Biotecnologia Vegetal

Instituto Superior de Agronomia 2011-2012

Relatrio da aula prtica: Obteno e anlise de marcadores RAPD

Objectivos
Esta aula prtica teve como principal objectivo realizar um procedimento experimental com marcadores biomoleculares, tendo como exemplo a tcnica RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). No qual se incluem objectivos mais especficos, entre os quais, compreender o fundamento e executar uma PCR (polymerase chain reaction), preparar um gel de agarose e realizar uma electroforese, entender a definio de marcador biomolecular e polimorfismo, contactar com aplicaes prticas de marcadores moleculares: identificao varietal e similaridade fentica, compreender outros marcadores moleculares, por analogia com a tcnica RAPD.

Introduo
Um marcador gentico qualquer caracterstica morfolgica ou molecular, herdada de maneira simples que diferencia indivduos. O uso de marcadores genticos baseia-se na deteco de polimorfismos. Os polimorfismos so variedades que podem ocorrer simultaneamente dentro ou entre populaes de mltiplas formas fnotipicas de um carcter, atribuveis aos alelos de um nico gene. Os marcadores genticos podem ser morfolgicos ou moleculares. Os marcadores morfolgicos so raros porque a variao gentica tem uma base molecular complexa no sendo fcil de determinar. Os marcadores moleculares podem ser bioqumicos devido a protenas ou de DNA.

Os marcadores moleculares apresentam diversas vantagens como independncia de factores ambientais e do estado de desenvolvimento da planta, independncia do estado fisiolgico e sanitrio e tem nmero virtualmente ilimitado. Os marcadores moleculares baseiam-se na deteco de sequencias especificas de DNA do organismo podendo ser por hibridao ou por PCR. Para a obteno e anlise de marcadores RAPD utilizmos o PCR para amplificar segmentos de DNA e posteriormente separar os fragmentos em gel de agarose atravs da electroforese. A tcnica da PCR baseia-se no processo de replicao de DNA que ocorre in vivo. A tcnica consiste na realizao de vrios ciclos, sendo realizados trs passos em cada ciclo: No primeiro passo so usadas temperaturas elevadas de forma a separar as molecular de DNA em duas cadeias simples (desnaturao de DNA). A desnaturao de DNA permite a ligao dos primers, a ligao feita em cadeias simples. (geralmente os primers so constitudos por 15 a 30 nucletidos). No segundo passo, a ligao dos primers feita atravs de ligaes de hidrognio, para permitir a ligao a temperatura de reaco reduzida para 50 e 65C. ( a temperatura de emparelhamento vai depender da sequencia a amplificar, a ligao entre Adenina e Timina exige menores valores do que a ligao entre Guanina e Citosina. O terceiro passo do PCR consiste na sntese da cadeia complementar de cada cadeia molde, catalisada pelo DNA polimerase.

O processo pode ser repetido vrias vezes sendo assim possvel aumentar em cada ciclo duas vezes a concentrao de DNA.

A PCR uma tcnica rpida, simples com custo reduzido e elevada sensibilidade.
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A separao dos fragmentos em gel de agarose feita atravs de uma outra tcnica: a electroforese. A electroforese consiste no transporte de partculas num campo elctrico. No transporte electrofortico a fora do campo ope-se a resistncia viscosa do meio, produzindo quando se igualam uma velocidade constante das partculas. Pode-se definir a mobilidade electrofortica (u) como a velocidade de migrao por unidade de campo elctrico. Numa mesma soluo partculas com a mesma carga podem ter mobilidade electrofortica distinta pois podem ter pesos moleculares diferentes. Atravs da separao das partculas de DNA conseguimos identificar uma variedade desconhecida. A identificao feita por comparao de bandas: bandas iguais indivduos iguais. A similaridade fentica pode ser calculada atravs do coeficiente de Dice. Coeficiente de Dice: 2Nab /(Na+Nb).

Equipamento
Mquina de gelo Centrfuga de bancada Termociclador Tina de electroforese horizontal Fonte de alimentao para electroforese Equipamento fotogrfico tipo Polaroid Transiluminador Agitadores magnticos com e sem aquecimento Arca congeladora 20C Computador Pessoal (PC)

Material
Micropipetas Pontas para micropipeta Frascos erlenmeyer Tubos eppendorf 0,5 ml e 1,5 ml Parafilme Filmes Polaroid 667

Reagentes
Agarose ultra pure electrophoresis grade Tampo de reaco PCR 10X Pharmacia (10mM Tris-HCl pH 9,0; 1,5mM MgCl2; 50mM KCl) 50X Tampo TAE Tris-Acetato-EDTA (1 x 0,04 M Tris acetato; 0,001 M EDTA) GreenSafe (corante de visualizao de DNA) Pharmacia Corante azul de bromofenol (0,25% (p/v) de azul de bromofenol; 30% glicerol em dH2O miliQ) dNTPs Gibco BRL (soluo equimolar (10mM) de cada dNTP) Primer OPA18 Marcador de DNA de peso molecular 100bp ladder MBI Fermentas

Mtodos
O trabalho de laboratrio decorreu em quatro passos A), B), C) e D). Embora a sequencia dos passos em laboratrio, no tenha sido igual ao do protocolo, por motivos de exequibilidade no tempo da aula, vamos descrever o trabalho pela ordem do protocolo, por ser essa a correta. A) PREPARAO DE UMA REACO RAPD (PCR com primer nico de sequncia arbitrria) Para preparar esta reao RAPD, utilizmos 3 amostras de DNA de 3 variedades de cerejeira e de 1 variedade desconhecida: C1- Saco do Douro, C2-Saco Cova da Beira, C3-Vilar e C4-Desconhecida. Num tubo eppendorf de 1,5 ml colocou-se: 18,8ul x 5 x 1,05=98,70ul de dH2O miliQ; 2,5ul x 5 x 1,05=13,13ul de tampo de reao PCR 10X Pharmacia (10mM Tris-HCl pH 9,0; 1,5mM MgCl2; 50mM KCl) 0,5ul x 5 x 1,05=2,63ul de dNTPs Gibco BRL (soluo equimolar (10mM) de cada dNTP) 1,0ul x 5 x 1,05=5,25ul de Primer OPA18 Operon Technologies (sol. de trabalho a 10pmol/ul) 0,2ul x 5 x 1.05=1,05ul de Taq DNA polimerase 5U/ul Pharmacia Total da Soluo 120,76ul
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Para evitar erros, as contas anteriores foram reconfirmadas dando no final 23ul/cada amostra. Escolheu-se o primer OPA-18, por anterior conhecimento do mesmo, sabendo de antemo que iriamos ter vrias bandas possveis, para estas variedades de Cerejeira. Caso no tivssemos conhecimento anterior, teramos de experimentar diversos at que um desses primer desse resultados aceitveis, cerca de 400 bandas diferentes. A colocao dos diversos produtos fez se com a ajuda de uma pipeta. Regulou-se a pipeta para os diferentes volumes (um de cada vez), tendo o cuidado de usar uma ponta nova sempre que se colocava um produto diferente no tubo. A ordem de colocao deve ser a descrita anteriormente. A gua ser sempre a primeira a ser colocada no tubo para evitar que a soluo precipite. O Tampo tem de ser colocado obrigatoriamente antes da Taq DNA Polimerase para regular o meio onde a mesma ser introduzida posteriormente. A Taq dever ser a ultima a ser introduzida no tubo e s nessa altura poder ser retirada do frio (Condies de -20 C) onde est armazenada, para evitar que se degrade. CONDIES FINAIS: Volume total de 25ul contendo 30ng de DNA genmico, 1 unidade de Taq DNA polimerase, 0,2mM de cada dNTP, 0,4uM de primer em 1 x tampo de reao. De seguida, misturmos ligeiramente por inverso o mix da PCR (para as 4 amostras mais uma parte para o controlo negativo), agitando com cuidado para no danificarmos os primer. Levmos a centrfugar durante 7 segundos, na centrifugadora de bancada, com o intuito de recolher o contedo que possa estar no fundo. Com a ajuda de uma pipeta regulada para 23ul, colocmos os produtos, j devidamente misturados, num tubo eppendorf de 0,5 ml, ficando assim com 4 tubos com idntica quantidade da reao onde se vai misturar 2ul de amostra de DNA (15ng/ul), tambm com a ajuda de uma pipeta. De cada vez que se mistura um tipo de ADN retira-se a ponta da pipeta e coloca se uma nova, para que no exista contaminao de ADN entre os tubos. No quinto e ultimo tubo, que vai servir para o controle negativo coloca se 2ul de dH2O miliQ. Temos assim completos os tubos que iremos colocar no termociclador para amplificarmos os respectivos ADNs . Segue-se a fase da programao dos tempos e temperaturas do termociclador onde ir ocorrer o PCR. Adotou-se o seguinte perfil:

94C ----------------- 90 seg. 94C ----------------- 30 seg. | 36C ----------------- 30 seg. |>35 ciclos 72C ----------------- 60 seg. | 72C ----------------- 10 min

Os primeiros 90s a 94 C servem para a desnaturao inicial do ADN e essa temperatura calculada de acordo com a seguinte formula Tm = 4(G + C) + 2(A + T) C . As amostras de ADN teriam cerca de 280 a 300 bp o que deu cerca de 94C para a temperatura de desnaturao. Como se trata de um primer relativamente pequeno AGGTGACCGT utilizou-se a temperatura de emparelhamento ou annealing de 36C. A temperatura de polimerizao ronda os 70C que a temperatura tima para o funcionamento da enzima Taq DNA polimerase, neste caso vamos usar 72C. De seguida colocam se os tubos (4+1) no termociclador e inicia-se o programa. A nossa amplificao dever ficar pronta 82 min depois. Caso no se possa estar perto do mesmo quando a programao terminar deve se programar uma ltima temperatura cerca de 4C para que o termociclador faa de frigorfico e a amostra no se degrade. B) PREPARAO DE UM GEL DE 1,5% AGAROSE EM 1 x TAE (esta operao pode ser feita enquanto o termociclador estiver a cumprir o seu programa) Pesam-se 3g de Agarose ultra pure electrophoresis grade ( em p) e colocam-se numa folha de alumnio. Mede se 196ml de dH2O e despeja se por cima da agarose (lavando o alumnio) ao mesmo tempo que esta vai escorrendo para o frasco erlenmeyer. Mede- se com uma pipeta 4ml de 50X Tampo TAE Tris-AcetatoEDTA (1 x 0,04 M Tris acetato; 0,001 M EDTA) e despeja-se para o anterior frasco erlenmeyer. Agita-se a mistura e coloca-se num agitador magntico por forma a dissolver a agarose. O processo de dissoluo leva entre 5 a 6 minutos. Juntase 5ul de corante Greensafee quando a soluo j estiver a fazer bolhas e translcida, e homogeneiza-se a mistura. Desliga-se o agitador e deixa-se arrefecer a mistura at aproximadamente 50C. Entretanto colocamos o molde que ir receber a mistura por forma a que fique nivelado. Esta preocupao deriva da necessidade do gel ficar uniforme e sem bolhas para que a condutividade seja constante. Deita-se a soluo j a 50C no molde do gel, no lado oposto aos pentes. Caso tenha bolhas de ar, furam-se as bolhas com uma ponta de micropipeta e colocam-se os pentes. Os pentes devero ficar bem encaixados para que os poos tenham todos a mesma profundidade.

C) ELECTROFORESE EM GEL DE AGAROSE Com as amostras do passo A) e com o Gel preparado como descrito no passo B) vamos agora fazer uma eletroforese em gel de agarose para determinar as bandas de cada uma. Colocou-se um pedao de parafilme com seis marcas, que distinguem, quatro das amostras das nossas variedades de Cerejeira (trs conhecidas e uma desconhecida), uma para fazer o controlo negativo da experincia e a ltima para o marcador molecular.
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Pipetaram-se 10ul da reaco de amplificao de cada amostra com 2ul de corante azul de bromofenol (0,25% (p/v) de azul de bromofenol; 30% glicerol em dH2O miliQ). De seguida preparou-se o marcador molecular. Adicionou-se 1ul de marcador de DNA de peso molecular 100bp ladder MBI Fermentas a 9ul de dH2O, e o corante, j descrito anteriormente para as amostras. De notar que a proporo de qualquer um dos seis preparados tem uma proporo volumtrica de 1X de corante para 5X de soluo de marcador/produtos da reaco de amplificao. Os preparados devem ser rapidamente colocados no gel de agarose e iniciar a eletroforese para no se degradarem. Esta colocao faz-se com a ajuda de uma pipeta adequada ao volume e devem-se trocar as pontas sempre que se manipular uma amostra diferente, para no existir contaminao das mesmas. Depois de se colocarem as amostras nos poos do gel de agarose, previamente colocado na tina de eletroforese horizontal, regula-se a alimentao 120 V durante uma hora e meia. Se quisssemos que a experincia decorresse com maior rapidez poderamos colocar uma voltagem na ordem dos 140 V durante meia hora, aproximadamente. Podemos constatar desde o incio que as amostras comearam a difuso passado pouco tempo. No final da hora e meia retirou-se o gel e levou-se para a cmara escura onde se fotografou com a ajuda de uma mquina tipo Polaroid. Ficmos assim com uma fotografia com as bandas detectadas. Tambm foi visualizada o gel com as bandas num transiluminador de luz UV. Como no temos a mesma reproduzimos esquematicamente de seguida. Saco do Douro ---------------------------------------Saco Cova da Beira ----------------------------------------

Vilar Desconhecida --------------------------------------------------------------------------------------------

Ou numa Matriz de zeros e uns: Saco do Douro 0 1 1 1 0 Saco Cova da Beira 0 1 0 1 1

Vilar 1 1 0 1 1

Desconhecida 0 1 1 1 0

Verificou-se na fotografia que no apareceu qualquer banda na amostra destinada ao controlo negativo, o que significa que os reagentes no estavam contaminados com ADN.
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Pela anlise dos quadros acima a amostra Desconhecida dever ser similar amostra do Saco do Douro.

D) ANLISE DOS RESULTADOS 1) Vamos calcular agora a matriz de similaridade fentica utilizando o coeficiente de Dice. Dice a,b=2Nab/(Na+Nb) sendo: Nab-Numero de bandas comuns entre a variedade a e a variedade b Na-Numero de bandas da variedade a Nb- Numero de bandas da variedade b

Matriz de Similaridade Fentica de Dice Saco do Saco Cova da Douro Beira Vilar Desconhecida Saco do Douro 1 0,67 0,57 1 Saco Cova da Beira 0,67 1 0,86 0,67 Vilar 0,57 0,86 1 0,57 Desconhecida 1 0,67 0,57 1 2) Utilizando a matriz de zeros e uns anterior e o sofware NTSYS previamente intalado num PC foi-se calcular o Dendrograma para estas variedades, que abaixo se reproduz atravs de uma fotografia tirada ao ecr do pc aps introduo dos dados.

3) Atravs da matriz de similaridade calculada na alnea 1) e do Dendrograma da alnea 2) pode-se concluir que existe 100% de similaridade fentica entre as amostras de DNA utilizadas da variedade Saco do Douro e da variedade Desconhecida. No entanto para que se pudesse melhor aferir a similaridade deveramos ter cerca de 400 bandas em cada variedade. 4) Um marcador molecular todo e qualquer fentipo molecular proveniente de um gene expresso (isoenzimas) ou, de um segmento especfico de ADN (correspondendo a regies expressas, ou no, do genoma). O polimorfismo pode ser definido como a ocorrncia simultnea, dentro ou entre populaes, de mltiplas formas fenotpicas de um caracter, atribuveis aos alelos de um nico gene. Os RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphism), so polimorfismos no comprimento de fragmentos de restrio, no sendo necessrio sequenciar DNA. As variaes que ocorrem nos nucletidos do DNA, seja por mutao, deleo, insero e inverso, podem ser detectadas se ocorrerem nos locais de corte das enzimas de restrio. Caso o DNA de plantas, diferindo num ou vrios desses nucletidos, for exposto a essas enzimas, originam-se fragmentos de diferentes tamanhos, portanto polimrficos (RFLPs), que podem ser identificados e clonados. Os polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrio, ou polimorfismo de tamanho de fragmento, so loci no DNA que podem ser identificados e mapeados. Na anlise de RFLP, a amostra de DNA quebrada em pedaos (digerida) pelos enzimas de restrio e os fragmentos de restrio resultantes so separados de acordo com seus comprimentos por eletroforese em gel. Apesar de, na actualidade, esta tcnica estar ultrapassada devido ao aumento das tecnologias de DNA de baixo custo de sequenciamento, a anlise RFLP foi o primeiro perfil de DNA. Os RFLPs tm muitas aplicaes no melhoramento de plantas, tais como no desenvolvimento de mapas de ligao, altamente saturados com marcadores. Estes mapas servem de base para o mapeamento de outras caractersticas de importncia agronmica, principalmente as de natureza quantitativa e governada por muitos genes. Desta forma possvel verificar as associaes (ligaes genticas) entre os marcadores moleculares e os genes que afectam um carcter quantitativo. Os RFLPs ainda tm outras utilidades como a identificao de germoplasma, a identificao de variedades, o controle de qualidade na produo de sementes hbridas, a caracterizao gentica de populaes, o monitoramento nos retrocruzamentos e auxlio na identificao e clonagem de genes, entre outras. Os AFLPs (Amplified Fragment Length Polymorphism) so polimorfismos de comprimento de fragmentos amplificados, que resultam do uso combinado
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de enzimas de restrio e da reaco em cadeia da polimerase (PCR). Tm como principais caractersticas uma alta especificidade e resoluo e poder de amostragem. Os Microssatlites (SSR - Simple Sequence Repeats) so sequncias curtas em tandem, simples, formadas por um ou poucos nucletidos. Comparativamente aos RFLPs, os microssatlites proporcionam 3 a 4 vezes mais polimorfismo ou informao. No entanto, para o uso dos microssatlites, tem de se amplificar primeiro uma regio, posteriormente, sequenci-la e, em terceiro lugar, sintetizar os iniciadores especficos para cada locus. Uma vez feito isto, o locus marcador pode ser utilizado indefinidamente naquela espcie. Desta forma, existe um custo elevado e trabalho no incio, mas o custo subsequente baixo e torna-se uma tcnica bastante simples. Os marcadores microssatlites so utilizados no mapeamento gentico e na caracterizao varietal para fins de proteco e de germoplasma para fins de conservao de vrias espcies. Trabalho realizado por: Ana Cristina Gonalves, n20078 Augusto Ezequiel, n20050 Maria Correia, n20087 Nuno Fonseca, n20033 Pedro Fazenda, n20019 Turma 1A Grupo 2 Lisboa, 15 de Novembro de 2011

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