O cncer colorretal o terceiro cncer mais comum em homens e mulheres nos Estados Unidos hoje.

. American Cancer Society projees para 2008 estimam que 150 mil casos de cncer colorretal ir ocorrer, levando a vida de aproximadamente um tero daqueles diagnosticados. Estratgias para melhor combater o cncer colo-retal seria de grande benefcio na reduo da taxa de mortalidade desta doena. Metodologia atual usando entrega de drogas especficas por meio de anticorpos (ADEPT) ou gene-dirigido pr-droga terapia (GDEPT) capaz de ativar a pr-frmacos especificamente em locations.1 precisos, 2 O benefcio de uma estratgia ADEPT ou GDEPT que as concentraes elevada do agente quimioteraputico desejado podem ser entregues diretamente para as clulas infectadas, evitando sua liberao em regies benigna. Esta estratgia representado na literatura por meio do uso de um blactamase (BL) para ativar b-lactmicos pr-frmacos com base, visando especificamente a infeco ou doena.3-5 Uma classe blactmicos particular, as cefalosporinas, tm-se revelado muito reprter til de sinalizao, e antibacteriano compostos que so capazes de permanecer dormente at que a ativao por um (Fig. 1) bL 0,6-9 Muitos compostos quimioterpicos utilizando o andaime cephem tm sido relatados, incluindo: mitomicina C, 4 mostardas de nitrognio, 3,10 - 13 doxarubacin, 14,15 compostos de platina, 16 taxol5 e um derivado da vimblastina alcalide da vinca. 17 Estes compostos foram testados in vivo e mostrar atividade promissora contra o cncer de vrias linhas quando usado em conjunto com uma estratgia de ADEPT. Embora muitos dos conjugados pr-frmaco acima mencionados foram avaliados in vivo, a FDA aprovou medicamentos comuns para o cncer colorretal, 5fluorouracil (5-FU), no foi avaliada de forma anloga. 5-fluorouracil um componente principal do usado atualmente cncer colorretal terapia regime FOLFOX, juntamente com oxaliplatina e folnico Capacidade acid.18 especificamente para oferecer 5-fluorouracil para as clulas cancerosas fornece proteo para as regies benigna ao alvejar as concentraes de medicamentos para as reas de preocupao. Seria um benefcio para criar um simples, a sntese direta de um pr-frmaco cefalosporina-5-fluorouracil, que podem ento ser avaliada in vivo. Descrevemos aqui uma sntese fcil de um pr-frmaco cefalosporina-5-fluorouracil, que mostra estabilidade em ambientes aquosos at que seja ativado por uma b-lactamase. A fim de criar um conjugado 5-FU-cefalosporina, foi de fundamental importncia para determinar a maneira pela qual 5-FU poderia ser anexado posio 30 da cefalosporina. Mais frequentemente do que no a droga de escolha est ligada ao carbono 30 pelo uso de um linker carbonato ou carbamato que se decompe em expulso do pr-

droga para produzir o composto desejado livre. Em alguns casos, o composto pode ser ligado diretamente posio 30 atravs de uma reao de deslocamento entre um grupo de 30 e deixando um nuclefilo adequado. Com os dois meios de ligao que so iguais, o fator decisivo foi a disponibilidade de um material comercial de partida que levou rota mais direta sintticos. 7-Amino-3chlormethyl-3-cephem-4-carboxlico p-methoxybenzyl ster (3) foi selecionado como um material de partida adequado (Otsuka, Osaka Japo). Cephem 3, desde um ncleo que poderia ser modificado para o prfrmaco desejado (Esquema 1). Este material de partida foi passveis de penhora direta de 5-FU via deslocamento do cloreto de 30 com 5FU. Tratamento de 3 com 2-tiofeno cloreto de acetil e 2,6 lutidinaproporcionaram o intermedirio em quatro yield.8 excelente, 19 com o composto 4 em mos era desejado em seguida, anexar 5-FU. Isto provou ser mais difcil do que se pensava inicialmente. Figura 1 e Esquema A principal dificuldade com o uso de 5-FU em reaes orgnicas sua insolubilidade relativa em todos os solventes orgnicos comuns. Alm de sua baixa solubilidade, foi motivo de preocupao que ambas as amida e imida posies poderiam atuar como nuclefilo, dando origem a regioismeros. Para superar essas duas restries, a proteo do nitrognio amida com t-butil carbamato (Boc) foi performed.20, 21 A proteo Boc aumentou 5 - solubilidade FU ao mesmo tempo, limitar a imida funcionar como o nuclefilo nico. Com os compostos 2 e 4 na mo, de acoplamento direto para a posio 30 foi tentada. Foi observado que quando se utiliza carbonato e bases amina terciria, bem como piridina, isomerizao parcial do ncleo cephem ocorreu produzindo uma mistura de ismeros D2 e D3. Formao do ismero D2 inativa do composto, tendo o nitrognio do b-lactmicos de conjugao com a posio 30, bloqueando assim a liberao do composto anexado na ativao bL. Uma soluo comum para este problema a oxidao do enxofre cephem para restaurar o ismero D3 ativa, seguido pela reduo de volta para o tioter. Oxidao do composto 5 contendo uma mistura de ismeros D2 e D3 foi presumido para restaurar conjugation.22 Observou-se, no entanto, que a oxidao do enxofre ponte no foi possvel, tal como outros sistemas relacionados, fornecendo nenhum trao do sulfxido como um produto . Pode-se racionalizar este observando que o cephem contm um anel muito enrugada em que a poro 5-FU poderia bloquear abordagem do oxidante, resultando em nenhuma reao. Neste ponto, qualquer apego da fraco 5-FU necessrios para fornecer um ismero nico devido incapacidade da seqncia de oxidao / reduo para

restaurar a conjugao necessria. Um relatrio anterior havia mostrado que silanoate trimetil potssio (KOSiMe3) poderia ser usado para executar a reao acilao produzindo 4 sem formao do ismero D2. 23 De fato, o uso de KOSiMe3 como a base estequiomtrica na formao do composto 5, desde que o ismero D3 em yield.24 bom Foi ento possvel para desproteo cidas de ambas as metades e Boc pmethoxybenzyl de 5 fornecendo o composto final em yield.25 alta O uso de KOSiMe3 na reao de deslocamento direto proporcionado uma rota fcil para o 6 desejado em 3 etapas linear. Esta rota para cephem derivados evita a seqncia de oxidao / reduo que tradicionalmente tem dominado em snteses de semelhante compostos. Estratgias e ADEPT GDEPT para combater a doena tm a distinta vantagem de que o pr-frmaco ativada especificamente em reas de infeco benigna enquanto as regies so deixados relativamente intocado. Para qualquer estratgia ou ADEPT GDPET para ser bem sucedido, o pr-frmaco deve primeiro ser estvel sob condies noativao, mas rapidamente ativadas nas condies desejadas. No caso de 6 isso equivaleria ao composto adormecidos at influenciado por uma bL. Alm da ativao especfica por bL, importante verificar se 6 um bom substrato para bL pela avaliao dos seus fundamentais parmetros cinticos. Composto 6 foi preparado em soluo estoque 10 mg / mL e posteriormente diludo para todos os experimentos in vitro. Para primeiro verificar se o composto pode ser especificamente ativados somente na presena de um bL, um ensaio de HPLC foi pr-formada. O pr-frmaco substrato 26 6 foi incubado em tampo fosfato (50 mM, pH 7,0) por 12 horas a 28 _C sob condies de ativao e noativao. Os resultados mostram que 6, na presena de bL, foi completamente clivadas a 5-FU e as cefalosporinas hidrolisado enquanto 6 era de outra maneira estvel na ausncia de bL (Fig. 2). Figura 2 Para avaliar melhor o quo eficiente um substrato para a 6 bL acima, os parmetros cinticos foram medidos usando um ensaio anteriormente described.13 Determinou-se que tinha um composto de seis molhabilidade molar (e) de 9640 lmol_1 cm_1, o que possibilitou monitoramento de b-lactmicos hidrlise a 267 nm. Composto 6 foi avaliado em relao ao disponvel comercialmente Enterobacter cloacae b-lactamase (EClbL) (Sigma, St. Louis, MO). Velocidades iniciais foram medidos em concentraes variando de 6 (LM 25-250) e ajuste para a equao de MichaelisMenton para estabelecer Km e Vmax.Composto 6 foi encontrado para

ter um quilmetro de 95,4 lm e uma Vmax de 3,21 lmol min_1 mg_1, que comparam favoravelmente ao relatado anteriormente cefalosporina conjugates.3, 4,13 Para determinar o rendimento de 5FU quando 6 ativado, uma reao de 6 com o EClbL foi executado em condies idnticas s do ensaio de estabilidade anterior. Os produtos desta reao foram comparados a uma curva padro de concentraes conhecidas de 5-FU para determinar o percentual de 5-FU lanado usando o HPLC previamente estabelecidos method.26 Foi determinado que compem 6 ativado para 5-FU em um 78 2% de rendimento. Os dados combinados mostram que compostos 6 um bom substrato para um bL, a ativao ocorre de uma maneira eficiente e compostos 6 estvel em um ambiente aquosa neutra, at que seja ativado pelo bL (Fig. 2). Ns projetamos uma sntese direta de uma BL-ativvel 5-FUcefalosporina conjugado para liberar o agente citotxico 5FU. Preparao deste composto foi facilmente alcanado atravs de uma ateno especial a dois passos-chave na sntese. A proteo do nitrognio amida 5-FU com um grupo Boc melhorada solubilidade em solventes orgnicos e evitar a formao de regioismeros. Segundo, o uso de KOSiMe3 na cephem 30 cloreto de reao de deslocamento transcorreu sem formao do ismero D2, contornando a oxidao habitual ea seqncia de reduo de enxofre no cephem para restaurar o vnculo D3 dupla. O uso de KOSiMe3 oferece uma abordagem geral para a fixao de metades qumica nucleoflica no carbono 30, mantendo o cephem D3 intacta. A estabilidade do composto 6 na ausncia de um bL e sua favorveis parmetros cinticos para a hidrlise na sua presena demonstrar o potencial de compostos de 6 a ser utilizada em estratgias ADEPT ou GDEPT contra uma srie de linhas de clulas humanas de carcinoma, e abrir o caminho para a sua avaliao, in vivo. Agradecimentos Agradecemos uma doao de sementes do Instituto para a nanobiotecnologia na Universidade Johns Hopkins de apoio financeiro. Otsuka Chemical Corporation (Osaka, Japo) agradeceu a doao de uma amostra de 7-amino-3-clorometil-3-cephem-4carboxlico p-metxi-benzil ester. Agradecemos a T. Soka para discusses teis na preparao para o vivo em aplicaes do conjugado.