1.

Patulina n sucul de mere

Patulina este un metabolit secundar, produs n special de mucegaiurile Penicillium patulum, Penicillium expansum, Penicillium claviforme, Aspergillus clavatus, cu efecte toxice asupra organismului uman i animal. Patulina a fost descoperit drept contaminant n multe fructe (pere, caise, piersici si struguri), legume, cereale i alte alimente mucegite, cu toate acestea, sursa major de contaminare constituind-o merele i produsele din mere. Patulina este stabil, n special, n produsele procesate din mere: suc de mere, suc concentrat de mere, nectar de mere, nectar de fructe (care are ca ingredient i sucul de mere), piure de mere, compot de mere etc. Fermentaia alcoolic distruge patulina i, prin urmare, produsele fermentate, cum sunt cidrul de mere i cidrul de pere, nu conin patulin. Patulina a fost descoperit n produsele fermentate crora li s-a adugat suc de mere contaminat cu patulin, dup fermentare. Se cunoate faptul c acidul ascorbic determin dispariia patulinei din sucul de mere, dei condiiile optime pentru inactivare nu au fost stabilite pe deplin. Patulina este relativ termostabil, n mod special la pH acid. S-a dovedit c tratamentele pe termen scurt la temperaturi nalte (150C) duc la o reducere cu 20% a concentraiei de patulin. Cu toate acestea, numai procesarea termic nu este suficient pentru a asigura un produs liber de patulin. Procesarea termic nu este suficient pentru a asigura obinerea unui produs liber de patulin. Patulina apare n principal n fructele mucegite, dei prezena mucegaiului nu implic n mod necesar prezena patulinei n fruct, dar indic faptul c aceasta ar putea fi prezent. n anumite situaii, dezoltarea n interior a mucegaiurilor are drept cauze atacul insectelor sau altor invadri ale esuturilor sntoase, determinnd apariia patulinei n fruct, care la exterior apare ca fiind neafectat. Cu toate acestea, patulina poate aprea n fructele lovite dup depozitarea n atmosfer controlat i expunerea la condiii ambientale, cu sau fr alterarea pulpei. Splarea fructului sau nlturarea esutului mucegit imediat naintea presrii nu va nltura patulina prezent n fruct, ntruct aceasta difuzeaz i n esutul aparent sntos.

Dei sporii celor mai multe mucegaiuri capabile s produc patulin sunt prezeni pe fructe n vreme ce acestea se gsesc nc n pom, nu se vor dezvolta pe fruct pn dup cules. Cu toate acestea, mucegaiul se dezvolt i patulina se poate produce n fruct nainte de cules, dac fructul este afectat de o boal sau atacat de insecte ori dac fructele czute sunt culese pentru procesare. Starea fructului la recoltare, modul n care fructul este manipulat ulterior (n special n timpul depozitrii), ca i msura n care condiiile de depozitare inhib dezvoltarea mucegaiurilor vor afecta posibilitatea contaminrii cu patulin a sucului i a altor produse preparate din fructe proaspete i depozitate. Mucegaiurile ce produc patulin se pot dezvolta mpreun cu alte mucegaiuri i drojdii, n special n sucurile care nu sunt obinute din concentrate. Este esenial prevenirea dezvoltrii unor astfel de organisme n timpul transportului i depozitrii pentru a preveni alterarea produsului i a preveni, prin aceleai mijloace, producerea de patulin. Penicillium i Aspergillus pot fi considerate, speciile principal responsabile pentru producerea de micotoxine n etapele de pre-prelucrare a fructelor (pre-recoltare i post-recoltare). Unele specii de Byssochlamys pot fi considerate ca poteniali productori de micotoxine n etapele de post-pasteurizare, datorit capacitii lor de a supravietui tratamentului termic aplicat de obicei sucurilor de fructe. Norma pentru prevenirea i reducerea contaminrii cu patulin a sucului de mere (aprobat prin Ordinul nr. 163/13.07.2006 i publicat n Monitorul Oficial, Partea I, nr. 653 din 28.07.2006) impune aplicarea Bunelor Practici Agricole (GAP) i Bunelor Practici de Producie (GMP). Din punct de vedere chimic, patulina [4-hidroxi-4-H-furo (3,2-c) pyran-2 (6H)-on], este o lacton heterociclic nesaturat, cu formula empiric C7H6O4 i o mas molecular de 154 (Fig. 1), stabil n mediu acid, dar instabil n mediu alcalin. Se prezint sub form de cristale incolore, rombiforme sau prismatice, cu punct de topire de 110,5C, cu maxim de absorie la 276 nm, n soluie alcoolic.

Fig. 1. Structura chimica a patulinei

1.2. Efectele toxice ale patulinei asupra sntii

Sucul de mere contaminat cu patulina este periculos pentru sanatatea umana, nu doar datorita efectelor patulinei dar si a toxicitatii produsa atunci cand patulina este combinata cu alte micotoxine. Simptomele acute determinate de consumul unor produse contaminate cu patulin, pot fi: agitaie, convulsii, dispnee, congestie pulmonar, edem, ulceraii, hemoragie intestinal, degenerarea celulelor epiteliale, inflamaie gastrointestinal, stare de vom. Consumul frecvent al unor produse contaminate cu patulin, peste limitele maxim admise, poate determina n timp, urmtoarele efecte asupra organismului uman: efecte neurotoxice, hepatotoxice, imunosupresive, teratogene i cancerigene.

La nivel celular, cteva exemple ale acestor efecte sunt: ruperea membranei plasmatice, inhibarea sintezei proteinelor, i inhibarea sintezei ADN i ARN. Datorita dovezilor despre efectele adverse ale acestei micotoxine, Codex Alimentarius i FDA, au recomandat un nivel maxim de 50 g/L, pentru sucurile de fructe i produsele lor. Limita maxima admisa pentru patulina, in sucurile de fructe si nectar, in special, sucurile de mere si sucurile de mere folosite ca ingredient in alte bauturi comercializate in Europa, este de 50 ppb. n sucul de mere, micotoxina a fost detectat n diferite ri din ntreaga lume, cum ar fi: Finlanda, Statele Unite ale Americii, Australia, Chile, Spania, Brazilia, Turcia, Japonia, Africa de Sud, Iran, rile de Jos, Frana, Italia i Belgia. Prezena patulinei n sucurile de mere, comercializate n ntreaga lume indic faptul c ntr-o anumit msur, aceast micotoxin este stabil la etapele procesului de fabricare a sucului de mere. n scopul de a reduce contaminarea sucului de mere cu patulin, Codex Alimentarius recomand ca aciunile s fie axate pe bunele practici agricole (GAP) i bunele practici de fabricaie (BPF), pe tot parcursul lanului de producie a sucului. Organizaia pentru Alimentaie i Agricultur a Naiunilor Unite (FAO), a recomandat, adoptarea Analizei Riscurilor i Punctelor de Control Critice ale sistemului (HACCP), astfel

nct s garanteze controlul patulinei i a altor pericole asociate cu sucul de mere.

Limitele maxim admise pentru coninutul n patulin al unor alimente conform Ordinului nr.530/2007; Nr.crt. Produs Nivel maxim al patulinei (ppb) 1. Suc de fructe i nectar de fructe, n special suc de mere i sucurile de fructe utilizate ca ingrediente pentru alte buturi 2. Suc de fructe concentrat dup reconstituire, conform specificaiilor productorului 3. Buturi spirtoase, cidru i alte buturi fermentate derivate din mere sau coninnd suc de mere 4. Produse solide din mere, inclusiv compot de mere i piure de mere, destinate consumului direct 5. Suc de mere i produse solide din mere, inclusiv compot de mere i piure de mere pentru sugari i copii de vrst mic 6. Alte alimente pentru copii altele dect cele pe baz de cereale procesate 10 10 25 50 50

50

Diverse tehnici i metode au fost propuse i studiate pentru a controla/reduce nivelul patulinei i a mucegaiurilor care le produc, n timpul prelucrrii sucului de mere. Metoda de prelevare a probelor pentru controlul oficial al nivelurilor de patulin n anumite alimente este prezentat n Anexa IV a Normei sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor privind anumii contaminani din alimentele de origine animal i nonanimal, aprobat prin Ordinul 530/2007. Proba global trebuie s fie reprezentativ pentru lotul supus analizei i trebuie s cntreasc cel puin 1 kg.

Masa unei probe elementare trebuie s fie de cel puin 100 grame, rezultnd o prob global de cel puin 1 kg.

2. Determinarea patulinei din sucul de mere, prin cromatografie de lichide de nalt performan (HPLC)
Desi patulina a fost cea mai studiata micotoxin, n sucul de mere, pe plan mondial, totusi nici un studiu nu a cercetat prezenta sa in sucul de mere, pe piaa din Arabia Saudit. Scopul lucrrii: de a cerceta prezena patulinei n sucul de mere, n piaa, Jeddah, din Arabia Saudit, prin metoda HPLC-DAD. Metodele de analiz folosite pentru a detecta patulina din sucul de mere implic o etap de extracie, cu acetat de etil i tehnici diferite de purificare, nainte de analiza cromatografic. Etapele metodei de determinare a patulinei din sucul de mere

Pregtirea eantionului pentru analiz

Extracia patulinei

Purificarea extractului

Evaporarea extractului

Detecie HPLC a patulinei

2.1. Materiale si metode 17 tipuri diferite de suc de mere (51 de probe), la diferite puncte de vnzare cu amnuntul au fost colectate de la Jeddah, Arabia Saudit n cursul anului 2008. Probele au fost depozitate sub t= -4C nainte de analiza lor. 2.2. Analiza micologic 50 ml din fiecare prob de suc de mere a fost adugat la 450 ml de ap steril- peptonat (0,1%) i s-a omogeenizat bine, prin agitare. Diluiile n serie a probelor iniiale i o prob nediluat de suc, au fost cultivate (0,1 ml/plac) cu ajutorul agarului de dextroz din cartofi (PDA) i apoi plcile au fost incubate timp de 5 zile la 28C i examinate pentru contaminare fungic. 2.3. Extracia patulinei Extracie Patulinei a fost efectuat n conformitate cu AOAC (2000). n aceast metod, 10 ml de acetat de etil a fost adaugat n 5 ml de suc i s-a agitat energic timp de 1 min, folosind agitator vortex, stratul superior a fost transferat ntr-un tub de cultur. Acest pas a fost repetat de 3 ori i apoi 2 ml de Na2CO3 1,5%, a fost adaugat in stratul de acetat de etil i omogenizat viguros. Stratul superior de acetat de etil a fost uscat prin adaugarea a 1 g Na2SO4 i apoi evaporat n curent de azot la 40C. Reziduul a fost dizolvat n 0,5 ml acid acetic, i pstrat pentru determinarea HPLC. 2.4. Condiiile HPLC pentru patulin

Patulina a fost determinat cu ajutorul unui sistem HPLC Agilent 1100 echipat cu o pomp cuaternar, model G1311A, un detector DAD n UV G13158, stabilit la lungimea de und de 276 nm, un autosampler model G1329 i o coloan C18 (Phenomenex) (150x 4,6 mm), 5 ml au fost utilizai pentru separarea patulinei. Faz mobil de tetrahidrofuran (THF) 5%, a fost utilizat la debit de 0,5 ml/min. 3. Rezultate i Discuii S-a ncercat detectarea contaminrii cu fungi n sucul de mere, cu toate acestea, toate probele de suc de mere analizate n acest studiu au fost lipsite de mucegaiuri i drojdii. Tratamentele termice, mpreun cu conservanii poate reprezenta motivul pentru care valori fungice nu au fost detectate n probele studiate. Patulina a fost detectat n 3 probe care aparin unui singur tip, din cele 17 tipuri de probe, (5.88%), colectate n acest studiu (Tabelul 2).

Tabel nr. 2. Nivelul de patulin n suc de mere local i importat, din magazine alimentare, localizate n Jeddah, Arabia Saudit;
Probe Nr. probe Nr. tipuri de suc de mere Nr. probe pozitive % probe pozitive Interval de patulin (ppb) Media global a probelor pozitive (ppb) SE Locale 36 12 3 8,3 ND-152,5 1407,85 Importate 15 5 0 ND Totale 51 17 3 5,88 ND-152,5 1407,85

Concentraia maxim a probelor pozitive a fost de 152.5 ppb, care este mai mare de 3 ori, limita maxim admis (50 ppb), cu o concentraie medie de 140 ppb. Nu exist date disponibile pentru prezena patulinei n sucul de mere, din piaa Jeddah, n Arabia Saudit.

Cu toate acestea, interesul la nivel mondial pentru contaminarea cu patulin a crescut dramatic in ultimii ani, dup o serie de articole care au publicat rezultatele mai multor studii realizate n diferite ri. Un studiu german a raportat c 6 din 28 probe de suc de mere testate, conineau patulin (21%), la nivel de urme. Un studiu realizat n Marea Britanie n 1980 a artat c patulina a fost detectat n 70% din probele testate la concentraii cuprinse ntre 1-38 ppb. Niveluri de patulin variind ntre 106-216 ppb au fost raportate n 15% din probele de sucuri de mere, prelevate din Noua Zeeland. Toate cele 215 probe concentrate, de suc de mere, analizate n Turcia pentru patulin n 1994 au fost contaminate, variind de la 7 la 376 ppb i 98 din aceste eantioane conineau niveluri de patulin de peste 50 ppb. n Brazilia, 111 probe de sucuri de fructe prelucrate i 38 probe de fructe tari au fost analizate pentru patulin. Doar unul din cele 30 de probe de suc de mere s-a dovedit a fi pozitiv, la 17 ppb. Cu toate acestea, concentraii de 150-267 ppb de patulin au fost gsite n 14 probe de mere stricate. 41% din cele 68 de sucuri de mere (32 sucuri limpezi i 36 sucuri tulburi) comercializate n Portugalia, au fost contaminate cu patulin la un nivel maxim de 42 ppb. O inciden mai mare de eantioane pozitive a fost detectat la sucurile tulburi (67%) n comparaie cu cele limpezi (13%). Tabelul 1 a artat c 8,33% din probele locale au fost contaminate cu patulin, cu un nivel maxim de 152.5 ppb i o valoare medie de 140 ppb. Cu toate acestea, patulina nu a fost detectat n probele importate. Sucul de mere, n piaa din Arabia Saudit este, fie, importat ca produs final de suc de mere sau importat ca concentrat de suc de mere i omogenizat si ambalat, la nivel local pentru a obine produsul final local. Astfel, probele locale de suc de mere n acest studiu nseamn un concentrat de suc de mere importat, cu etape minime de prelucrare, local pentru a obine produsul final. Prezena patulinei numai n probele locale, de suc de mere poate fi din cauza calitii proaste a concentratului importat, mai degrab dect contaminarea n timpul prelucrrii. Prezena patulinei n rile productoare de mere este bine documentat i posibilitatea ridicat de contaminare cu patulin a concentratelor de suc de mere i a produsului final de suc de mere, pe piaa internaional este dovedit. Concentraii de patulina de pn la 497 ppb au fost detectate n unele sucuri de mere, vndute cu amnuntul, n Marea Britanie. Per total, aproximativ 50% din probele analizate de suc de mere, pe plan mondial, s-au dovedit c conin niveluri detectabile de patulin. Contaminarea produselor de suc de mere poate fi uneori mare, de 8000

ppb, n sucurile de mere obinute de la mere parial putrede i chiar mai mare n cidrul de mere obinut din incinte industriale n cazul n care merele putrede nu au fost sortate nainte de prelucrare. Rezultatele studiului din Africa de Sud, despre 60 de produse comerciale de mere pentru determinarea contaminrii cu patulin, a artat c niciuna dintre probe nu are concentraia de patulin mai mare de 50 ppb, iar nivelul maxim a fost de 45 ppb. Studiile publicate n 1994 au raportat incidena patulinei n sucurile de fructe analizate n Spania i Austria, ntre 43% i 85%, cu concentraii de patulin de 10-185 ppb. n Australia, 328 de produse mixte de fructe, de mere i pere au fost colectate din diferite puncte de vnzare cu amnuntul i de la productorii din Sydney i din satul New South Wales, ntre august 1989 i mai 1990. 23% din probe au fost contaminate cu patulin i 22% din aceste probe au avut concentraii de patulin ntre 51 i 1130 ppb. n Spania, din 100 de probe de suc de mere, ntre aprilie i decembrie 1992, 82 de probe au fost contaminate cu patulin, 7 dintre acestea fiind peste 50 ppb, cu o medie de 13,8 ppb i cea mai mare concentraie de patulin a fost de 170 ppb. Figurile 1 i 2 au artat cromatogramele HPLC a standardului de patulin i a probei pozitive cu concentraia maxim de 152.5 ppb.

Fig. 1. Cromatograma HPLC a standardului de patulina

Fig. 2. Cromatograma HPLC a probei de suc de mere cu 152.5 ppb patulina/ml;

Cromatograma nu a aratat picuri de interferen datorate diferitelor tipuri de matrici de suc de mere utilizate n acest studiu. Aceasta nseamn c metoda utilizat n detectarea i determinarea patulinei a fost adecvat n ceea ce privete tipul de matrice de suc de mere.

Concluzii

Se poate concluziona din rezultatele acestui studiu c incidena patulinei, n concentratele de suc de mere, n Arabia Saudit, este sczut, cu o proporie semnificativ fa de produsele care depesc limita de 50 ppb pentru sucul de mere, stabilit de OMS i de anumite ri europene. De asemenea, trebuie subliniat faptul c metoda utilizat pentru determinarea concentraiilor de patulin din sucuri de mere concentrate s-a dovedit a fi foarte util n ceea ce privete uurina n funcionare, viteza, economa i sensibilitatea metodei. Prezena patulinei n sucurile de mere, comercializate n ntreaga lume indic faptul c ntr-o anumit msur, aceast micotoxin este stabil la etapele procesului de fabricare a sucului de mere.

n scopul de a reduce contaminarea sucului de mere cu patulin, Codex Alimentarius recomand ca aciunile s fie axate pe bunele practici agricole (GAP) i bunele practici de fabricaie (BPF), pe tot parcursul lanului de producie a sucului. Organizaia pentru Alimentaie i Agricultur a Naiunilor Unite (FAO), a recomandat, adoptarea Analizei Riscurilor i Punctelor de Control Critice ale sistemului (HACCP), astfel nct s garanteze controlul patulinei i a altor pericole asociate cu sucul de mere.