PRACTICA N4 CARACTERIZACIN Y CUANTIFICACIN DE PROTENAS

I.- OBJETIVOS: Caracterizar la presencia de protenas en material biolgico Demostrar las reacciones de coloracin para las protenas Verificar experimentalmente la precipitacin de protenas con y sin desnaturalizacin Relacionar las observaciones prcticas con la teora de propiedades generales estructura y aislamiento de protenas.

II.- FUNDAMENTO TERICO: Las protenas son polmeros lineales de -aminocidos con amplia variabilidad estructural y funciones biolgicas muy diversas. La variedad de protenas es elevadsima, y para su clasificacin se puede recurrir a criterios fsicos, qumicos, estructurales o funcionales. El criterio fsico ms utilizado es la solubilidad. As se distinguen (1) las albminas (protenas que son solubles en agua o en disoluciones salinas diludas), (2) las globulinas (que requieren concentraciones salinas ms elevadas para permanecer en disolucin), (3) las prolaminas (solubles en alcohol), (4) las glutelinas (slo se disuelven en disoluciones cidas o bsicas), (5) las escleroprotenas (son insolubles en la gran mayora de los disolventes).

Desde un punto de vista qumico, existen dos grandes grupos de protenas: (1) las protenas simples, formadas exclusivamente por -aminocidos, (2) las protenas conjugadas, que contienen adems una proporcin significativa de otros componentes. La fraccin no aminoacdica se llama grupo prosttico, y puede ser un azcar, un lpido, un cido nucleico o una sustancia inorgnica. La protena en ausencia de su grupo prosttico se llama apoprotena, y en presencia de l se llama holoprotena. As, holoprotena = apoprotena + grupo prosttico. Son protenas conjugadas la hemoglobina, la mioglobina, los citocromos, etc. En cuanto a su forma molecular, las protenas son globulares cuando la cadena polipeptdica aparece enrollada sobre s misma dando lugar a una estructura ms o menos esfrica y compacta. Cuando hay una dimensin que predomina sobre las dems, se dice que la protena es fibrosa. Las protenas fibrosas, por lo general, tienen funciones estructurales. Algunas protenas constan de una sola cadena polipeptdica, y se llaman protenas monomricas, mientras que otras constan de varias cadenas polipeptdicas, y se llaman protenas oligomricas. Las distintas cadenas polipeptdicas que componen una protena oligomrica se llaman subunidades, y pueden ser iguales o distintas entre s. Dada la gran variedad de estructuras a que puede dar lugar una secuencia aperidica de 20 -aminocido distintos es difcil hacer una clasificacin ms descriptiva o conceptual. Sin embargo, los criterios que hemos descrito son muy tiles desde el punto de vista prctico, y nos permiten definir al colgeno como una protena simple, fibrosa y oligomrica, y al citocromo c como una protena conjugada, globular y monomrica. 1. PROPIEDADES DE LAS PROTEINAS: Desde el punto de vista bioqumico, las propiedades de las protenas son: (1) la posibilidad de precipitacin selectiva (reversible o irreversible) por medio de

diversos procedimientos, (2) la capacidad amortiguadora y (3) las propiedades osmticas. 1.1 - PRECIPITACION SELECTIVA: El agua es el disolvente biolgico por excelencia. En disolucin acuosa, los residuos hidrofbicos de las protenas se acumulan en el interior de la estructura, mientras que en la superficie aparecen diversos grupos con carga elctrica, en funcin del pH del medio. En torno a los grupos cargados, los dipolos del agua se orientan conforme a la carga elctrica de cada grupo, de tal manera que la protena presenta una capa de solvatacin formada por el agua de hidratacin, que es el agua retenida por las cargas elctricas de la superficie de las protenas. Los AA polares sin carga tambin se disponen en la superficie, donde interaccionan con el agua mediante puentes de hidrgeno. Cualquier factor que modifique la interaccin de la protena con el disolvente disminuir su estabilidad en disolucin y provocar la precipitacin. As, la desaparicin total o parcial de la envoltura acuosa, la neutralizacin de las cargas elctricas de tipo repulsivo o la ruptura de los puentes de hidrgeno facilitarn la agregacin intermolecular y provocar la precipitacin. La precipitacin suele ser consecuencia del fenmeno llamado desnaturalizacin. Se llama desnaturalizacin de las protenas a la prdida de las estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptdica reducida a un polmero estadstico sin ninguna estructura tridimensional fija. Cuando la protena no ha sufrido ningn cambio en su interaccin con el disolvente, se dice que presenta una estructura nativa. Cualquier alteracin de la estructura nativa que modifique su interaccin con el disolvente y que provoque su precipitacin dar lugar a una estructura desnaturalizada. En una protena cualquiera, la estructura nativa y la desnaturalizada tan slo tienen en comn la estructura primaria, es decir, la secuencia de AA que la componen. Los dems niveles de organizacin estructural desaparecen en la estructura desnaturalizada. La desnaturalizacin provoca diversos efectos en la protena: (1) una drstica disminucin de su solubilidad, ya que los residuos hidrofbicos del interior aparecen en la superficie; (2) cambios en las propiedades hidrodinmicas de la protena: aumenta la viscosidad y disminuye el coeficiente de difusin y (3) prdida de las propiedades biolgicas. Una protena desnaturalizada cuenta nicamente con su estructura primaria. Por este motivo, en muchos casos, la desnaturalizacin es reversible, ya que es la estructura primaria la que contiene la informacin necesaria y suficiente para adoptar niveles superiores de estructuracin. Esta propiedad es de gran utilidad durante los procesos de aislamiento y purificacin de protenas, ya que no todas la protenas reaccionan de igual forma ante un cambio en el medio donde se encuentra disuelta.

Estado nativo

Estado desnaturalizado

En algunos casos, la desnaturalizacin conduce a la prdida total de la solubilidad, con lo que la protena precipita. La formacin de agregados fuertemente hidrofbicos impide su renaturalizacin, y hacen que el proceso sea irreversible. Los agentes que provocan la desnaturalizacin de una protena se llaman agentes desnaturalizantes. Se distinguen agentes fsicos (calor) y qumicos (detergentes, disolventes orgnicos, pH, fuerza inica). Como en algunos casos el fenmeno de la desnaturalizacin es reversible, es posible precipitar protenas de manera selectiva mediante cambios en (1) la polaridad del disolvente, (2) la fuerza inica, (3) el pH o (4) la temperatura.

La polaridad del disolvente disminuye cuando se le aaden sustancias menos polares que el agua como el etanol o la acetona. Con ello disminuye el grado de hidratacin de los grupos inicos superficiales de la molcula proteica, provocando la agregacin y precipitacin. Los disolventes orgnicos interaccionan con el interior hidrofbico de las protenas y desorganizan la estructura terciaria, provocando su desnaturalizacin y precipitacin. La accin de los detergentes es similar a la de los disolventes orgnicos. Un aumento de la fuerza inica del medio (por adicin de sulfato amnico, urea o hidrocloruro de guanidinio, por ejemplo) tambin provoca una disminucin en el grado de hidratacin de los grupos inicos superficiales de la protena, ya que estos solutos (1) compiten por el agua y (2) rompen los puentes de hidrgeno o las interacciones electrostticas, de forma que las molculas proteicas se agregan y precipitan. En muchos casos, la precipitacin provocada por el aumento de la fuerza inica es reversible. Mediante una simple dilisis se puede eliminar el exceso de soluto y recuperar tanto la estructura como la funcin original. A veces es una disminucin en la fuerza inica la que provoca la precipitacin. As, las protenas que se disuelven en medios salinos pueden desnaturalizarse al dializarlas frente a agua destilada, y se renaturalizan cuando se restaura la fuerza inica original. Los iones H+ y OH- del agua provocan efectos parecidos, pero adems de afectar a la envoltura acuosa de las protenas tambin afectan a la carga elctrica de los grupos cidos y bsicos de las cadenas laterales de los aminocidos. Esta alteracin de la carga superficial de las protenas elimina las interacciones electrostticas que estabilizan la estructura terciaria y a menudo provoca su precipitacin. La solubilidad de una protena es mnima en su punto isoelctrico, ya que su carga neta es cero y desaparece cualquier fuerza de repulsin electrosttica que pudiera dificultar la formacin de agregados. Cuando la temperatura es elevada aumenta la energa cintica de las molculas con lo que se desorganiza la envoltura acuosa de las protenas, y se desnaturalizan. Asmismo, un aumento de la temperatura destruye las interacciones dbiles y desorganiza la estructura de la protena, de forma que el interior hidrofbico interacciona con el medio acuoso y se produce la agregacin y precipitacin de la protena desnaturalizada.

III.- PARTE EXPERIMENTAL: 1. EXPERIMENTO N1 REACCIONES DE COLORACIN. En esta experiencia podremos determinar protenas mediante 2 reacciones: 1.1 REACCIN DE NINHIDRINA: 1.1.1 FUNDAMENTO TERICO:

Todas aquellas sustancias que presentan al menos un grupo amino y uno carboxilo libre, reaccionaran con la ninhidrina. La positividad se manifiesta por la aparicin de un color violceo o amarillo. Debido a que las protenas y los aminocidos, poseen esta caracterstica, la reaccin sirve para identificarlos. Algunas soluciones de amonio y aminas, dan la coloracin caracterstica, aparentemente debido a una oxidacin y reduccin intramolecular de la ninhidrina en presencia de amonaco. La Ninhidrina (Hidrato de Tricetohidrindeno) es el reactivo ms empleado en la deteccin y cuantificacin de aminocidos. Durante la reaccin, se consumen dos equivalentes de Ninhidrina por cada aminocido. En el primer paso de la reaccin el aminocido se oxida, descarboxilndose y liberando amoniaco, mientras que uno de los equivalentes de Ninhidrina se reduce a Hidrindantina . En el segundo paso la Hidrindantina formada y otro equivalente de Ninhidrina, reaccionan con el amoniaco formando un complejo de color prpura (Prpura de Ruhemann).

1.1.2

METODO DE TRABAJO

Tubo N 1: 2 ml de ninhidrina + 5 gotas de protena al 10% llevar al 10% y llevar a bao mara por 5 minutos a 100 C. En esta experiencia podremos identificar las protenas mediante una reaccin con la NINHIDRINA la aparicin de un color violceo formando un complejo de color prpura (Prpura de Ruhemann).

1.2 REACCION DE BIURET: 1.2.1 FUNDAMENTO TERICO:

++

Consiste en tratar una protena o pptido con Cu en medio alcalino, producindose una coloracin ++ violcea por formacin de un complejo de coordinacin entre el Cu y los pares electrnicos libres de los nitrgenos de los grupos imino de la unin peptdica. Son necesarias por lo menos dos uniones peptdicas para que tenga lugar la reaccin. La reaccin del biuret no es una reaccin especfica para protenas. Eso hace que un resultado positivo con este reactivo deba ser cuidadosamente evaluado para descartar los resultados falsos positivos. Un resultado negativo de la reaccin del biuret sobre una muestra problema no necesariamente indica la ausencia de protenas, ya que puede ocurrir a) que no existan protenas o pptidos en la muestra (ni tampoco otras sustancias no proteicas biuret positivas) b) que existan una o ms sustancias interferentes en la muestra que impidan que se produzca la reaccin (lo que dara lugar a un resultado falso negativo). Esto puede descartarse (o evitarse) si conozco de antemano la composicin aproximada de la muestra. Por ejemplo, si deseo determinar el contenido de pptidos generados por una reaccin de + hidrlisis cida, los H del medio interferirn con la reaccin del biuret, ya que sta necesita de un ++ medio alcalino para la formacin del complejo con Cu . En este caso la interferencia puede eliminarse alcalinizando el medio antes de realizar el ensayo (en caso contrario obtendra un falso negativo como resultado) c) Que existan pptidos, pero a una concentracin inferior al lmite de sensibilidad del mtodo. Todo mtodo permite determinar la presencia de un compuesto slo si la concentracin del mismo es superior a cierto valor. El nombre de la reaccin procede del compuesto coloreado formado por la condensacin de dos molculas de urea con eliminacin de amonaco.

Si una solucin fuertemente alcalina de sulfato cprico (CuSO 4) se aade a una solucin de protena se forma una complejo entre el ion cprico y los enlaces peptdicos, con aparicin de una coloracin violeta-prpura, que presenta un mximo de absorcin a 540 nm. Las caractersticas ms importantes de la reaccin son: La reaccin del Biuret se aplica, a partir de los tetrapptidos, a todos los pptidos y protenas. Su rango de determinacin es de 1 a 6 mg/ml. No depende de la composicin de aminocidos. Algunos compuestos (NH4+, Tris, etc.) dan la reaccin.

ALBUMINA

CASEINA

1.2.2

METODO DE TRABAJO:

Tubo N 2: 1 ml de protena al 10% + 5 gotas de NaOH 2,5M y 3 gotas de sulfato de cobre al 1% Tubo N 3: 1 ml de agua destilada + 5 gotas de NaOH 2,5M y 3 gotas de sulfato de cobre al 1%

1.3 EXPERIMENTO N2: REACCIONES DE PRECIPITACIN En esta experiencia podremos determinar protenas mediante 5 reacciones: En esta experiencia podemos determinar protenas mediante precipitacin ya que las protenas son coloides lioflicos; se hallan estabilizadas por ambas cargas y por interacciones protena-solvente. Cuando una de estas influencias estabilizadoras es removida, las protenas precipitan algunas veces; y cuando ambos son influenciados son eliminadas, las protenas siempre precipitan. A. ACCION DEL CALOR: 1.3.1 FUNDAMENTO TERICO:

Por efecto del calor la protena se desnaturaliza por la cual formara un coagulo que puede decirse que la protena esta sufriendo una variacin en su estructura. Cuando la temperatura es elevada aumenta la energa cintica de las molculas con lo que se desorganiza la envoltura acuosa de las protenas, y se desnaturalizan. Asmismo, un aumento de la temperatura destruye las interacciones dbiles y desorganiza la estructura de la protena, de forma que el interior hidrofbico interacciona con el medio acuoso y se produce la agregacin y precipitacin de la protena desnaturalizada. El calentamiento de las protenas en soluciones neutras produce alteraciones en sus propiedades, tales como disminucin

de la solubilidad, prdida de la actividad especfica, prdida de sus caractersticas de cristalizacin. Conjunto de alteraciones que se las conoce como desnaturalizacin. 1.3.2 TUBO 100C METODO DE TRABAJO:

N 4: 2 ml de protena al 10% colocar en bao mara a por 3 min.

1.4 REACCION CON REACTIVOS PARA ALCALOIDES: 1.4.1 FUNDAMENTO TERICO:

Puede afectar tanto a los puentes salinos como a los de hidrgeno. Estos reactivos precipitan las protenas. En

este caso la protena formara un precipitado por reaccin con TCA (acido tricloroacetato). La precipitacin probablemente se debe a la neutralizacin de la carga positiva de la protena por el anin libre. Este tipo de precipitacin es causada muchas veces debido al PH extremo al que es llevado la protena. Las protenas pueden precipitarse de la solucin acuosa por la adicin de ciertos cidos tales como tricloroactico (TCA), perclrico, clorhdrico, los cuales forman con las protenas sales insolubles. 1.4.2 METODO DE TRABAJO:

TUBO N 5: 1 ml de protena al 10% + 1 ml de TCA al 10%.

PP. de casena

PP. de albumina

1.5 REACCION CON SALES DE METALES PESADOS: 1.5.1 FUNDAMENTO TERICO: (Hg2+, Cu2+, Pb2+)

Las protenas son precipitadas de sus soluciones por sales de metales pesados, por combinacin del in metlico con la forma aninica de la protena. Las sales comnmente usadas son HgCl 2 ZnCl2. Si la protena est sobre su pI (cargada -) se producen precipitaciones que tambin son reversibles y pueden servir para su aislamiento y purificacin. Pueden romper puentes salinos (formando ellas mismas otros distintos). Estos iones precipitan casi siempre a las protenas (coagulacin). Los cationes de metales pesados como el plomo Pb precipitan a la protena en medio alcalina. El catin libre disminuye la carga negativa de la protena, causando as la precipitacin. Estos iones algunas veces desnaturalizan la protena porque reaccionan con los grupos S-H para formar sulfuros.

1.5.2

METODO DE TRABAJO:

TUBO N 6: 1 ml de protena al 10% + 1 ml de acetato de plomo al 5%.

1.6 REACCION CON SOLVENTES ORGANICOS: 1.6.1 FUNDAMENTO TERICO:

Pueden interferir con los puentes de Hidrgeno de las protenas, ya que las molculas de alcohol pueden formarlos. Desnaturaliza rpidamente a las protenas de las bacterias, y la mata (la accin desinfectante del alcohol etlico, solucin al 70%). La polaridad del disolvente disminuye cuando se le aaden sustancias menos polares que el agua como el etanol o la acetona. Con ello disminuye el grado de hidratacin de los grupos inicos superficiales de la molcula proteica, provocando la agregacin y precipitacin. Los disolventes orgnicos interaccionan con el interior hidrofbico de las protenas y desorganizan la estructura terciaria, provocando su desnaturalizacin y precipitacin. La accin de los detergentes es similar a la de los disolventes orgnicos. La adicin de solventes orgnicos como alcohol etlico precipitan las protenas, y otras veces la precipitacin ocurre mas fcilmente en el punto isoelctrico de la protena. Los solventes orgnicos tambin eliminan agua, as dism9inuye la interaccin protena-agua.

1.6.2

METODO DE TRABAJO:

TUBO N 7: 1 ml de protena al 10% + 3 ml de alcohol etlico

1.7 EFECTO DE LA ADICION DE SALES: 1.7.1 FUNDAMENTO TERICO:

Grandes cantidades de una sal muy soluble agregada a una solucin de protenas, disminuye la interaccin protena- H2O porque le quita la capa de solvatacin, predominar la interaccin protenaprotena y se producir la precipitacin. La concentracin salina a la que se produce la precipitacin no es igual para cualquier protena, lo que permite usar sta propiedad para la separacin y purificacin de protenas particulares a partir de mezclas complejas. Comnmente se usa sulfato de amonio (NH4)2SO4 para tal fin, a causa de su gran solubilidad. La adicin gradual de sta sal permite el fraccionamiento de una mezcla de protenas, las cuales son precipitadas pero no desnaturalizadas, entonces un exceso de agua, por encima del punto de precipitacin, permite solubilizar nuevamente las protenas. La adicin neutra causa la precipitacin de las protenas. Las diferentes protenas son precipitadas a diferentes concentraciones de sal. Esto ocurre ms fcilmente en el punto isoelctrico de la protena. El efecto de sal es eliminar el agua de solvatacin, la cual disminuye la interaccin protena-agua y aumenta la interaccin protena-protena, causando as la precipitacin. 1.7.2 METODO DE TRABAJO:

TUBO N 8: 3ml de clara pura + agua destilada hasta la formacin de un precipitado blanquecino disolver con ayuda de una varilla adicionar NaCl 1M gota a gota hasta redisolver el precipitado. TUBO N 9: 2 ml de la solucin anterior + 4 ml de la solucin saturada de sulfato de amonio observamos y posteriormente aadimos 4 a 6 ml de agua destilada y observamos el efecto.

IV. RESULTADOS: 1) EXPERIMENTO N1 REACCIONES DE COLORACIN. i. TUBO ALBUMINA CASENA NINHIDRINA 5 gotas REACCIN DE NINHIDRINA: 1 1ml 2 BAO MARA 100C 5 minutos 5 minutos RESULTADOS Reaccin positiva violceo. Reaccin positiva violceo.

coloracin coloracin

azul azul

1ml 5 gotas

Figura 1: Estructura de las protenas (R1, R2, etc., son los radicales especlicos de cada amino mido. El nmero de aminomidos en la casena de la leche vara de 199 a 209).

ESTRUCTURA DE LA ALBUMINA presenta una estructura terciaria.

CONCLUSION: Todas aquellas sustancias que presentan al menos un grupo amino y uno
carboxilo libre, reaccionaran con la ninhidrina. La reaccin positiva se manifestara por la aparicin de un color azul violceo o amarillo esto puede ser debido a que las protenas, poseen esta caracterstica, la reaccin sirve para identificarlos. En el primer paso de la reaccin el aminocido o protena se oxida, descarboxilndose y liberando amoniaco, mientras que uno de los equivalentes de Ninhidrina se reduce a Hidrindantina. En el segundo paso la Hidrindantina formada y otro equivalente de Ninhidrina, reaccionan con el amoniaco formando un complejo de color prpura (Prpura de Ruhemann).

ii.

REACCION CON BIURET:

TUBO ALBUMINA CASENA AGUA DESTILADA

NaOH 2.5M 1ml 5 gotas 1ml 5 gotas 1ml 5 gotas

CUSO4 1% 3 gotas 3 gotas 3 gotas

RESULTADOS Reaccin positiva color morado Reaccin positiva color morado Reaccin negativa color celeste

 CON ALBUMINA;

CON CASEINA:

CONCLUSION: est dada solo por aquellas sustancias cuyas molculas contienen dos grupos
carbamino (-CO.NH) unidos directamente o a travs de un solo tomo de carbono o nitrgeno dando un resultado positivo (la coloracin violeta).As mismo los enlaces peptidicos estn formando un tetracordinado. Todas las molculas que contengas 2 o ms uniones peptdicas, por lo tanto todas las protenas y todos los pptidos no menores de 3 unidades, dan positiva a la reaccin de Biuret. Cuando una protena o un polipptido se hacen reaccionar con sulfato de cobre en solucin alcalina se produce un color caracterstico prpura o violeta; el color se debe a un complejo que resulta al unirse el cobre con los tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos. Esta reaccin nos sirve para diferenciar las protenas y pptidos de los aminocidos y su utilidad principal es la de seguir el proceso de hidrlisis proteica, la reaccin ser negativa cuando la hidrlisis sea completa.

2) EXPERIMENTO N2: REACCIONES DE PRECIPITACIN a. ACCION DEL CALOR:

TUBO PROTEINAS(ovoalbmina) 1 2 ml BAO MARIA 100C 3 MINUTOS RESULTADOS REACCIN PRECIPITADO

POSITIVA

DE

CONCLUSION: primeramente debemos establecer que la casena naci como protena desnaturaliza
mientras que la ovoalbmina es desnaturalizada por el calor precipitando a este proceso se le denomina COAGULACION, donde se estn rompiendo puentes de hidrgeno y salinos, haciendo que las
molculas vibren demasiado violentamente. En efecto a una temperatura de ebullicin se produce un desorden en su estructura producindose un efecto deshidratante se unen entre si y forman grandes conglomerados. Se Produce coagulacin, como cuando su fre un huevo ya que para poder romper los enlaces peptidicos es necesario someter a altas temperaturas y presiones. El calor es uno de los agentes primordiales de

desnaturalizacin, la mayor parte de las protenas en solucin son inestables a temperaturas superiores a 60C. Las alteraciones que sufre la molcula disminuyen su solubilidad y generalmente precipitan en forma de agregados insolubles. Esta propiedad de las protenas se denomina coagulacin

Estableceremos la diferencia entre coagulacin y desnaturalizacin

LA DESNATURALIZACIN es un cambio estructural de las protenas o cidos nucleicos, donde pierden su estructura nativa, y de esta forma su ptimo funcionamiento y a veces tambin cambian sus propiedades fsico-qumicas. Las protenas se desnaturalizan cuando pierden su estructura tridimensional (conformacin qumica) y as su caracterstico plegamiento de su estructura.Las protenas son filamentos largos de aminocidos unidos en una secuencia especfica. Son creadas por los ribosomas que "leen" codones de los genes y ensamblan la combinacin requerida de aminocidos por la instruccin gentica. Las protenas recin creadas experimentan una modificacin en la que se agregan tomos o molculas adicionales, como el cobre, zinc e hierro. Una vez que finaliza este proceso, la protena comienza a plegarse sin alterar su secuencia (espontneamente, y a veces con asistencia de enzimas) de forma tal que los elementos hidrofobitos de la protena son encerrados dentro de su estructura y los elementos hidrofilitos son llevados al exterior. La forma final de la protena determina cmo interaccionar con el entorno. Si la forma de la protena es alterada por algn factor externo (por ejemplo, aplicndole calor, cidos o lcalis), no es capaz de cumplir su funcin celular. LA COAGULACIN se refiere al proceso de desestabilizacin de las partculas suspendidas de modo que se reduzcan las fuerzas de separacin entre ellas Para la coagulacin existen tambin dos modelos. El primero es llamado ortocintico, el cual es promovido por agitacin externa principalmente. Influyen partculas de tamao superior al micrn y tiene relacin con los gradientes de velocidad del lquido. El segundo modelo se llama pericintico y se diferencia del primero en que su fuente de agitacin es interna. Principalmente importarn el movimiento browniano y la sedimentacin. Su efecto es principalmente sobre partculas de tamao inferior a 1 micrn.

b. REACCION CON REACTIVOS PARA ALCALOIDES TUBO PROTENA(ovoalbmina) CASEINA 1 1ml 1ml RESULTADOS REACCIN POSITIVA DE PRECIPITADO BLANCO UNA SOLUCION MAS O MENOS BLACO.

TRICLOROACETATO (TCA)

CONCLUSION: El TCA es un agente coatropico es decir altera el estado ordenado de las

molculas del agua vecinos a la protena se sabe que la ovoalbmina y casena presentan una estructura terciaria se estn neutralizando por medio de enlaces dbiles dndose una neutralizacin al introducirse grupos con carga positiva como la arginina o la histidina y lisina formndose un complejo insoluble en agua y probablemente un proceso de deshidratacin. El TCA al unirse este presenta una muy poca electronegatividad mientras que la unin de carboxilato con agua es poco deshidratante por la formacin del precipitado. La desnaturalizacin por solventes se debe a que las molculas de los solventes interfieren con las interacciones hidrofbicas en el interior de las protenas. Este proceso se ve favorecido a temperaturas mayores a 0C. Cuando las protenas se mezclan con bajas concentraciones de cido tricloroactico o ferrocianida de potasio en cido actico, se obtienen resultados de turbidez.

c. REACCION CON SALES DE METALES PESADOS:

TUBO PROTENA(ovoalbmina) casena

1 1ml 1 ml

RESULTADOS REACCIN POSITIVA DE PRECIPITADO(pp lechoso) REACCIN POSITIVA DE PRECIPITADO(pp blanco)

CONCLUSION: las protenas como el acido glutamico y aspartico presentan carga negativa y all estara
ingresando el PLOMO con su carga positiva adems el medio tendr que ser siempre bsico ya que se est formando una sal insoluble. As mismo las protenas cuando se encuentran en solucin a pH superiores a su punto isoelctrico son capaces de reaccionar con diferentes metales pesados formando los correspondientes PROTEINADOS INSOLUBLES. Tiene influencia el pH en el efecto de los metales pesados sobre las protenas ya que dependiendo de qu protena se est tratando, el pH influir para que las protenas estn ms all de su punto isoelctrico, ya que as son capaces de reaccionar con diferentes metales. Todos los metales pesados tienen el mismo efecto precipitante sobre las protenas i ya que estos se fijan mejor a la protena formando as los diferentes protenados, los cuales son insolubles.

+ Hg2+
MERCURIO

PROTEINATO DE

+ Pb2+

PROTEINATO DE PLOMO

(OVOALBUMINA O CASEINA)

d. REACCION CON SOLVENTES ORGANICOS

TUBO PROTENA (OVOALBUMINA CASEINA) CH3CH2OH

1 1ml Y 3ml

RESULTADOS REACCIN POSITIVA DE PRECIPITADO( CONGLOMERADOS PEQUEOS)

CONCLUSION: Se puede apreciar la formacin de conglomerado lo que est sucediendo es una

deshidratacin de las protenas, el etanol es el que precipita en mayor proporcin esto se podra deber a la polaridad al igual que a su constante dielctrica ya que el etanol presenta una mayor polaridad y constante dielctrica que la acetona cabe recalcar que la constante dielctrica es una fuerza que se opone a la atraccin de 2 molculas cargadas en el caso de la acetona las molculas se empiezan a asociar y a formar grumos , el poder deshidratante se debe a la constante dielctrica que pueda presentar el solvente por ello se da la precipitacin y la formacin de conglomerados que son solubles en agua en cuanto mayor sea el tamao de las partculas ms rpido sedimentaran. Los alcoholes y la acetona son agentes desnaturalizantes de las protenas ya que las deshidratan al competir por el agua de solvatacin y por lo tanto las precipitan

e. EFECTO DE LA ADICION DE SALES TUBO PROTEINA NACL 1M 1 3 ml AGUA DESTILADA gotas RESULTADO Precipitado blanco Se solubiliza

CONCLUSION: la protena mas el agua forman un precipitado blanco al agregarle cloruro de sodio se est incrementando la fuerza inica, ya que esta deshidratando al agua del solvente que se est utilizando en bajas concentraciones de da el SALTING IN.

TUBO PROTENA (NH4)2SO4

1 2 ml

AGUA DESTILADA gotas

RESULTADO Precipitado blanco

CONCLUSION: se da un proceso de eliminacin del agua de solvatacin, las molculas pueden formar puentes de hidrogeno de la protena y entre s, de esa manera la protena estar solvatada. En este caso solo se precipita la protena no se desnaturaliza y esto se debe a que se est eliminando el agua de la solvatacin, es decir esta deshidratando a la protena. Dndose el proceso de SALTING OUT (no desnaturaliza la protena la estabiliza no pierde su actividad biolgica) El sulfato de amonio es una de las sales ms utilizadas para la precipitacin salina de protenas. Es muy soluble (760 g de sulfato de amonio/1000 de agua a una temperatura de 20 C) y el in sulfato divalente permite alcanzar altas fuerzas inicas. Las protenas en solucin son menos solubles cuando se aumenta la fuerza inica y esto se puede lograr adicionando sales solubles como el sulfato de amonio ((NH4)2SO4). Sin embargo, la concentracin para precipitar diferentes protenas es variable.