuras del tipo quinonas que estn involucradas en estos procesos de oxido reduccin; Field and Cervantes (2005) demostraron la interaccin de microorganismos en reacciones REDOX empleando humus y quinonas relacionadas; lo cual apoya nuestra suposicin del efecto de los cidos hmicos derivados del extracto de leonardita en la remocin de HTPs.

Estudios previos sobre el efecto de la incorporacin de los AHs en suelos contaminados con hidrocarburos demostraron que estos mejoran la actividad microbiana (Mosley, 1998), incrementa la retencin de Hidrocarburos Policclicos Aromticos (HPAs) (Soderstrom, 2000; Conte, 2001; Nieman J. K. C., 2005), tienen actividad de tensioactivos (Guetzloff and Rice, 1994; Engebretson and Wandrusrka, 1994; Wandruszka, 2000; Conte, 2005; Quagliotto et. al., 2006), etc. En estos experimentos reportados la contaminacin por hidrocarburos no superaba las 10000ppm, adems de que el tipo de hidrocarburo era ligero como aceites pesados o gasolinas; es decir, libre de la fraccin asfltica. Es por ello que nicamente se trabaj con una concentracin (1%) debido a que Mosley (1998); indica que empleando concentraciones por encima o por debajo de este valor no se estimula bien el crecimiento microbiano; sin embargo, Liem et. al. (2004) indica que el incremento de la concentracin de cidos hmicos mejora la remocin de hidrocarburos.

En estudios previos llevados por nuestro grupo de trabajo (datos no mostrados), se observ que los cidos hmicos derivados del extracto de leonardita (sin modificaciones posteriores, como la sulfonacin para mejorar su solubilidad en agua), tienen la capacidad de solubilizar la fraccin ligera de los HTPs en la concentracin presente en el suelo contaminado en estudio; empleando una solucin al 0.2% de EL; concentracin mucho menor a la que se trabajo en los tratamientos. Se emplean comillas para el trmino solubilizar, ya que se emplea en un sentido no convencional; lo correcto sera decir que a partir de cierta concentracin, las interacciones hidrfobas entre molculas de surfactantes se tornan suficientemente importantes respecto a las interacciones hidroflicas surfactante/agua para que se forme espontneamente una asociacin. Este conocimiento no ha sido reportado en la literatura hasta lo mejor de nuestro conocimiento; es decir, para hidrocarburos totales

71

libres de asfalteno. Estos resultados nos indicaron la elevada probabilidad de interaccin entre los cidos hmicos derivados de la leonardita y el contaminante a tratar.

Si al contaminante no se le remueven los asfaltenos la solubilizacin se me muy disminuida. Numerosos estudios indican la capacidad de los cidos hmicos de interactuar con hidrocarburos policclicos aromticos (Perminova, et al., 2006; Saparpakorn, Kim and Hannongbua, 2007). La

interaccin comprende la incorporacin de los HPAs a su centro hidrofbico al formar estructuras semejantes a micelas o interaccionando con ellos mediante enlaces de tipo (Kubicki and Apitz, 1999; Kcker, 2002; Wijnja, Pignatello and Malekani, 2004) (Figura 28); sin embargo, la mayoria de ellos se enfocan a hidrocarburos policclicos aromticos modelo como el pireno y no en mezclas complejas.

Figura 28. Modelo de interaccin de los cidos hmicos con xenobiticos. ( Wershaw, 1989; Engebretson and von Wandrusrka 1994; Perminova, 2005; Saparpakorn, Hyoun and Hannongbua 2007).

Los asfaltenos son molculas polares y extremadamente compleja (Pineda and Mesta-Howard, 2001). En forma natural usualmente se encuentran formando complejos con resinas y aceites (Subiaga and

72

Cuattrocchio, 2000). En la Figura 29, se muestra la composicin de agregados de asfaltenos. La complejidad de este tipo de estructuras dificulta la eficiencia de solubilizacin, an con los cidos hmicos.

Figura 29. Estructura de los agregados de asfalteno y floculacin de estos.

No obstante se ha considerado que una modificacin estructural de los cidos hmicos (AHs) podra incrementar la interaccin AHs-HPAs descrita anteriormente e incluso permitir una mayor biodisponibilidad (Perminova, et al., 2006). Los cidos hmicos tienden a disminuir las cargas positivas del suelo debidas a los iones sodio como se observa en la Figura 30, disminuyendo la dureza y compactacin del suelo (Tan, 2003). En el presente estudio la disminucin de la resistencia a la ruptura (dureza) registrada fue de 177.7Kg/cm a 33.3Kg/cm ; es decir, 1/5 de la dureza inicial.
2 2

Figura 30. Efecto de la presencia de cidos hmicos en los suelos compactos.

73

6.6.1.3. Efecto de la presencia de la lombriz (Eisenia andrei) en la remocin de HTPs

Como era de esperarse entre mayor fuera el contenido de lombrices en los tratamientos, debera mejorase el proceso de remocin de HTPs, debido a los reportes del empleo de lombrices en suelos contaminados con hidrocarburos (Singera, et al., 2001; Schaefera, 2005; Contreras-Ramos, 2006). Estos resultados pueden ser debido a que las lombrices, durante el proceso de alimentacin, fragmentan los residuos, incrementan la actividad microbiana y los ndices de descomposicin y/o mineralizacin de los residuos orgnicos, alteran las propiedades fsicas y qumicas de los materiales, provocando un efecto de composteo o humificacin mediante el cual la materia orgnica inestable es oxidada y estabilizada. El producto final, comnmente llamado vermicomposta (VC) es obtenido conforme los residuos orgnicos pasan a travs del intestino de la lombriz, y es bastante diferente al material original (Atiyeh et al., 2000). Adems, se ha demostrado que bajo la accin de las lombrices se incrementa tanto la velocidad de mineralizacin del nitrgeno como los ndices de conversin del N-NH4+ a N-NO3- (Atiyeh et al., 2002), lo cual contribuyen a mantener un ciclo del nitrgeno activo mejorando los niveles de remocin de HTPs.

Las Figuras 31, 32, 33 y 34 muestran que la presencia de un nmero creciente de individuos, incrementa la velocidad de remocin de HTPs durante la primera semana, incrementando de 0.095 mgHTPs/cm 3da (nivel basal) a 2.2 mgHTPs/cm 3da; mientras que la ausencia de estas solo incrementa de 0.095 mgHTPs/cm da (nivel basal) a 1.1 mgHTPs/cm da. Estas velocidades de remocin estn por encima de las reportadas por Bossert and Bartha (1984); ya que indican que para suelos contaminados con 5000 a 10000 ppm de HTPs las velocidades de remocin oscilan entre 0.08 y 1.38 mgHTPs/cm da.
3 3 3

La incorporacin de lombrices y el numero de estas (20 40), puede incrementar los niveles de remocin (dependiendo de la composicin del tratamiento), de un 20 a un 52% ms dependiendo del tratamiento respecto al blanco b.

74

Figura 31. Remocin de HTPs en presencia de lombrices, (S Si/Presencia; N No/Ausencia)

Figura 32. Remocin de HTPs en presencia de lombrices y extracto de leonardita, (S Si/Presencia; N No/Ausencia)

75

Figura 33. Remocin de HTPs en presencia de lombrices y bagacillo de caa, (S Si/Presencia; N No/Ausencia)

Figura 34. Remocin de HTPs en presencia de lombrices, bagacillo de caa y extracto de leonardita, (S Si/Presencia; N No/Ausencia)

76

Mientras los microorganismos son responsables de la degradacin bioqumica de la materia orgnica en el proceso de vermicomposteo, las lombrices acondicionan el sustrato y promueven la actividad microbiana. Las lombrices podran ser consideradas batidoras mecnicas ya que desintegran el material orgnico, lo que incrementa el rea superficial expuesta a los microorganismos y mueven los fragmentos y los excrementos ricos en bacterias, en consecuencia homogenizan el material orgnico (Domnguez et al., 2003). La bacterias Xanthomonas maltophilia Pseudomonas maltophilia son especies de bacterias que residen en la cavidad coelomica de las lombrices, y por lo cual tambin estn fuertemente relacionadas con la vermicomposta. Estas bacterias han mostrado una eficiencia elevada en la biorremediacin de HPAs (Lowry and Hurley, 2005) por lo que, la actividad de las lombrices es considerada de tipo fsico/mecnico y bioqumico. Los procesos mecnicos incluyen: aeracin del substrato, mezclado, y molienda. El proceso bioqumico es afectado por la descomposicin microbiana del substrato en el intestino de las lombrices (Buck et al., 2000).

Los resultados obtenidos indican que a mayor nmero de lombrices se mejora el nivel de remocin, debido a que se incrementa el efecto de estas sobre el suelo. A pesar de los niveles de remocin alcanzados, existi una prdida dramtica de peso de las lombrices. Al inicio del tratamiento las lombrices pesaban alrededor de 0.4 g y despus del tratamiento su peso disminuy en alrededor de un 70%. En aquellos tratamientos sin bagacillo de caa las lombrices perecieron en alrededor de dos meses y medio. Algunos reportes indican que las lombrices pueden perder hasta un 50% de su peso, despus de no recibir alimento durante 64 das (Beyer, 1996). En este estudio la prdida excesiva de peso podra estar relacionada a la gradual eliminacin de microorganismos, que son fuente de nutrientes para ellas. Se observ que en presencia de bagacillo de caa, proliferaron bastante bien; ya que, 10 lombrices al cabo de un mes generaron 30 cocones (datos no mostrados, Figura 35), por lo tanto la dilucin del alimento en el suelo y la presencia del contaminante pudieron provocar que la lombriz tuviera que llevar a cabo una mayor ingesta de suelo ms alimento, para cubrir sus necesidades fisiolgicas. Un mayor consumo de suelo por consiguiente estar asociado a una mayor incorporacin de txicos hacia el interior de la lombriz, provocando una intoxicacin crnica que gradualmente la llevara a la muerte. El los tratamientos que contenan VC, BC, EL, 40 y VC, EL, 40 se observaron nuevas lombrices (17 y 10 respectivamente), lo cual nos sugiere una

77

posible detoxificacin del suelo ya que en los otros tratamientos no hubo reproduccin. Es posible que el incremento en el nmero de individuos permitiera un incremento en la remocin de aquellos hidrocarburos presentes que eran txicos para las lombrices.

Figura 35. Cocn de la lombriz Eisenia andrei y lombrices recin nacidas

Pequeas cantidades de HPAs han sido encontradas en el tejido de la lombriz, cuando estos se encuentra en el suelo. Se tiene el conocimiento de las lombrices acumulan contaminantes presentes de su medioambiente y que esta acumulacin no es solo por adsorcin pasiva a travs de la pared del cuerpo de la lombriz, sino que tambin es durante el paso del suelo contaminado a travs de su intestino (Belford, 1998).

Contreras-Ramos (2006) al contaminar suelo con Fenantreno, Antraceno y Benzo(a)pireno con alrededor de 500 mg/Kg de cada HPA en presencia de Eisenia foetida (especie muy emparentada con Eisenia andrei); analiz el tejido de la lombriz y determin concentraciones de alrededor de 0.1, 0.01 y 0.001 ppm del contaminante respectivamente; por lo que el nivel de adsorcin de contaminantes por la piel de la lombriz se considera bajo. Adems la presencia de Eisenia foetida permiti obtener niveles de remocin de estos contaminantes en alrededor de 99%, 91% y 61% respectivamente; incrementando el nivel de remocin de estos compuestos al doble respecto al control. Estas investigaciones presentan evidencia sobre el efecto que tiene la lombriz sobre algunos contaminantes; sin embargo, las contaminaciones por TPHs son mucho ms complejas en cuanto a variedad de contaminantes a remover.

78

6.6.1.4. Efecto de la vermicomposta en la remocin de HTPs

Este efecto se observ en el sistema constituido por vermicomposta y agua al 60% de su CRA, el cual corresponde al blanco b (Figura 36). El nivel de remocin mximo fue de 29% en un tiempo de 94 das. Esta reportado que la vermicomposta mejora las caractersticas estructurales del terreno y desliga suelos arcillosos. Por otra parte los agregados que posee, permiten obtener una gran rea superficial, que le permite adsorber y absorber fuertemente elementos nutritivos (Atiyeh, 2000), lo cual presumiblemente favoreci la estimulacin de la flora microbiana del suelo, capaz de consumir hidrocarburos como fuente de carbono y/o energa. La presencia de flora microbiana

hidrocarbonoclasta presente en la vermicomposta (Tabla 12), pudo haber encontrado las condiciones necesarias para sobrevivir en el suelo contaminado y desarrollarse, de esta manera contribuir a la degradacin del contaminante.

Figura 36. Efecto de la vermicomposta en la remocin de HTPs.

79

6.6.1.5. Efecto de la humedad (blanco a) en la remocin de HTPs

El blanco a, al solo poseer la humedad necesaria para mantener una actividad de agua adecuada para el crecimiento de microorganismos de acuerdo con Smith, (1985); permiti un nivel de remocin de un 13%, lo cual nos indica que existen muy pocos recursos nutricionales para llevar a cabo la mineralizacin del contaminante; ya que, existe flora microbiana hidrocrabonoclasta considerable en el suelo (7106 UFC/g de suelo) como se coment anteriormente, la poblacin mnima requerida para llevar acabo procesos de biorremediacin es de 10 4 a 107 UFC/gramo de suelo. En las cinticas de remocin de HTPs se observar una muy baja velocidad de remocin durante la primera semana y durante el resto del periodo, incrementando de 0.095 mgHTPs/cm da (nivel basal) a
3

0.32

mgHTPs/cm 3da; mientras que al final del tratamiento esta tiene una velocidad de solo 0.095 mgHTPs/cm 3da (nivel basal) a 0.14 mgHTPs/cm 3da. Estas velocidades de remocin a pesar de ser demasiado bajas, estn por encima de las reportadas por Bossert and Bartha (1984).

6.6.1.6. Efecto de la bioestimulacin con sales minerales (blanco c) en la remocin de HTPs

El blanco c, debido a que contiene nutrientes en forma de sales minerales para obtener una relacin C/N 25 se obtuvo una remocin del 23%. Las sales minerales adicionadas, a pesar de su rpida asimilacin, pueden causar intoxicacin en los ecosistemas debido a su concentracin (Merck) por lo que se ve disminuido o atenuado el proceso de remocin de HTPs. Este efecto se pudo apreciar cuando se realizaba la cuenta total; ya que, la flora microbiana del blanco (a) era ms rica en variedad de cepas que el blanco (c). Las velocidades de remocin tambin fueron bajas respecto a los tratamientos del DEFG (Diseo experimental factorial general), llegando como mximo a un 0.27 mgHTPs/cm 3da.

Los blancos estriles a y c removieron 3%, indicando que es muy necesaria la flora microbiana del suelo.

80

6.6.2.

Eficiencia de remocin de HTPs en los diferentes tratamientos

Durante la evolucin de remocin de HTPs de los tratamientos, su eficiencia disminuy a las pocas semanas o se extendi a meses, si consideramos el porcentaje de remocin de hidrocarburos de cada tratamiento de manera individual como 100% la eficiencia comenz a disminuir a partir del da indicado en la Tabla 16.

Tabla 16. Periodo de tiempo a partir del cual comenz la disminucin de la eficiencia de remocin para cada tratamiento.

da de inicio disminucin eficiencia N/BC, N/EL, 0 Blanco (b) N/BC, N/EL, 20 N/BC, N/EL, 40 S/BC, N/EL, 0 S/BC, N/EL, 20 S/BC, N/EL, 40 N/BC, S/EL, 0 N/BC, S/EL, 20 N/BC, S/EL, 40 S/BC, S/EL, 0 S/BC, S/EL, 20 S/BC, S/EL, 40 Blanco (a) Blanco (c) 22 36 44 36 44 44 44 44 44 44 63 63 83 83

HC Totales HC tericos removibles % R (HTP's) % R (HC libres de Asfaltenos) 19 30 41 32 44 50 33 47 44 39 54 61 11 19 30 47 63 51 67 78 50 72 68 60 83 93 17 29

%R de los HC del tratamiento (HC libres de Asfaltenos) 86 83 93 86 91 92 82 97 82 84 97 96 83 81

El blanco b, parece que consume la mayor parte de sus nutrientes al da 22, por lo que su remocin es lenta a los largo del tiempo de tratamiento, en comparacin con el blanco a y c los cuales tardan hasta cerca de 83 das en obtener alrededor de un 83% de remocin pero el tratamiento es muy lento. El tratamiento compuesto por BC, EL y 40 lombrices es eficiente hasta el da 63 indicando que el efecto de todas las variables involucradas mantiene activo a este sistema por un periodo prolongado de tiempo; lo mismo ocurre con la mayora de los tratamientos; sin embargo, algunos de ellos dejan de ser eficientes a los 44 das posiblemente debido a la carencia de algn componente, lo que puede llevar a un disminucin de flora microbiana compleja o consorcio altamente degradador de hidrocarburos.

81

6.6.3.

Niveles de remocin de HTPs libres de la fraccin de asfaltenos

Si a la concentracin inicial de HTPs de 69000ppm de los tratamientos, le restamos la fraccin recalcitrante representada por los asfaltenos (35%), la concentracin terica de HTPs removible sera de 44850ppm, los niveles de remocin se muestran en la Tabla 17.

Tabla 17. Remocin de HTPs con y sin asfaltenos

HC Totales HC tericos removibles % R (HTP's) % R (HC libres de Asfaltenos) N/BC, N/EL, 0 Blanco (b) N/BC, N/EL, 20 N/BC, N/EL, 40 S/BC, N/EL, 0 S/BC, N/EL, 20 S/BC, N/EL, 40 N/BC, S/EL, 0 N/BC, S/EL, 20 N/BC, S/EL, 40 S/BC, S/EL, 0 S/BC, S/EL, 20 S/BC, S/EL, 40 Blanco (a) Blanco (c) 28 35 43 34 48 57 42 51 57 43 58 64 13 23 45 55 68 56 73 84 61 74 84 71 86 98 20 36

Se ha indicado la importancia de la presencia de cada uno de los componentes de los tratamientos y el efecto que implic su presencia; por lo que los resultados reflejan que se puede mejorar y disminuir el tiempo de remocin de HTPs de este suelo contaminado, a pesar de que estos resultados indican que es posible la remocin hasta un 98% sin considerar la fraccin de asfaltenos. Sin embargo, independientemente de los resultados es necesario determinar la composicin real o aproximada del hidrocarburo remanente. Ya se ha indicado que los asfaltenos e inclusive diversos hidrocarburos como los carbazoles, son estructuras altamente recalcitrantes (Pineda and Mesta-Howard, 2001), por lo que no necesariamente un 98% de remocin de hidrocarburos libres de asfaltenos indican que se ha removido totalmente y el hidrocarburo residual es nicamente asfalteno.

82

6.6.4.

Remocin HTPs a largo plazo (11 meses)

La Figura 37 presenta la concentracin de HTPs residuales para el mejor tratamiento (S/BC, S/EL, 40 lombrices) y algunos que contrastan en su composicin; hasta el da 94 y posteriormente al da 330.

Figura 37. Remocin de HTPs despus de 11 meses de tratamiento, (S Si/Presencia; N No/Ausencia)

Los anlisis de HTPs posteriores al da 330 para el mejor tratamiento no muestra diferencias significativas; sin embargo, el tratamiento sin lombrices al cabo de 6 meses removi una concentracin similar demostrando la importancia de stas. La ausencia de extracto de leonardita (EL) incrementa casi 9 meses el proceso de tratamiento. La ausencia de BC, EL y lombrices conlleva a un tiempo de tratamiento de alrededor de 11 meses. El blanco a removi un 20% aproximadamente despus de 11 meses de tratamiento.

83

Estos resultados sugieren que no existen las condiciones nutricionales adecuadas para llevar a cabo la remocin total del contaminante en algunos tratamientos. Se asume que la flora microbiana se atena simplemente no se dispone de la maquinaria enzimtica necesaria para poder continuar con la remocin del hidrocarburo remanente dado su carcter excesivamente recalcitrante. La comparacin de los diferentes tratamientos refleja la capacidad de los diferentes sistemas para remover HTPs, no obstante solo uno de los tratamientos es altamente eficiente para realizar dicha tarea en menor tiempo.

6.6.5.

Remocin de asfalteno contenidos en la mezcla compleja de HTPs

El anlisis de los asfaltenos remantes se observa en la Tabla 18. Existen fracciones de la molcula de asfalteno susceptibles a mineralizarse como las cadenas alifticas laterales, posteriormente las estructuras aromticas y en mucho menor grado las estructuras policondensadas (Rontani et. al. 1985), por lo cual bajo las condiciones adecuadas es posible removerlos. Martn-Gila, et al. (2007) determinaron parcialmente la composicin de los asfaltenos identificando los siguientes hidrocarburos:

Alcanos (n-hexano; 2-metilpentano, C6H14; y fitano, C20H42); cicloalcanos o naftenos (ciclopentano, C5H10; ciclohexano, C6H12 y metilciclopentano, C6H12); hidrocarburos aromticos (tetralino, C10H12; acenafteno, C12H10; y metilnafteno, C11H10) and policclicos, como el pireno.

Otros sistemas sulfurados no de hidrocarburos como derivados tiol: etanotiol, C2H6S o dimetilsulfuro, C2H6S; tiofeno, C4H4S and benzotiofeno C8H6S, los cuales se asume se producen durante la degradacin de los asfaltenos.

Compuestos nitrogenados como: 2-metilpiridina, C6H7N; quinolina, C9H7N e indol, C8H7N; y compuestos que contienen oxgeno como: cido esterico, C18H36O2; ciclopentano cido carboxlico, C6H10O2; o fenol, C6H6O, han sido caracterizados.

84

Algunos de estos hidrocarburos fueron identificados en el sobrenadante muestras de asfaltenos suspendidos en hexano. El anlisis cromatogrfico de estas muestras permiti observar hidrocarburos de alto peso molecular (Figura 38).

Figura 38. Perfil cromatogrfico de los asfaltenos.

La presencia de VC, EL, BC y 40 lombrices permiti obtener el mayor grado de remocin de asfaltenos en un menor tiempo; sin embargo, los otros tratamientos tambin presentaron las condiciones necesarias para llevar a cabo su remocin aunque en menor proporcin y en un periodo de tiempo mayor. Pineda and Mesta-Howard (2001) indican que se han reportado casos de niveles de remocin de asfaltenos de entre 5 y 35%. Como se haba indicado anteriormente, con el mejor tratamiento (VC, EL, BC y 40 lombrices) se obtuvo 63% de remocin de HTPs que corresponden a 24409ppm residuales, los cuales corresponden a un 98% de remocin de hidrocarburos tericos removibles, por lo que se puede suponer que el hidrocarburo restante sera nicamente asfalteno. Como podemos observar en la Tabla 18, de los 24409ppm de HTPs remantes de este tratamiento, 63.5% corresponden a asfaltenos y el resto a hidrocarburos degradables.

85

Tabla 18. Eficiencia de remocin de asfaltenos en los tratamientos seleccionados.

Das de Tratamiento tratamiento VC VC+EL VC+EL+BC VC+EL+BC+L 330 280 180 94

mg A*/Kg de suelo 19800.83 17948.34 17320.47 15505.9

mg HCLA*/Kg de %A suelo 12369.11 7655.63 7638.63 8903.28 61.58 70.25 69.39 63.48 38.42 29.75 30.61 36.52 %HCLA

%Remocin de A 18 26 28 38

24500 mg A/Kg de suelo iniciales; *A: Asfaltenos; *HCLA: hidrocarburos libres de asfaltenos

El tipo y la cantidad de hidrocarburo presente en la fraccin libre de asfalteno, se analiz mediante cromatografa de gases. Los resultados se muestran en la Tabla 19.

Tabla 19. Tipo y concentracin de hidrocarburos residuales; as como, su porcentaje de remocin.

Suelo inicial Tolueno* Xileno* C12* C14* Acenafteno* C16* Antraceno* C18* Fenantreno* C20* Fluoranteno* C22* C24* Criseno* C26* C28* Benzo(a)pireno* C30* seales cromatogrficas identificadas seales cromatogrficas totales

HTP's 163.4 46.1 187.9 162.3 111.2 173.1 182.2 294.1 731.3 780.4 959.6 931.6 1038.7 569.3 1883.4 1255.7 703.5 181.1

Asfaltenos *

mg*/Kg de suelo VC + EL + BC + L %R VC + EL + BC %R VC + EL %R
N/D N/D N/D N/D N/D N/D

VC
N/D N/D

%R

537.8 207.8
N/D N/D N/D

186 28

7.3 5.2
N/D N/D N/D

96 97

243.2 94.4
N/D N/D N/D

29 14.6 42 4.1
N/D N/D N/D

92 97

16.1 * * * * * * * *
N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

95

72.4 45.2
N/D N/D N/D

75 94

84.3
N/D N/D

71

6.3 3.6
N/D

98 99.5 72 84 57 86

450.0
N/D

403.5
N/D

61 84

302.0
N/D N/D N/D

611.6 63.3 524.0

N/D N/D N/D

53 264.6 144.9 41 444.2 89 N/D 72 259.2

N/D N/D N/D

18

130

30

28

37

48

40

Concentracin mnima detectada: 0.1 mg HTPs/Kg de suelo; N/D: no detectado; %R: porcentaje de remocin

86

De acuerdo con los resultados obtenidos el mejor tratamiento (VC, BC, EL y 40 lombrices), permiti reducir hasta concentraciones inferiores a 0.1mg HTPs/Kg de suelo, los hidrocarburos Criseno y Benzo(a)pireno considerados por la NOM-138-SEMARNAT/SS-2003 como hidrocarburos prioritarios txicos. Las 25 seales cromatogrficas no identificadas para este tratamiento indica la presencia de hidrocarburos del tipo recalcitrante. La superposicin de cromatogramas correspondientes a la muestra de asfaltenos y el mejor tratamiento de HTPs residuales extrados al da 94, se presenta en la Figura 39. De acuerdo a los perfiles mostrados, los hidrocarburos remanetes podran ser los presentes en las estructuras de los asfaltenos (Martn-Gila J., et al., 2007). La seal cromatogrfica observada a los 44.6 min no fue identificada; sin embargo, de acuerdo a los hidrocarburos presentes ntes y desps de esta seal puede corresponder al pentacosano (C25). Este puede ser producto de la degradacin de hidrocraburos alifticos de mayor peso molecular o producto de degradacin de algun hidrocarburo de alto peso molecular.

Figura 39. Perfiles cromatogrficos del mejor tratamiento (BC, EL y 40 L) en comparacin con los HTPs iniciales y asfaltenos.

De acuerdo a los resultados de la Tabla 19, existi generacin de los hidrocarburos C12 y C14 para este tratamiento, lo cual nos indica que pueden ser estos, producto de la degradacin de los hidrocarburos de cadena ms larga o de la biosntesis de hidrocarburos por las bacterias presentes en el tratamiento. Rapp and Gabriel-Jrgens (2003) reportaron que el gnero Rhodococcus sp., tiene la capacidad de degradar hidrocarburos alifticos de 16 carbonos. Park, et.al. (2001, 2005) reportaron que la bacteria Vibrio furnissii es capaz de sintetizar hidrocarburos de 14 a 27 carbonos. Todos los

87

tratamientos removieron Tolueno y Xileno presente en el hidrocarburo inicial; as como, Benzo(a)pireno y Criseno con excepcin del tratamiento con VC y EL (89%R) totalmente. Los niveles mximos de HTPs residuales permitidos reportados en la NOM-138-SEMARNAT/SS-2003 indica que, todos los suelos biotratados pueden ser considerados para uso de suelo de tipo agrcola, forestal, recreativo y de conservacin; debido a que los hidrocarburos mencionados estan por debajo de la norma. Los tratamientos que contiene VC y EL; as como, el blanco b an poseen remantes de fluoranteno, a pesar de los 10 meses de tratamiento. La estructura molecular del fluoranteno es relativamente compleja y probablemente es ms difcil se asimilar para la flora microbiana presente en estos tratamientos.

6.6.6.

Fraccionamiento de los HTPs residuales

La concentracin de las cuatro fracciones del hidrocarburo, antes y despus del mejor biotratamiento, se muestra en la Figura 40. Se muestra que el porcentaje del retiro fue relacionado con la clase de estructura del hidrocarburo. La composicin de los hidrocarburos residuales sugiere que la continuidad de los procesos de remocin podra ser posible solamente si los nutrientes requeridos estn disponibles. Interesantemente, los procesos del bioestimulacin empleados aqu, removieron hidrocarburos de peso molecular elevado y de estructura compleja (35%) contenidos en un suelo de baja porosidad. Tales resultados fueron asociados al aumento de la porosidad del suelo, debido a la adicin de vermicomposta y el efecto de los cidos hmicos; as como, al posible co-metabolismo presente entre la diversa fuente de microorganismos agregados, de bagacillo de caa y las lombrices..

88

Figura 40.Fraccionamiento de los HTPs residuales antes y despus del tratamiento.

89

6.6.7.

Anlisis Estadstico de la Fermentacin Slida del Suelo

En la Tabla 20 se muestran los resultados obtenidos del nivel de remocin de HTPs de los tratamientos del DEFG (Diseo Experimental Factorial General).
Tabla 20. Porcentaje de remocin de HTPs del DEFG.

BC (%) 0 6 0 6 0 6 0 6 0 6 0 6

EL (%) 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1

L 0 0 0 0 20 20 20 20 40 40 40 40

%R 29 37 40 46 36 48 48 56 44 55 54 63

Empleando el Programa Design Expert versin 7 se obtuvo el Anlisis Estadstico de la remocin de HTPs obtenido del DEFG para la fermentacin slida del suelo, para ello se obtuvo un primer diagnstico de efectos principales que involucra la suma de cuadrados y el % de Contribucin que mide la contribucin porcentual de cada uno de los trminos del modelo a la suma de cuadrados total (Anexo A1). Debido a que el porcentaje de contribucin es con frecuencia una gua aproximada pero efectiva de la importancia relativa de cada trmino del modelo, se seleccionaron aquellos trminos cercanos al 1%. Posteriormente el ANDEVA (Anexo A2), indic que todas las variables involucradas en el modelo son significativas; sin embargo, las interacciones BC-EL y BC-L tambin son significativas.

Debido a que las interacciones BC-EL y BC-L fueron significativas, estas se graficaron.

La interaccin entre BC-L, indica que la presencia de BC mejora el nivel de remocin hasta en un 33%. La presencia de EL, mejora hasta en 38% la remocin de HTPs, como se muestra en las Figuras 41 y 42.

90

Interaccin Bagazo de Caa (BC) - Lombrices (presencia de EL)

70

60

%Remocin de HTP's

50

40

30

20

10

0 N/BC S/BC

0 lombrices

20 lombrices

40 lombrices

Figura 41. Interaccin BC-L en presencia de EL

Interaccin Bagazo de Caa (BC) - Lombrices (ausencia de EL)

70

60

%Remocin de HTP's

50

40

30

20

10

0 N/BC S/BC

0 lombrices

20 lombrices

40 lombrices

Figura 42. Interaccin BC-L en ausencia de EL

La interaccin de BC-EL, indica que las lombrices y el nmero de individuos presentes incrementa significativamente la remocin de HTPs durante el tratamiento hasta en un 52%, como se muestra en las grficas 43, 44 y 45.

91

Interaccin Bagazo de Caa (BC) - Extracto de Leonardita (EL) (0 lombrices)

80

70

%Remocin de HTP's

60

50

Figura 43. Interaccin BC-EL

40

sin lombrices

30

20

10

0 N/BC
Ttulo del eje

S/BC

S/EL

N/EL

Interaccin Bagazo de Caa (BC) - Extracto de Leonardita (EL) (20 lombrices)

80

70

%Remocin de HTP's

60

50

Figura 44. Interaccin BC-EL en presencia de 20 lombrices

40

30

20

10

0 N/BC
Ttulo del eje

S/BC

S/EL

N/EL

Interaccin Bagazo de Caa (BC) - Extracto de Leonardita (EL) (40 lombrices)

80

70

%Remocin de HTP's

60

50

40

Figura 45. Interaccin BC-EL en presencia de 40 lombrices

30

20

10

0 N/BC
Ttulo del eje

S/BC

S/EL

N/EL

92

6.6.8.

Monitoreo de la poblacin microbiana

6.6.8.1. Carbono de biomasa

Esta metodologa permite analizar toda la biomasa viva contenida en la muestra; es decir, bacterias, levaduras, hongos y actinomicetos. La Figura 46, muestra la tendencia de los resultados obtenidos durante los 94 das de tratamiento.

Figura 46. Comportamiento del carbono de biomasa para los tratamientos del DEFG, (S Si/Presencia; N No/Ausencia)

Se observa un incremento y disminucin drstica de la biomasa microbiana durante el primer mes de tratamiento, posiblemente debida a la actividad de agua presente durante el acondicionamiento de los tratamientos al inicio del experimento, que permite un desarrollo momentneo de la flora microbiana presente. La repentina disminucin sugiere una preseleccin de la flora microbiana debido a los altos niveles del contaminante. Despus de 44 das de tratamiento se observa una recuperacin aparente

93

de la actividad microbiana, que sugiere el inicio de la detoxificacin del suelo, provocando como consecuencia el establecimiento y desarrollo de microorganismos hidrocarbonoclastas ms especficos y tolerantes. Al cabo de 60 das de tratamiento se observa una recuperacin de la flora microbiana lo cual sugiere una restauracin de esta.

En los blancos a y c, el carbono de biomasa (Cb) presenta un crecimiento durante las primeras semanas (Figura 47); sin embargo, despus de este tiempo no vuelve a incrementar significativamente. Lo cual indica la atenuacin de estos sistemas. El blanco c, corresponde al tratamiento bioestimulado con sales minerales (sulfato de amonio, como fuente de nitrgeno). Podra decirse que estos nutrientes son txicos a la flora microbiana nativa del suelo. En el caso del blanco a se esperaba que la flora microbiana se mantuviera constante a lo largo del proceso dado que solo se le adicion agua y por lo tanto no se tienen las condiciones nutricionales adecuadas para llevar a cabo la remocin del contaminante.

Figura 47. Comportamiento del carbono de biomasa para los blancos a y c

94

6.6.8.2. Cuenta total para Bacterias

La cuenta bacteriana mostr una variacin acorde a la composicin de los tratamientos (Figura 48). Los sistemas adicionados con BC, presentaron un incremento de bacterias totals entre 10 a 10 ; sin embargo, se vio afectada la flora hidrocarbonoclasta. El mayor incremento se observ en los sistemas que contenan adicionalmente EL y 40 lombrices (108 UFC/g de suelo). En todos los casos la flora microbiana total fue mayor hasta un orden de magnitud (10 veces mayor) con relacin a la hidrocarbonoclasta. La relacin flora microbiana total/flora microbiana hidrocarbonoclasta se vio disminuida en los sistemas adicionados con EL. Solo en el sistema preparado con BC, EL y 40 lombrices, la relacin de floras microbianas se aproxim a 1. Detalles del efecto de la composicin de los sistemas en el crecimiento bacteriano se describen a continuacin.
8 9

Nota: nicamente se presentarn los grficos de aquellos tratamientos representativos en donde se observe el efecto de cada variable (S N/BC, S N/EL y S N/40 lombrices), ya que se observ un comportamiento similar para aquellos tratamientos con 20 lombrices.

En la Figura 48-A se observa que la ausencia de BC, EL y lombrices mantuvo prcticamente constante a las bacterias totals; sin embargo existi una disminucin de las hidrocarbonoclastas, probablemente por ausencia de nutrientes, lo cual se ve reflejado en el carbono de biomasa despus de 15 das. Por otra parte, la presencia de lombrices estimula la actividad microbiana total y en menor proporcin la hidrocarbonoclasta, debido a las razones explicadas con anterioridad (Figura 48-B).

El extracto de leonardita incrementa la flora microbiana hidrocarbonoclasta (Figura 48-C), debido a que se ha demostrado que los cidos hmicos incrementan la tolerancia de bacterias y levaduras ante hidrocarburos aromticos, permitiendo que se desarrollen mejor (Feificova, et. al., 2005). Este efecto se observa entre los das 30-50, ya que el carbono de la biomasa no cae drsticamente. La presencia de BC no mejora el crecimiento hetertrofo e hidrocarbonoclasta, pero tampoco lo perjudica (Figura 48-D).

95

G
Hidrocarbonoclastas Totales Carbono de biomasa (Cb)

H
96

Figura 48. Efecto del BC, EL y L en las cinticas de crecimiento de las bacterias

Cuando en el tratamiento est presente tanto el BC como las lombrices, se estimula el crecimiento de la flora microbiana total e hidrocarbonoclasta, adems no se ve disminuido el carbono de biomasa durante un largo periodo, permitiendo as una restauracin de la flora microbiana en menor tiempo. La presencia de BC y EL (Figura 48-E), mejora la flora hidrocarbonoclasta y en general evita en gran medida el descenso del carbono de biomasa, lo que nos indica los beneficios de los cidos hmicos.

Cuando el tratamiento posee BC, EL y lombrices (Figura 48-F), la flora hidrocarbonoclasta se ve favorecida a lo largo del tiempo y tiende a ser prcticamente equivalente a la total. Respecto al carbono de biomasa ste disminuye poco respecto a su valor inicial. Se observa una rpida recuperacin de la flora microbiana lo que indica que se lleva a cabo una detoxificacin rpida del suelo contaminado.

Los blancos a y c (Figuras 48-G y 48-H), mantuvieron una concentracin de microorganismos constante a lo largo del tiempo del tratamiento. Debido a que el blanco a nicamente tiene agua pero no nutrientes necesarios para remover el hidrocarburo, la flora microbiana se mantuvo en un estado basal, por otra parte el blanco c al poseer nutrientes en forma de sales minerales, favoreci el crecimiento al parecer de la flora total (datos no mostrados), pero no de la hidrocarbonoclasta. De acuerdo a las hojas de especificaciones de Merck, el sulfato de amonio puede llegar a ser txico para las bacterias, de hecho advierte sobre su incorporacin a suelos y acuferos.

97

6.6.8.3. Cuenta total para Levaduras

Las levaduras presentaron un comportamiento semejante a las bacterias (Figura 49); debemos de tomar en cuenta que conforme transcurre el tiempo del tratamiento, se van llevando a cabo adaptaciones y substituciones de la flora microbiana.

Como se observa las levaduras tendieron a mantenerse estables conforme transcurri el tiempo lo cual nos puede indicar que se adaptaron al contaminante, de hecho fueron identificadas algunas de las cepas por nuestro grupo de trabajo como Candida tropicallis y Pichia sp., gneros identificados como degradadores de hidrocarburos (Duursma, Dowson, 1983).

Se observ en general que la ausencia de BC, EL y lombrices; es decir, nicamente el sistema bioestimulado con vermicomposta (Figura 49-A), no afect negativamente el crecimiento microbiano; de hecho, hubo un crecimiento considerable de las levaduras totals presentes pero no en el caso de las hidrocarbonoclastas; lo cual sugiere que las levaduras se encontraban posiblemente es fase de latencia esperando las condiciones favorables para reproducirse. Este comportamiento nos indica que las levaduras presentes en el suelo, son capaces de tolerar periodos prolongados de sequia y carencia de nutrientes, por lo que una caracterizacin de estas pueden ser de gran ayuda al realizar bioaumentacin en otros suelos semejantes.

La sola presencia de lombrices favorece a las levaduras totals (Figura 49-B), pero interfiere gradualmente con las hidrocarbonoclastas, es posible que la flora microbiana asociada al intestino de la lombriz compita con la flora microbiana nativa del suelo y la desplace gradualmente. La sola presencia de EL (Figura 49-C), por otro lado favorece el crecimiento de la poblacin de levaduras como lo ha demostrado Feificova, (2005).

98

Hidrocarbonoclastas

Totales

Carbono de biomasa (Cb)

Figura 49. Efecto del BC, EL y lombrices en las cinticas de crecimiento de las levaduras

99

La incorporacin de BC en los tratamientos mantiene activo el crecimiento microbiano e incrementa la flora total (Figura 49-D), posiblemente debido a la elevada cuenta microbiana natural que posee. Si al tratamiento se adicionan lombrices (Figura 49-E), se mejora ambos tipos de floras microbianas, lo cual sugiere que el efecto de mezclado, aireacin, distribucin de nutrientes y flora microbiana por la lombriz acta de manera sinrgica con la presencia de la flora microbiana asociada al BC.

El EL en conjunto con BC (Figura 49-F), mejoran el crecimiento de las levaduras y los mantuvieron casi constantes a los largo del proceso, se observa claramente el efecto sobre las levaduras totals propiciado por el BC. Si el BC, EL y las lombrices estn presentes se observa un crecimiento mximo de las levaduras totals, lo cual refleja el sinergismo de los componentes mencionados.

100

6.6.8.4. Cuenta total para Hongos

La Figura 50 muestra la cuenta de hongos en el curso del tiempo. En general la cuenta de hongos totales e hidrocrabonoclastas se mantuvo en el rango de 10 y 10 , respectivamente. El mximo crecimiento detectado fue hasta 10 . Se observa que los hongos presentes en los distintos sistemas son en su mayora hidrocrabonoclastas. Hacia el final del tiempo de tratamientos, el tipo de hongo que predomina es el hidrocrabonoclasta. La diferencia de la cuenta total de hongos totales e hidrocarbonoclastas, pueden ser ocasionada por el tipo de nutrientes empleados para llevar a cabo la cuenta total.
6 4 5

La evolucin de los hongos se vio favorecida con el transcurso del tiempo, la mayora de los tratamientos comenzaron a tener un incremento en la poblacin microbiana a partir del primer mes, algunos investigadores (Yateem et al., 1998; Mollea et al., 2005; Mancera at al., 2007) han demostrado la capacidad de ciertos hongos como Phanerochaete chrysosporium, Pleurotus ostreatus, Trametes versicolor, Rhizopus sp., Penicillium funiculosum y Aspergillus sydowii; de mineralizar HPAs y HTPs.

El crecimiento de hongos en los tratamientos solo se vio favorecido al principio de los tratamientos, posiblemente debido a la presencia de agua, ya que en general todos los tratamientos alcanzaron un crecimiento alrededor de las 1,000,000 UFC/g suelo seco, al cabo de 2 meses de tratamiento; por lo que la presencia o ausencia del BC, EL o las lombrices no tuvieron un efecto muy significativo en el crecimiento de los hongos.

101

Hidrocarbonoclastas

Totales

Carbono de biomasa (Cb)

Figura 50. Efecto del BC, EL y lombrices en las cinticas de crecimiento de los hongos

102

6.6.8.5. Cuenta total para Actinomicetos

Los actinomicetos se desarrollaron en gran medida en mayor proporcin a partir del primer mes (Figura 51). Su cuenta microbiana inicial y final se encuentra dentro de los rangos reportados por Pizzul (2006), cuyo rango es de 105-106 UFC/gramo de suelo. Prez-Armendriz (2004) reporta una concentracin de entre 10 -10 durante la remocin de hidrocarburo en suelo. Los actinomicetos como Streptomyces, Nocardia, etc., son capaces de generar antibiticos para limitar el crecimiento bacteriano desfavorable, lo cual puede tener efecto negativo en el crecimiento de bacterias y levaduras; por lo que su crecimiento puede afectar a los microorganismos que los rodean.
7 8

Figura 51. Efecto del BC, EL y lombrices en las cinticas de crecimiento de los actinomicetos.

Desempean un papel importante en el reciclaje del carbn orgnico y pueden degradar los polmeros complejos. Muchas cepas tienen la capacidad de solubilizar la lignina y de degradar compuestos relacionados con la lignina; produciendo enzimas degradadoras de celulosa/hemicelulosa; as como

103

enzimas extracelulares tipo peroxidasas, por lo que tambin estn involucrados en la formacin de substancias hmicas.

En general las condiciones ptimas para su crecimiento son temperaturas de 25-30C y en pH neutro (Pizzul, 2006). La temperatura promedio de los sistemas fue de 28C por lo que se pudo desarrollar las condiciones necesarias para su reproduccin. Los actinomicetos poseen muchas caractersticas que les permiten ser buenos candidatos para su uso en el biotratamiento de suelos contaminados con agentes orgnicos. Producen enzimas extracelulares que degradan una amplia gama de compuestos orgnicos complejos y esporas que son resistentes a la desecacin. Adems, su crecimiento filamentoso con frecuencia favorece la colonizacin de las partculas de suelo.

Otra caracterstica interesante dentro de este grupo de microorganismos, especialmente con respecto a la degradacin de compuestos hidrofbicos, es su produccin de tensioactivos (Pizzul, 2006). En el caso de los actinomicetos, la actividad de sus tensioactivos es debido: a) a la produccin de los biosurfactantes extracelulares, especialmente glicolpidos, como los lpidos del trealosa producidos por la especie de Rhodococcus o lipopeptidos producidos por una especie de Arthrobacter. Muchos actinomicetos pueden degradar diversos agentes contaminantes, incluyendo varios pesticidas. Por ejemplo, los miembros del gnero Arthrobacter degradan el 4-clorofenol, la atrazina y alaclor por Streptomyces.

Adems

los

actinomicetos

nocardioform

(e.g.

Rhodococcus,

Gordonia,

micobacteria)

son

degradadores conocidos de hidrocarburos alifticos e HPAs en suelo (Piero and Rivas, 2004). Adems, en algunos sitios contaminados representan un grupo dominante entre los degradadores (Pizzul, 2006).

104

6.6.9.

Correlacin de la poblacin microbiana hidrocarbonoclasta y la remocin de HTPs

Cada una de las variables de estudio, afecta positivamente la flora microbiana hidrocarbonoclasta y por lo tanto se ve reflejado en los niveles de remocin de HTPs alcanzados por los diferentes tratamientos (Figura 52). Como se observa en la Figura 52-A, la ausencia de BC, EL y lombrices, provoc una prdida de la flora hidrocarbonoclasta. Despus de de la segunda semana, es posible que los nutrientes aportados por la vermicomposta se hallan consumido rpidamente por lo que durante las primeras semanas existi cierto nivel de remocin acelerado. Si el ciclo de nitrgeno no se regenera de la manera adecuada, existe el denominado robbing de nitrgeno (Gotaas, 1956), por lo que los microorganismos ya no tienen suficiente nitrgeno para crecer y por lo tanto dejan de consumir hidrocarburo.

Es posible que las lombrices con el paso del tiempo consuman la flora microbiana nativa, las cuales no estn es las mejores condiciones ambientales para reproducirse; por lo que la remocin se favorece pero a largo tiempo. El EL al favorecer el crecimiento microbiano (Figura 52-B), permite que estas acten poco a poco sobre el contaminante permitiendo tolerar mejor los contaminantes (Ferficova, 2005), es posible y de acuerdo a Nieman (1998) que parte de los hidrocarburos se hayan incorporado a las substancias hmicas.

Cuando est presente el BC (Figura 52-C), se mejora

el crecimiento de la flora microbiana

hidrocarbonoclasta durante las primeras semanas, pero estas despus se atenan indicando que existe probablemente una sucesin microbiana o existe hidrocarburos ms recalcitrante o txicos. La presencia simultnea del BC y lombrices (Figura 52-D), ejercen un efecto sinrgico en la remocin de hidrocarburos, lo cual se ve reflejado en un incremento en la remocin de HTPs.

105

G
Hidrocarbonoclastas Remocin de HTPs

Figura 52. Correlacin entre el crecimiento microbiano y la remocin de HTPs, ante la presencia o ausencia de BC, EL y L

106

El EL y el BC, permiten que la flora microbiana sea ms activa durante todo el proceso (Figura 52-E), lo cual nos indica por un lado que los cidos hmicos, favorecen la remocin de los hidrocarburos ya sea por efecto directo sobre la flora microbiana o por su accin fisicoqumica sobre estas molculas; y por otro lado la presencia de bagazo de caa al estimular la flora microbiana debido a las presencia de su elevada flora microbiana hidrocarbonoclasta. Si adems estn presentes las lombrices se obtiene las mejores condiciones para la remocin (Figura 52-F).

La ausencia del VC, BC, EL y lombrices (Figura 52-G); mantiene constante la flora microbiana nativa, pero a pesar de esto, es probable que esta no sea lo suficientemente especializada como para llevar a cabo la remocin; ya que, esta flora microbiana est presente desde tiempo atrs. Por lo tanto sta ya esta aclimatada a las condiciones del suelo, pero an con la adicin de nutrientes salinos (Figura 52-H) no se mejora la remocin por lo que este suelo requiri la presencia de la flora microbiana proporcionada el BC, EL y lombrices, para llevara a cabo la remediacin del suelo.

107

6.6.10. Formacin de cidos hmicos

La formacin y descomposicin de cidos hmicos (AHs), se lleva a cabo de manera natural en los suelos; sin embargo, la cantidad presente est influenciada por el tipo y cantidad de materia orgnica; as como, de la flora microbiana presente. Se ha mencionado el rol de los AHs a nivel biolgico y fisicoqumico en los procesos de remocin de HTPs en los tratamientos; sin embargo, debemos de tomar en cuenta la sntesis de stos y su evolucin a lo largo del tiempo, en cada tratamiento en particular; ya sea, de los AHs nativos o los adicionados de manera exgena.

Es imprescindible la sntesis de AHs para que los sistemas funcionen mejor. Se ha demostrado que la incorporacin exgena de AHs permite en general incrementar los niveles de remocin en funcin al tipo de hidrocarburo presente (Mosley, 1998). Adems permiten que se generen ms AHs en menor tiempo, debido tal vez a que funcionan como cntros de nucleacin, a partir de los cuales los microorganismos presentes los emplean en reacciones redox (Field and Cervantes, 2005), pero a la vez reaccionan con molculas orgnicas presentes lo que contribuye a que se formen en mayor cantidad y complejidad.

Las Figuras 53 y 54, indican cmo afectan positivamente las variables en estudio en la formacin de AHs, durante el tiempo de tratamiento. La presencia de BC o las lombrices o ambos, incrementa hasta en un 100% la sntesis, respecto a los AHs nativos.

108

Figura 53. Sntesis de AHs para los tratamientos sin EL del DEFG, a lo largo del proceso.

Figura 54. Sntesis de AHs para los tratamientos con EL del DEFG, a lo largo del proceso.

109

6.6.11. Correlacin de la formacin de cidos hmicos y la remocin de HTPs

A pesar de que la VC incorpora una pequea cantidad de AHs (0.03%) parece no ser suficientes como para incrementar los niveles basales de AHs presentes en el suelo (0.5%) (Figura 55). La presencia de lombrices incrementa la generacin de AHs, estudios llevados a cabo por Pramanik (2007) en sistemas de vermicompostas empleando la lombriz Eisenia foetida, indican que existe formacin de AHs an cuando el alimento para la lombriz este desprovisto de estos. La diversa flora microbiana asociada al intestino de la lombriz, puede ser la causante de su formacin acelerada de AHs; ya que, en un sistema de composta su generacin es casi la mitad. En el presente estudio el incremento de AHs puede estar relacionado a la remocin de HTPs, ya que estos pueden interaccionar con los hidrocarburos.

Se observ que en los tratamientos adicionados con BC (Figura 55-D), incremento la sntesis de AHs en un 25%. Los AHs se generan a partir de restos de clulas animales, vegetales y bacterianas; algunas hiptesis de su sntesis podra ser a partir de la lignina, que es un polisacrido presente en el BC en un 20% aproximadamente, por lo que la presencia de ste puede propiciar la formacin de ms AHs. La presencia de lombrices pude incrementar un 60% la formacin de AHs (Figura 55-B). El efecto combinado de la presencia de BC y lombrices puede incrementar hasta un 87% la generacin de AHs. Los tratamientos adicionados nicamente con AHs en forma de extracto de leonardita (Figura 55-C), se incrementa la formacin de estos y se mejora los niveles de remocin de HTPs, nicamente se adicion 1% (40g por tratamiento) de AHs a este tratamiento, por lo que la flora microbiana hidrocarbonoclasta incorporada por estos, es muy baja en comparacin, por ejemplo de la VC que se adicion alrededor de 600g o el BC con 250g. Se asume que los incrementos de HTPs removidos fue gracias a las interacciones de tipo fisicoqumico (Perminova, 2006; Saparpakorn 2007) sobre los hidrocarburos presentes y el efecto de amortiguacin ante condiciones adversas que imparten estos (Mosley R. 1998). La Figura 55, indica el efecto sinrgico ocasionado por cada una de las variables presentes en cada tratamiento en especfico. La formacin de cidos hmicos se mantuvo constante en el caso de los blancos a y c (alrededor de 0.5%), debido a que no existieron las condiciones necesarias para poder sintetizarlos.

110

cidos Hmicos

Remocin de HTPs

Figura 55. Correlacin entre la formacin de cidos hmicos y la remocin de HTPs, ante la presencia o ausencia de BC, EL y L

111

6.7. Lavado de suelo con substancias hmicas

6.7.1.

Anlisis Estadstico de la remocin HTPs del suelo lavado

En la Tabla 21 se muestran los porcentajes de HTPs removidos mediante lavado de suelos con cidos hmicos de acuerdo al diseo experimental planteado.
Tabla 21. Porcentaje de remocin de HTPs del DEFC para el lavado de suelo.

EL (g) 0.1 1.0 10.0 0.1 1.0 10.0 0.1 1.0 10.0 0.1 1.0 10.0 0.1 1.0 10.0 0.1 1.0 10.0 0.1 1.0 10.0 0.1 1.0 10.0 0.1 1.0 10.0 1.0

Suelo (g) 5.0 5.0 5.0 10.0 10.0 10.0 15.0 15.0 15.0 5.0 5.0 5.0 10.0 10.0 10.0 15.0 15.0 15.0 5.0 5.0 5.0 10.0 10.0 10.0 15.0 15.0 15.0 10.0

Agua (ml) 50.0 50.0 50.0 50.0 50.0 50.0 50.0 50.0 50.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 150.0 150.0 150.0 150.0 150.0 150.0 150.0 150.0 150.0 100.0

Concentracin del EL (g/L) 2.0 20.0 200.0 2.0 20.0 200.0 2.0 20.0 200.0 1.0 10.0 100.0 1.0 10.0 100.0 1.0 10.0 100.0 0.7 6.7 66.7 0.7 6.7 66.7 0.7 6.7 66.7 10.0

%R 3.1 16.5 22.5 45.3 1.0 1.0 50.1 16.2 34.5 0.3 19.4 12.1 3.9 33.4 8.1 30.2 11.8 20.2 1.0 1.0 7.4 1.7 13.8 1.0 19.6 21.2 5.0 33.4

Para poder determinar si las variables en estudio son significativas estadsticamente y si tiene un efecto significativo, se llev a cabo el anlisis estadstico.

112

Empleando el Programa Design Expert versin 7 se obtuvo el anlisis de estadstico del experimento del porcentaje de remocin de HTPs despus del lavado del suelo, para ello se obtuvo un primer diagnstico de efectos principales que involucra la suma de cuadrados y el % de Contribucin que mide la contribucin porcentual de cada uno de los trminos del modelo a la suma de cuadrados total (Anexo A3). De acuerdo al anlisis de datos, se sugiere un modelo factorial 2FI. Posteriormente el ANDEVA, indic que todas las variables involucradas en el modelo son significativas; sin embargo, la interaccin EL-S fue significativa. A continuacin se analizaron las graficas de interacciones, as como, la de los residuales (Anexo A4).

Debido a que la interaccin EL-S fue significativa, esta se grafic.

La interaccin entre S-EL a niveles de concentracin bajos; es decir, 2g/L permite obtener el mayor nivel de remocin de HTPs como se observa en las Figuras 56, 57 y 58.

Figura 56. Superficie de respuesta de la interaccin S-EL, en presencia de 50ml de agua.

113

Figura 57. Superficie de respuesta de la interaccin S-EL, en presencia de 100ml de agua.

Figura 58. Superficie de respuesta de la interaccin S-EL, en presencia de 150ml de agua.

114

En este estudio se trabajaron concentraciones que van desde las 666ppm hasta las 200,000ppm. Estas concentraciones se establecieron en base al trabajo realizado por (Conte, 2005; Quagliotto, et. al., 2006), el cual es el trabajo ms reciente que indica por primera vez que un surfactante natural no txico como los cidos hmicos (HA) aislados de leonardita, son capaces de remover cantidades similares de hidrocarburos en suelos contaminados, tal y como lo hace un surfactante sinttico. En este trabajo se emplearon concentraciones de 10ppm basndose en el trabajo de Guetzloff and Rice, 1994., a pesar de que ste indica que los cidos hmicos (de sntesis qumica de Aldrich) poseen la capacidad de generar micelas y solubilizar DDT (hidrofbico) a una concentracin de 7.4g/L. Este ltimo artculo es cuestionado debido a que el empleo de la solubilidad como nico factor para determinar la concentracin micelar crtica (CMC) puede ser cuestionado. Cuando se adiciona un agente tensioactivo al agua, ste comienza a desplazar a las molculas de agua, evitando su unin mediante puentes de hidrgeno, dando como consecuencia una disminucin de la tensin superficial. La CMC es el punto en el cual la superficie del liquido (en este caso agua), se encuentra completamente saturada del componente en estudio y la adicin de una molcula mas de este compuesto genera la formacin de micelas con la capacidad de incorporar en su centro hidrofbico molculas hidrofbicas como los HPAs (Wandruszka, 2000). Las pruebas hidrofbicas tienden a interaccionar con los ncleos aromticos y complejos de los cidos hmicos y por lo tanto los valores de la CMC para un compuesto en especfico depende de su solubilidad. Sin embargo existen otros artculos que mencionan una CMC tan baja como 4mg/L Quagliotto, et. al. (2006).

6.7.2.

Determinacin de la Concentracin Micelar Crtica (CMC) del EL en solucin

Graficando la disminucin de la tensin superficial contra la concentracin del EL en solucin, se observa un comportamiento asinttico, del cual para poder determinar la CMC es necesario interpolar este comportamiento y leer el valor obtenido en el eje de las abscisas (mtodo empleado por diversos investigadores como Salager, 1993; Wandruszka and Young, 2001; Liang, 2007). De acuerdo a los resultados obtenidos se determin la CMC del EL en 2g/L; este resultado estuvo de acuerdo al obtenido mediante el DEFC planteado para el lavado de suelo contaminado. Por debajo de la CMC es

115

como si solo existiera agua en el tratamiento; sin embargo, por encima las micelas se deforman y pierden sus cualidades de emulsificar molculas hidrofbicas; por esta razn al disminuir o incrementar la concentracin de EL en solucin, se disminuy la capacidad de disolver el hidrocarburo.

Se emple un tensimetro (LAUDA - TD1C), para determinar la Concentracin Micelar Crtica (CMC) del EL en solucin obtenindose el comportamiento que muestra la Figura 59.

Figura 59. Determinacin de la CMC del EL.

De acuerdo al ANOVA del DEFC del lavado de suelo, en promedio se removi un 30% de HTPs a concentraciones de 2g/L de EL en una relacin 10:1 (solucin de cidos hmicos:suelo); por lo tanto est relacin se emple para llevar a cabo el lavado de 10Kg de suelo contaminado para llevar a cabo la fermentacin slida del suelo lavado (se empleo una concentracin de 3g/L, como medida de seguridad). La Tabla 22, indica la cantidad de hidrocarburo removido durante el lavado de 10Kg de suelo; as como, la cantidad de hidrocarburos en cada fraccin que se obtuvo como consecuencia del

116

proceso. Se removi 35.7% de HTPs, nivel semejante al obtenido en el diseo experimental, planteado para el lavado de suelo con cidos hmicos (DEFC).

Tabla 22. HTPs removidos mediante lavado con cidos hmicos.

Durante el proceso de lavado, las partculas de suelo de menor dimetro formaron una especie de emulsin estable (favorecida por la presencia de cidos hmicos), la cual solo pudo ser rota por centrifugacin, con lo cual se obtuvo un lodo. El anlisis de HTPs contenidos en esta especie de lodo arroj valores altos de HTPs (30000 mg HTPs/Kg de suelo).

El nivel de remocin est en funcin del tipo de contaminante, la intemperizacin y el tipo de surfactante empleado. Estudios realizados por nuestro grupo de trabajo (datos no mostrados) indicaron que los cidos hmicos son capaces de solubilizar 0.2g de hidrocarburo libre de asfalteno de este suelo a una concentracin de 0.2% de EL en un volumen de 50ml, en menor tiempo y con mayor eficiencia que los surfactantes sintticos SDS, Tritn X100 y Tergitol. Conte, et. al. (2005) tambin emple cidos hmicos para remover una contaminacin de 5000ppm de HPAs en comparacin con SDS, Tritn X100 y agua; demostrando que los tres surfactantes remueven cantidades semejantes de HPAs (alrededor de 60%, siendo ligeramente mejor los cidos hmicos). Cho, et. al. (2002) realiz un estudio sobre la capacidad de los cidos hmicos para mejorar la biodisponibilidad de los HPAs (naftaleno, fenantreno y pireno) en comparacin con los surfactantes sintticos SDS y Tritn X100, indicando que los cidos hmicos fueron ms eficaces. Bhandari et. al. (2000) quienes aplicaron Citrikleen para llevar a cabo el lavado de 20000ppm de diesel lograron remover 65% de ste contaminante. Torres, et. al. (2005) contamin suelo 100000ppm de petrleo del Batab (Campeche, Mxico), el cual fue lavado con SDS y E600 al 1%. Estos autores determinaron niveles de remocin de 20.4-32.9%.

117

Balcke, et. al., (2005) ha demostrado que los cidos hmicos pueden recubrir diversas partculas o arcillas, debido a las diversas cargas que poseen (Figura 60). Esta propiedad es de inters para aplicar los cidos hmicos en la elaboracin de soportes inertes para realizar biorremediacin in-situ.

Figura 60. Posible interaccin de los cidos hmicos con las molculas de suelo y HTPs, que permiti la formacin de un lodo en el lixiviado.

118

6.8. Fermentacin Slida del Suelo Lavado

6.8.1.

Remocin de HTPs debido al lavado de suelo

El suelo lavado, se acondicion de acuerdo al mejor tratamiento del DEFG de la fermentacin slida del suelo: BC, EL y 40 lombrices. La cintica de HTPs removidos se muestra en la Figura 61.

Figura 61. Cintica de remocin de HTPs del suelo lavado en comparacin con los blancos y el mejor tratamiento del DE FG.

Se puede apreciar que a pesar de que el proceso de lavado permiti remover 36% de HTPs (20000 mg HTPs/Kg de suelo), el desempeo del biotratamiento es inferior. Se haba considerado que el lavado previo del suelo permitira incrementar la eficiencia del biotratamiento y como consecuencia disminuir el tiempo remocin del contaminante. No obstante, se asume que es posible que se haya eliminado parte de la flora microbiana hidrocarbonoclasta; as como, nutrientes presentes en el suelo. En este sistema nacieron 40 lombrices y no hubo muerte de las lombrices incorporadas

119

inicialmente, lo cual sugiere la eliminacin de hidrocarburos txicos para est durante el proceso de lavado; no obstante, hubo una dramtica disminucin en la velocidad de remocin.

En la Figura 61 se observar que el lavado de suelo provoc una fuerte disminucin en la velocidad de remocin de HTPs durante la primera semana, incrementando de 0.092 mgHTPs/cm da (nivel basal) a solo 0.36 mgHTPs/cm 3da. Estas velocidades de remocin estn entre las reportadas por Bossert and Bartha (1984); ya que indican que para suelos contaminados con 5000 a 10000 ppm de HTPs han determinado velocidades de remocin entre 0.08 y 1.38 mgHTPs/cm 3da. En la Tabla 23, se indica la evolucin en la velocidad de remocin de HTPs a lo largo de los 94 das de tratamiento. Se observa que en todos los tratamientos la tasa de remocin fue superior a las reportadas por Bossert and Bartha, 1984; a excepcin de la obtenida con el suelo lavado. Este ltimo valor es prcticamente igual al obtenido con el blanco c (bioestimulado con sales minerales). Este hecho puede ser debido a que se removieron hidrocarburos ms fcilmente asimilables.
3

Tabla 23. Velocidad de remocin de HTPs (mgHTPs/cm3da) durante el tratamiento (94 das)
0 dias 1 semana 1 mes 2 meses 3 meses N/BC, N/EL, 40 0.095 2.16 0.88 0.67 0.46 N/BC, N/EL, 20 0.095 3.55 0.81 0.54 0.37 N/BC, N/EL, 0 Blanco (b) 0.095 1.03 0.53 0.38 0.3 N/BC, S/EL, 40 0.095 1.67 0.7 0.72 0.57 N/BC, S/EL, 20 0.095 1.56 0.77 0.71 0.51 N/BC, S/EL, 0 0.095 0.9 0.6 0.65 0.42 S/BC, N/EL, 40 0.095 2.89 1.29 0.81 0.57 S/BC, N/EL, 20 0.095 3.38 1.03 0.7 0.5 S/BC, N/EL, 0 0.095 2.76 0.86 0.54 0.34 S/BC, S/EL, 40 0.095 3.71 1.22 0.95 0.67 S/BC, S/EL, 20 0.095 3.81 1.21 0.85 0.58 S/BC, S/EL, 0 0.095 3.42 1.01 0.65 0.45 Suelo Lavado 0.095 0.36 0.32 0.26 0.2 Blanco (a) 0.095 0.32 0.2 0.14 0.14 Blanco (c) 0.095 0.27 0.38 0.25 0.24

0 dias 1 semana 1 mes 2 meses 3 meses

0 dias 1 semana 1 mes 2 meses 3 meses

Conversiones valor/1.43 = mgHTPs/gda; (valor1000)/1.43 = mgHTPs/da

La Tabla 24 muestra un resumen condensado de los HTPs residuales; as como, los porcentajes de remocin alcanzados por los 12 tratamientos en un periodo de 94 das, incluyendo los 2 blanco adicionales y el suelo lavado; en la Figura 62 se muestra a manera de resumen los HTPs residuales. Como era de esperarse y en comparacin con el blanco b, el suelo lavado incremento en un 62% la

120

remocin de HTPs, un 260% en comparacin con el blanco a y un 100% con relacin al blanco c. A pesar de estos incrementos en los niveles de remocin y con relacin a los tratamientos control, su desempeo fue inferior debido a que removi 30% menos HTPs que el mejor tratamiento del suelo sin lavar. Realizar este tratamiento; aparte de ser ms costoso, equivale a incorporar 40 lombrices nicamente; EL y 40 lombrices; BC y 40 lombrices BC y EL, de los cuales el ms econmico y viable sera la incorporacin de BC y EL.

Tabla 24. Porcentaje de remocin de HTPs al termino del tratamiento (94 das).

Remocin HTP's

N/BC, N/EL, 40 44 N/BC, N/EL, 20 36 N/BC, N/EL, 0 Blanco "b" 29

N/BC, S/EL, 40 54 N/BC, S/EL, 20 48 N/BC, S/EL, 0 40

S/BC, N/EL, 40 55 S/BC, N/EL, 20 48 S/BC, N/EL, 0 37

S/BC, S/EL, 40 63 S/BC, S/EL, 20 56 S/BC, S/EL, 0 46

Suelo Lavado 47 Blanco "a" 13 Blanco "c" 23

Remocin HTP's

Remocin HTP's

Blanco a Suelo al 60% de la CRA-S Blanco c Suelo al 60% de la CRA-S; bioestimulado con sales minerales

Figura 62. Hidrocarburos totales del petrleo remanentes antes del tratamiento y despus de ste.

121

6.8.2.

Eficiencia de remocin de HTPs en los diferentes los tratamientos

La eficiencia de remocin de HTPs disminuy a las pocas semanas o se extendi a meses, si consideramos el porcentaje de remocin de hidrocarburos de cada tratamiento de manera individual como 100% la eficiencia comenz a disminuir a partir del da x, como muestra la Tabla 25.

Tabla 25. Periodo de tiempo a partir del cual comenz la disminucin de la eficiencia de remocin para cada tratamiento.

da de inicio disminucin eficiencia N/BC, N/EL, 0 Blanco (b) N/BC, N/EL, 20 N/BC, N/EL, 40 S/BC, N/EL, 0 S/BC, N/EL, 20 S/BC, N/EL, 40 N/BC, S/EL, 0 N/BC, S/EL, 20 N/BC, S/EL, 40 S/BC, S/EL, 0 S/BC, S/EL, 20 S/BC, S/EL, 40 SL Blanco (a) Blanco (c) 22 36 44 36 44 44 44 44 44 44 63 63 63 83 83

HC Totales HC tericos removibles % R (HTP's) % R (HC libres de Asfaltenos) 19 30 41 32 44 50 33 47 44 39 54 61 46 11 19 30 47 63 51 67 78 50 72 68 60 83 93 70 17 29

%R de los HC del tratamiento (HC libres de Asfaltenos) 86 83 93 86 91 92 82 97 82 84 97 96 95 83 81

El tratamiento del suelo lavado acondicionado con VC, BC, EL y 40 lombrices es eficiente hasta el da 63 indicando que el efecto de todas las variables involucradas mantiene activo a este sistema por un periodo prolongado de tiempo; sin embargo, alrededor del da 44 se tiene un nivel de remocin del 80% de su tratamiento lo que nos indica que puede existir un rompimiento de una flora microbiana compleja o consorcio altamente degradador de hidrocarburos de este tratamiento. La remocin para este tratamiento es creciente a los largo de todo el proceso, pero muy lenta como se indico anteriormente.

122

6.8.3.

Niveles de remocin de HTPs libres de la fraccin de asfaltenos

Si a la concentracin inicial de HTPs de 69000ppm de los tratamientos, le restamos la fraccin recalcitrante representada por los asfaltenos (35%), la concentracin terica de HTPs removible sera de 44850ppm, los niveles de remocin se muestran en la Tabla 26.

Tabla 26. Niveles de remocin de HTPs en funcin de la presencia de asfaltenos.

HC Totales HC tericos removibles % R (HTP's) % R (HC libres de Asfaltenos) N/BC, N/EL, 0 Blanco (b) N/BC, N/EL, 20 N/BC, N/EL, 40 S/BC, N/EL, 0 S/BC, N/EL, 20 S/BC, N/EL, 40 N/BC, S/EL, 0 N/BC, S/EL, 20 N/BC, S/EL, 40 S/BC, S/EL, 0 S/BC, S/EL, 20 S/BC, S/EL, 40 SL Blanco (a) Blanco (c) 28 35 43 34 48 57 42 51 57 43 58 64 47 13 23 45 55 68 56 73 84 61 74 84 71 86 98 73 20 36

Se ha indicado la importancia de la presencia de cada uno de los componentes de los tratamientos y el efecto que implic su presencia; por lo que los resultados reflejan que se puede mejorar y disminuir el tiempo de remocin de HTPs de este suelo contaminado an cuando este ha sido lavado, pero se obtiene un 73% de remocin de la fraccin libre de asfalteno. En este tratamiento los asfaltenos remantes siguieron siendo unas 22400ppm, que son aproximadamente un 33% de asfaltenos en el suelo contaminado lavado, lo cual demuestra que el lavado de suelo elimin cierta flora microbiana, hidrocarburos o nutrientes indispensables para llevar a cabo una remocin mayo de la fraccin asfltica.

123

Para conocer el tipo y la cantidad de hidrocarburo presente en la fraccin libre de asfalteno, las muestras fueron analizadas mediante cromatografa de gases obtenindose los resultados que se muestran en la Tabla 27.

Tabla 27. Tipo y concentracin de hidrocarburos residuales, para el suelo lavado.

Suelo inicial Tolueno* Xileno* C12* C14* Acenafteno* C16* Antraceno* C18* Fenantreno* C20* Fluoranteno* C22* C24* Criseno* C26* C28* Benzo(a)pireno* C30* seales cromatogrficas identificadas seales cromatogrficas totales

HTP's 163.4 46.1 187.9 162.3 111.2 173.1 182.2 294.1 731.3 780.4 959.6 931.6 1038.7 569.3 1883.4 1255.7 703.5 181.1

mg*/Kg de suelo Asfaltenos SL (ntes) * 65.1

N/D

%R SL (despus) %R 60 N/D
N/D

193.7 70.1
N/D N/D

3 57

N/D N/D N/D N/D

94.1
N/D

48 86

75.0 141.1
N/D N/D

59 52

* * * * * * * *

103.7
N/D N/D N/D

393.4 589.5 42 41 78 21
N/D N/D

59 37

607.4
N/D

1116.1 272.8 558.3

N/D

904.6 210.0
N/D N/D

52 83

18

130

30

80

40

Concentracin mnima detectada: 0.1 mg HTPs/Kg de suelo; N/D: no detectado; %R: porcentaje de remocin

El proceso de lavado de suelo permiti eliminar Xileno, Acenafteno, Fluoranteno, Criseno; as como, algunos hidrocarburos alifticos de cadena larga, pero no del todo al Antraceno, Fenantreno y al Benzo(a)pireno. Se ha indicado la capacidad que tiene los cidos hmicos de solubilizar los hidrocarburos libres de la fraccin asfltica y como estos actan sobre los HPAs; por lo que se esperaba que fueran capaces de interaccionar con algunas de estas molculas; no obstante el nivel

124

de remocin del 36% de HTPs se detectaron 80 seales cromatogrficas no identificadas, que nos indica que este suelo an est muy contaminado.

Por otro lado, el nivel de remocin obtenido por el tratamiento de suelo lavado que contiene VC, BC, EL y 40 lombrices despus de la fermentacin slida, permiti eliminar por completo los hidrocarburos Criseno y Benzo(a)pireno considerados por la NOM-138-SEMARNAT/SS-2003 como hidrocarburos prioritarios txico. An existe la presencia de 40 seales cromatogrficas no identificadas para este tratamiento lo que indica que an existen diversos hidrocarburos recalcitrantes. Aun existe la presencia de Antraceno y Fluoranteno, los cuales son hidrocarburos carninognicos, aunque en menor concentracin; as como, la presencia de hidrocarburos alifticos de cadena larga debido posiblemente como consecuencia de la degradacin de hidrocarburos ms complejos. Los perfiles cromatograficos superpuestos de este tratamiento, de los asfaltenos y de los HTPs inciales (Figura 63), indican que los hidrocarburos remantes pueden ser muy semejantes a los encontrados en los asfaltenos, si consideramos la degradacin de estos; ya que, pueden liberar hidrocarburos muy diversos (Martn-Gila et al., 2007). Se observa una seal cromatogrfica a los 44.6min muy elevada la cual no fue identificada; sin embargo, de acuerdo a los hidrocarburos presentes ntes y desps de esta seal puede corresponder al pentacosano (C25).

Figura 63. Perfil cromatogrfico del tratamiento del suelo lavado acondicionado con VC, BC, EL y 40 lombrices en comparacin con la muestra inicial y los asfaltenos.

125

Esta generacin de hidrocarburos de cadena larga en comparacin con el suelo lavado pueden tener un origen natural, ms que de origen antropognico. Duursma and Dowson, (1983), nos indica que pueden ser producto de biosntesis de hidrocarburos por las bacterias presentes en el tratamiento ya que estas pueden producir hidrocarburos alifticos con cadenas de entre 13 y 31 carbonos. Conforme a la NOM-138-SEMARNAT/SS-2003, el tratamiento del suelo lavado se pueden considerar para su uso de suelo de tipo agrcola, forestal, recreativo y de conservacin; debido a que los hidrocarburos mencionados estan por debajo de la norma.

6.8.4.

Fraccionamiento de los HTPs residuales

El proceso de lavado permiti remover cerca del 60% y 30% de la fraccin aliftica y aromtica respectivamente (Figura 64). De acuerdo a experimentos previos, realizados por el grupo de trabajo; se observ la capacidad de los cidos hmicos, de solubilizar a los hidrocraburos libres de asfaltenos provenientes de este suelo contaminado. De acuerdo a las propiedades fisicoqumicas de los cidos hmicos se esperaba que durante el proceso de lavado, estos tuvieran cierto grado de interaccin del contaminante. Se nota una fuerte interaccin sobre hidrocraburos de cadena lineal sobre los aromticos.

La concentracin de las cuatro fracciones del hidrocarburo, antes y despus del mejor biotratamiento, se muestra en la Figura 65. Se muestra que el porcentaje del retiro fue relacionado con la clase de estructura del hidrocarburo. La composicin de los hidrocarburos residuales sugiere que la continuidad de los procesos de remocin podra ser posible solamente si los nutrientes requeridos estn disponibles. Interesantemente, los procesos del bioestimulacin empleados aqu, removieron hidrocarburos de peso molecular elevado y de estructura compleja ( 35%) contenidos en un suelo de baja porosidad. Tales resultados fueron asociados al aumento de la porosidad del suelo, debido a la adicin de vermicomposta y el efecto de los cidos hmicos; as como, al posible co-metabolismo presente entre la diversa fuente de microorganismos agregados, de bagacillo de caa y las lombrices.

126

Figura 64. Fraccionamiento de los HTPs del suelo lavado antes y despus del biotratamiento.

Figura 65. Fraccionamiento de los HTPs del suelo lavado biotratado y el mejor biotratamiento del suelo sin lavar.

127

6.8.5.

Monitoreo de la poblacin microbiana

6.8.5.1. Carbono de biomasa (Cb)

La Figura 66, muestra la tendencia de los resultados obtenidos durante los 94 das de tratamiento.

Figura 66. Comportamiento del carbono de biomasa para los blancos y el suelo lavado.

El suelo lavado present un comportamiento muy similar a los obtenidos para la fermentacin slida del suelo sin lavar del DEFG (Diseo experimental factorial general), a pesar de que mostr incremento el carbono de biomasa significativo durante las primeras semanas no se recuper despus de los 20 das de tratamiento, indicando que la flora microbiana presente fue muy pobre los microorganismos indispensables que formaban parte de consorcios fueron eliminados durante el proceso de lavado.

128

6.8.5.2. Cuenta total para Bacterias y Carbono de biomasa (Cb)

La flora hidrocarbonoclasta total con el tiempo fue disminuyendo (Figura 67), lo cual se ve reflejado en el carbono de biomasa, como consecuencia de este descenso el nivel de remocin de HTPs fue muy lento y muy pobre (Figura 68).

Figura 67. Efecto del lavado de suelo en las bacterias del tratamiento.

Figura 68. Efecto del lavado de suelo en el nivel de remocin de HTPs.

129

6.9. Tratamiento del Lixiviado

Este lixiviado present la formacin de una capa grasosa y viscosa, lo que sugiere la formacin de una biopelcula de microorganismos y la presencia de hidrocarburos en su superficie (Figura 69). Este fue tratado inyectndole aire para favorecer la remocin de los hidrocarburos remanentes. Como se indic anteriormente el lixiviado tuvo una concentracin de 3000ppm.

Figura 69. Lixiviado del proceso de lavado.

Para conocer el tipo y la cantidad de hidrocarburo presente en el lixiviado, las muestras fueron analizadas mediante cromatografa de gases obtenindose los resultados que se muestran en la Tabla 28. nicamente se detectaron los hidrocarburos Fluoranteno, C24 y C26, los cuales se encontraban en mayor concentracin en el suelo antes del tratamiento. Debido a la dilucin que hubo sobre el contaminante del suelo durante el proceso de lavado (100 litros de solucin de cidos hmicos: 10 kilogramos de suelo contaminado) por lo que es posible que los hidrocarburos monitoreados no se hayan detectado. Despus del tratamiento del lixiviado, no se detectaron los hidrocarburos monitoreados. No obstante se detectaron 6 seales cromatogrficas, lo cual sugiere que sean hidrocarburos recalcitrantes. La concentracin final de hidrocarburos en la muestra fue de 250ppm.

130

Tabla 28. Tipo y concentracin de hidrocarburos residuales, para el lixiviado

mg*/Kg de suelo Suelo inicial HTP's Asfaltenos SN (ntes) Tolueno* 163.4 * N/D Xileno* 46.1 N/D C12* 187.9 N/D C14* 162.3 N/D Acenafteno* 111.2 N/D C16* 173.1 N/D Antraceno* 182.2 N/D C18* 294.1 N/D Fenantreno* 731.3 * N/D C20* 780.4 * N/D Fluoranteno* 959.6 * 270.8 C22* 931.6 * N/D C24* 1038.7 * 553.4 Criseno* 569.3 * N/D C26* 1883.4 781.8 C28* 1255.7 * N/D Benzo(a)pireno* 703.5 * N/D C30* 181.1 N/D seales cromatogrficas identificadas seales cromatogrficas totales

%R SN (despus) %R
N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

72 47 58

N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D N/D

18

130

30

31

Concentracin mnima detectada: 0.1 mg HTPs/Kg de suelo; N/D: no detectado; %R: porcentaje de remocin

La Figura 70, muestra los perfiles cromatogrficos obtenidos de lixiviado antes y despus del tratamiento. El lixiviado tratado no mostr casi hidrocarburos. Lo cual sugiere que durante el proceso de lavado, se incorporaron microorganismos hidrocarbonoclastas contenidos en el suelo e el lixiviado, lo que permiti remover los hidrocarburos

131

Figura 70. Perfil cromatogrfico del lixiviado antes (A) y despus (B) del tratamiento.

132

7. CONCLUSIONES

Caracterizacin de los materiales

Todos los materiales empleados presentaron crecimiento microbiano hidrocarbonoclasta, lo cual indica que cada material puedo contribuir a la remocin de HTPs del suelo contaminado.

Seleccin de la fuente de nitrgeno

La lombriz Eisenia andrei, no sobrevive a la relacin C/N: 10 25, adicionando sulfato de amonio, nitrato de sodio, nitrato de potasio o urea, como fuente de nitrgeno, propuesta para la remocin de hidrocarburos de este suelo.

Fermentacin slida del suelo

Se obtuvo un 63% de remocin de HTPs con el tratamiento adicionado con BC, EL y 40 lombrices, en un periodo no mayor a 3 meses.

Se removieron los hidrocarburos alifticos en un 85.5%, los policclicos aromticos en un 78.4%, los saturados en un 73.2%y los asfaltenos en un 35.8%; con el tratamiento adicionado con BC, EL y 40 lombrices.

El empleo de VC como bioestimulante, permite una remocin del 23% de HTPs.

La presencia de Bagacillo de caa y Extracto de Leonardita en los tratamientos, mejora la remocin de hidrocarburos e incrementa la actividad de la flora microbiana.

Los niveles de remocin de hidrocarburos se ven favorecidos ante la presencia de la lombriz y mejora con el nmero de individuos presentes en presencia de alimento.

133

Lavado de suelo con cidos hmicos

Se removi un 35.7% de HTPs mediante el proceso del lavado con cidos hmicos (Con una concentracin de 2g/L de Extracto de Leonardita), 65% del total de hidrocarburos extrables del suelo.

Fermentacin slida del suelo lavado

Se obtuvo un 47% de remocin de HTPs con el tratamiento adicionado con BC, EL y 40 lombrices, en un periodo no mayor a 3 meses.

Se removieron los hidrocarburos alifticos en un 69.9%, los policclicos aromticos en un 64.3%, los saturados en un 52.6%y los asfaltenos en un 15.7%; con el tratamiento adicionado con BC, EL y 40 lombrices.

La velocidad de remocin de HTPs se ve seriamente afectada por el proceso de lavado,, siendo 10 veces menor que el mejor biotratamiento de suelo sin lavar, bajo las mismas condiciones.

134

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Pginas de Internet consultadas:

http://www.epa.gov/tio/remed.htm. http://www.bp.com http://www.frtr.gov/matrix2/top_page.html

152

9. ANEXO
A1. Porcentaje de contribucin de los trminos del DEFG al modelo. Trmino A-BC B-EL C-L AB AC BC ABC Residuales Suma Cuadrados % Contribucin 243 280 515 5 6 1 1 0 23 27 49 1 1 0 0 Trminos implicados en el Modelo (M) o como parte del error (e) M M M M M e e

A2. Anlisis de varianza de los efectos seleccionados como principales contribuyentes del anlisis estadstico del DEFG.

ANDEVA para el modelo factorial seleccionado cuadrtico Tabla de anlisis de varianza Suma de Significado de los F Cuadrados g.l. Cuadrados Valor Modelo 1049.3 7.0 149.9 449.7 A-BC 243.0 1.0 243.0 729.0 B-EL 280.3 1.0 280.3 841.0 C-L 514.7 2.0 257.3 772.0 AB 5.3 1.0 5.3 16.0 AC 6.0 2.0 3.0 9.0 Residual 1.3 4.0 0.3 Total 1050.7 11.0

p-valor Prob > F < 0.0001 < 0.0001 < 0.0001 < 0.0001 0.0161 0.0331

significantivo

El valor F del modelo (449.71) indica que el modelo es significativo. Solo hay un 0.01% de probabilidad de que " El valor F del modelo" sea debido a ruido. Valores de "Prob > F" menores que 0.0500 indican que los trminos del modelo son significativos. En este caso A, B, C, AB, AC son trminos significativos del modelo. Valores superiores a 0.1000 indican que los trminos del modelo no son significativos.

Desv. Estd. Significado C.V. % PRESS

0.577350269 46.33333333 1.246079718 12

R-cuadrada Adj R-cuadrada Pred R-cuadrada Adeq Precision

0.99873096 0.99651015 0.98857868 72.4784451 153

A3. Graficas de residuales del DEFG. Los puntos de la grfica de residuales (Figura A3-1), se localizan razonablemente prximos a una lnea recta, brindando apoyo a la conclusin de que BC (A), EL (B), L (C), BC-EL (AB) y BC-L (AC), son los principales efectos significativos y que satisfacen los supuestos fundamentales del anlisis.
Design-Expert Software Remocin de HTP's Color points by value of Remocin de HTP's: 63

Normal Plot of Residuals

99

95

N o rm a l % P ro b a b ility

29

90 80 70

50

30 20 10 5

-1.50

-0.75

0.00

0.75

1.50

Internally Studentized Residuals

Figura A3-1. Grfica normal de residuales.

Se observa una dispersin equitativa de los residuales entre + 3.0 y 3.0 (Figura A3-2).

Design-Expert Software Remocin de HTP's

3.00

Residuals vs. Run

In te rn a lly S tu d e n tiz e d R e s id u a ls

Color points by value of Remocin de HTP's: 63 29

1.50

0.00

-1.50

-3.00

11

Run Number

Figura A3-2. Grfica de residuales contra tratamiento.

154

Como se observa en estas grficas (Figura A3-3) la varianza no es demasiada para cada uno de los efectos.
Design-Expert Software Remocin de HTP's
3.00

Residuals vs. BC

In te rn a lly S tu d e n tiz e d R e s id u a ls

Color points by value of Remocin de HTP's: 63 29

1.50

2
0.00

2 2

-1.50

-3.00

BC
Design-Expert Software Remocin de HTP's
3.00

Residuals vs. EL

In te rn a lly S tu d e n tiz e d R e s id u a ls

Color points by value of Remocin de HTP's: 63 29

1.50

2
0.00

-1.50

-3.00

B:EL
Design-Expert Software Remocin de HTP's
3.00

Residuals vs. L

In te rn a lly S tu d e n tiz e d R e s id u a ls

Color points by value of Remocin de HTP's: 63 29

1.50

0.00

-1.50

-3.00

C:L

155

A4. Graficas de residuales del DEFC. Los puntos de la grfica de residuales (Figura A4-1), se localizan razonablemente prximos a una lnea recta, brindando apoyo a la conclusin de que S (B), Agua (C) y EL-S (AB), son los principales efectos significativos y que satisfacen los supuestos fundamentales del anlisis.
Design-Expert Software Sqrt(Remocin + 1.00) Color points by value of Sqrt(Remocin + 1.00): 7.14533

Normal Plot of Residuals

99

95

N o rm a l % P ro b a b ility

1.1351

90 80 70

50

30 20 10 5

-1.99

-1.12

-0.25

0.63

1.50

Internally Studentized Residuals

Figura A4-1. Grfica normal de residuales.

Se observa una dispersin equitativa de los residuales entre + 3.0 y 3.0 (Figura A4-2).

Design-Expert Software Sqrt(Remocin + 1.00)

3.00

Residuals vs. Run

In te rn a lly S tu d e n tiz e d R e s id u a ls

Color points by value of Sqrt(Remocin + 1.00): 7.14533 1.1351

1.50

0.00

-1.50

-3.00

10

19

28

Run Number

Figura A4-2. Grfica de residuales contra tratamiento.

156

Como se observa en esta Figura A4-3, la varianza no es demasiada para cada uno de los efectos.

Design-Expert Software Sqrt(Remocin + 1.00)

3.00

Residuals vs. EL

In te rn a lly S tu d e n tiz e d R e s id u a ls

Color points by value of Sqrt(Remocin + 1.00): 7.14533 1.1351

1.50

0.00

-1.50

-3.00

0.10

2.57

5.05

7.53

10.00

EL
Design-Expert Software Sqrt(Remocin + 1.00)
3.00

Residuals vs. Suelo

In te rn a lly S tu d e n tiz e d R e s id u a ls

Color points by value of Sqrt(Remocin + 1.00): 7.14533 1.1351

1.50

0.00

-1.50

-3.00

10

11

12

13

14

15

B:Suelo
Design-Expert Software Sqrt(Remocin + 1.00)
3.00

Residuals vs. Agua

In te rn a lly S tu d e n tiz e d R e s id u a ls

Color points by value of Sqrt(Remocin + 1.00): 7.14533 1.1351

1.50

0.00

-1.50

-3.00

50

67

83

100

117

133

150

C:Agua

157

A5. Porcentajes de remocin de los diferentes tratamientos y el suelo lavado, respecto a los blancos a, b y c.

Porcentaje de remocin entre tratamientos N/BC, N/EL, 40 52 N/BC, N/EL, 20 24 N/BC, N/EL, 0 Blanco "b" 0 N/BC, N/EL, 40 0 N/BC, N/EL, 20 0 N/BC, N/EL, 0 Blanco "b" 0 N/BC, S/EL, 40 35 N/BC, S/EL, 20 20 N/BC, S/EL, 0 0 N/BC, S/EL, 40 23 N/BC, S/EL, 20 33 N/BC, S/EL, 0 38 S/BC, N/EL, 40 49 S/BC, N/EL, 20 30 S/BC, N/EL, 0 0 S/BC, N/EL, 40 25 S/BC, N/EL, 20 33 S/BC, N/EL, 0 28 S/BC, S/EL, 40 37 S/BC, S/EL, 20 22 S/BC, S/EL, 0 0 S/BC, S/EL, 40 43 S/BC, S/EL, 20 56 S/BC, S/EL, 0 59

respecto a filas

respecto a columnas

respecto al blanco del tratamiento

N/BC, N/EL, 40 52 N/BC, N/EL, 20 24 N/BC, N/EL, 0 Blanco "b" 0 N/BC, N/EL, 40 91 N/BC, N/EL, 20 57 N/BC, N/EL, 0 Blanco "b" 26 N/BC, N/EL, 40 238 N/BC, N/EL, 20 177 N/BC, N/EL, 0 Blanco "b" 123

N/BC, S/EL, 40 86 N/BC, S/EL, 20 66 N/BC, S/EL, 0 38 N/BC, S/EL, 40 135 N/BC, S/EL, 20 109 N/BC, S/EL, 0 74 N/BC, S/EL, 40 315 N/BC, S/EL, 20 269 N/BC, S/EL, 0 208

S/BC, N/EL, 40 90 S/BC, N/EL, 20 66 S/BC, N/EL, 0 28 S/BC, N/EL, 40 139 S/BC, N/EL, 20 109 S/BC, N/EL, 0 61 S/BC, N/EL, 40 323 S/BC, N/EL, 20 269 S/BC, N/EL, 0 185

S/BC, S/EL, 40 117 S/BC, S/EL, 20 93 S/BC, S/EL, 0 59 S/BC, S/EL, 40 174 S/BC, S/EL, 20 143 S/BC, S/EL, 0 100 S/BC, S/EL, 40 385 S/BC, S/EL, 20 331 S/BC, S/EL, 0 254

respecto al blanco bioestimulacin

respecto al blanco suelo + agua

respecto al blanco del tratamiento respecto al blanco bioestimulacin respecto al blanco suelo + agua

62

104

Suelo Lavado

262

158

Determinaciones Analticas

Para evaluar las determinaciones que a continuacin se enlistan, se tom una muestra completamente al azar de los tratamientos; para ello se dividi la caja del tratamiento en 9 segmentos imaginarios y empleando una calculadora se seleccion la funcin de random la cual permite obtener al azar tres nmeros; de esta manera se tom la muestra desde la superficie hasta el fondo del tratamiento para posteriormente mezclarlos en lo posible de manera homognea las tres sub-muestras. De la muestra mencionada anteriormente se tomaron 50g para realizar los anlisis mencionados en la seccin de materiales y mtodos.

B1. Extraccin de HTPs (EPA 3550b)

Se elabora un cartucho de papel filtro Whatman de tal forma que pueda almacenar suelo en su interior y se pone a peso constante (colocarse guantes de ltex para evitar transferir humedad y grasa a los cartuchos). Se determina la humedad del suelo a analizar. Posteriormente se pesa aproximadamente un gramo de suelo colocndolo en el cartucho. Se coloca el cartucho con muestra en un frasco de vidrio de 4.5 10cm con tapa y se adicionan 40ml de diclorometano. Se snica la muestra empleando un equipo de ultrasonido Branson DHA-1000 durante 40min. Esta operacin se hace por triplicado. El sobrenadante se trasvasa a otro frasco de vidrio y se permite la evaporacin del diclorometano hasta sequedad para llevar a cabo la recuperacin de asfaltenos. El cartucho posteriormente se lleva a peso constante, para determinar la concentracin de HTPs (ppm) se aplica la siguiente frmula:

159

B2. Recuperacin de Asfaltenos

Empleando los HTPs obtenidos se la etapa anterior se adicionan 40ml de pentano y se coloca en el frasco un agitador magntico y se agita por 10min (se observa inmediatamente la precipitacin del asfalteno). Posteriormente la mezcla se centrifuga a una velocidad de 10,000 rpm, a una temperatura de 4 C, tambin por 10 minutos, se realiza una decantacin y con el precipitado que se vaya obteniendo, se repite la misma operacin cuatro ocasiones, (dilucin, agitacin y centrifugacin), el sobrenadante se va aclarando en cada operacin pero no llega a ser incoloro.

Tanto del precipitado como del sobrenadante se evapora el solvente y se cuantifica asfaltenos en el primero e hidrocarburos ligeros en el segundo.

B3. Fraccionamiento de Hidrocarburos Ligeros (sin asfaltenos)

Los hidrocarburos ligeros se separan en tres fracciones que son alifticos, aromticos poli cclicos y saturados por el mtodo de cromatografa en columna.

Se emplea una columna de vidrio de 20 cm de longitud con dimetro interior de 0.85 cm, empacada con slica gel (malla 60 200); primero se coloca en su parte interior un tapn de fibra de vidrio para evitar la slica sea arrastrada por el solvente, despus la columna se llena con hexano, purgando en repetidas ocasiones para sacar todas las burbujas de aire atrapadas y despus se adiciona slica gel activada previamente (24 horas a 100C), cuidando que no queden burbujas de aire atrapadas.

Primera fraccin (hidrocarburos Alifticos). Se pesan 0.1 g de hidrocarburos ligeros (libres de asfaltenos), se disuelven en hexano y se colocan en la parte superior de la columna. El eluyente para la primer fraccin es hexano con este solvente se obtienen los hidrocarburos alifticos, que producen una coloracin verde-amarillo tenue, esta y todas las fracciones a recuperar se deben recibir en un vaso de precipitados de 100 ml puestos anteriormente a peso constante, para cuantificar los hidrocarburos correspondientes. La obtencin de esta primera fraccin tarda aproximadamente 6:30 h,

160

siendo el criterio para concluir esta separacin la aparicin gradual de una mancha amarilla. Se recomienda montar en la parte superior de la columna de fraccionamiento un matraz de separacin con el solvente que se est alimentando a la columna, igualando los flujos de entrada y de salida de la columna que es aproximadamente de 20 gotas por minuto.

Segunda fraccin (hidrocarburos Aromticos). Se adicion un eluyente compuesto por benceno hexano (1:3). Con ste se fraccionarn los hidrocarburos aromticos que producen una coloracin amarillo brillante. La obtencin de esta fraccin demora unas 5:00 h misma que se da por terminada cuando el efluente sea incoloro.

Tercera fraccin (hidrocarburos Policclicos Aromticos). Se cambia la adicin del solvente a otro compuesto por acetona metanol (1:1), con el que se obtiene la tercera fraccin que componen los hidrocarburos saturados y que producen una coloracin caf, esta fraccin se obtiene en aproximadamente 3:00 horas y el criterio para concluir la recuperacin de sta es tambin cuando el efluente sea totalmente incoloro.

B4. Anlisis cromatogrfico

Se empleo un cromatgrafo de gases Perkin Elmer, Auto System con detector de ionizacin de flama (FID), las condiciones bajo las cuales se oper el equipo fueron; columna capilar SIL 8CV de 25m de longitud y de 0.320.4m, que utiliza helio, como gas acarreador a un flujo de 6 mL/min. La temperatura del inyector y detector se mantuvo a 240 y 280C respectivamente, la temperatura del horno se program a 60C por 4min; con rampas de temperatura de 60 a 140C a 10C/min; de 140C a 180C a 2C/min y de 180 a 280C a 15C/min.

161

B5. Capacidad de Retencin de Agua (CRA)

Pesar 10g de muestra a peso constante y determinar humedad inicial posteriormente colocar la muestra en un vaso de precipitados de 250mL y adicionar 100mL de agua, mezclar mediante agitacin magntica durante 20min. Colocar la muestra hmeda en un embudo con papel filtro ambos a peso constante y permitir que el agua absorbida a la muestra se libere de este de manera natural. En el momento en que ya no salga ms agua por el cuello del embudo, pesar la muestra ms el embudo y por diferencia de pesos determinar la CRA.

B6. Mtodo de extraccin de Substancias Hmicas del Suelo, mtodo de la IHSS (International Humic Substances Society) modificado

1. Equilibrar la muestra a un valor de pH entre 1-2 con 1 M HCl a temperatura ambiente. Ajustar el volumen de la solucin con 0.1 M HCl para proveer una concentracin final en un rango comprendido de 10 mL liquido/1 g muestra seca. Agitar la suspensin por una hora, con la finalidad de eliminar carbonatos adheridos a las substancias hmicas y que interfieran con la determinacin.

2. Separar el sobrenadante del residuo por decantacin despus de permitir que la solucin descanse (o mediante centrifugacin a baja velocidad 10000rpm 10min). Conservar el sobrenadante para el tratamiento con la resina XAD-7.

3. Neutralizar el residuo del suelo con 1 M NaOH a pH=7.0 entonces adicionar 0.1 NaOH bajo una atmsfera de N2 hasta obtener una relacin de 10:1.

4. Extraer la suspensin bajo N2 con agitacin intermitente por un mnimo de 4 horas. Permitir que la suspensin alcalina descanse toda la noche y recolectar el sobrenadante por decantacin o centrifugacin.

5. Acidificar el sobrenadante con 6 M HCl con agitacin constante hasta pH=1.0 y despus permitir que la suspensin descanse de 12 16 horas.

162

6. Centrifugar para separar las fracciones de cido hmico (precipitado) y el cido flvico (sobrenadante FA Extracto 2).

7. Redisolver la fraccin de cido hmico adicionando un volume mnimo de 0.1 M KOH bajo N2. Adicionar KCl slido hasta obtener 0.3 M (K ) y despus centrifugar a una velocidad alta para remover los slidos suspendidos.
+

8. Reprecipitar el cido hmico como en el paso 5. Centrifugar y descartar el sobrenadante.

9. Suspender el cido hmico precipitado en una solucin 1:1 de 0.1 M HCl/0.3 M HF. Agitar toda la noche a temperatura ambiente. Esto con la finalidad de eliminar silicates adheridos a las cido hmico.

10. Centrifugar y repetir el tratamiento de HCl/HF (Paso 9), si es necesario, hasta que el contenido de cenizas sea inferior a 1%.

11. Transferir el precipitado a un tubo de dialisis con agua destilada y dializar en un frasco con agua destilada, hasta que el agua del recipiente de una reaccin negativa de Cl - cuando se adiciona AgNO3 al 1%. Esto tiene la finalidad de eliminar el exceso de acido clorhdrico en la muestra.

12. Liofilizar el cido hmico o secar a 60C.

13. Pasar el sobrenadante del paso 2 a travs de una columna con resina XAD-7. Descartar el efluente, eluir la columna de XAD-7 que contiene sorbido al cido flvico con 0.65 volmenes de la columna de agua destilada. No conservar esta agua destilada.

14. Desorber la columna XAD-7 con un volumen de columna de 0.1 M NaOH, seguido de 2-3 volmenes de agua destilada.

163

15. Inmediatamente acidificar con 6 M HCl a pH=1. Adicionar HF concentrado a una concentracin final de 0.3 M HF. El volumen de la solucin debe de ser suficiente para mantener la solubilidad del cido flvico.

16. Pasar el sobrenadante del paso 6 a travs de de la columna con XAD-7.

17. Repetir los pasos 14 y 15

18. Combinar los eluyentes finales de los pasos 15 y 17, y pasarlos de Nuevo por la columna. Eluir con 0.65 volmenes de la columna de agua destilada.

19. Obtener el eluato final con un volumen de columna de 0.1 M NaOH seguido de 2 columnas de agua destilada.

20. Liofilizar la elucin para recuperar el cido flvico.

Crecimiento microbiano

B7. Cuenta total en placa

Para evaluar el crecimiento microbiano por cuenta en placa; se realizaron diluciones seriales del suelo, bagacillo de caa, vermicomposta y extracto de leonardita (de 110 -1 a 110-10) a partir de 1 gramo de muestra. Una muestra de 100L de cada dilucin fue distribuida en cajas Petri previamente preparadas con medio slido. Se emplearon medios de cultivo complejos para el crecimiento de todo tipo de bacterias, hongos, levaduras y actinomicetos en el menor tiempo, agar nutritivo (Bioxon) para bacterias, agar maltosa sabouraud (DB Difco) para hongos y levaduras; as como, agar czapeck (Bioxon) para actinomicetos. Las cajas Petri fueron incubadas a 32C durante 7 das, realizando la cuenta total despus de ste periodo.

164

Criterio para el conteo de colonias: 20-200 por caja El nmero de UFC/g de suelo (peso seco) se obtuvo de la siguiente manera: UFC/mL = (No. de colonias / 0.1 mL de inculo) x factor de dilucin UFC/g = (UFC/mL) x (9 mL) / peso de la muestra (g)

B8. Microorganismos hidrocarbonoclastas

Se realizaron diluciones seriales del suelo, bagacillo de caa, vermicomposta y extracto de leonardita (110
-1

a 110 ) a partir de 1 gramo de muestra. Una muestra de 100L de cada dilucin fue

-10

distribuida en cajas Petri previamente preparadas con medio slido. El criterio para la seleccin de cepas hidrocarbonoclastas, fue su capacidad de crecer en medio mineral adicionado de queroseno como fuente de carbono. El medio mineral (1 L) consisti de dos soluciones; solucin A (0.9L): K2HPO4 (0.8g), KH2PO4 (0.2g), KCl (0.1g), Na2FeEDTA (0.014g), Na2MoO42H2O (0.025g), NH4NO3 (1g) y Agar-Agar (15g) y la solucin B (0.1L): MgSO 47H2O (0.2g) y CaCl2 (0.06g) (Renie, 1981; modificado por R. Ferrera-Cerrato). Ambas soluciones, previamente preparadas y ajustadas a pH 7, fueron esterilizadas por separado a 121C por 18 min, antes de ser mezcladas bajo condiciones de esterilidad; por ltimo se adicion biotina y cido p-aminobenzoico (10 mg/L). Se impregna un papel filtro con 0.5mL de queroseno y se coloca en la tapa superior de la caja Petri. Las cajas Petri fueron incubadas a 32C durante 7 das, realizando la cuenta total despus de ste periodo.

B9. Carbono de Biomasa (Islam and Weil, 1998)

Colocar en dos frascos 10g de suelo del tratamiento, irradiar una de las muestras en microondas (700W de potencia) por 7 segundos (para proporcionar 800kJ/g de suelo), adicionar 25ml de una solucin de K2SO4 0.5M a cada frasco y agitar por 1 hora. Centrifugar la mezcla a 10000rpm por 10 minutos, transferir 5ml de sobrenadante a otro frasco, adicionar 5ml de cido Sulfrico y 1ml de K2Cr2O7 0.1M. Irradiar las muestras 13 segundos, dejar enfriar y adicionar 19ml de agua destilada desionizada (para completar 30ml de volumen final). Leer en espectrofotmetro a 590nm. Realizar una curva tipo de sacarosa con las siguientes concentraciones: 0, 10, 20, 40, 80, 200, 400ppm realizar los

165

mismo pasos mencionados anteriormente. Realizar blanco de reactivos y hacer la prueba por duplicado.

Clculos varios

B10. Elaboracin del alimento de lombriz

La preparacin del alimento (bagacillo de caa) se fundament en que las lombrices en promedio consumen su peso en un da, excretando el 60% de ste. El promedio en peso de las lombrices es de 0.375g, que se colocaron en el sistema, si se colocan 40 lombrices y en un periodo de 90 das consumirn: 0.375g/lombriz,da x 40 lombrices x 90 das = 1350g de alimento

166

167