Biotecnologa

Optimizacin de la hidrlisis cida de la inulina

Obtencin de jugo fermentable para la produccin de bioetanol
O. Len, M. Santos, R. Lpez y G. Antoln
Centro de Automatizacin, Robtica y Tecnologas de la Informacin y Fabricacin (CARTIF) 1. Introduccin El proceso de hidrlisis est orientado a la obtencin de los monosacridos, fructosa y glucosa, constituyentes de la molcula de inulina [1 y 2], de tal forma que el jugo resultante tenga capacidad fermentativa y pueda ser adecuado para la obtencin de bioetanol. Existen dos alternativas para la realizacin del proceso de hidrlisis de la inulina: enzimtica [3] y cida. La hidrlisis enzimtica se ha desestimado dado que en la actualidad no existe exo-inulasa que haga viable la aplicacin industrial [4]. Adems, el alto coste de las materias primas y los reactivos, junto con grandes tiempos de operacin, hace que el proceso sea muy poco rentable comparado con la hidrlisis cida para el caso concreto de la molcula de inulina. La hidrlisis cida precisa de un reactor que opere a presiones del orden de 10-15 bar, intervalo de presin necesario para conseguir temperaturas del orden de 150-180C sin que se produzca la vaporizacin del producto. Adems, bajo estas condiciones de operacin se evita una posterior pasteurizacin del jugo, eliminndose cualquier microorganismo contaminante que afecte al proceso fermentativo posterior y reduzca su rendimiento. Adems, el control de la fermentacin es mucho ms sencillo, lo que implica menores costes durante el proceso y, por lo tanto, un mayor rendimiento tcnico y econmico. Aunque las condiciones de operacin, en cuanto a temperatura y tiempo de reaccin, sean mucho ms elevadas que las necesarias para el caso de hidrlisis enzimtica, no hacen al proceso una alternativa inviable a escala industrial [5]. En comparacin, la hidrlisis cida de la inulina se realiza en unas condiciones mucho ms suaves de pH y temperatura en comparacin con la hidrlisis cida de otros polisacridos. El objetivo fundamental de este estudio es la optimizacin del proceso de hidrlisis de la inulina mediante tratamiento cido a elevada temperatura, procurando que ste sea competitivo con otras alternativas. Este estudio viene condicionado por ser este proceso de hidrlisis una de las etapas dentro del proceso de produccin de bioetanol. Tanto las condiciones de entrada de jugo depurado como las de salida a fermentacin del jugo hidrolizado quedan establecidas dentro de unos lmites muy reducidos en cuanto a pH y concentracin inicial de inulina en el jugo depurado. 2. Experimentacin
2.1. Planta piloto y equipos

Se realiza un estudio del proceso de hidrlisis cida de la inulina extrada de la pataca y la achicoria, para la obtencin de monosacridos fermentables por levaduras del tipo Saccharomyces uvarum. Su optimizacin se lleva a cabo mediante el control de las variables determinantes del proceso: temperatura, pH, tiempo de reaccin y concentracin inicial de inulina, aplicando a los resultados un diseo factorial de desarrollo de experimentos. Tanto el pH del medio como la concentracin inicial de inulina vienen fijados por un proceso global de obtencin de bioetanol, donde se enmarca esta etapa de hidrlisis de la inulina.

En la figura 1 se presenta un esquema de la planta piloto utilizada. Consiste en un recipiente de alta presin de un litro de capacidad, construido en acero inoxidable AISI 316, con cierre de seguridad y entradas para la medida y el control de presin y temperatura. El aporte de calor al reactor se realiza mediante una resistencia elctrica de

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Tabla I. Datos experimentales promedio Tipo de inulina Comercial T (C) 130 t (min) 0 10 20 0 10 20 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 0 10 20 0 10 15 20 0 5 10 15 0 5 10 15

pH 4,0

%R 3,12% 4,80% 14,50% 2,66% 33,70% 46,73% 4,80% 23,17% 40,02% 61,67% 75,43% 4,87% 52,02% 76,36% 81,23% 92,90% 6,3% 21,14% 43,75% 7,3% 56,24 76,01 90,19% 5,5% 14,26% 34,04% 65,50% 4,94% 66,11% 79,57% 80,79%

140

150

160

Natural

130

150
Figura 1. Esquema de la planta piloto

abrazadera de 1,5 kW. A la salida del reactor, se tiene acoplado un sistema de refrigeracin, donde condensa el jugo hidrolizado y se descomprime tras el tiempo de hidrlisis, de forma que se evite la prdida parcial del jugo por evaporacin. El seguimiento del proceso y el control de calidad se realizan con un HPLC de la marca Agilent, modelo 1100 Series, con detectores IR para la medida de los azcares y DAD para el anlisis del hidroximetilfurfural. La columna que se utiliza en el HPLC para la medida de azcares es Shodex SUGAR KS-802 de 300 mm de longitud, dimetro de 8 mm y tamao de partcula 6 m, para la separacin de los azcares presentes en los jugos analizados por exclusin en orden decreciente de tamao molecular. Se utiliza una segunda columna en el HPLC para la medida de azcares de menor tamao molecular, principalmente fructosa y glucosa. Se trata del PL Hi-Plex Pb de 300 mm de longitud, con 7,7 mm de dimetro interno y 8 m de tamao de partcula.

3,5

Comercial

150

160

Por ltimo, la columna utilizada para la medida del hidroximetilfurfural (HMF) es una Kromasil C18 de 5 m de tamao de partcula, con una longitud de 250 mm y un dimetro interno de 4,6 mm.
2.2. Materiales y mtodos

La inulina comercial utilizada es Raftiline HP Gel, presentada en forma de polvo, proporcionada por la empresa ORAFTI y obtenida a partir de Cichorium intybus L., con posterior purificacin y separacin por cromatografa para la eliminacin de los restos de azcares originados por la degradacin de la inulina. La preparacin de la muestra inicial de inulina natural se obtiene de la extraccin de los polisacridos presentes en los tubrculos de pataca o achicoria, por difusin en contracorriente [6] con agua precalentada a una temperatura de 75C y en relacin variable segn la calidad de la materia prima, entre 0,7-1 L agua/kg tubrculo. El tiempo de extraccin es variable segn la materia prima, si bien es prximo a los 60 minutos. Posteriormente, se procede a la eliminacin de las impurezas pre-

Como base del estudio se utilizan dos tipos de inulina: comercial y natural, a fin de realizar una comparativa. Se denomina inulina natural a la que se obtiene de los tubrculos de pataca (Helianthus tuberosus L.) y de achicoria (Cichorium intybus L.) mediante trituracin y extraccin por difusin con agua en contracorriente, con posterior depuracin del jugo mediante adiccin de floculantes, centrifugacin y filtracin.

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sentes en el jugo mediante la aplicacin de filtracin tangencial por membranas. Antes, se adiciona floculante para aumentar la retencin de impurezas y protenas, ya que stas precipitan mejor quedando retenidas. As se facilita su eliminacin mediante el aumento del pH del medio hasta alcanzar el punto isoelctrico. Una vez obtenido el jugo libre de impurezas y de restos de partes vegetales, se acidifica con una disolucin 0,1 N de H2SO4, hasta alcanzar un pH en torno a 3,5-4,0, antes de comenzar la hidrlisis cida de inulina. La concentracin de inulina que se obtiene est comprendida entre 120-130 g/L, y el rendimiento del proceso de extraccin es del orden de 96%. El seguimiento del proceso en las distintas etapas se realiza a travs de un HPLC [7]. La medida de los azcares presentes en los distintos jugos se efecta mediante HPLC-IR. En la columna Shodex SUGAR KS-802 se separan los azcares presentes en los jugos por exclusin en orden decreciente de tamao. La fase mvil es agua ultra pura con un caudal de 0,5 ml/min, siendo la temperatura de la columna de 80C. El tiempo de elucin de todos los azcares es de unos 25 min. Bajo estas condiciones se utiliza la columna PL Hi-Plex Pb para determinar el contenido en fructosa reduciendo la superposicin de los picos de los distintos azcares. Esta columna presenta el inconveniente de que las molculas de inulina no se llegan a diferenciar, donde slo se tiene en cuenta el grado de polimerizacin. El anlisis del hidroximetilfurfural (HMF) se realiza por HPLCDAD, con la columna C-18. La medida en el detector se realiza a 280 nm, con un caudal de la fase mvil de 1 mL/min de agua/ACN (95:5). El tiempo de elucin total de la muestra fue entorno a 30 min. 3. Resultados y discusin En la Tabla I se muestra los resultados experimentales obtenidos. El parmetro de medida es el gra-

la hidrlisis del jugo de inulina a dos niveles de temperatura. Se observa que existe una ligera variacin cuando el pH disminuye, aunque no supone una influencia considerable, por lo que el pH no va a ser un factor influyente en el proceso. Efecto de la temperatura La figura 4 muestra la influencia del tiempo de reaccin en el grado de hidrlisis a distintos niveles de temperatura. Se observa que a medida que aumenta la temperatura se obtiene un mayor porcentaje de hidrlisis de las molculas de inulina. Para una misma temperatura, con un tiempo de reaccin ms prolongado se consigue un grado de conversin mayor. En conclusin, la relacin temperatura y tiempo de reaccin afecta de forma directa sobre el porcentaje de fructosa con respecto al total de los azcares presentes. De acuerdo con la comparativa entre inulina comercial y natural descrita, es previsible que la temperatura a la que se deba llevar a cabo el proceso de hidrlisis a escala sea mucho menor. Esto significa que el coste energtico va a ser mucho menor en el proceso a escala para tiempos de reaccin iguales. Diseo factorial completo Se lleva a cabo un anlisis de los resultados por un diseo factorial [8] de desarrollo de experimentos, a fin de reducir el nmero de experiencias y delimitar qu variables del proceso influyen en mayor medida sobre la relacin de conversin de inulina a monosacridos (glucosa y fructosa). Las etapas a seguir son: - Decisin sobre la funcin objetivo acorde con lo que se va a juzgar en el mtodo: conversin de inulina a fructosa, %R. - Identificacin de los factores que influyen sobre la funcin objetivo: T, pH y t.

Figura 2. Rendimiento de la hidrlisis respecto al tipo de inulina

do de hidrlisis de inulina: relacin de la concentracin de fructosa respecto a la concentracin de azcares totales. Tipo de inulina Se realizaron pruebas de hidrlisis de jugos de inulina comercial y jugos depurados de inulina natural. La figura 2 muestra el efecto del tipo de inulina sobre el grado de hidrlisis de inulina a fructosa. El grado de polimerizacin del jugo depurado de la inulina de partida es mayor en el caso de la inulina comercial que la inulina natural. Este factor es muy importante durante la hidrlisis, ya que, para un mismo tiempo de reaccin, el grado de hidrlisis es mucho mayor en el caso de la inulina natural. Efecto del pH del medio El pH del medio puede estar comprendido en torno a 3,5-4,0, que es el adecuado para la posterior fermentacin. La figura 3 muestra la influencia del pH sobre
Figura 3: Rendimiento de la hidrlisis respecto al pH del medio

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La informacin sobre los factores ms influyentes se obtiene mediante la comparacin de una Fcalc (varianza de cada fuente o errores aleatorios totales) con el valor Fcrt obtenido en tablas (F2,3). En la Tabla III se puede comprobar las varianzas obtenidas, as como la Fcalc en relacin con la Fcrt., de forma que en los casos en que Fcacl > Fcrit se considera que el factor correspondiente es el influyente.
Figura 4. Rendimiento de la hidrlisis respecto a la temperatura

cin ms favorables en cuanto a hidrlisis de la inulina. Segn los anlisis realizados, se observaron diferencias notables en funcin del tipo de jugo de inulina utilizado. De forma que usando jugos de extraccin de inulina natural depurados, donde no existan restos de impurezas slidas y en los que el grado de degradacin de la inulina es mnimo, no se detecta HMF. En cambio, en el caso de la hidrlisis a partir de jugos de difusin sin depurar, el porcentaje de HMF obtenido es significativo, llegando hasta porcentajes prximos al 1%, lo cual afecta a la fermentacin posterior impidiendo el normal desarrollo de la misma. 4. Conclusiones A la vista de los resultados experimentales, la influencia del pH no es significativa dentro del intervalo considerado de 3,5 a 4,0. La seleccin del pH del medio viene dada por aspectos econmicos, principalmente, con una tendencia a un menor consumo de cido; y tcnicos: se maximiza la actividad de las levaduras encargadas de la fermentacin. El incremento bacteriano implica que los rendimientos de fermentacin se reduzcan de forma importante, reduciendo la cantidad de etanol producido, debido a que se desarrollan vas bacterianas secundarias que consumen los monosacridos o incluso utilizan en su desarrollo el producto de inters de la fermentacin: el etanol. De este modo, aparecen productos secundarios de bajo inters, generndose jugos de una mezcla compleja de compuestos ms difcil de depurar. Por tanto, se toma 4,0 como valor ptimo de pH del medio.

- Planificacin de la experimentacin de modo que se minimicen los efectos de los factores incontrolados. - Utilizacin del anlisis estadstico para la separacin y estimacin de los efectos de los diversos factores, as como de las interacciones entre los mismos: T-pH, T-t, pH-t y T-pH-t. - Optimizacin de los niveles de los factores en orden a obtener la mejor funcin objetivo. Partiendo de un conocimiento del mtodo, se aplica un diseo factorial completo de tres factores a dos niveles de acuerdo con la funcin objetivo. Se definen los factores que a priori se suponen influyentes: temperatura (T), el pH (pH) y el tiempo (t). En la Tabla II se asigna a cada uno de los factores dos niveles: mximo (+) y mnimo (-). Trabajando de este modo se consigue reducir el nmero de combinaciones posibles entre factores y, por tanto, el nmero de experimentos a 2k, siendo k el nmero de factores. Es necesario un anlisis experimental previo con repetitividad para calcular los errores residuales o aleatorios, de forma que el mtodo ofrezca una orientacin suficientemente valiosa sobre los factores ms influyentes.

De acuerdo con los resultados de la Tabla III, se observa que los factores temperatura (T) y tiempo (t) son los que tienen mayor influencia en la hidrlisis cida de la inulina. Basndose en la interrelacin de estas variables influyentes se puede determinar el ptimo de operacin en el proceso. Hidroximetilfurfural Es conveniente comprobar que no se produce hidroximetilfurfural (HMF) cuando se lleva a cabo el proceso de hidrlisis, ya que a temperaturas elevadas y pH cido se originan reacciones paralelas que llevan a su formacin. El HMF es un compuesto con carcter txico para el crecimiento y desarrollo de los microorganismos utilizados en la fermentacin. Esta situacin supone un problema tcnico y econmico dado que se producen problemas en el inicio de la fermentacin y/o paradas de fermentacin una vez iniciada, con la consecuente prdida del jugo fermentable. Esto significa que la seleccin definitiva de las condiciones ptimas de operacin depende de la posible generacin de HMF. As pues, se han obtenido medidas de HMF en las condiciones de operaTabla III. Factores y efectos Factor T pH t T-pH T-t pH-t T-pH-t Efecto 0,313 -0,018 0,314 -0,069 -0,138 0,037 0,088 Factor SC 0,393 0,001 0,393 0,019 0,076 0,005 0,031

Tabla II. Niveles mximos y mnimos Factores T, C pH t, min (-) 130 3.5 5 (+) 160 4.0 20

Varianza 0,393 0,001 0,393 0,019 0,076 0,005 0,031

Fcalc 1.048 3,29 1.050 50,2 203,6 14,3 81,9

Fcrt

7,57

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El tiempo de calentamiento y la temperatura de proceso son las variables ms influyentes en la hidrlisis cida de la inulina. Los mejores rendimientos se consiguen con menores tiempos a una temperatura mayor. Las condiciones ptimas de operacin son 20 min. y a 160 C, cuyo rendimiento es del 93%. Bajo estas condiciones de operacin, temperatura y tiempo de calentamiento, se produce la total eliminacin de los microorganismos presentes en el jugo, evitndose de este modo contaminaciones posteriores. Por ltimo, es necesaria una depuracin previa de los jugos de difusin antes de llevar a cabo el proceso de hidrlisis cida de la inulina. La presencia de impurezas en el medio durante el tratamiento trmico del jugo favorece la aparicin de HMF en el medio y, adems, se produce la carbonizacin de las partculas slidas presentes, lo que origina ensuciamiento e incrustaciones en las tuberas del sistema. 5. Bibliografa
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