ENFERMEDADES PRODUCIDAS POR MICROORGANISMOS EN LA ALIMENTACIN Y LAS TCNICAS BIOTECNOLGICAS UTILIZADAS PARA SU DETECCIN Flrez, K.L., Snchez, E.O.

, Quintero, A.L., Zona, A.

Programa de Especializacin en Ingeniera de Procesos y Biomateriales

Universidad Nacional Abierta y a Distancia ____________________________________________________________________ ABSTRAC Detection and enumeration of microorganisms on food contact surfaces of food are an important part of any quality control scheme. Because it is necessary to implement detection techniques to perform surveillance and control of these microorganisms and prevent the diseases they produce. The establishment of appropriate control measures requires reliable methods of differentiation between bacterial species in soil, water and gastrointestinal tract, which implies that must be fast and sensitive, but above all highly specific. (Rojas, R., Flrez, T. 2006) ___________________________________________________________________ RESUMEN La deteccin y la enumeracin de microorganismos en alimentos en superficies que tienen contacto con alimentos constituyen una parte importante de cualquier esquema de control de calidad. Debido a esto es necesario implementar tcnicas de deteccin para efectuar la vigilancia y el control de dichos microorganismos y prevenir las enfermedades que estos producen. El establecimiento de medidas de control apropiadas requiere de mtodos confiables de diferenciacin entre bacterias ubicuas presentes en el suelo, agua y el tracto gastrointestinal, lo cual implica que deben ser rpidos y sensibles pero sobre todo altamente especficos. (Rojas & Flrez, 2006) ____________________________________________________________________ Palabras clave: microorganismos, biotecnologa, PCR, patgeno, enfermedad, deteccin. INTRODUCCIN Las tcnicas biotecnolgicas para la deteccin de agentes nocivos (microorganismos patgenos y/o sus toxinas, alrgenos, residuos de tratamientos veterinarios, contaminantes abiticos de origen ambiental, etc.) en los alimentos pueden emplearse individualmente o en combinacin con tcnicas analticas tradicionales .Los sistemas biotecnolgicos de deteccin estn basados en tcnicas inmunoqumicas (ELISA, dispositivos de flujo lateral, ensayos de aglutinacin con partculas de ltex, etc.), genticas

(hibridacin de ADN, PCR y sus variantes, como PCR cuantitativa en tiempo real, etc.), u otras (por ejemplo, deteccin de la bioluminiscencia del ATP). En muchos casos, estas tcnicas se presentan bajo el formato de kits comerciales sencillos de utilizar, que producen resultados de forma rpida y que permiten la realizacin de ensayos de campo gracias a su portabilidad. As, cada vez se dispone de una mayor variedad de dispositivos de anlisis para la deteccin de agentes nocivos presentes en los alimentos. OBJETIVOS Identificar las enfermedades transmitidas por alimentos ms comunes. Describir los microorganismos que estn asociadas a estas enfermedades. Conocer las tcnicas biotecnolgicas que se emplean para la deteccin de microorganismos que generan enfermedades transmitidas por alimentos. MTODO DE LOCALIZACIN SELECCIN Y EVALUACIN DE ESTUDIOS PRIMARIOS Para la localizacin de los documentos bibliogrficos se utilizaron varias fuentes documentales. Se utiliz principalmente la base de datos en lnea, a travs de del buscador Google, las palabras claves empleadas fueron deteccin microorganismos patgenos, biotecnologa, PCR, enfermedad transmitida alimentos. Los artculos

fueron seleccionados cuenta:

teniendo

en

Fecha de publicacin no superior a 10 aos Aquellos que trataban el tema de deteccin de microorganismos patgenos a travs de tcnicas biotecnolgicas Los trabajos que incluan las enfermedades transmitidas especficamente por alimentos. Se tomaron en cuenta artculos en espaol y en otros idiomas como el ingls. Se excluyeron aquellos artculos o trabajos que manejan deteccin de microorganismos a travs de mtodos clnicos. Tambin se emplearon libros de texto Adams & Moss. y Revistas Chile, G. d. de los cuales se obtuvieron algunas de las enfermedades que son transmitidas por los aliemntos y sus caracteristicas.

DESARROLLO TEMA

Y DISCUSIN DEL

Segn Cardona, las enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) se clasifican por su origen en: Intoxicacin Alimentaria: causadas por la ingestin de alimentos contaminados por sustancias txicas que pueden ser de origen qumico no bacteriano, o toxinas producidas por microorganismos. Infeccin Alimentaria (gastroenteritis): causadas por ingestin de alimentos contaminados por grmenes patgenos

que invaden la mucosa intestinal u otros tejidos y se multiplican o elaboran enterotoxinas. Otras. Algunas enfermedades comunes son ocasionalmente transmitidas por los alimentos, aun cuando de ordinario se transmiten por otras vas. Domingo, E., Hernndez, G., Palou, A. (2005), presenta en su informe la siguiente Descripcin de agentes infecciosos:

Virus En la actualidad la incidencia de los brotes de origen vrico ha aumentado de forma considerable convirtindose en una de las primeras causas de enfermedad asociada al consumo de alimentos. Los virus causan muchas enfermedades humanas comunes, como resfriados, gripes, diarreas, varicela, sarampin y paperas. El agua y los productos que se ingieren crudos, como ciertos vegetales, o poco cocinados son los vehculos ms frecuentes de estos agentes infecciosos.

La tabla 1 muestra los principales virus transmitidos a travs de los alimentos y el agua
Tabla 1. Principales virus transmitidos a travs de los alimentos y el agua

Fuente: Domingo, E., Hernndez, G., Palou, A. (2005). Aplicaciones de la biotecnologa en la seguridad alimentaria

Hongos Las micosis varan considerablemente en sus manifestaciones, pero tienden a ser enfermedades subagudas o crnicas de curso indolente y recurrente. Los hongos rara vez causan infecciones agudas como las producidas por muchos virus y bacterias.

La mayora de las infecciones fngicas en el hombre no son contagiosas, aparecen tras un contacto con un reservorio ambiental o a partir de la flora de hongos del propio paciente. Atendiendo al lugar y grado de afectacin las micosis pueden ser divididas para su estudio en tres grandes grupos: micosis profundas, micosis subcutneas y micosis superficiales.

Bacterias Slo una pequea parte de los miles de especies de bacterias causan enfermedades humanas conocidas. Las infecciones bacterianas se evitan destruyendo las bacterias con calor, como se hace en las tcnicas de esterilizacin y pasteurizacin. Cuando se producen, las enfermedades bacterianas se tratan con antibiticos. Pero el abuso de estos compuestos en los ltimos aos ha favorecido el desarrollo de cepas de bacterias resistentes a su accin, como Mycobacterium tuberculosis, que causa la tuberculosis.

Entre las bacterias ms frecuentes que producen este tipo de enfermedades se encuentran Salmonella y Campylobacter, que suelen causar gastroenteritis benignas, que en el caso de nios y ancianos pueden cursar con sntomas ms graves. Existen otros agentes causales que tienen menor importancia numrica como Clostridium perfringens y Bacillus cereus y otros patgenos cuya incidencia no es muy elevada, pero que se perfilan como patgenos emergentes como Listeria monocytogenes y E. colivero toxignica, que pueden tener severas consecuencias sobre la salud de las personas que sufren estas enfermedades. En la tabla 2 se indican las principales bacterias relacionadas con infecciones alimentarias

Tabla 2. Principales bacterias productoras de infecciones alimentarias

ORGANISMO Aeromonas hydrophila Bacillus cereus Campylobacter jejuni Clostridium botulinum Clostridium perfringens Escherichia coli O157:H7 Escherichia coli enteroinvasiva Listeria monocytogenes Salmonella spp. Shigella spp. Staphylococcus aureus Vibrio cholerae Yersinia cholerae Brucella Melitensis Corynebacterium dphtheriae Plesiomonas shigelloides
1 2

ENFERMEDAD Gastroenteritis, septicemia Intoxicacin Campilobacteriosis Botulismo Intoxicacin Intoxicacin Disentera bacilar Listeriosis Salmonelosis Disentera bacilar Intoxicacin clera Intoxicacin Brucelosis Difteria Gastroenteritis, septicemia

ALIMENTO IMPLICADO Pescasos, mariscos, cordero, ternera, cerdo y aves 1 Carnes, leche, verduras, pescado, arroz, salsas, sopas .1 Pollo crudo, leche no pasteurizada, agua no clorada. 1 Alimentos en conserva, incluidos vegetales, carnes y sopas. 2 Comidas preparadas no refrigeradas como carne y productos crnicos y salsas.1 Carne poco cococinada, zumos de frutas no pasteurizados, salami, quesos curados. 2 Hamburguesas y leche no pasteurizada.2 Leche, quesos no curados, helados, verduras crudas, carnes crudas y pescados ahumados. 2 Carnes crudas, huevos, aves, leche, lcteos, pescado, gambas, salsas y alios, crema pastelera, mantequilla de cacahuate y chocolate.2 Ensaladas, verduras crudas, leche y lcteos, aves.2 Carne y derivados crnicos, aves, huevos, ensaladas, productos de panadera y pastelera, leche y lcteos.2 Agua contaminada, mariscos.1 Carnes, ostras, pescados y leche cruda.1 leche cruda y productos lacteos no pasterizados.2 Leche no pasteurizada.2 Pescados y mariscos.1

Adams, R., & Moss, M. (2003). Food microb iology. North Yorhshire: Athenaeum Press Ltd. Domingo, E., Hernndez, G. &, Palou, A. (2005). Aplicaciones de la b iotecnologa en la seguridad alimentaria

BACTERIAS PATGENAS IMPORTANTES EN LA SEGURIDAD ALIMENTARIA

De acuerdo a Oleaga, B: Campylobacter La enfermedad, producida por este microorganismo se denomina Campylobacteriosis. La mayora de las personas infectadas por esta bacteria presentan diarrea, calambres estomacales y fiebre. La diarrea es a veces sangrante y est acompaada por nuseas y vmitos. Tarda de 2 a 3 das en desarrollarse la enfermedad. No hay, normalmente un tratamiento para esta enfermedad, debido a que los pacientes se recuperan rpidamente. El pollo ha recibido mucha atencin debido a que es bien conocido que Campylobacter infecta las granjas de pollos sin causar a las aves ningn sntoma. La bacteria reside en los intestinos y cuando es sacrificado el animal, se puede contaminar la carne. Tambin puede ser encontrada en agua, en heces de animales e incluso en la leche, sin embargo es a menudo asociada con el consumo de pollo. Salmonella Este es un amplio gnero de bacterias, pero 2 son los ms importantes como agentes

contaminantes de alimentos, S. typhimurium y S. enteritidus, aunque hay otras especies muy importantes como patgenos humanos, no estn necesariamente asociados con los alimentos. Salmonelosis es el nombre que recibe la enfermedad producida por estas bacterias, cuyos sntomas de diarrea, fiebre y calambres estomacales (retorcijones), aparecen 12-72 horas despus de haber consumido el alimento contaminado. La Salmonella es una bacteria comn del intestino de muchos animales, incluido humanos, es muy fcil transferirla a la carne en el momento de despostarla y tambin por medio de los operarios y personas que manejan el alimento si no llevan una buena prctica de higiene personal. La Salmonella esta normalmente asociada a la carne, pero las verduras pueden tambin ser contaminadas siguiendo el uso de abonos animales o contaminacin del suelo (por medio de las heces del animal). E. coli Es una especie bacteriana con muchas cepas diferentes. La mayora de ellas son inofensivas, componente normal del complejo mixto de microorganismos que habita nuestro intestino. .

Los sntomas normales son diarrea sangrante y calambres estomacales. En raras ocasiones los glbulos rojos son destruidos por la infeccin, lo que ocasiona un fallo renal. Cualquier alimento que provenga de estar en contacto con heces de animales puede estar contaminada con E. Coli 0157:H7. La leche es un buen ejemplo. Esta es otra buena razn para tomar leche pasteurizada. Clostridium El gnero Clostridium son bacterias anaerobias con forma redondeada que son capaces de producir esporas. Estas esporas son increblemente resistentes y representan la fase durmiente que puede germinar muchos meses o quizs aos ms tarde para liberar una bacteria activa. La formacin de esporas significa la proteccin del organismo en condiciones adversas, con lo que el gnero Clostridium esporular si las condiciones del medio le son desfavorables. Estas bacterias producen un veneno de asombrosa toxicidad. Pueden causar problemas por 2 vas. Si se ingiere el alimento contaminado con la bacteria activa, stas pueden crecer en el intestino (las condiciones son ideales, 37C, humedad y falta de oxgeno) y produce la toxina. O tambin si se ingiere el alimento conteniendo la toxina porque una vez fue infectado con la bacteria activa, si la concentracin de la toxina es

bastante alta se producir la enfermedad. C. botulinum puede causar la enfermedad por ambas vas, pero C. perfringens casi siempre acta a travs de la ruta de infeccin del intestino. Clostridium botulinum La enfermedad causada por C. botulinum se denomina botulismo. Es muy grave y es considerada como de emergencia mdica. La toxina botulina es un increble potente veneno nervioso, su dosis letal en personas es aproximadamente de 1 milln de un gramo. Es 5.000 veces ms potente que el cianuro potsico. La infeccin con C. botulinum o la ingestin de la toxina botulina resulta en fallo respiratorio que requiere asistencia respiratoria al paciente mientras su cuerpo elimina la toxina. Si no se recibe ayuda mdica la muerte es inevitable. Clostridium perfringens El alimento contaminado por C. perfringens es desagradable pero no grave. Se caracteriza por calambres estomacales y diarrea que comienza de 8-22 horas despus de haber ingerido el alimento infectado. Un da en cama es suficiente para reponerse de la enfermedad. Como con C. botulinum, C.perfringens produce una toxina que causa la enfermedad. La toxina de C. perfringens es muchsimo menos potente que la toxina botulina. Hay una forma ms grave, pero rara, de intoxicacin alimentaria por

perfringens, que es causada por una cepa diferente de bacteria C. perfringens tipo C. Esta causa necrotismo de las clulas del intestino (clulas entriticas del intestino), lo cual implica a las bacterias inducir la muerte de las clulas del intestino. Esto es extremadamente grave y es normalmente fatal. Bsicamente cualquier alimento que haya sido preparado horas antes de ser servido es la zona peligrosa de perfringens. Los jugos crnicos podran contener esporas de C. perfringens que hayan sobrevivido a la coccin, las esporas, entonces, se asientan en la salsa en una cocina a temperatura adecuada, germinan y la bacteria comienza a crecer.

es particularmente peligrosa en mujeres embarazadas, ya que puede ocasionar abortos o malformaciones congnitas. Los sntomas de la infeccin son fiebre, Dolores musculares, y a veces nuseas y diarrea. Sin embargo, las bacterias pueden llegar a penetrar el Sistema nervioso Central, cuyo resultado es muy grave siendo caracterstico dolores de cabeza, agarrotamiento del cuello, confusin, prdida del equilibrio y en casos graves convulsiones. Como otras bacterias alimentarias L. monocytogenes es una bacteria que se encuentra en la tierra, probablemente llega all procedente de las heces de animales. Puede vivir en el intestino de los animales sin causarles ningn dao aparente. Puede llegar al alimento tanto por va de contaminacin de la tierra (ej. vegetales que son comidos crudos), o por va de contaminacin fecal de carne o de la leche durante el ordeo. La listeria es eliminada por pasteurizacin, pero se reproduce bien a bajas temperaturas, por esta razn es un gran problema para los fabricantes de alimentos y los minoristas.

Listeria En este gnero solamente hay una especie implicada en intoxicaciones alimentarias, Listeria monocytogenes. Es una bacteria de forma redonda con flagelos que la hacen motil. Prefiere vivir y crecer en ambientes no muy clidos (4C), lo cual es un problema a la hora de guardar el alimento contaminado en la nevera, pues sera una temperatura idnea para crecer. La enfermedad producida por esta bacteria se denomina Listeriosis. Esta es una grave enfermedad que puede resultar fatal en nios, personas cuyas defensas no estn muy altas;

Staphylococcus Este gnero de bacterias tienen forma redondeada que normalmente crece en parejas, cadenas cortas, o

racimos. Algunas producen toxina muy estable al calor.

una

Tambin llamada staphyloenterotoxicosis o staphyloenterotoxaemia es causada por la produccin de una toxina de una cepa de Staphylococcus aureus. Las bacterias en si no producen mucho dao, es la toxina la que causa la enfermedad, la forma no txica de cepas de S. aureus que no causan problemas patgenos. La enfermedad es normalmente causada por comer alimentos contaminados con la toxina debido al crecimiento de S. aureus en el alimento, por eso el tiempo entre comer el alimento contaminado y la aparicin de los sntomas es muy corto. La toxina de esta bacteria es increblemente potente. La ingestin suficiente de la toxina provoca nuseas, vmitos, arcadas, calambres estomacales. La muerte por esta intoxicacin es rara. Los alimentos procesados y que pueden ser mantenidos a temperatura ambiente por largo tiempo antes de ser consumidos son considerados de alto riesgo. Estos incluyen: Carne / productos crnicos Aves y productos con huevos Ensaladas de huevo, atn, pollo y papas Macarrones Productos lcteos

Sndwiches Pasteles de crema, de chocolate y bollera con crema.

Bacillus El gnero ms importante en toxicidad alimentaria es B. cereus. Es una bacteria formadora de esporas con forma redondeada que prefiere condiciones bajas de oxgeno. B. cereus puede producir 2 toxinas. Una es una gran protena que causa diarrea y la otra es una pequea protena que es estable al calor y causa vmito. A causa de las 2 toxinas, hay 2 enfermedades distintas causadas por B. cereus, las que provocan diarrea y las que provocan vmitos. La enfermedad diarreica est asociada con muchos tipos diferentes de alimentos, mientras que la que provoca vmito est casi exclusivamente asociada con el arroz y mariscos.

TCNICAS BIOTECNOLGICAS UTILIZADAS PARA LA DETECCIN DE MICROORGANISMOS Actualmente, se han desarrollado diversas tcnicas moleculares que permiten la deteccin de microorganismo, debido a que los por los mtodos clsicos es en muchas ocasiones una tarea ardua en tiempo y dinero. Mediante las tcnicas

moleculares se pueden detectar genes especficos de microorganismos en los alimentos y de ello incidir en la presencia del mismo. Segn Ramn, Morn, Costa, Lpez, & Arriola, (2005), la base conceptual de este tipo de tcnicas es reconocer el ADN especfico de un organismos tanto en muestras homogneas, como heterogneas, donde el ADN del organismo que queremos detectar est mezclado con otros ADNs de distintas especies u organismos. Como el ADN que se busca puede ser minoritario frente a otros ADNs presentes en la muestra, lo que se hace es amplificar el ADN del organismo de inters. Para realizar un anlisis molecular en un alimento, lo primero que se hace es obtener el ADN, eliminando cualquier sustancia presente en la muestra (colorantes, conservantes, protenas) que puedan actuar como inhibidores. Los mtodos de extraccin de ADN son diversos y dependen de la materia prima de la que se parta; pero todos van encaminados a conseguir los mismos objetivos: a) Romper membranas celulares con el fin de liberar al medio las molculas de ADN. b) Separa lpidos o grasas y las protenas celulares del ADN c) Limpiar la molcula de ADN mediante una serie de lavados con soluciones alcohlicas. Una vez sea extrado el ADN, se debe elegir la tcnica por medio de la cual se va a analizar, dependiendo de lo que se est buscando.

DESCRIPCIN DE LAS TCNICAS DE DETECCIN DE MICROORGANISMOS La mayora de las tcnicas moleculares se basan en la hibridacin de los cidos nucleicos o bien en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Segn Rodrguez, Aguilar, Labarrios, Garca, & Revilla (2009), estas tcnicas se desarrollaron a partir del conocimiento de que dos cadenas sencillas de cido nucleico que tengan secuencias complementarias se pueden unir o hibridar para formar una cadena doble. Las cadenas sencillas pueden ser de ADN o ARN, o bien una de ADN y otra de ARN. Los avances en la instrumentacin e implementacin de los descubrimientos de la bioqumica y la biologa molecular permiten utilizar la informacin gentica de los microorganismos como herramientas de identificacin y cuantificacin de inters para el hombre. Entre estos mtodos destacan la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). De acuerdo a Rojas & Flrez, (2006), la invencin de la reaccin en cadena de la polimerasa permite la amplificacin selectiva de secuencias especficas de ADN que se encuentran en cantidades muy pequeas. Como su nombre indica, se basa en la actividad de la enzima ADN polimerasa que es capaz de sintetizar una cadena de ADN complementaria a otra ya existente. El mtodo de PCR utiliza dos secuencias cortas de oligonucletidos llamadas iniciadores o cebadores que son complementarios a los extremos de la

regin de amplificar.

ADN

que

se

pretende

Uno de los factores que llevan al xito en la implementacin de la PCR para al identificacin de microorganismos

patgenos es la eleccin correcta de la secuencia blanco. Esta secuencia debe permitir la identificacin del microorganismo de inters independientemente de la presencia de otras fuentes de ADN.

Tabla No 3 Algunos protocolos basados en la PCR para la deteccin e identificacin de bacterias patgenas en los alimentos

Fuente: Rojas, R. & Flrez, T. (2006). Deteccin e identificacin de bacterias causantes de ETAs mediante la reaccin en cadena de la polimerasa. Tomado de: http://redalyc.uaemex.mx/pdf/576/57631205.pdf

Ventajas y Desventajas de la PCR De acuerdo a Rojas et al., las principales ventajas del uso de la PCR radica en tres aspectos fundamentales: su sensibilidad,

su especificidad y su capacidad de procesamiento de grandes cantidades de muestras.

Entre los factores que limitan la aplicacin de la PCR en la identificacin de microorganismos patgenos en muestras de alimentos destaca la presencia de sustancias que pueden ejercer un efecto inhibitorio sobre la reaccin Fragmentos de restriccin de longitud polimrfica (RFLPs) Dentro de las tcnicas de hibridacin ms utilizadas esta los fragmentos de restriccin de longitud polimrfica (RFLPs). Esta tcnica est basada en hibridacin de ADN. Consiste en extraer ADN de un cultivo puro de un microorganismo o bien de una muestra infectada y digerir el ADN con enzimas de restriccin (enzimas que cortan el ADN en sitios especficos), posteriormente estos fragmentos de ADN son separados en un gel de agarosa utilizando electroforesis. El ADN est cargado negativamente, por lo tanto, en un campo elctrico el ADN migrara del polo negativo hacia el polo positivo a travs de la matriz de un gel. La friccin entre el fragmento y la matriz ocasiona que fragmentos pequeos migren ms rpido que fragmentos grandes. Esta metodologa es muy especfica. Sin embargo, no es muy rpida ni muy sensible, adems de que se requiere utilizar radioactividad (si no es empleada adecuadamente y bajo condiciones especiales de laboratorio, se pueden tener riesgos de salud del analista, contaminaciones de instalaciones o del medio ambiente).

Una variante de RFLP`s se ha diseado para la deteccin de Listeria. RAPDs O polimorfismo del ADN amplificado al azar en este caso se realiza una reaccin de PCR con un solo iniciador el cual tiene un tamao de 8 a 12 bases con secuencia arbitraria. En la etapa de alineamiento del iniciador se emplean temperaturas bajas 37 a 40 oC para asegurar que el iniciador se una a diferentes regiones del genoma del microorganismo que se desee identificar. En este caso la identificacin se realiza solo de cultivos puros del microorganismo y con una sola reaccin del PCR se amplifican varios segmentos a la vez. Tiene la ventaja de que no se requiere conocimientos previos del microorganismo para poderlo identificar, esta tcnica como mtodo de identificacin a nivel comercial no es muy utilizada debido a los problemas de reproducibilidad, sin embargo es muy til cuando se requiere determinar diferencias entre 2 microorganismos altamente emparentados pudindose detectar estas diferencias aun a nivel de cepa. Esta tcnica se ha utilizado para el estudio de cepas de Salmonella entrica. Inmunomagnetic PCR Es similar a la anterior, en este caso el soporte es una esfera magntica, la cual es removida de la muestra con un magneto y posteriormente se realiza la PCR . En esta tcnica un anticuerpo primario se encuentra unido a perlas metlicas las cuales se colocan dentro de la muestra a analizar, se deja incubar

para la unin antgeno-anticuerpo, posteriormente se extraen estas perlas metlicas con un magneto, se lavan y se colocan en un tubo en el cual se realiza la PCR. Esta tcnica se ha utilizado para la deteccin de Listeria monocytogenes en alimentos. PCR-mltiple Uno de los problemas de las tcnicas de PCR discutidas anteriormente es que solo permiten la identificacin de un solo patgeno a la vez. Con la finalidad de solucionar este problema se ha diseado la tcnica conocida como PCRmltiple la cual permite la deteccin de diferentes molculas o microorganismo de inters en una sola reaccin. En esta tcnica se incorporan a la reaccin un par de iniciadores por cada uno de las molculas o microorganismos a detectar, lo cual permite un ahorro en tiempo y costo para la deteccin de diferentes microorganismos simultneamente. Esta tcnica presenta retos como el de disear todos los iniciadores que se deseen agregar a la reaccin con similar temperatura de alineamiento, no deben de presentar homologa entre ellos, adems de amplificar fragmentos de diferentes longitudes. La sensibilidad de una PCR mltiple es del orden de 102 clulas o de 2.9 pg de ADN de inters. Sin embargo esta sensibilidad puede ser afectada por el diseo ineficiente de los iniciadores. Esta tcnica se ha utilizado para la deteccin de diferentes especies de Listeria en una misma muestra, as como para detectar diferentes microorganismos a la vez como es el caso de Salmonella, Campylobacter, Shigella y E. coli .

Esta tcnica tambin es usada para identificar cuales genes de resistencia a antibiticos poseen una determinada cepa bacteriana. Identificacin de Microorganismos Altamente Emparentados De acuerdo a Rodrguez & Aguilar et al., en algunas ocasiones se encuentra en una situacin en la cual tiene que identificar una cepa especial de un microorganismo ya que esta presenta caractersticas sobresalientes de produccin de alguna enzima o bien de adaptacin a una determinada condicin, o bien cuando se requiere preservar la identidad de una cepas en particular, lo cual ayudara a determinar si se contamin, as mismo cuando se quieren establecer relaciones de parentesco gentico (filogentica) entre diferentes cepas de una especie, diferentes especies de un gnero, diferentes gneros de una misma familia o bien entre diferentes familias de microorganismos. Todos estos casos se presentan cuando se identifica una cepa con una caracterstica no reportada previamente, por lo tanto las tcnicas moleculares permiten tener un control sobre la produccin y diseminacin de esta cepa. Una de las tcnicas moleculares que ayudan para la identificacin de microorganismos altamente emparentados adems de las discutidas previamente es la PCR-RFLP; esta tcnica consiste en amplificar por PCR un segmento especfico de un microorganismo y posteriormente digerir el ADN amplificado con enzimas de restriccin, esto permite poder

determinar diferencias entre los patrones de bandas amplificadas y/o entre los patrones de los fragmentos resultantes de la digestin del ADN. Se han establecido metodologas para la identificacin rpida basada en PCRRFLP de cuatro especies altamente emparentadas de Carnobacterium las cuales son importantes en la industria alimentaria. La amplificacin de los segmentos ITS y su posterior digestin con la enzima Xho I permiti la identificacin de diferentes cepas altamente emparentadas de Aspergillus niger. FUTURO DE LA DETECCIN DE MICROORGANISMOS Actualmente existen tcnicas muy prometedoras que en los prximos aos jugarn sin duda un papel importante en la deteccin y cuantificacin de un microorganismo en una muestra dada, una de estas tcnicas es PCR en tiempo real, la cual permite la estandarizacin de los ensayos y la incorporacin de sistemas de control de calidad internos que suponen un importante avance en cuanto a la fiabilidad de los resultados obtenidos PCR en tiempo real Segn Daz, (s.f.), la reaccin en cadena de la polimerasa en directo (en tiempo real) (RT-PCR) es un mtodo que permite la cuantificacin de cidos nucleicos con gran exactitud y fiabilidad. Est basada en la monitorizacin de la PCR usando tcnicas de fluorescencia. Esto permite la visualizacin en directo del perfil completo de amplificacin de la diana dentro de un amplio rango de

magnitud. El anlisis de la curva de fusin del producto, posibilita adems la caracterizacin del fragmento amplificado por su temperatura de fusin (Tm). Esta tcnica ofrece una gran cantidad de aplicaciones al ser capaz de cuantificar de manera absoluta o relativa molculas molde de DNA o RNA. Para llevar a cabo estas aplicaciones se necesita un termociclador con capacidad para detectar y medir la fluorescencia. La exactitud y la precisin de los aparatos de RT-PCR se ven afectadas, en gran medida, por la razn seal: ruido, la cual depende del formato de deteccin (fluorforos) y de la calidad del sistema ptico. Otro parmetro a tener en cuenta es la homogeneidad de la temperatura dentro del instrumento, ya que la menor desviacin de la temperatura llevara a una cuantificacin errnea. De acuerdo Rodrguez & Aguilar, et al., con esta tcnica supone ahorro y tiempo manipulacin de muestras, ya que los resultados se visualizan en tiempo real sin necesidad de migrar las amplificaciones en geles de agarosa, puesto que el termociclador est conectado a un ordenador, que mide de modo continuo el aumento de los puntos amplificados en la PCR. La gran ventaja de esta tcnica respecto a la PCR tradicional, es que la cantidad de ADN presente en una muestra se puede medir en cualquier ciclo de amplificacin. CONCLUSIONES Los microorganismos en los alimentos pueden generar desde leves

intoxicaciones hasta la muerte de la persona que consuma un alimento contaminado con estos de ah radica la importancia que tiene la deteccin e identificacin de estos en cualquier tipo de alimento. Las ETAs se pueden prevenir por medio de herramientas muy conocidas como son el uso de las BPM, o la implementacin de planes HACCP en las industrias de alimentos con el fin de preservar la inocuidad de los alimentos y preservar la salud de los consumidores. Se debe tener muy en cuenta la calidad del agua con la cual se procesa todo tipo de alimentos ya que de la calidad de esta depende mucho la inocuidad de los alimentos

Extrado 23 Mayo de 2001 de http://www.envigado.gov.co/Secre tarias/SecretariadeSalud/Docume ntos%20direccion%20de%20Insp eccion/prevencion%20de%20las %20enfermedades%20transmitid as%20por%20alimentos.pdf Centro de Vigilancia Sanitaria Veterinaria (VISAVET). Biotecnologa 2001 limentacion/2007/04/25/64351 Chile, G. d. (2000). Normas tecnicas de vigilancia de enfermedades transmisibles. Chile: Ministerio de Salud. Daz, S. (s.f). Mayo Como ver la PCR en de 2001 de directo: la RT-PCR. Extrado 23 http://www.encuentros.uma.es/en cuentros101/pcr.htm Domingo, E., Hernndez, G., & Palou, A. (2005). Aplicaciones en la de la biotecnologa 2001 seguridad de (2007). en la La Industria de

Alimentaria. Extrado 23 Mayo de http://www.madrimasd.org/blogs/a

Existen diferentes tcnicas para la deteccin e identificacin de microorganismos, entre las ms usadas para la identificacin esta la tcnica de PCR pero se debe tener precaucin a la hora de realizar un procedimiento de estos y se deben tener en cuenta las limitaciones de los mtodos.

REFERENCIAS Adams, R. & Moss, M. (2003). Food microbiology. Cardona, H. (s.f). enfermedades Alimentos procesadoras North Yorhshire: Athenaeum Press Ltd. Prevencin de las transmitidas por en de plantas alimentos.

alimentaria. Extrado 17 Mayo de http://www.aesan.msc.es/AESAN/ docs/docs/publicaciones_estudios /seguridad/SEGURIDAD_ALIMEN TARIA.pdf El portal de la Ciencia y la Tecnologa en Espaol. Enfermedades

producidas por microorganismos. Extrado 13 Mayo de 2001 de http://www.solociencia.com/biologi a/microbiologia-microorganismosenfermedades.htm INS Subdireccin de vigilancia y control. vigilancia (2007). de Protocolo de Enfermedades

os7/Trabajos_Publicos/Trab_8/Mu noz_Rosario_8/PrimeraParte.htm. Ramn, D., Morn, M., Costa, J., Lpez, F. & Arriola, en A. el (2005). sector Biotecnologa 2001 _83_d.pdf Rodrguez, R. Aguilar, N., Labarrios, A., Garca, V. & Revilla J.C. (2009). Deteccin de Microorganismos mediante Mtodos Moleculares. Extrado 23 Mayo de 2001 de: http://www.postgradoeinvestigacio n.uadec.mx/AQM/AQMmicroorga nismos.html Rojas, R. & Flrez, T. (2006). Deteccin e identificacin de de bacterias alimentos Extrado 23 2001 de: causantes transmitidas enfermedades por de:

Alimentario. Extrado 17 Mayo de http://www.genes.org/12_publicaciones/docs/pub

Transmitidas por Alimentos ETAExtrado 13 Mayo de 2001 de http://www.saludcordoba.gov.co/a rchivos_de__descarga/protocolo/ noinmunoprevenibles/eta.pdf Jimnez, M.T. & Martn, C. (2004). Vigilancia epidemiolgica de los brotes de enfermedades transmitidas por agua y alimentos en castilla y len (I). Extrado 13 Mayo de 2001 de www.saludcastillayleon.es/sanida d/cm/profesionales/images?locale Oleaga, B. Enfermedades producidas por los de microorganismos 2001 de en la de: alimentacin. Extrado 20 Mayo http://www.uned.es/expertobiotecnologiaalimentos/TrabajosSelecc/BegonaOle aga.pdf Problema de salud sometida a vigilancia en la comunidad (s.f). Extrado 13 Mayo de 2001 de: http://sameens.dia.uned.es/Trabaj

mediante la reaccin en cadena de la polimerasa. Mayo de

http://redalyc.uaemex.mx/pdf/576/ 57631205.pdf Romero, G. (2008). Biotecnologa: riesgos y de: generalidades, 2001 http://www.uned.es/expertobiotecnologiaalimentos/TrabajosSelecc/GloriaR omero.pdf

beneficios. Extrado 13 Mayo de