Manual de Bacteriologia

Coleccin Textos Universitarios
Manual prctico
de bacteriologa clnica
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Manual prctico de
bacteriologa clnica
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!UTORIDADES5NIVERSITARIAS
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s Vicerrector Acadmico
Humberto Ruiz Caldern
s Vicerrector Administrativo
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Textos Universitarios
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6ICERRECTORADO
!CADMICO
Manual prctico de bacteriologa clnica
Primera edicin, 2008
Universidad de Los Andes
Vicerrectorado Acadmico,
CODEPRE
Judith Velasco, Mara del Carmen Araque, Emma Araujo,
Aurora Longa, Beatriz Nieves, Ana Carolina Ramrez, Kiral-
ba Snchez, Elsa Velazco.
s Concepto de coleccin
y diseo de portada
Katalin Alava
s Correcin de texto
Freddy Parra Jahn
s Diagramacin
Jilmor Gilson DINAMICA Art Design Studio
s Dibujos
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s Impresin
Editorial Venezolana C. A.
HECHO EL DEPSITO DE LEY
Depsito Legal: LF23720085891416
ISBN: 978-980-11-1157-3
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Los trabajos publicados en la
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han sido rigurosamente
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por especialistas en las
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Primera edicin digital 2011
Hecho el depsito de ley
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especialistas en las diferentes disciplinas

Las enfermedades infecciosas en los ltimos tiempos han mantenido un lugar pre-
ferencial en el rea mdica, sobre todo por la aparicin de enfermedades virales como
el SIDA y el resurgimiento de cuadros infecciosos que se crean controlados como la
tuberculosis. Por otra parte, el uso indiscriminado de antibiticos de amplio espectro
ha incrementado la resistencia a los antimicrobianos y la circulacin de cepas multirre-
sistentes en los ambientes hospitalarios, situacin que diculta el manejo de pacientes
hospitalizados.
Es por ello, que el clnico recurre al laboratorio de Microbiologa con el nico pro-
psito de obtener resultados conables y en el menor tiempo posible. En tal sentido, el
presente manual se ha diseado de manera que sirva de texto gua para los estudiantes
de Bioanlisis que cursan la asignatura Microbiologa clnica y aplicada e, igualmente,
de texto de consulta rpida de los profesionales del laboratorio de Microbiologa. Tie-
ne por objetivo mostrar los recursos y tcnicas convencionales para el diagnstico de
algunas de las enfermedades infecciosas ms frecuentes; se hace nfasis en los procedi-
mientos a seguir de acuerdo a la impresin clnica inicial, aislamiento, identicacin,
pruebas de susceptibilidad de los microorganismos involucrados, interpretacin y re-
porte de los resultados.
Las metodologas descritas se presentan en una forma clara y sencilla, su presenta-
cin grca en forma de guras a color facilita la comprensin global de las tcnicas utiliza-
das para el diagnstico microbiolgico.
La elaboracin del presente manual es producto del conocimiento y experiencia de
varios profesionales del rea de microbiologa adscritos al Departamento de Microbio-
loga y Parasitologa de la Facultad de Farmacia y Bioanlisis de la Universidad de Los
Andes.
Es importante mencionar, que en los ltimos aos se han desarrollado nuevas
tecnologas que escapan al objetivo de este manual, pero que pueden ser consultadas
en otras bibliografas especializadas.
Judith Velasco Carrillo
Prof. de la Ctedra de Bacteriologa
Prefacio
9
MANUAL PRCTI CO DE BACTERI OLOG A CL NI CA
prctica 1
Principios diagnsticos
de las enfermedades infecciosas
Objetivo general
Introducir al estudiante en la aplicacin de conocimientos tcnico-cientcos para
el diagnstico microbiolgico de las enfermedades infecciosas.
Objetivos especficos
1. Describir la importancia clnica y microbiolgica de las diferentes etapas que con-
forman el procesamiento microbiolgico de una muestra clnica y su relacin con
el xito o fracaso en el diagnstico de las enfermedades infecciosas.
2. Reforzar las destrezas prcticas adquiridas en Microbiologa general, en cuanto a la
realizacin de tcnicas de coloracin e inoculacin de medios slidos para aisla-
mientos primarios.
Aspectos tericos
El diagnstico de las enfermedades infecciosas se realiza sobre la base de los signos
y sntomas clnicos que presenta el paciente, los datos epidemiolgicos y la demostra-
cin del agente causal o las huellas que ste ha dejado en el sistema inmunolgico del
individuo. (1)
El papel del laboratorio de microbiologa clnica consiste en determinar la presen-
cia de patgenos potenciales en los tejidos, los lquidos corporales o las secreciones de
los pacientes, e identicarlos en caso de que estn presentes. Este servicio es indispen-
sable para el mdico tratante, porque la informacin acerca de la identidad del patgeno
10
PRCTICA 1 Principios diagnsticos de las enfermedades infecciosas
es de importancia primordial para predecir el curso de la infeccin y orientar o decidir
la conducta teraputica ms apropiada. Esta informacin puede obtenerse por medio de
cuatro formas posibles: (1,2)
- El cultivo y la identicacin de los microorganismos a partir de muestras clnicas.
- El examen microscpico de la muestra clnica.
- La medicin o cuanticacin de la respuesta inmune especca para el patgeno
en el paciente.
- La deteccin de molculas especcas de los patgenos en las muestras de los pa-
cientes.
La extensin y la conabilidad de la informacin que puede proporcionar el labo-
ratorio varan de acuerdo con la naturaleza del patgeno. Algunos de ellos son fciles de
detectar, cultivar, identicar y caracterizar (Escherichia coli); otros requieren medidas
extraordinarias tan slo para detectar su presencia (Helicobacter pylori). Sin embargo,
las capacidades del laboratorio de microbiologa clnica se estn ampliando y perfeccio-
nando aceleradamente, gracias a los avances tecnolgicos y cientcos en el campo de
la biologa molecular, han permitido introducir, cada vez ms rpido, nuevos mtodos
diagnsticos en la prctica clnica.
La principal conexin entre el mdico y el laboratorio de microbiologa clnica es
la muestra que se recolecta y se enva para su procesamiento.(1-3) Es por ello, que la
recoleccin correcta de una muestra clnica para su cultivo es la etapa ms importante
en el aislamiento exitoso de un microorganismo responsable de una determinada enfer-
medad infecciosa (Fig. 1).
11
Mara del Carmen Araque 1
Figura 1. Estudio microbiolgico de una muestra clnica
Tomado de: Mims y col., 1995
12
Una muestra decientemente recogida puede ser motivo de confusin al momento de
aislar el agente etiolgico. La recuperacin de grmenes contaminantes puede conducir a un
diagnstico microbiolgico equivocado y, en consecuencia, a la instalacin de una terapia
incorrecta, que en algunos casos puede agravar el cuadro clnico del paciente. Por otro lado,
se debe tener en cuenta que la piel y todas las supercies de las mucosas estn normalmente
colonizadas por una ora habitual. Sin embargo, con frecuencia estas supercies pueden ad-
quirir una ora transitoria o, incluso, ser colonizadas por patgenos potenciales provenien-
tes del medio ambiente. En consecuencia, se deben emplear procedimientos especiales que
permitan distinguir los verdaderos microorganismos implicados en un proceso infeccioso,
de aquellos provenientes de la ora saprta y/o de los que son colonizadores anormales
que no estn causando ninguna infeccin (Tablas 1 y 2).
TABLA 1. Algunos sitios de infeccin y sus posibles fuentes de
contaminacin con flora saprfita
Para orientarnos a resolver este problema debemos considerar lo siguiente: (1-4)
1. La obtencin de lquidos normalmente estriles (sangre, LCR, etc.) por aspiracin
con aguja percutnea debern ser precedidos siempre por una exhaustiva descon-
taminacin de la piel. Por lo tanto, se debern extremar los cuidados de asepsia y
antisepsia en aquellas reas normalmente contaminadas. El alcohol al 70% es satis-
factorio para la piel, sin embargo, debe dejarse actuar, por lo menos, 2 minutos. El
yodo (2%) y la povidona yodada son muy efectivos y de actividad rpida (1 minuto)
contra todos los microorganismos, incluso, los formadores de esporas.
2. Realizar cultivos cuantitativos que permitan determinar que el microorganismo ais-
lado es el responsable de la patologa infecciosa (contaje de colonias, Ej: uroculti-
vos). Una cuanticacin menos rigurosa puede ser adoptada como rutina, mediante
la implementacin de una escala que oscile entre 0 a 4 cruces, o simplemente,
expresar el desarrollo de microorganismos como crecimiento escaso, moderado o
abundante.
Sitio de infeccin Fuente de contaminacin
Vejiga Uretra y perineo
Sangre Sitio de puncin
Cuello uterino y endometrio Vagina
Fstula Tracto gastrointestinal
Odo medio Piel del conducto auditivo externo
Cornetes nasales Nasofaringe
Infecciones subcutneas y heridas superciales Piel y mucosas
Tracto respiratorio superior Cavidad oral y nasofarnge
13
3. Considerar la posibilidad de recolectar la muestra en forma seriada y evaluar los
cultivos de acuerdo al criterio anterior.
TABLA 2 . Muestras que no deben ser procesadas debido a su
cuestionable informacin microbiolgica
Normas bsicas para la recoleccin correcta de muestras biolgicas
1. La muestra para cultivo debe proceder, de ser posible, del verdadero sitio de la in-
feccin y deber recogerse con un mnimo de contaminacin de tejidos, rganos o
secreciones adyacentes.
2. Se establecern los perodos ptimos para la recoleccin de las muestras de acuer-
do al proceso natural de la enfermedad y del microorganismo posiblemente involu-
crado. Esto se realiza con la nalidad de aumentar las posibilidades de recuperar y
aislar el agente etiolgico.
3. Obtener la suciente cantidad de muestra para llevar a cabo todas las pruebas y
tcnicas de cultivo solicitadas.
4. Utilizar dispositivos de recoleccin, recipientes para las muestras y medios de trans-
porte adecuados para asegurar el ptimo aislamiento de los microorganismos.
5. Siempre que sea posible, se debern obtener las muestras clnicas antes de la admi-
nistracin de antibiticos.
6. El envase o los dispositivos de recoleccin de muestras clnicas debern estar co-
rrectamente rotulados y fechados.
Tipo de muestra no adecuada Alternativa o comentario
Exudados de heridas por quemaduras Biopsia o aspirado
Descarga de colostoma No procesar
Exudados de lceras de decbito Biopsia o aspirado
Punta de catter de Foley No procesar
Aspirado gstrico en recin nacidos No procesar
Loquios No procesar
Exudados de absceso perirectal Biopsia o aspirado
Exudado de lesin gangrenosa Biopsia o aspirado
Exudado de lesin periodontal Biopsia o aspirado
Exudado de lesin varicosa Biopsia o aspirado
Vmitos No procesar
14
Factores que influyen en el aislamiento de microorganismos
- Localizacin del proceso infeccioso.
- Tcnica y material utilizado para colectar la muestra.
- Medio de transporte en el cual la muestra es colocada.
- Tiempo transcurrido entre la toma de muestra y su procesamiento en el laboratorio.
Transporte de muestras biolgicas
El principal objetivo del transporte de muestras clnicas dentro y fuera de un hos-
pital, es la preservacin del material biolgico lo ms semejante a su estado original,
con un mnimo de deterioro y sin riesgos de contaminacin para quien manipula estas
muestras (Tabla 3).
TABLA 3. Sistemas de transporte y condiciones
de almacenamiento de muestras*
* Condiciones de almacenamiento mximo por 24 horas.
En la actualidad se dispone de una variedad de recipientes para la recoleccin y
transporte de muestras clnicas tales como: placas de Petri, jeringas y agujas para as-
piracin, tubos o viales con medio de transporte, sistema de tubo plstico con medio
Condiciones de almacenamiento
4C 25C
Sistema de
transporte
Tejido de autopsia, lavado bronquial,
catter endovenoso, uido pericrdi-
co, esputo, biopsia de pulmn, orina,
muestras con sospecha de agentes vi-
rales.
LCR, lquido sinovial, lquido pleural,
lquido asctico, agentes bacterianos.
Sin preservar
Lquido abdominal, lquido amnitico,
lquido biliar, aspirado transtraqueal,
material profundo de heridas, aspirado
sinusal, biopsia, orina, aspirado supra-
pbico.
Transporte para
anaerobios
Muestras inoculadas
directamente en el
medio de cultivo
Raspado corneal, hemocultivo, secre-
cin uretral y humor vtreo.
Medio de
transporte

Tejido seo, hisopado cervical, hiso-
pado conjuntival, secrecin de odo
externo, hisopado vaginal, hisopado
nasofarngeo, exudado de tracto respi-
ratorio superior.
Biopsia de heridas, secrecin de odo
externo, muestras de heces en donde
se sospecha la presencia de Shigella
sp., Vibrio sp. y Yersinia sp.
15
de transporte e hisopo para bacterias aerobias y anaerobias (Culturette System
R
BBL),
sistema de bolsas biolgicas para bacterias microaerlas estrictas y anaerobios (Pouch
System
R
Difco), entre otras. Sin embargo, el equipo de recoleccin de muestras ms
utilizado es el hisopo de madera con punta de algodn, alginato o dacrn. La seleccin
del tipo de hisopo estar determinada de acuerdo al microorganismo en sospecha en la
muestra clnica. Una vez recolectada la muestra, el hisopo es introducido en el medio
de transporte. Este procedimiento suministrar la humedad suciente a la muestra hasta
por 72 horas.
Los medios para el transporte de muestras ms utilizados y que permiten la viabi-
lidad de la mayora de los patgenos son: el medio de Stuart, Cary-Blair y el de Amies.
Estos medios semislidos tienen un ph regulado y son esencialmente una mezcla de sus-
tancias tamponadas que carecen de factores de crecimiento. Se les adiciona un agente
reductor como el tioglicolato de sodio para mejorar la recuperacin de bacterias anaero-
bias. En otros casos, se aconseja agregar borato de sodio para preservar el transporte de
muestras donde se sospecha la presencia de micobacterias.
Es importante destacar que aunque los hisopados son la forma ms comnmente
utilizada para el envo de muestras, se preere que la muestra sea enviada en la mayor
cantidad posible (una jeringa o en un vial), de manera que se pueda garantizar su pro-
cesamiento para la mayor cantidad estudios y tcnicas bacteriolgicas. Asimismo, si se
sospecha que los microorganismos son escasos, cuanto mayor sea la muestra, mejores
sern las probabilidades de aislar el patgeno involucrado.(5)
En los captulos subsiguientes que conciernen a la actividad prctica de labora-
torio, se describen los mtodos de recoleccin y el manejo de las muestras clnicas de
acuerdo al proceso infeccioso y al rea anatmica involucrada.
Procesamiento de las muestras clnicas
Toda muestra que se recibe en el laboratorio de microbiologa se debe examinar
visualmente o microscpicamente a n de evaluar si es adecuada para su posterior pro-
cesamiento. Si hay evidencia de que la muestra ha sido recogida incorrectamente, si
hay cantidad insuciente de material, si el recipiente es inadecuado o si hubo excesiva
demora en el envo, se debe recomendar la recogida de una segunda muestra.
El examen microscpico de las muestras clnicas es de gran importancia. No slo
puede convalidar la calidad de las muestras, sino tambin, identicar algunos patgenos
por sus caractersticas morfolgicas, movimientos o propiedades de tincin particular.
En ciertas infecciones el diagnstico microscpico es altamente sensible y espec-
co (Tabla 4). Tambin representa una tcnica rpida que permite que el mdico inicie un
tratamiento sin tener que esperar los resultados del cultivo.
16
TABLA 4 Muestras clnicas y examen directo
El examen en fresco de materiales clnicos sin colorear, por microscopa de contras-
te de fase o campo oscuro, es til para demostrar la presencia y movilidad de bacterias
como las espiroquetas (Treponema pallidum). Muchos patgenos fngicos tambin tienen
aspectos morfolgicos caractersticos. De manera notable, la meningitis por Cryptococcus
neoformans se diagnostica con mayor rapidez por el hallazgo de la levadura encapsulada en
lquido cefalorraqudeo. Mediante la tincin de fondo con tinta china se visualiza la cpsula
transparente de la levadura. Si bien los virus no pueden verse con el microscopio ptico,
los cambios inducidos por ellos en la morfologa de las clulas hospederas pueden ser diag-
nsticos. Ejemplos de ello son las clulas gigantes multinucleadas observadas en el material
Difteria.
Azul de metileno de
Lefer Exudado farngeo
Muestra clnica Impresin diagnstica Examen directo
Faringitis o faringoamigdalitis bacteriana. Gram
Angina de Vincent. Gram Ulceras orofarngeas
Bronconeumona o neumona bacteriana.
Tuberculosis.
Micosis pulmonar.
Gram
Ziehl Neelsen
Azul de Lactofenol
Esputo aspirado
transtraqueal
Lavado bronquial
Celulitis bacteriana, furunculosis. Heridas qui-
rrgicas infectadas, lceras de decbito, entre
otras. Mionecrosis.
Micetoma.
Gram
Solucin Salina.
Heridas cutneas
o secreciones
purulentas de
piel o mucosas
Kinyoun
Azul de Lactofenol
Infeccin urinaria bacteriana.
Leptospirosis.
Gram
Tinta china
Lquido
cefalorraqudeo
Meningitis bacteriana.
Meningitis criptocccica.
Gram
Campo oscuro
Orina
Gram
Giemsa
Al fresco o
Azul de lactofenol
Secrecin uretral o
cervical purulenta
Gonorrea.
Infeccin no gonoccica.
Candidiasis.
Campo oscuro
Exudado de lcera
en genitales
(chancro)
Slis.
Gram
Giemsa
Secrecin ocular o
raspado corneal
Conjuntivitis purulenta.
Tracoma.
KOH al 40%
Azul de lactofenol
Raspados de piel,
fragmentos de
uas o pelos
Dermatotosis.
Pitiriasis versicolor.
Candidiasis.
TABLA 4. Muestras clnicas y examen directo
17
de raspado de las lesiones producidas por el virus herpes simple o el virus de la varicella
zoster (frotis de Tzanck) y los cuerpos de inclusin intracelular especcos observados en
los tejidos activamente infectados por citomegalovirus.
Los patgenos bacterianos pueden ser visualizados y agrupados de forma morfo-
lgica y funcional utilizando tinciones especiales como la de Gram o la coloracin de
Ziehl Neelsen.
La tincin de Gram es rpida y simple de llevar a cabo y puede emplearse en casi
todos los lquidos o tejido corporal (el fundamento y los pasos de la tincin pueden con-
sultarse en el Manual prctico de microbiologa general). Esta tincin proporciona tres
tipos de informacin bsica:
- Puede conrmar la presencia de bacterias en un lquido o tejido corporal normal-
mente estril (LCR, sangre, entre otros).
- Las propiedades tintoriales y la morfologa de los microorganismos en la muestra
o en el cultivo permiten establecer las estrategias de identicacin denitiva del
patgeno y la seleccin de los antibiticos a probar en el antibiograma.
- La observacin de algunos tipos morfolgicos puede ser diagnstica en algunos
casos por ejemplo; diplococos gramnegativos intracelulares en polimorfonucleares
en muestras de secrecin uretral es altamente sugestivo de Neisseria gonhorroeae.
Las micobacterias poseen una pared celular gruesa y cerosa, de manera que cuando
son teidas, por ejemplo, con la coloracin de Ziehl Neelsen, estas son resistentes a la
decoloracin al someterse al tratamiento con potentes solventes orgnicos tales como
el alcohol cido. En consecuencia, los microorganismos que tienen esta propiedad se
llaman acidorresistentes. Un ejemplo caracterstico de este grupo de bacterias son las
pertenecientes al gnero Mycobacterium.
Aislamiento e identificacin bacteriana por mtodos convencionales
El crecimiento e identicacin del agente etiolgico in vitro casi siempre es el re-
curso diagnstico ms sensible y especco, y por eso es el mtodo ms usual. Casi todas
las bacterias de importancia mdica pueden cultivarse fuera del hospedador, en medios
articiales de cultivo.
Las muestras destinadas al cultivo de microorganismos se pueden dividir en dos
tipos, segn su procedencia de sitios estriles o de lugares normalmente contaminados
con ora saprta. Es importante tener un conocimiento profundo de los microorga-
nismos aislados comnmente en muestras clnicas no estriles y de los contaminantes
frecuentes en muestras provenientes de sitios estriles, para asegurar que todas esas
muestras sern tratadas adecuadamente y los resultados interpretados correctamente.
18
Es posible cultivar la mayora de las especies de bacterias y hongos de importancia
clnica en medios articiales, pero no existe un medio de cultivo universal que permita
el crecimiento de todas ellas, y hay algunas especies que slo pueden cultivarse en ani-
males de experimentacin (Mycobacterium leprae y Treponema pallidum). Otras bacte-
rias son imposibles de cultivarlas en medios articiales (Chlamydia sp. y Rickettsia sp.)
pero se desarrollan muy bien en lneas celulares.
Una vez que se detecta el crecimiento bacteriano en un medio de cultivo para aisla-
miento inicial o primario, debe determinarse la importancia real de la bacteria que se ha
aislado. Luego, se continuar con el proceso de obtener cultivos puros a partir de colonias
aisladas y la aplicacin de pruebas diseadas para la caracterizacin e identicacin de-
nitiva de la bacteria. Las pruebas exactas y la estrategia metodolgica a seguir varan con
los distintos grupos bacterianos, y el nivel taxonmico (gnero, especie o subespecie) de
identicacin requerido estar en relacin con la utilidad o importancia clnica que se le d
a esa informacin. En la seccin de anexos se describen las pruebas claves requeridas para
identicar los principales grupos y especies bacterianas de importancia mdica.(2-5)
Los mtodos convencionales para la identicacin de los microorganismos se fun-
damentan principalmente en:
1. Pruebas bioqumicas: evalan la capacidad metablica de un microorganismo rela-
cionado con:
- Los sustratos que puede utilizar la bacteria para crecer (hidratos de carbono, ami-
nocidos, entre otros).
- Las enzimas que posee la bacteria (descarboxilasas, ureasas, peroxidasas, entre otras).
- Los productos metablicos producidos por las bacterias (cido frmico, succnico,
butrico, entre otros).
- La capacidad para metabolizar azcares por oxidacin o fermentacin.
- La capacidad de reducir ciertos iones (ferroso a frrico).
- La capacidad de movilidad por la presencia de agelos.
- La produccin o no de hemolisinas.
- El requerimiento o no de ciertos factores especiales para el crecimiento bacteria-
no (vitamina K, isovitalex, factor V y/o X, entre otros).
- La produccin o no de algunas toxinas con capacidad virulenta.
2. Pruebas de tolerancia: se reere a la capacidad que pueda tener la bacteria para crecer
a distintos tipos de temperaturas, atmsfera, pH, sales presentes en el medio, antibiti-
cos, entre otras.
Existen mtodos que utilizando los fundamentos del diagnstico convencional se
han diseado para proporcionar resultados rpidos. Entre los ms conocidos tenemos:
19
- Sistema API: es, entre los sistemas de identicacin ms rpidos, el ms conocido.
Posee un gran nmero de pruebas bioqumicas, las cuales se presentan como sustratos
liolizados en una galera de pozos y se requiere slo de un inculo estandarizado a
partir de cultivos puros y frescos, y un tiempo de incubacin posterior que depende
de la galera de pruebas que se haya escogido. La identicacin se realiza partiendo de
un sistema de cdigos que se introducen en una computadora cargada con un software
especco y que identica la bacteria mediante un banco de datos.
- Sistema Sens-Ident: este sistema utiliza placas de microtitulacin y en sus pocillos
tienen sustratos liolizados. Este sistema tambin utiliza un inculo estandarizado. Re-
quiere de un tiempo mnimo de incubacin (16 a 18 h) y la lectura se realiza mediante
un lector automatizado.
- Sistema VITEK: el sistema VITEK consta de un mdulo de vaco-sellador, un incuba-
dor-lector, un computador, el monitor y la impresora. Permite identicar bacterias hasta
en 3 horas. Se utilizan sustratos liolizados y se requiere de un inculo estandarizado,
y es en los mdulos del equipo donde se realiza el llenado y sellado de las tarjetas, la
incubacin y la lectura. El software proporcionado con el computador es el que analiza
las lecturas en cada una de las tarjetas comparndolas con una base de datos, generan-
do de esta forma el resultado de acuerdo con el teorema de Bayes.
- Sistema MicroScan: este sistema consiste en placas plsticas de microtubos, que llevan
incorporados sustratos reactivos para la identicacin de bacterias aerobias, anaero-
bias y levaduras. Algunas placas tambin incluyen microdilucin en caldo de ciertos
antibiticos, lo que permite realizar estudios de sensibilidad. Las placas o paneles de
MicroScan contienen sustratos y antibiticos deshidratados. Los microtubos son ino-
culados con una suspensin del microorganismo estandarizado e incubados a 36
0
C por
15 a 18 horas, despus de este perodo puede realizarse una lectura en forma visual a
los paneles o usar un sistema automatizado de lectura. En este ltimo caso, el equipo
detecta el crecimiento bacteriano o los cambios de color suscitados en los microtubos
por diferencias en la transmisin de luz. Las diferencias en las pulsaciones electrnicas
son analizadas automticamente por un microcomputador que compara los patrones
de reaccin con un programa interno para determinar la probabilidad de identica-
cin.
Mtodos no convencionales para el diagnstico microbiolgico
Inmunodiagnstico. Tambin conocido como serologa diagnstica. Se utilizan prue-
bas que permiten la interaccin antgeno anticuerpo para diagnosticar enfermedades infec-
ciosas, as como para identicar microorganismos. En el caso de que se realice el diagnstico
de infeccin en el hospedero susceptible, este mtodo basado en la serologa presenta una
desventaja, que es su carcter retrospectivo, ya que deben transcurrir de 2 a 4 semanas an-
20
tes de que puedan detectarse en el suero del paciente las IgG producidas como respuesta a
la infeccin. Por otra parte, un resultado positivo slo indica que el paciente ha estado en
contacto con la infeccin en algn momento del pasado. Sin embargo, las IgM se pueden
detectar en perodos ms tempranos de la infeccin (7-10 das), indicando infeccin activa.
En este contexto, es importante destacar que la respuesta inmunolgica observada en un
paciente depender de la integridad de su sistema inmunolgico. El inmunodiagnstico es
el principal mtodo utilizado para el diagnstico de laboratorio de enfermedades virales.
Las pruebas para la deteccin de antgenos son como pruebas serolgicas inver-
tidas, en lugar de emplear antgenos microbianos para capturar los anticuerpos espe-
ccos en el suero de un paciente, en este caso se emplean anticuerpos de captura
para detectar en las muestras clnicas antgenos especcos del microorganismo. En la
mayor parte de estas pruebas los anticuerpos de captura se encuentran unidos a un
soporte slido, tal es el caso del uso de bolitas de ltex recubiertas con anticuerpos espe-
ccos (aglutinacin con ltex) para detectar el material capsular de los meningococos,
Streptococcus pneumoniae, Haemophilus inuenzae y Cryptococcus neoformans, entre
otros (Fig. 2). En muchas ocasiones, este panel de pruebas es utilizado en muestras de
lquido cefalorraqudeo para establecer el diagnstico precoz de meningitis.(1,4,5)
Las pruebas serolgicas usadas ms frecuentemente en el laboratorio para el diag-
nstico de enfermedades infecciosas son:
- Precipitacin - Inhibicin de la hemaglutinacin
- Aglutinacin - Fijacin de complemento
- Hemaglutinacin - Tcnicas de anticuerpos uorescentes
- ELISA
Tomado de Mims y col., 1995
Figura 2. Prueba de aglutinacin con ltex
21
Mtodos moleculares de diagnstico en enfermedades infecciosas. El uso de la
biologa molecular para el diagnstico y seguimiento de las enfermedades infecciosas se
basa en las caractersticas de los cidos nucleicos como cdigos nicos de identicacin
de todo ser viviente.
El primer paso en el desarrollo de metodologas basadas en tcnicas de biologa mo-
lecular se sustent en la deteccin de los cidos nucleicos del microorganismo mediante
una sonda. La sonda gentica es una molcula de cido nucleico que, una vez en estado
monocatenario y marcada, se puede usar para detectar una secuencia complementaria de
ADN hibridndola con ella. Las sondas de oligonucletidos se obtienen a partir de ADN
natural, mediante clonacin de fragmentos de ADN en vectores plsmidos apropiados
y aislando posteriormente el ADN clonado. Sin embargo, si se conoce la secuencia del
gen que interesa, es posible sintetizar la sonda especca que corresponde. Las sondas
se pueden marcar con istopos radiactivos o con sustancias que produzcan reacciones
de color en condiciones adecuadas.(5-7)
La construccin de sondas de virulencia como las toxinas, permite detectar los or-
ganismos que portan esos genes en las muestras clnicas, sin necesidad de cultivarlos.
Un ejemplo de ello, es la sonda para las enterotoxinas de Escherichia coli o para la toxi-
na de Vibrio cholerae, las cuales se pueden aplicar directamente en muestras de material
fecal.
En la actualidad el desarrollo de sondas comerciales para el diagnstico de enfer-
medades infecciosas va en aumento, pero la deteccin de un pequeo nmero de orga-
nismos o pocas copias de gen en la muestra clnica es un factor limitante en esta tcnica.
Sin embargo, la combinacin de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (RCP) con la
hibridacin con sondas puede convertirse en el mtodo de eleccin, especialmente para
microorganismos cuyo cultivo en el laboratorio resulta lento o difcil.(6,7)
La RCP es una tcnica de amplicacin que permite detectar y replicar en forma
selectiva una porcin determinada del genoma. La tcnica usa polimerasas de ADN
especiales que pueden manipularse mediante cambios alternos en las condiciones de
prueba (temperatura) para que se inicie la replicacin en direccin 3 o 5. La especici-
dad la establecen los cebadores que reconocen sitios especcos en la cadena de ADN,
de tal forma que el segmento intermedio entre los cebadores puede replicarse mediante
ciclos repetidos de las condiciones de prueba. Cada fragmento recin sintetizado sirve
como molde para su propia replicacin, por lo tanto, la cantidad de ADN se duplica en
cada ciclo (Fig. 3).
Otras tcnicas moleculares utilizadas en el diagnstico de enfermedades infeccio-
sas son:
- Ribotipicacin
- PCR ngerprinting
22
- Polimorsmo de longitud de fragmentos de restriccin RFLP
- Oligotipicacin
1 Actividad prctica
1. Realizar la tincin de Gram en frotis de muestras clnicas asignadas a cada equipo de
trabajo.
2. Observar e interpretar los frotis coloreados.
3. A partir de las muestras clnicas asignadas a cada equipo de trabajo, los estu-
diantes realizarn la inoculacin de las mismas en medios de cultivo slidos
para aislamiento primario.
4. En el segundo perodo de prctica, el estudiante evaluar e interpretar los re-
sultados obtenidos en los cultivos primarios.
Figura 3. Amplicacin del ADN mediante la reaccin en cadena de la polimerasa
Tomado de: Engleberg NC., 1994
23
Autoevaluacin
1. Por qu se considera importante conocer la ora habitual del organismo en el mo-
mento de realizar estudios microbiolgicos?
2. Existen circunstancias en las que la ora habitual se convierte en patgena?
3. Cules consideraciones previas deberan tenerse en cuenta a la hora de realizar la
toma de una muestra clnica?
4. Cul es la importancia estratgica que tiene el examen directo al momento de pro-
cesar una muestra clnica?
5. Cul es el fundamento de las pruebas convencionales en el diagnstico de enfer-
medades infecciosas?
6. Cules son las ventajas y desventajas que tienen los mtodos no convencionales en
el diagnstico de las enfermedades infecciosas?
Bibliografa
(1) Drew LW., Cockerill FR, Henry NK. In: Wilson Wr, Sande MA. Current. Diagnosis &
treatment in infectious diseases. International Edition. United States: McGraw-Hill
Companies; 2001. p. 43-64.
(2) Engleberg NC. Principios diagnsticos. En Schaechter M, Medoff G, Eisenstein BI, Guer-
ra H. Mecanismos de las enfermedades infecciosas. 2 ed. Argentina: Editorial Mdica
Panamericana; 1994. p. 691-708.
(3) Mims CA, Playfair JHL, Roitt IM, Wakelin D, Williams R, Anderson RM. Microbiologa
mdica. Espaa: Mosby/Doyma; 1995. p. 17.1-18.15.
(4) Murray PR, Rosethal KS, Kobayashi GS, Pfaller MA. Microbiologa mdica. 4 ed. Es-
paa: Mosby Elsevier Science; 2002. p. 153-170.
(5) Montiel F, Lam M. Seleccin, recoleccin y transporte de muestras para el estudio mi-
crobiolgico. En Montiel F, Lam M. Manual de microbiologa clnica. Chile: Publicacio-
nes Tcnicas Mediterrneo; 2001. p. 17-52.
(6) Podest O, Sturba E, Casimir L. Mtodos moleculares de diagnstico y seguimiento. En
Stamboulian D. Temas de infectologa clnica. Colombia McGraw-Hill Interamericana;
2002. p. 139-58.
(7) Ryan KJ, Ray, CG. Principios de diagnstico por laboratorio de las enfermedades infec-
ciosas. En Ryan KJ, Ray CG. Sherris Microbiologa mdica. 4 ed. Mxico: McGraw-Hill
Interamericana; 2004. p. 251-82.
25
prctica 2
Prueba de susceptibilidad antimicrobiana

Objetivo general
Determinar la importancia clnica y microbiolgica de las pruebas de susceptibilidad.
1. Elaborar correctamente un antibiograma de acuerdo al mtodo de difusin del disco.
2. Conocer los criterios que permiten la escogencia adecuada de los discos de antibi-
ticos a probar en un antibiograma.
3. Interpretar y elaborar correctamente el reporte de un antibiograma.
Aspectos tericos
El aislamiento e identicacin de un agente infeccioso a partir de una muestra
clnica proveniente de un paciente, no es suciente para impartir una terapia antiinfec-
ciosa adecuada. Actualmente, numerosos microorganismos han desarrollado mltiples
mecanismos que les permiten resistir a la accin de los ms nuevos y potentes agentes
antimicrobianos.
Como no se puede predecir la susceptibilidad de las bacterias a los antimicrobia-
nos, en la actualidad se dispone de varios mtodos para determinar el patrn de suscep-
tibilidad de una bacteria a los antibiticos. Entre los mtodos ms utilizados podemos
mencionar: (1)
1. Mtodo de difusin del disco en agar (prueba de Kirby-Bauer).
2. Antibiograma ATB Rapid (bioMrieux).
3. Mtodo de dilucin en caldo o en agar (Concentracin Inhibitoria Mnima [CIM]).
4. Mtodo de la cinta o Epsilmetro Etest
R
(AB BIODISK).
26
PRCTICA 2 Prueba de susceptibilidad antimicrobiana
Otro aspecto importante que se debe tener en cuenta en la realizacin de las pruebas
de susceptibilidad, es la eleccin correcta de los antibiticos a probar. A continuacin
se sealan algunos criterios que pueden ayudar a seleccionar adecuadamente dichos
agentes: (1-3)
1. Microorganismo aislado.
2. Mecanismo de accin del antibitico.
3. Espectro de accin del antibitico.
4. Biodisponibilidad del antibitico en rganos y sistemas (localizacin de la infeccin).
5. Origen o fuente de la infeccin (hospitalaria o extrahospitalaria).
6. Estados siolgicos del paciente (edad, embarazo, entre otros).
7. Estados patolgicos subyacentes (inmunosupresin, tratamiento previo con anti-
biticos, insuciencia renal o heptica, entre otros).
La prescripcin de algunos medicamentos est sujeta en muchas ocasiones a fac-
tores o circunstancias inherentes al hospedero. Los antibiticos no son la excepcin. Es
por ello, que el microbilogo deber conocer las restricciones que tiene el uso clnico de
algunos antibiticos, con el n de elaborar pruebas de susceptibilidad que proporcionen
una valiosa informacin. A continuacin, se muestran algunos de los casos en los que el
uso clnico de los antibiticos debe evitarse:
TABLA 5. Circunstancias en las que el uso de algunos
antibiticos est contraindicado
El reporte de los resultados de una prueba de susceptibilidad bien realizada, es un
instrumento que le permitir al clnico elaborar un plan antibacteriano ecaz contra el
Embarazo Insuciencia heptica Insuciencia renal Neonato
Cloranfenicol
Colistina
Dapsona
Nitrofurantoina
Sulfonamidas
Tetraciclinas
Rifampicina
Metronidazol
Vancomicina
Aminoglucsidos*
Cloranfenicol
Isoniacida
Piracinamida
Rifampicina
Tetraciclinas
Cloranfenicol
cido nalidxico
Nitrofurantona
Tetraciclina
Vancomicina
Aminoglucsidos
Cloranfenicol
Clindamicina
Quinolonas
Sulfonamidas
Aztreonam
Tetraciclinas
Vancomicina
* Si se indican, deben vigilarse los niveles sricos.(4)
27
patgeno, seleccionando la droga menos txica para el paciente, y con las caractersticas
farmacocinticas ms apropiadas segn la naturaleza y gravedad de la infeccin.(4)
Fuentes de error ms comunes en la realizacin de un antibiograma
1. Falta del control de calidad de los medios de cultivo a utilizar, patrn de McFar-
land y los discos de antibiticos.
2. Trabajar con cepas bacterianas que no estn puras.
3. Inadecuada estandarizacin de la concentracin del inculo.
4. Utilizacin de un nmero excesivo de discos de antibiticos por placa.
5. Utilizacin de medios de cultivo no aptos para las pruebas de susceptibilidad.
6. Lectura prematura o extempornea de las pruebas de susceptibilidad.
7. Medicin incorrecta de los halos de inhibicin por una iluminacin deciente o
reglilla inadecuada.
8. Incubacin en atmsfera inadecuada.
9. Error en la transcripcin de los resultados en la hoja de reporte.
2 Actividad prctica
El antibiograma
El mtodo utilizado con mayor frecuencia para evaluar la sensibilidad de las bacte-
rias a los agentes antimicrobianos es el denominado prueba de difusin del disco. Esta
tcnica fue estandarizada por Kirby y Bauer en 1966, de all que dicho mtodo tambin
se le conozca con el nombre de prueba de Kirby-Bauer. Es un mtodo sencillo y fcil
de realizar en los laboratorios de rutina que slo brinda informacin cualitativa o semi-
cuantitativa sobre la sensibilidad de un microorganismo a un antibitico determinado.
Sin embargo, los resultados obtenidos son de gran valor clnico para iniciar, mantener o
modicar una antibioticoterapia.(1-3, 7)
Materiales
- Placas con agar Mueller Hinton
- Solucin salina estril
- Patrn 0.5 del estndar de McFarland
- Pinzas
- Asa de platino
- Discos de antibiticos
- Regla milimetrada
- Tablas de los criterios estandarizados
del CLSI.
- Hisopos estriles
28
Procedimiento
1. Cepa bacteriana a estudiar: Debe provenir de un cultivo fresco, preferiblemente de
un cultivo en agar, de manera que podamos comprobar la pureza de la cepa.
2. Inculo: Se transferirn una o dos colonias del cultivo a un tubo que contenga so-
lucin siolgica estril. En el caso de bacterias exigentes (Ej: especies de Haemo-
philus, especies de Streptococcus, etc.), las colonias se transferirn a un tubo que
contenga caldo Mueller Hinton. En cualquiera de los casos, el crecimiento bacteria-
no se ajustar a la turbidez del patrn 0.5 del estndar de McFarland.
3. Se introducir un hisopo de algodn estril dentro del tubo que contiene el inculo
estandarizado en el paso anterior. El exceso de lquido se eliminar haciendo rotar
suavemente el hisopo contra las paredes del tubo.
4. Con el hisopo debidamente humedecido, se inocular en tres o cuatro direcciones
toda la supercie de una placa con agar Mueller Hinton, girando sucesivamente
dicha placa en ngulos de 90
0
. Se deja secar el inculo a temperatura ambiente du-
rante algunos minutos (no ms de 20 minutos).
Nota: El agar Mueller Hinton se suplementar con 5% de sangre de carnero en los
casos que se est estudiando la sensibilidad en especies de Streptococcus o Corynebac-
terium. En cepas de Neisseria y Haemophilus se tendrn en cuenta las recomendaciones
del Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI, 2007).
Nunca utilice agar sangre, agar chocolate, agar tripticasa soya, agar nutriente, agar
Luria Bertani, BHI entre otros, para la realizacin de antibiogramas convencionales.
5. Se colocarn con una pinza estril hasta un mximo de 6 discos de antibiticos en
forma equidistantes, presionndolos suavemente contra la supercie de agar.
6. Se colocarn las placas a 36
0
C, en atmsfera aerbica durante toda la noche.
7. Lectura: Se realizar despus de 18 horas de incubacin. Con una regla milimetra-
da, se medir la zona clara alrededor del disco de antibitico, el cual se correspon-
de con la inhibicin del crecimiento bacteriano. Estos datos se compararn con los
dimetros de zona establecidos para cada antibitico en las tablas de interpretacin
internacional.(6) La interpretacin de los halos de inhibicin nos permitirn expre-
sar los resultados como sensible, sensibilidad intermedia o resistente. Estas catego-
ras indican lo siguiente:
- Sonsiblo (S}: la infeccin debida al microorganismo aislado puede ser tratada apro-
piadamente con el antibitico a la dosis recomendada, de acuerdo a la gravedad
de la infeccin. Sin embargo, para la prescripcin denitiva del medicamento, el
29
mdico tratante tendr en cuenta algunos factores tales como biodisponibilidad del
antibitico en el tejido o sistema afectado, presentacin del medicamento, edad del
paciente, condiciones patolgicas subyacentes o siolgicas, entre otras.
- Intormodiu (I}: indica que el antibitico tiene aplicabilidad clnica en sitios corpo-
rales donde el antibitico alcance concentraciones teraputicas adecuadas, como es
el caso de -lactmicos y quinolonas en el tracto urinario. En otros casos, puede uti-
lizarse el medicamento con seguridad en dosis elevadas que no alcancen los niveles
de toxicidad pero que garanticen actividad teraputica. Sin embargo, es recomenda-
ble evitar el uso de la categora intermedia cuando sea posible.
- Rosistonto (R}: la bacteria aislada no es inhibida por el antibitico a las concentra-
ciones teraputicas ideales o la bacteria ha generado mecanismos de resistencia que
evaden la actividad del antibitico, por lo tanto, la ecacia clnica de ste no es con-
able. Es recomendable que ante el aislamiento de un microorganismo multirresis-
tente clnicamente signicativo se ensayen otras pruebas de susceptibilidad adicio-
nales (CIM), tal es el caso de cepas de Staphylococcus resistentes a la vancomicina.
8. El reporte de los resultados del antibiograma debe ser realizado en forma clara y
precisa y enviados en forma inmediata al mdico tratante.
Utilice la siguiente tabla para registrar los resultados obtenidos en el antibiograma:
Microorganismo aislado: ________________________________________________________
Disco de antibitico
Dimetro en
milmetros
Interpretacin
Observaciones: __________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
Autoevaluacin
1. De acuerdo a los datos suministrados por el profesor y los registrados en la tabla
anterior, elabore el reporte del antibiograma:
30
2. Cul es la nalidad de las pruebas de susceptibilidad?
3. Que signica sensibilidad y resistencia cuando se interpreta un antibiograma?
4. En que casos, las pruebas de susceptibilidad requerirn de medios de cultivos dis-
tintos al de Mueller Hinton?
Bibliografa
(1) Baquero E. El antibiograma: bases microbiolgicas para su interpretacin. [serie en l-
nea] disponible en http//www.OCENETmedicinaysalud.com. Cdigo de documento:
1015491.
(2) Cona E. Condiciones para un buen estudio de susceptibilidad mediante test de difusin
en agar. Rev Chil Infect 2002; 19 (Supl.2): S77-81.
(3) Garca JA, Cantn R, Garca JE, Gmez-Lus ML, Martnez L, Rodrguez-Avial C, Vila J.
Mtodos bsicos para el estudio de la sensibilidad a los antimicrobianos 2000. [serie en
lnea] disponible en http://www.seimc.org/protocolos/cap11.htm#A.
(4) Linares N.C., Devoto F.M., Estrn M.A., Serra H.A., Tessler J. Quimioantibioticoterapia.
2 ed. Argentina: Editor Luis Mara Zieher; 2002.
(5) Martnez-Martnez L. El futuro de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos.
Enferm Infecc Microbiol Clin 2003; 21 (supl. 2): 64-71.
(6) Clinical Laboratory Standards Institute CLSI (formerly National Committee Laboratory
Standards NCCLS). M2-A5 Performance standards for antimicrobial disk susceptibility
test. Approved Standard. NCCLS, Wayne. 17 (17), 2007.
31
prctica 3
Diagnstico microbiolgico de las infecciones
del tracto respiratorio superior
Kiralba Snchez
Objetivo general
Desarrollar la estrategia metodolgica para el diagnstico microbiolgico de infec-
ciones del tracto respiratorio superior
1. Reconocer los microorganismos de la ora habitual y los principales patgenos del
tracto respiratorio superior.
2. Esquematizar los pasos para la obtencin y procesamiento de muestras del tracto
respiratorio superior.
3. Obtener y procesar muestras de exudado farngeo y secrecin nasal.
4. Identicar los patgenos implicados en procesos infecciosos del tracto respiratorio superior.
5. Detectar la presencia de eosinlos en moco nasal.
6. Registrar y reportar los resultados.
Aspectos tericos
El tracto respiratorio (TR) est en contacto directo con el medio ambiente y se en-
cuentra expuesto continuamente a los microorganismos suspendidos en el aire que res-
piramos. El aparato respiratorio est divido anatmicamente en superior (TRS) e inferior
(TRI). EL TRS comprende: la boca, fosas nasales, orofaringe, nasofaringe y senos parana-
sales. Otra clasicacin incluye al odo medio por la comunicacin estrecha que existe
entre ste y la nasofaringe a travs de la trompa de Eustaquio, sin embargo, los procesos
infecciosos de odo medio sern considerados en un captulo separado.(1)
Diversos mecanismos no especcos protegen el tracto respiratorio de las infec-
ciones, entre ellos, se sealan: los pelos, pasaje contorneado, mucus, inmunoglobulina
32
PRCTICA 3 Diagnstico microbiolgico de las infecciones del tracto respiratorio superior
A secretora y sustancias antibacterianas como la lisozima presente en las secreciones
respiratorias. Los reejos mecnicos como la tos, el estornudo y la deglucin contribu-
yen con la eliminacin de agentes extraos; por otra parte, la microbiota normal de la
nasofaringe y orofaringe previene la colonizacin del tracto respiratorio por microorga-
nismos patgenos (Tabla 6). (2)
Las infecciones de vas respiratorias superiores (ITRS) afectan a la poblacin en
general, son causa frecuente de consulta mdica, sobre todo en la edad peditrica, pro-
vocando ausentismo escolar y laboral. Las ITRS involucran a la cavidad nasal, faringe
y senos paranasales. El 80% de estas infecciones son de etiologa viral, en segundo
lugar son producidas por bacterias y un reducido nmero de casos son de origen mic-
tico.(2)
Tabla 6. Flora habitual y patgenos respiratorios
Manifestaciones clnicas
- Rinitis: es la manifestacin clnica caracterstica del resfro comn, se presenta
con aumento de la secrecin nasal, la cual suele ser clara y acuosa al inicio, confor-
me avanza el cuadro puede sobreagregarse una infeccin bacteriana; en estos casos
la secrecin se vuelve espesa o purulenta, requiriendo tratamiento con antibiticos.
La rinitis alrgica cursa igualmente con aumento de secrecin nasal, necesitndose
el diagnstico diferencial que oriente el tratamiento adecuado.(3)
- Faringitis o amigdalitis: se maniestan con dolor farngeo, eritema y edema de los
tejidos afectados; puede existir exudado, petequias hemorrgicas y placas de clu-
las inamatorias, presentes frecuentemente en la infeccin bacteriana. La observa-
cin de vesculas y lesiones ulcerativas son comunes en las infecciones virales y la
Microbiota habitual Posibles patgenos respiratorios Patgenos denitivos
Estreptococos del grupo viridans Estreptococos beta-hemolticos Corynebacterium diphtheriae
Estalococos coagulasa negativo Haemophilus inuenzae Bordetella pertussis
Micrococos Haemophilus parainuenzae Mycoplasma pneumoniae
Corynebacterium sp. Streptococcus pneumoniae
Neisseria sp. (no patgenas) Neiserias patgenas
Lactobacillus sp. Moraxella catarrhalis
Veillonella sp. Enterobacterias
Espiroquetas Fusobacterium sp.
Bacteroides sp.
Actinomyces sp.
Tomado de: Koneman y col., 2001; Murray y col., 2002.
33
Kiralba Snchez 3
formacin de aftas o placas blanquecinas con base erosionada son compatibles con
candidosis farngea.(3)
- Sinusitis: Posterior a una infeccin nasofarngea, por contigidad puede afectarse
una o mas cavidades paranasales. La sintomatologa cursa con obstruccin nasal,
rinorrea, dolor facial, cefaleas y ebre. En los nios el sntoma caracterstico es la
rinorrea, que simula un resfriado comn. Se debe sospechar de una sinusitis cuan-
do los sntomas perduran por ms de 10 das.(1)
- Epiglotitis: es una inamacin difusa de la epiglotis y de las estructuras adyacentes, de
progresin rpida; en nios la obstruccin es brusca, completa y fulminante de la va
area (en un lapso de 30 min.), se acompaa de disnea y cianosis que pone en riesgo la
vida del paciente. La epiglotis se visualiza edematosa y de color rojo cereza.(1)
Otras manifestaciones menos frecuentes incluyen la formacin de pseudomembranas,
constituidas por tejido necrtico, clulas inamatorias y bacterias. Estas formaciones pue-
den orientar el diagnstico de la difteria farngea o hacia una Angina de Vincent.(3)
Etiologa de las infecciones del tracto respiratorio superior
El 80% de las ITRS son de etiologa viral. El resfriado comn es causado principal-
mente por el grupo de los rinovirus y coronavirus.
La faringitis aguda en su gran mayora es causada por rinovirus, adenovirus, para-
inuenza y coxsackie. La causa bacteriana ms frecuente de faringoamigdalitis y, por lo
tanto, susceptible de ser tratada con antimicrobianos es Streptococcus pyogenes, res-
ponsable de 15 a 30% de las faringitis agudas en nios y de 5 a 10% en adultos.(1)
En la tabla 7 se sealan otras bacterias causantes de faringitis, entre stas tenemos a
los Estreptococos beta-hemolticos de los grupos C y G que se han asociado a brotes epi-
dmicos de faringitis transmitidas por alimentos, a faringitis endmica en comunidades
cerradas donde concurren jvenes y adultos.(4)
Otros agentes etiolgicos poco frecuentes lo constituyen: Arcanobacterium
haemolyticum, Yersinia enterocolitica, Franciscella tularensis y Neisseria gonorrhoeae,
esta ltima debe ser considerada entre los jvenes y adultos como consecuencia del con-
tacto buco-genital.(1) Existen microorganismos que forman parte de la microbiota habi-
tual de la faringe, algunos participan en la etiologa de infecciones del tracto respiratorio
bajo, sin embargo, no se consideran patgenos en faringoamigdalitis aguda en pacientes
inmunocompetentes; es el caso de H. inuenzae, S. pneumoniae, M. catarrhalis y S.
aureus. H. inuenzae es un agente causal de faringitis en nios.(1)
En pacientes inmunocomprometidos, se debe informar el hallazgo de Candida sp.,
bacilos gramnegativos y S. aureus.(1)
Tanto en la sinusitis como en otitis media, entre los microorganismos etiolgicos
34
frecuentemente implicados se seala a: S. pneumoniae, H. inuenzae y, en menor pro-
porcin M. catarrhalis.(1)
La Angina de Vincent es producida por una mezcla de bacterias anaerbicas y espi-
roquetas. Estos cuadros son muy raros y se producen en adultos jvenes.(4)
TABLA 7. Principales causas infecciosas del tracto respiratorio superior
Etiologa Diagnstico
clnico
Virus Bacterias y hongos
Rinitis
Virus Coxsackie A, virus parainuenza
e inuenza, virus sincitial respiratorio,
rinovirus, adenovirus, coronavirus
Raros
Faringitis o
amigdalitis
Virus Coxsackie A B, virus parain-
uenza e inuenza, Herpes simple,
adenovirus, rinovirus, Epstein-Barr
Streptococcus pyogenes
Estreptococos beta hemolticos gru-
pos B,C,G,
Neisseria gonorrhoeae,
Arcanobacterium haemolyticum
Sinusitis Raros
Streptococcus pneumoniae
Haemophilus inuenzae
Moraxella catarrhalis
Bacterias anaerbicas
Pseudomembranas
farngeas
Ninguno
Corynebacterium diphtheriae
Fusobacterium nucleatum y
Borrelia vincenti
Epiglotitis Ninguno
Haemophilus inuenzae
serotipo b
Estomatitis Virus Coxsackie A, Herpes simple
Especies de Candida
Fusobacterium sp, espiroquetas
Abscesos
periamigdalino
o retrofarngeo
Ninguno
Anaerobios bucales
como Fusobacterium sp.
Staphylococcus aureus.
Tosferina o
coqueluche
Bordetella pertussis
Tomado de: Ryan y Ray, 2004; Braun, 2003.
35
Kiralba Snchez 3
Diagnstico
El objetivo primordial del diagnstico de los ITRS consiste en distinguir los casos
de etiologa viral (80-90% de los casos) de los producidos por bacterias para los que se
dispone de tratamiento. La investigacin de agentes virales involucrados en ITRS no se
practica de rutina, debido a los altos costos y como no son susceptibles de tratamiento
no se justica su diagnstico, el cual se reserva para la investigacin de brotes epidmi-
cos.(5)
En la tabla 8 se presentan las muestras tiles para el diagnstico de los diferentes
cuadros respiratorios.
TABLA 8. Muestras clnicas y consideraciones para el cultivo segn
el cuadro clnico
Cuadro clnico Muestra a cultivar Indicaciones para el cultivo
Exudado nasal Recomendado para la bsqueda de S. aureus
y para el diagnstico diferencial de una rinitis
alrgica.
Hisopado nasofarngeo Investigacin de virus
Principalmente se justica en pacientes sinto-
mticos para la bsqueda de S. pyogenes. Algu-
nas excepciones de esta conducta se relacionan
con las condiciones del hospedero como inmu-
nosupresin, hospitalizacin, antecedentes de
intercurso buco-genital.
Indicado en pacientes inmunocomprometidos,
en infecciones nosocomiales, mala respues-
ta antimicrobiana y en casos de complicacio-
nes como: meningitis, osteomielitis, celulitis
periorbitaria.
Se recomienda la toma de hemocultivos
Epiglotitis Sangre seriados (3 muestras)
Est contraindicada la toma de muestras farn-
geas o nasofarngeas.
Exudado farngeo Se cultivarn si existe las caractersticas
Raspado de clnicas y epidemiolgicas que orienten
pseudomembrana a su investigacin
Son muy raros los casos, por lo tanto,
Tosferina Hisopado nasofarngeo no se practica de rutina su investigacin,
salvo solicitud clnica.
Tomado de: Braun, 2003; Koneman y col., 2001.
Rinitis
Faringitis Exudado farngeo
Secrecin obtenida
Sinusitis por puncin de senos
paranasales
Difteria y Angina de
Vincent
36
Etapa pre-analtica
Los antecedentes del paciente y los factores epidemiolgicos son tiles para
orientar el diagnstico etiolgico. Entre stos se deben considerar los datos lia-
torios: nombre, edad, ocupacin, residencia; la evolucin clnica del proceso (ver
manifestaciones clnicas), estado inmunolgico del paciente, procedencia (hospita-
lizacin o de la comunidad), condiciones socio-econmicas, estilo de vida, exposi-
cin reciente a caso clnico de ITR, tratamientos previos con antimicrobianos, entre
otros.(5)
Etapa analtica
La validez de los resultados del diagnstico microbiolgico depende entre otros
factores, de que se sigan correctamente las normas de obtencin y transporte de la
muestra y que la solicitud del estudio, sea acompaada de un breve informe con los
datos clnicos y epidemiolgicos, que orienten al bioanalista en la seleccin de las tc-
nicas ms adecuadas, segn el microorganismo que se vaya a investigar.
Tanto la obtencin como el transporte de las muestras al laboratorio constituyen
un punto clave para conseguir un resultado satisfactorio.
I. Obtencin y procesamiento de exudado nasal
Condiciones previas del paciente:
- No debe estar recibiendo antibiticos, ni antiinamatorios, ni antialrgicos.
Procedimiento:
1. Elevar la punta de la nariz con el dedo pulgar.
2. En caso de ausencia de secrecin, humedecer la punta del hisopo en solucin sali-
na estril e introducirlo hasta la base de la fosa nasal, donde se rota suavemente.
3. Retirar el hisopo con cuidado de evitar la contaminacin del mismo con las bacte-
rias de la piel, proceder a realizar los extendidos nos sobre lminas portaobjetos
nuevas y limpias para teir con Gram y Hansel.
4. Proceder de igual forma con un segundo hisopado para la siembra en medios de
cultivo: agar sangre (AS) y agar manitol salado (AMS) (Fig. 4).
37
Kiralba Snchez 3
5. Incubar los medios de cultivo a 36 C, en condiciones de aerobiosis por 18 a 24
horas.
Observacin: Para la obtencin de secrecin nasofarngea, se sugiere utilizar hiso-
pos exibles de alginato de calcio. Esta muestra es til para la deteccin de portadores
de patgenos como: N. meningitidis, C. diphtheriae y B. pertussis.(5)
Interpretacin del examen directo:
s Gram: no es til para el diagnstico, ya que no es representativo del proceso infeccioso
en nasofaringe ni en senos paranasales. Informar la cantidad de leucocitos o clulas
inamatorias presentes: 1-4xc escaso; 5-10xc moderado; >10xc abundantes.(6)
s Hansel: esta coloracin es muy til para la investigacin de eosinlos en moco
nasal, la cual permite conrmar el diagnstico de una rinitis alrgica. Para ello
se realiza un recuento diferencial con objetivo de 40X, se cuentan 50 clulas por
campo, si se observan 10 eosinlos se considera la prueba positiva. Es importante
tener presente que la ausencia de eosinlos no descarta el cuadro alrgico ya que
hasta el 70% de los pacientes puede mostrar recuentos menores de eosinlos o
ausencia de stos, segn el momento en que se recolecte la muestra y la severidad
de la rinitis.(7)
Revisin de los cultivos para la investigacin de portadores nasales de S. aureus:
La siembra realizada en los medios de cultivo AS y AMS se revisarn en busca de colo-
nias sugestivas de S. aureus, y se proceder a la identicacin bioqumica y determinacin
de la susceptibilidad antimicrobiana por el mtodo de Kirby-Bauer (Anexo 3 y 4).
38
II. Obtencin y procesamiento de exudado farngeo
El cultivo farngeo es el mtodo estndar para documentar la presencia de S. pyoge-
nes en la faringe, esta prueba alcanza una sensibilidad del 90 a 95%.(1)
Condiciones previas del paciente
- El paciente no debe haber recibido antibiticos en los ltimos 8 das, previos a la
obtencin de la muestra.
- El paciente debe acudir en ayunas al laboratorio.
- Debe cepillarse los dientes y no practicar gargarismo.
Figura 4. Procedimiento para el cultivo de exudado nasal.
Estudio macroscpico
de colonias
Colonias sospechosas
de un patgeno
Si no se observan colonias de
inters, reincubar hasta 48 h en
las mismas condiciones
Pruebas bioqumicas
Antibiograma
Exudado nasal
Gram
Hansel
Incubar a 36C por 18-24 h
en microaerolia
Negativo o
ora habitual
Gram
Reporte
AS AMS
39
Kiralba Snchez 3
Procedimiento
1. Inspeccin de la faringe: ubicar al paciente en una posicin cmoda y con buena
iluminacin, deprimir la lengua con el baja lengua, visualizar la fosa amigdalina y
faringe en busca de exudado posterior, presencia de pseudomembrana o placas.
2. Indicar al paciente que abra la boca y que pronuncie un largo ah, el cual sirve
para elevar la vula y evitar las nuseas.
3. Introducir el hisopo y frotar enrgicamente ambas amgdalas y la pared posterior
de la faringe con movimientos de barrido.
4. Retirar el hisopo cuidando de no tocar las paredes laterales de orofaringe, vula,
lengua, encas y dientes.
5. Extender la muestra con suaves movimientos sobre la supercie de los portaobje-
tos para realizar los frotis que sern teidos al Gram y con la tcnica de Hansel.
6. Obtener un segundo hisopado de fauces para la siembra en AS de carnero, siguien-
do la tcnica de estriado sobre supercie, realizando siembras de profundidad con
el asa para la deteccin de hemolisinas estreptoccicas (Fig.5).
7. Incubar el AS a 36C, en condiciones de 5-7% CO
2,
por 24-72 horas.
Observacin: En caso de ser necesario, la muestra se podr transportar en medio de
Stuart o Amies, realizando el cultivo de la misma en el menor tiempo posible (menos
de 2 horas).
Interpretacin del examen directo
s Gram: describir los hallazgos de clulas inamatorias y de alteracin de la ora
habitual, como es el caso del aumento de bacilos gramnegativos fusiformes y es-
piroquetales que orientan el diagnstico hacia una Angina de Vincent; as mismo
reportar la presencia de clulas levaduriformes, hifas y pseudohifas.
s Hansel: observacin de eosinlos, permite el diagnstico diferencial de una farin-
gitis alrgica, muy comn en pacientes alrgicos.(7)
Revisin de los cultivos
- Inspeccionar las placas de AS en busca de colonias pequeas de 1 a 1,5 mm de di-
metro, rodeadas de un halo de hemlisis completa (beta-hemlisis).
- A partir de las colonias sugestivas realizar extendidos para teir al Gram; si se ob-
servan cocos grampositivos dispuestos en cadenas, se repican de 4 a 6 colonias en
AS y en tubos de caldo Todd-Hewitt e incubar a 36 C por 24 h.
40
- Del cultivo en Tood-Hewitt o AS practicar coloracin con el mtodo de Gram, para
conrmar morfologa, reaccin y disposicin caractersticas de los Streptococcus.
- Realizar pruebas de identicacin (Anexos 3, 7, 8 y 9)
Para diferenciar S. pyogenes de otros beta-hemolticos, se pueden utilizar diferen-
tes pruebas, siendo la de uso comn la prueba de la bacitracina (Anexo 7). Esta prueba
se basa en la susceptibilidad de S. pyogenes frente a una concentracin relativamente
baja de bacitracina. Para ello se inocula la cepa pura en AS, mediante hisopo estril ex-
tendiendo en cuatro direcciones; se coloca el taxo A (bacitracina 0,04 U) y el disco de
trimetoprim-sulfametoxazol (SXT) sobre el cultivo. Al cabo de 18-20 h de incubacin
a 36C, se detectar la presencia de un halo de inhibicin del crecimiento de cualquier
tamao, que indica la susceptibilidad del microorganismo.(7)
Figura 5. Procedimiento para el cultivo de exudado farngeo
Identicacin
(anexos 3, 7 y 8)
Gram
Hansel
Colonias pequeas -hemolticas
Incubar a 36C por 18-48 h
en microaerolia
AS
Exudado farngeo
Si no se observan
colonias de inters
Reporte
Negativo o
ora habitual
Gram
Subcultivar en AS y
caldo BHI TH
41
Kiralba Snchez 3
Esta tcnica tiene un 5% de falsos negativos y entre 10 y 20% de falsos positi-
vos ya que otros Streptococcus (grupos C y G) tambin pueden dar sensibles.(1)
Otra prueba disponible en muchos laboratorios es la hidrlisis del PYR, sta se
fundamenta en la actividad de la enzima pirrolidonil aminopeptidasa producida
por S. pyogenes, sobre un sustrato el L-pirrolidonil-beta-naftilamida (PYR), con
formacin de beta-naftilamida libre, que se combina con el reativo cinamaldehdo
formando un producto nal de color rojo.(6)
Los laboratorios que utilizan las pruebas bacitracina o PYR deben informar: Hubo
desarrollo presuntivo de Streptococcus pyogenes
La identicacin denitiva se lleva a cabo mediante la deteccin del antgeno es-
pecco de grupo, tambin llamado carbohidrato de Lanceeld; sta se realiza a travs
de mtodos de aglutinacin con partculas de ltex o coaglutinacin, directamente
sobre la colonia aislada. Solo los estreptococos beta-hemolticos, A , B , C , F , G y los
alfa o no hemolticos del grupo D pueden clasicarse con esta prueba. Para su realiza-
cin se procede a una extraccin previa de los antgenos de pared, que dependiendo
del mtodo, se emplear: cido, calor o enzimas. Luego se hace reaccionar la cepa pura
de 24 h de desarrollo con cada uno de los antisueros para cada serogrupo. La reaccin
positiva se evidenciar dependiendo de la interpretacin de cada protocolo: ya sea por
aglutinacin, coaglutinacin, entre otros.(6)
Deteccin directa de Streptococcus del grupo del A en hisopado de garganta
Estas pruebas permiten detectar directamente el carbohidrato de la pared de S.
pyogenes, a partir de un hisopado farngeo, con la ventaja de obtener resultados in-
mediatos. La mayora de las pruebas rpidas tienen excelente especicidad (> 95%)
comparado con el cultivo, sin embargo, la sensibilidad alcanza entre 80 y 90%. Por
lo que se recomienda que una prueba negativa sea conrmada con el cultivo.(1,2)
Entre los mtodos de deteccin rpida de antgenos se emplean las pruebas de
aglutinacin con ltex y los mtodos de enzimoinmunoanlisis (ELISA), estos lti-
mos con una mayor sensibilidad y especicidad.
Actualmente se ha desarrollado la prueba de inmunoensayo ptico y sondas de
ADN quimioluminiscentes. Los datos sugieren que son ms sensibles aunque ms
costosos, por lo cual no estn disponibles para uso rutinario.(1)
Las desventajas de estos mtodos de deteccin directa se basan en:
- Solo detectan Streptococcus grupo A, no detecta otros serogrupos.
- Bajo valor predictivo positivo, esto es, que no diferencia ecientemente los porta-
dores de un individuo infectado con un reducido nmero de S. pyogenes.
- El elevado costo, sobre todo de los ltimos mtodos.
42
Investigacin de otros patgenos
1. Bsqueda de Arcanobacterium haemolyticum: Se recomienda el uso de AS humana
o de caballo para el aislamiento primario a partir de exudado farngeo. En su defecto
se puede utilizar el AS de carnero convencional con incubacin hasta por 72 h para
lograr evidenciar la beta-hemlisis. Realizar Gram a todas las colonias - hemolticas
aisladas sospechosas de S. pyogenes para hacer diagnstico diferencial con A. hae-
molyticum que se presenta como un bacilo corto pleomrco grampositivo.(5)

Para su
identicacin remtase al Anexo 21.
2. Investigacin de Corynebacterium diphtheriae: Se solicitar cuando exista la sos-
pecha clnica y epidemiolgica de un caso de difteria, el cual debe ser orientado
por el mdico (Anexo 24).
3. Cuando la historia clnica y el examen fsico orienten hacia una faringitis por N. gono-
rrhoeae, debe seleccionarse el medio Thayer-Martin, adems del AS. Otras especies
de Neisseria tambin pueden estar presentes en cultivos de garganta y deben diferen-
ciarse bioqumicamente de N. gonorrhoeae, tales como: N. meningitidis y las especies
no patgenas.(1)

Las colonias sospechosas son pequeas, traslcidas y brillantes, a las
cuales se les practicar la tincin al Gram, prueba de la oxidasa y fermentacin de
azucares (Anexo 12,13).(5,6)
4. La investigacin de B. pertussis, se practicar en caso de sospecha clnica de tos
ferina. El cultivo se lleva a cabo en medio enriquecido de Bordet-Gengou con el
agregado de 10% de sangre de caballo y como agente inhibidor meticilina (2,5ug/
mL) o cefalexina (40ug/mL) (Anexo 25).(5,8)
Etapa post-analtica
El informe al mdico tratante debe incluir la identicacin del paciente, tipo de
muestra recolectada, estudio microbiolgico realizado, fecha de recepcin de la mues-
tra, emisin de los resultados y cualquier otro dato que el bioanalista considere necesa-
rio, por ejemplo, las condiciones en que se traslad la muestra o las caractersticas de la
misma, hora de llegada al laboratorio, entre otros (Anexo 2).
- Ln Examen directo. Indique la tcnica utilizada y describa la morfologa, reaccin
al Gram de los diferentes morfotipos con importancia clnica, tomando en cuenta
los aspectos mencionados anteriormente, dependiendo del tipo de muestra y el o
los patgenos a investigar. Sealar en forma semicuantitativa la presencia de clu-
las inamatorias.(6)
43
Kiralba Snchez 3
- En el tem Cultivo: Registre el microorganismo aislado tomando en cuenta su sig-
nicancia clnica y los aspectos relacionados con el paciente, considerados en el
contenido terico de esta prctica.
- Si estn presentes microorganismos indgenas y se ha determinado que son con-
taminantes para el caso, incluir el siguiente comentario Desarrollo de microbiota
habitual de la regin.
- En el caso de cultivos negativos, indicar No hubo crecimiento bacteriano en 48 ( 72)
horas de incubacion
- Reporte el Antibiograma (en los casos que aplique).
- En Observaciones, se debe sealar la lista de microorganismos investigados y otros
datos que se consideren de inters para la interpretacin clnica del resultado.
- Datos y rma de la persona encargada de la investigacin: Nombre y apellido en forma
legible. Nmero de registro ante el Ministerio de Salud y ante el Colegio de Bioanalis-
tas. Firma y sello del laboratorio o institucin de adscripcin.
3 Actividad prctica
Primer perodo: Obtencin y siembra de secrecin nasal y exudado farngeo
Materiales
- Hisopos estriles
- Bajalenguas estriles
- Lminas porta objetos
- Medios de cultivo: Agar Sangre de car-
nero (AS) y agar manitol salado (AMS)
- Coloracin de Gram
- Coloracin de Hansel
- Asa de platino
- Solucin salina siolgica
Procedimiento
1. Elaborar la cha clnico-epidemiolgica del paciente (Anexo 1).
2. Preparar todo el material necesario para la obtencin y siembra de las muestras.
Rotule las placas, caldo de cultivo y las lminas portaobjeto con el cdigo asignado
al paciente.
3. Obtener las muestras de exudado nasal y farngeo como se explic previamente.
Observe la demostracin del docente.
4. Practicar la siembra de las muestras en los medios respectivos: secrecin nasal en
AS y AMS, el exudado farngeo en AS (Fig. 4 y 5)
5. Incubar los medios de AS, a 36 C, en microaerolia por espacio de 24 a 48 horas.
Con revisin peridica cada 24 h y el AMS en aerobiosis.
44
6. Realizar 2 frotis con cada muestra: uno para teir con la tcnica de Gram y el otro
para la coloracin de Hansel. Prepare el frotis, aplicando al hisopo movimientos
rotativos sobre la lmina portaobjeto, procurando que el extendido quede no. Deje
secar al aire.
7. Fijar los extendidos y siga los pasos para las tcnicas de Gram y Hansel. Observar
al microscopio.
Coloracin de Hansel
- Fije la lmina con metanol absoluto por 3 minutos
- Cubrir la lmina con el colorante durante 1 minuto.
- Agregar agua destilada sobre el colorante por 30 segundos
- Lavar con agua destilada
- Decolorar ligeramente con metanol (dos a tres gotas)
- Dejar secar y examinar el extendido con objetivos de 10X y 40X (no utilice aceite
de inmersin)
Segundo perodo: Revisin de los cultivos
Materiales
- Lminas portaobjeto
- Asa de platino
- Gotero con solucin salina siolgica
- Placas de AS y caldo Tood-Hewitt (TH) o
infusin cerebro corazn (BHI)
- Agua oxigenada 3%
- Plasma citratado
- Palillos de madera
- Pipetas Pasteur
- Propipeteador
- Coloracin de Gram
Procedimiento
1. Evaluar cada placa de cultivo segn las caractersticas morfolgicas de las colonias,
la presencia o no de hemlisis y valorar el desarrollo bacteriano en escaso, mode-
rado o abundante. En el caso de AMS observe si hubo la fermentacin del manitol.
Registre todas las caractersticas observadas.
2. Realizar el anlisis microscpico de las colonias de inters microbiolgico, segn
el tipo de muestra. Para ello preparar frotis con las colonias a investigar y teir con
la coloracin de Gram. Observar y registrar los resultados.
3. Las colonias de valor diagnstico deben ser puricadas, en AS y en caldo TH o BHI.
45
Kiralba Snchez 3
4. A partir del crecimiento en AMS, se procede a la investigacin de S. aureus, si-
guiendo el esquema de identicacin propuesto (Anexos 3,4).
5. Incubar los medios AS, TH y las pruebas bioqumicas inoculadas.
Tercer perodo: Identicacin bacteriana
Materiales
- Placas de AS
- Placas de Mueller Hinton sin sangre y
con 5% sangre de carnero
- Solucin salina siolgica estril
- Patrn de Mc Farland 0.5
- Viales con discos de antibiticos
- Asa de platino
- Agua oxigenada al 3%
- Palillos de madera
- Lminas portaobjeto
- Taxos de bacitracina
- Coloracin de Gram
Procedimiento
1. Revisar y vericar la pureza de los repiques realizados en el perodo anterior me-
diante la tcnica de Gram.
2. A partir de este repique realizar un inculo con las colonias sospechosas de S. pyo-
genes sobre un AS fresco. Aplicar un taxo de bacitracina sobre la siembra e incubar
en microaerolia.
3. Realizar la prueba de la catalasa a partir del caldo TH. Registre el resultado.
4. Interpretar las pruebas bioqumicas inoculadas en el perodo anterior e identicar
el microorganismo.
5. Realizar la prueba de sensibilidad antimicrobiana, en el caso que aplique.
Cuarto perodo: Continuacin con la identicacin bacteriana
1. Observar la presencia de un halo de inhibicin alrededor del taxo de bacitracina.
Registre el resultado.
2. Identicar el microorganismo.
3. Dar lectura al antibiograma.
4. Registrar y elaborar el reporte respectivo (Anexo 2).
46
Autoevaluacin
1. Por qu en el cultivo de un exudado farngeo se debe utilizar sangre de carnero?
2. Clasique los medios de cultivo empleados en la prctica segn su utilidad en el
laboratorio.
3. Cul es la importancia de los portadores nasales de S. aureus?
4. Enumere los patgenos respiratorios y los cuadros clnicos que producen.
5. Explique el fundamento de las pruebas: catalasa, coagulasa y PYR.
6. Cul es la utilidad de la coloracin de Hansel en una faringitis?
7. Mencione las pruebas no convencionales para el diagnstico de una faringitis es-
treptoccica y discuta sus ventajas y desventajas.
Bibliografa
(1) Braun S. Estudio microbiolgico del tracto respiratorio superior. Rev Chil Infect 2003;
20:193-198.
(2) Murray P, Rosenthal K, Kobayashi G, Pfaller M. Microbiologa mdica. Texto Atlas Co-
lor. 4 ed. Espaa: Mosby Elsevier Science; 2002.
(3) Ryan K, Ray C. Sherris Microbiologa mdica. 4 ed. Mexico: McGraw-Hill Interameri-
cana; 2004.
(4) Mandell G, Bennett J, Dolin R. Enfermedades infecciosas. Principios y prctica. 5 ed.
Argentina: Mdica Panamericana; 2002.
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Texto y Atlas Color. 5 ed. Espaa: Mdica Panamericana; 2001.
(6) Montiel F, Lam M. Manual de microbiologa clnica. Chile: Mediterrneo; 2001.
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line) 1996 (citado 17 may 2005). Disponible en: http://colombiamedica.univalle.edu.
co/Vol27no3-4/rinitis.pdf.
(8) Universidad Central de Venezuela. Gua de Trabajos prcticos de microbiologa. Cara-
cas: FEPUVA-UCV; 2000.
47
prctica 4
del tracto respiratorio inferior
Anu Curnlinu Rumroz
Objetivo general
Aplicar el procesamiento microbiolgico de las diferentes muestras para el diagnstico
etiolgico de las infecciones de las vas respiratorias inferiores ocasionadas por bacterias.
1. Mencionar los principales agentes etiolgicos causantes de infecciones del tracto
respiratorio inferior.
2. Relacionar los datos epidemiolgicos y clnicos necesarios para la orientacin del
diagnstico microbiolgico (etapa pre-analtica).
3. Realizar los diferentes pasos que comprende la etapa analtica del procedimiento
para el cultivo de muestras provenientes del tracto respiratorio inferior.
4. Analizar, interpretar y reportar los resultados obtenidos (etapa post-analtica).
Aspectos tericos
El aire que inhalamos contiene millones de partculas suspendidas, incluidos algu-
nos microorganismos que en su mayora son inocuos, sin embargo, el aire constituye un
vehculo para la transmisin de patgenos importantes.(1)
Aunque la va respiratoria es un todo continuo desde la nariz a los alvolos, es con-
veniente distinguir entre infecciones de las vas respiratorias superiores e inferiores. En
esta seccin estudiaremos estas ltimas, las cuales tienden a ser infecciones ms graves
y la eleccin de un tratamiento antimicrobiano adecuado es importante para salvar la
vida del enfermo.(1)
El tracto respiratorio inferior es un rea normalmente estril, la afeccin puede
ocurrir por extensin de una infeccin de las vas respiratorias medias, aspiracin
48
PRCTICA 4 Diagnstico microbiolgico de las infecciones del tracto respiratorio inferior
de microorganismos patgenos que rebasan las defensas de las vas respiratorias
superiores o, menos a menudo, por diseminacin hematgena desde un sitio distan-
te, como un absceso o una vlvula cardiaca infectada. Cuando hay infeccin a
travs de las vas respiratorias, muchas veces se observa alguna alteracin de los
mecanismos de ltrado o eliminacin de agentes infecciosos inhalados de las vas
respiratorias inferiores.(3,4)
Las infecciones de las vas respiratorias inferiores se presentan con invasin y
afeccin del pulmn, produciendo neumona y alveolitis o pueden afectar la trquea
y bronquios ocasionando: traquetis, bronquitis y bronqueolitis (Fig. 6); estos cua-
dros se pueden presentar en forma aguda o crnica.(1,2,3)
La bronquitis aguda es una inamacin del rbol traqueobronquial, que se carac-
teriza desde el punto de vista clnico por tos, grado de ebre variable y produccin de
esputo. Este ltimo (material expulsado desde los bronquios, pulmones y trquea, por la
boca) a menudo es lmpido al comienzo, pero puede tornarse purulento si la enfermedad
persiste. La bronquitis puede manifestarse como crup (cuadro clnico caracterizado por
una tos perruna o ronquera, o ambas).(5)
Figura 6. Sndromes que incluyen las infecciones respiratorias bajas
Tomado de: Va salud, 2001.
49
Ana Carolina Ramrez 4
Las principales causas de bronquitis agudas se mencionan en la tabla 9.
TABLA 9. Principales causas de bronquitis agudas

La neumona es un proceso inamatorio que se caracteriza por la presencia de un
inltrado exudativo y celular en el parnquima pulmonar. La mayora de las neumonas
son de causa infecciosa y tienen una evolucin aguda. Ocasionalmente, pueden tener
un origen no infeccioso como en el caso de enfermedades autoinmunes, neoplasias o
exposicin a agentes txicos.(2)
Las neumonas pueden ser causadas por una gran variedad de microorganismos:
bacterias, virus, micobacterias, hongos y levaduras. En la Tabla 10 se muestran los sig-
nos, sntomas y los patgenos aislados en adultos, y en la Tabla 11 se muestran los pat-
genos aislados en los nios de acuerdo a la edad.
TABLA 10. Etiologas ms frecuentes de neumonas en adultos
Bacterias Virus
Bordetella pertusis, Bordetella parapertusis, Virus parainuenza, inuenza, sincitial respiratorio
Haemophilus inuenzae, Mycoplasma (VSR), adenovirus y virus del sarampin
pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae
Tomados de: Forbes B. y col, 2004.
Patgenos aislados
Frocuontos Pncn frocuontos Rurns
Bacterias:
- Streptococcus pneumoniae - Coxiella burnetii
- M. pneumoniae - Legionella sp
- C. pneumoniae - MIciooigunIsmos unuoiohIos
- Mycobacterium tuberculosis de la orofaringe
- Coccidioides inmitis
Hongos: - Blastomyces dermatitidis
- Histoplasma capsulatum
- Cryptococcus neoformans
VIius: - VIius Inuonzu - VSR
- VIius vuiIcoIu zosloi
PuisIlos: - Ascaris lumbricoides
Tomado de: Va salud 2001 [en lnea]. Disponible en: http://www.viasalud.com/documento.asp?
50
TABLA 11. Etiologas ms frecuentes de neumonas en nios de
acuerdo a la edad
Las neumonas pueden clasicarse segn distintos criterios: a) de acuerdo a la etio-
loga (segn el microorganismo causal); b) segn el lugar de adquisicin (dentro o fuera
del hospital), este ltimo criterio es el ms til a la hora de establecer el tratamiento
inicial de un paciente determinado.(2)
Los sntomas que sugieren neumona son ebre, escalofros, dolor en el pecho y tos
con produccin o no de esputo, dolor torcico, disnea, consolidacin pulmonar: estertores,
ruidos respiratorios disminuidos, inltrados radiogrcos y empiema. Es importante tener
en cuenta que algunos pacientes con neumona no muestran signos y sntomas relaciona-
Patgenos aislados
Frecuencia < 1 mes 1 mes- 5 aos > 5 aos
Bacterias:
- Streptococcus agalactiae - S. pneumoniae - S. pneumoniae
- Escherichia coli - Chlamydia trachomatis - M. pneumoniae
- C. trachomatis
Frecuentes Virus:
- VIius sIncIlIuI - VSR
iosIiuloiIo [VSR) - AuonovIius
- VIius Inuonzu
- VIius uiuInuonzu
Bacterias:
- Klebsiella s. - H. inuenzae - Coxiella burnetii
Monos Iiocuonlos - Olius LnloiohucloiIus - Moraxella catarrhalis - AnuoiohIos uo Iu
- Enterococcus s. - Neisseria meningitidis microbiota orofarngea
- Staphylococcus aureus - M. pneumoniae - B. pertusis
Bacterias:
- Ureaplasma urealyticum - S. aureus
- Mycoplasma hominis - S. pyogenes
- S. aureus - H. inuenzae
Ruios - Streptococcus pyogenes - N. meningitidis
- LnloiohucloiIus - Legionella sp.
- M. tuberculosis - M. tuberculosis
Virus:
- CIlomoguIovIius - LnloiovIius
- RuhoIu - VSR
- VIius uiuInuonzu
Tomado de: Va salud 2001 [en lnea]. Disponible en: http://www.viasalud.com/documento.asp?
51
dos con el tracto respiratorio. Por lo tanto, el examen fsico del paciente, los hallazgos en
la radiografa de trax, los antecedentes del paciente y los resultados del laboratorio clnico
son importantes. Del 10 al 30 % de los individuos con neumona, adems de los sntomas
respiratorios, maniestan dolor de cabeza, nuseas, vmitos, dolor abdominal, diarrea y
mialgias.(5)
Una vez establecido el diagnstico clnico-radiogrco de infecciones del tracto respirato-
rio inferior es recomendable precisar el diagnstico etiolgico mediante pruebas de laboratorio
adecuadas que permitan establecer la terapia antimicrobiana adecuada.(5)
El diagnstico etiolgico puede efectuarse de diferentes maneras: en forma directa, con
la identicacin del agente causal; indirectamente, a travs del hallazgo de un metabolito en
particular y, ms recientemente, utilizando tcnicas inmunolgicas y de biologa molecular
como herramientas en reacciones consideradas rpidas no convencionales.(6,7)
Etapa pre-analtica
u} Dutns opidominlgicns: Las infecciones del tracto respiratorio inferior se presentan
a cualquier edad, aunque son ms frecuentes en nios y ancianos. Estn especial-
mente predispuestas las personas que viven con un bajo nivel socioeconmico y en
condiciones de hacinamiento.
Los factores que intereren con las defensas normales del husped son alteracin de
la conciencia, humo de cigarrillo, hipoxemia, acidosis, alcoholismo, inhalaciones
txicas, edema de pulmn, desnutricin, infecciones virales previas, uremia, obs-
truccin mecnica y utilizacin de agentes inmunosupresores (corticoides y drogas
citotxicas). Asimismo, pueden interferir con las defensas normales, enfermedades
de base como diabetes, brosis qustica, enfermedad pulmonar obstructiva crnica,
enfermedad cardiaca congestiva y enfermedades inmunosupresoras como el SIDA.
Estos datos son fundamentales para orientar al microbilogo hacia la bsqueda de
determinados agentes, (2,4) por ejemplo:
- Fibrosis qustica: P. aeruginosa, S. aureus, H. inuenzae y en menor medida
Burkholderia cepacia y otros bacilos gramnegativos.
- Infecciones virales previas: S. aureus.
- Contacto con aves: Chlamydophila psittaci.
- Viajes a reas endmicas: C. immitis, Paracoccidioides brasiliensis, Legionella
pneumophila, Francisella tularensis.
- Riosgn ncupucinnul y/n cnntuctn cnn unimulos: C. burnetti, Bacillus anthracis,
Brucella sp., Yersinia pestis.
- Antecedente de macroaspiracin: anaerobios
- Epidemias de inuenza: Inuenza, S. pneumoniae, S. aureus, S. pyogenes, H. inuenzae.
52
- Bajo nivel socioeconmico: M. tuberculosis.
- Alcoholismo: S. pneumoniae, anaerobios, bacilos gramnegativos.
- Pacientes infectados con HIV: Pnemocistis carinii, M. tuberculosis, S. pneumoniae,
H. inuenzae.
- FPOC/fumudnros: S. pneumoniae, H. inuenzae, M. catarrhalis, Legionella sp.
- Exposicin a murcilagos o materia fecal de los mismos: H. capsulatum.
- Exposicin a conejos: F. tularensi.(4)
b} Dutns clnicns dol pucionto: signos y sntomas, enfermedades subyacentes y, ade-
ms, en la orden debe sealarse la impresin diagnstica del mdico tratante.
Etapa analtica
u} Tipn do muostrus: esputo o expectoracin, aspirado transtraqueal, muestras obteni-
das por broncobroscopia, lavado bronquial, cepillado bronquial, lavado bronco-
alveolar y biopsia pulmonar. En algunas oportunidades las infecciones pulmonares
se acompaan de derrame pleural por lo que es necesario recolectar y estudiar una
muestra de lquido pleural obtenida por puncin.(7)
b} Tnmu do muostru: independientemente del mtodo a escoger para el procesamiento
microbiolgico, la muestra a seleccionar juega un papel importante en el xito espe-
rado, ya que toda informacin diagnstica que el laboratorio pueda proporcionar, de-
pende de la calidad de la muestra recibida.(6,7,8,9)
El esputo o expectoracin en las condiciones habituales de la clnica diaria, no es una
muestra representativa de la situacin existente en el tracto respiratorio inferior por su
mezcla con secreciones procedentes de todo el rbol traqueo-bronquial y con la ora
saprta de la orofaringe. No obstante, es una muestra de fcil obtencin cuya utilidad
o relacin entre resultado obtenido y verdadera etiologa depende en gran medida de
su correcta obtencin, control de calidad antes de iniciar su procesamiento, tipo de
agente que se pretenda detectar y valoracin adecuada del resultado.(10)
La recoleccin de esta muestra es sencilla y consiste en solicitar al paciente seguir
las siguientes indicaciones:
- Colocar en las paredes exteriores del envase la identicacin del paciente (nombre).
- Cepillarse los dientes con agua (no usar pasta de dientes).
- Obtener el esputo tras una expectoracin profunda, preferentemente matinal. Para ello,
debe inspirar profundamente, reteniendo por un instante el aire de los pulmones y ex-
pelindolo violentamente por un esfuerzo de tos, repetir la operacin hasta obtener no
menos de tres esputos. Este procedimiento deber realizarlo en un lugar ventilado.
53
- La recoleccin la realizar en un envase que debe ser de boca ancha con tapa de
rosca, con capacidad para 30 50 mL, transparente porque permite ver la cantidad
y la calidad de la muestra y desechable (Fig. 7).
- De no producirse expectoracin espontnea, puede inducirse el esputo con nebu-
lizaciones de suero siolgico estril (15 mL durante 10 minutos), siendo til ade-
ms realizar un drenaje postural o sioterapia respiratoria.
- Enviar de inmediato al laboratorio, y si esto no es posible, conservar a 4 C.(10,11)
Las tcnicas de recoleccin de muestras obtenidas por mtodos invasivos no sern
objeto de estudio en este captulo ya que son recolectadas por mdicos especialistas y
son trasportadas al laboratorio para su procesamiento.
Figura 7. Envase para la recoleccin de esputo
c} Fxumon diroctn do osputn: para la realizacin del frotis se debe seleccionar la par-
tcula til de la muestra, constituida por la parte ms densa o purulenta. Si hay
varias porciones purulentas, se deben mezclar cuidadosamente con los aplicadores
y tomar una porcin de la mezcla. En caso de observarse solo pequeas partculas
purulentas, escoger tres o ms de ellas y mezclarlas en el mismo portaobjeto para
homogeneizarlas.(11) A cada muestra se le realiza un extendido para colorear con
Gram y otro para Ziehl-Neelsen.
1. Coloracin de Gram: se usa para el tamizaje del esputo antes de la realizacin
del cultivo, por lo tanto, esta coloracin va a permitir controlar la calidad del espu-
to, lo cual es importante para evaluar el grado de contaminacin con bacterias del
tracto respiratorio superior y si la muestra realmente proviene del tracto respirato-
rio inferior o si se obtuvo de la faringe o por aspiracin de secreciones nasales o si
es saliva solamente.(11,12)
Uno de los sistemas utilizados es el de Murray y Washington el cual se muestra en la
Tabla 12, segn este sistema, la observacin de gran nmero de clulas epiteliales en los gru-
pos 1 al 4 indica contaminacin con secreciones orofarngeas e invalida la muestra. Slo las
muestras del grupo 5 son consideradas clnicamente signicativas. Es importante destacar
54
que el sistema de graduacin del esputo no puede ser empleado si se sospecha de infeccio-
nes pulmonares causadas por micobacterias, la mayora de los hongos y virus.(8)
TABLA 12. Sistema de graduacin Murray y Washington para
el ensayo de calidad de muestra de esputo
2. Coloracin de Ziehl-Neelsen: este examen directo se denomina baciloscopa, la
cual es una tcnica fundamental para la investigacin bacteriolgica de la tubercu-
losis, tanto para el diagnstico como para el control del tratamiento. Esta observa-
cin microscpica debe cumplir dos objetivos: a) determinar si en el extendido hay
bacilos cido resistentes (BAR) y b) establecer su nmero aproximado, esto tiene
importancia ya que orienta sobre la ecacia del tratamiento.(11,13)
La baciloscopa es una tcnica rpida, econmica, que permite lograr una amplia
cobertura de la poblacin, por lo cual constituye un aporte importante para los pro-
gramas de control de la tuberculosis, sin embargo, la visualizacin de BAR en esputo
no es armativa de M. tuberculosis porque otras micobacterias pueden tambin causar
enfermedad pulmonar, as como especies del gnero Nocardia que tambin pueden ser
cido alcohol resistentes. Sin embargo, una baciloscopa positiva en conjuncin con la
clnica y hallazgos radiolgicos puede utilizarse para un diagnstico presuntivo de mi-
cobacteriosis.(7,13)
La lectura de la baciloscopa debe ser hecha de manera sistemtica, leyendo de
izquierda a derecha el extendido, tomando en cuenta slo los campos microscpicos
tiles que son aquellos en los que se observan elementos celulares de origen bronquial
(leucocitos, bras mucosas y clulas ciliadas); en aquellos campos en que no aparezcan
dichos elementos no deben contabilizarse en la lectura.(11)
El nmero de campos que se debern observar vara segn la cantidad de bacilos
que contenga la muestra:
Grupo Clulas epiteliales por campo Leucocitos por campo
bajo de aumento bajo de aumento
1 25 10
2 25 10-25
3 25 25
4 10-25 25
5 < 10 25
Tomado de Koneman y col., 1999.
55
- Si no se encuentran BAR o se observa menos de un bacilo por campo promedio
deben examinarse mnimo 100 campos microscpicos tiles.
- Si se encuentran de uno a diez BAR por campo promedio, es suciente observar 50
campos.
- Si se encuentran ms de diez BAR por campo promedio, basta con la observacin
de 20 campos.(11,12)
Para anotar el recuento de bacilos se utilizar la hoja de recuento semicuantitati-
vo (Fig. 8) en la cual cada cuadro representa un campo microscpico til y se colocar
el nmero de BAR observados, luego en la columna 11 se anotar la sumatoria corres-
pondiente a cada lnea y el recuento de bacilos corresponder a la suma de los resulta-
dos registrados en la columna 11.
Figura 8. Hoja de recuento semicuantitativo
Tomado de: Armengol R., Guilarte A, 1998.
Es importante tener en cuenta que la no observacin de BAR en una muestra clnica
no descarta el diagnstico de tuberculosis, ya que es una tcnica de sensibilidad limi-
tada. Se ha demostrado que son necesarios de 5.000 a 10.000 bacilos por mL de esputo
para el reconocimiento en la microscopa directa, en estos casos el cultivo detecta de 10
a 100 colonias de micobacterias viables.(12).
3. KOH al 10%: para descartar la presencia de estructuras fngicas.
d} Cultivn do osputn: entre los medios de cultivos primarios tenemos: agar sangre, agar
chocolate, agar Mac Conkey y para investigar micobacterias se puede utilizar: Agar
LMINA N RESULTADO N
Columna 11
TOTAL
56
Lwenstein-Jensen, Ogawa Kudoh o Middlebrook 7H10-7H11; dependiendo de la
orientacin diagnstica se incluirn medios especcos para hongos dimorfos tales
como: agar infusin cerebro-corazn, as como agar infusin de corazn de Sabouraud
(SABHI) con sangre de oveja y tambin Micobiotic o Mycosel, en caso de sospecha
de infeccin por Legionella se usa el agar extracto levadura carbn con pH regulado
(BCYE) y tincin especca para P. carinni.(15, 16)
En la Figura 9 se representa esquemticamente el procedimiento para el cultivo de
la muestra de esputo o expectoracin.
Figura 9. Procedimiento para el cultivo de esputo
Para el aislamiento de micobacterias antes de realizar la siembra en el medio de cul-
tivo se debe realizar un proceso de descontaminacin debido a que es necesario eliminar
de las muestras los microorganismos contaminantes que intereren en el desarrollo de
estas bacterias. Tambin es importante conseguir la licuefaccin de los restos orgnicos
(tejidos, moco y otros materiales) que rodean a los microorganismos, para que los agen-
tes descontaminantes puedan destruir las bacterias no deseadas.
Pero si stas no se utilizan adecuadamente pueden afectar, tambin la viabilidad
de las micobacterias presentes en la muestra y dar lugar a falsos cultivos negativos (por
AS ACH AMK
Incubacin 18-24 h a 36C
en microaerolia
Incubacin 18-24 h a 36C
en aerobiosis
Incubar hasta 6
semanas a 36C
KOH 10%
Gram Ziehl-Neelsen
Muestra de esputo
Examen directo
Proceso de
descontaminacin
Examen directo
Reincubar 24 h a 36C
el ACH
Cultivo
Agar Lowenstein-Jensen
< 10 clulas epiteliales
25 PMN
Positivo
Identicacin
Negativo o ora habitual
Reincubar 24 h a 36C
Negativo o ora habitual
Prueba de
susceptibilidad
Pruebas
bioqumicas
Positivo
57
exceso de descontaminacin) o a un nmero elevado de contaminaciones (por defecto
de descontaminacin).
Entre los mtodos de descontaminacin utilizados tenemos de NaOH 4%, Petroff,
Tacquet y Ticcson, Kubica modicado por Krasnow y N-acetil-L cistena-Hidrxido S-
dico (NALC-NaOH). La eleccin de cualquiera de estos mtodos depender del tipo de
muestras que se descontamine y, sobre todo, de la utilizacin de determinados medios
de cultivo y realizacin de tcnicas moleculares a partir del sedimento de las muestras
descontaminadas, ya que algunos reactivos utilizados en estos mtodos pueden retrasar
el crecimiento de las micobacterias o interferir en las reacciones de amplicacin.(14)
Todas las muestras clnicas sospechosas de contener micobacterias se deben sem-
brar en medios de cultivo adecuados por las siguientes razones:
- Los cultivos son mucho ms sensibles que los exmenes microscpicos, pudiendo
detectar una cantidad tan pequea como 10 bacterias por mL de muestra clnica
digerida y concentrada.
- Los aislamientos en cultivo puro son necesarios normalmente para poder identi-
car las especies de las cepas aisladas.
- Si la baciloscopa es un ndice de la ecacia del tratamiento, el cultivo permite ase-
gurar la negativizacin y curacin del paciente.(14)
g} Idonticucin: de acuerdo a la correlacin obtenida en el Gram directo de la mues-
tra y el cultivo se procede a la identicacin, realizando la seleccin de las pruebas
de acuerdo con la orientacin preliminar.
En los anexos 4, 6, 7, 14, 22, 23, 25, 26 y 27 se muestran los esquemas de identi-
cacin de algunos los agentes etiolgicos que causan infecciones del tracto respiratorio
inferior.
Procedimiento para el cultivo de otros tipos
de muestras provenientes del tracto respiratorio inferior
u} Fxumon diroctn: se realizar la coloracin de Gram para el tamizaje de la muestra
al igual que el esputo, en el caso de aspirados bronquiales se usan los criterios de
Murray y Washington; mientras que en las muestras obtenidas por mtodos bron-
coscpicos la presencia de ms del 1% de clulas escamosas signica contamina-
cin orofarngea signicativa. Adems, estos especmenes no deben mostrar menos
de un 10% de neutrlos.(14)
58
b} Cultivn: se utilizan los mismos medios primarios que para esputo. Para estos tipos
de muestras se recomienda cultivos cuantitativos que son imprescindibles para po-
der comprender el signicado del o de los patgeno/s aislado/s.(14)
- Culloi loIoscouuo: LI voIumon uo sociocIonos iosIiuloiIus quo so iocogo con
este dispositivo es de aproximadamente 0,01 a 0,001 mL. Despus de obtener
la muestra, el cepillo se coloca en 1 mL de suero siolgico estril, consiguin-
dose de esta forma una solucin de secreciones respiratorias diluidas entre 100
y 1.000 veces. Posteriormente, se realizar un cultivo cuantitativo de esta solu-
cin. Cuando la neumona es clnicamente maniesta, habitualmente las secre-
ciones respiratorias contienen al menos 10
4
UFC por gramo de tejido y 10
5
o ms
bacterias por mililitro de exudado.(14)
- Luvuuo hioncouIvooIui [LBA): on oslo cuso, oI voIumon uo sociocIonos iosI-
ratorias recuperadas se estima en algo ms de 1 mL diluido en el lquido que
se aspira (entre 10 y 100 mL), lo que viene a suponer un factor de dilucin de
1/10-1/100 de las secreciones respiratorias originales. Los puntos de corte han
variado entre 10
3
y 10
5
UFC/mL. No obstante, el umbral diagnstico general-
mente aceptado es el de 10
4
UFC/mL de al menos uno de los microorganismos
aislados en el cultivo.(14)
- TcnIcus cIogus: on oI cuso uoI usIiuuo hionquIuI cIogo y mInI Iuvuuo hionco-
alveolar se han considerado como signicativas concentraciones entre 10
3
y 10
4

UFC/mL. Para el catter telescopado no broncoscpico se acepta el mismo punto
de corte que para el procedimiento guiado.(14)
- AsIiuuo onuoliuquouI: LI umhiuI uIugnoslIco muyoiIluiIumonlo ucoluuo os uo
10
6
UFC/mL. Algunos autores han recomendado un valor de 10
5
UFC/mL como
mejor punto de corte para esta muestra.(14)
Factores a considerar en la interpretacin
de los cultivos cuantitativos de muestras respiratorias
A pesar de establecer estos umbrales diagnsticos para cada una de las muestras
respiratorias, la carga bacteriana debe interpretarse en el contexto clnico especco de
cada paciente. No obstante, el anlisis de los recuentos bacterianos requiere tener en
cuenta la existencia de factores que puedan inuir en la concentracin de microorganis-
mos en las muestras respiratorias:
1. Tiempo de evolucin de la infeccin: Un recuento bajo de microorganismos puede
representar un estadio evolutivo precoz de la infeccin respiratoria.
2. Antibioterapia previa: La exposicin previa a antibiticos es la variable ms impor-
tante y la que ms a menudo reduce la concentracin bacteriana en las muestras
59
respiratorias, particularmente en pacientes que han iniciado un tratamiento anti-
bitico en las 24 horas previas a la recogida de muestras.
3. Existen subgrupos de pacientes con recuentos bacterianos relativamente altos pero sin
los cambios inamatorios que denen la existencia de una neumona, como ocurre con
frecuencia en pacientes con Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crnica.
4. Variabilidad de las tcnicas: Aunque la reproducibilidad cualitativa es alta, se pue-
de observar una variabilidad en el recuento bacteriano que supone un cambio en la
categora diagnstica (por encima o por debajo del punto de corte) de un 25-30%,
tanto en LBA como en catter telescopado.
5. Factor dilucional: Cambios en el volumen en el que se introduce el cepillo del ca-
tter telescopado (universalmente admitido de 1 mL) pueden producir variaciones
dilucionales de la muestra respiratoria recogida e inuir en el recuento de colonias.
En el caso del LBA el problema es mayor debido a la falta de estandarizacin de
la tcnica, en la que se usan distintos volmenes segn los autores. Se desconoce
el efecto del volumen de lquido instilado y del porcentaje recuperado sobre el re-
cuento bacteriano.
6. Otros aspectos tcnicos: Errores en la toma de muestras o retrasos en el envo de las
mismas al laboratorio de microbiologa pueden ser causa de descensos signicati-
vos en los recuentos bacterianos o de sobrecrecimientos inespeccos.(15)
Etapa post-analtica
Una vez realizado el anlisis e interpretacin de los resultados, se procede al repor-
te de los mismos:
u} Bucilnscnpu:
(-): No se encuentran BAR en 100 campos observados.
(+): Menos de 1 BAR por campo en 100 campos observados.
(++): 1 a 10 BAR por campo en 50 campos observados
(+++): Ms de 10 BAR por campo en 20 campos observados.
En caso de encontrar slo uno a cuatro bacilos en cien campos observados debe
ampliarse la lectura a otros 100 campos utilizando una nueva lnea. Al examinar 200
campos y persistir el nmero de bacilos en 1 a 4, realizar un nuevo extendido y si per-
siste el nmero de bacilos, reportar el nmero de bacilos observados y solicitar otra
muestra. (11,12)
b} Cultivn: se realiza el reporte como se seala en el anexo 2.
60
4 Actividad prctica
Materiales
- Guunlos
- Tuuhocu
- AIIcuuoios uo muuoiu
- LmInus oiluohjolos
- LquIo uiu coIoiucIon uo Gium y
Ziehl-Neelsen
- Asu on uio
- PIucus: ugui sungio, ugui clocoIulo y
agar Mac Conkey.
- Iiusco uiu mIciouoioLIIu
- RouclIvos uiu culuIusu y oxIuusu.
Procedimiento
Etapa pre-analtica
El estudiante recibir dos hojas de solicitud de examen con los datos clnicos y
epidemiolgicos del paciente.
Etapa analtica
Cada grupo de trabajo recibir un frotis para la realizacin de baciloscopa y una
muestra de esputo, el profesor dar las indicaciones y condiciones de trabajo necesarias
para el procesamiento.
Primer perodo
Esputo
a) Colocar sobre la mesa de trabajo papel absorbente humedecido con fenol al 5 %.
b) Realizar los frotis de la siguiente manera:
- DIvIuIi un uIIcuuoi uo muuoiu osliII on uos y con Ios oxliomos IiioguIuios
seleccionar la partcula til de la muestra.
- CoIocuiIu sohio Iu ImInu oiluohjolo y oxlonuoiIu con oI uIIcuuoi lucIu oI ox-
tremo opuesto.
- Inu voz loimInuuo oI oxlonuIuo, uosoclui Ios uIIcuuoios on un iocIIonlo con
cloro al 2%.
- Dojui socui uI uIio y Ljui uI cuIoi.
c) A uno de los frotis realizar la coloracin de Gram, y al otro, Ziehl-Neelsen.
d) Sembrar por estra en supercie las placas de AS, ACH y AMK.
61
e) Incubar a 36 C durante 18 24 h, las placas de AS y ACH en microaerolia y AMK
en aerobiosis (Fig. 9).
Frotis entregado
a) Fijar al calor.
b) Realizar la coloracin de Ziehl-Neelsen y dejar secar al aire.
c) Observar con objetivo de inmersin y realizar la lectura como se explic en el marco
terico.
d) Realizar el recuento semicuantitativo y registrar los resultados en la hoja destinada
para tal n.
Segundo perodo
a) Evaluar la ora bacteriana.
b) Practicar anlisis microscpicos utilizando la coloracin de Gram de las colonias
sospechosas de inters clnico.
c) Seleccionar la(s) colonia(s) de inters y puricarlas en el medio de cultivo utilizado
en el aislamiento primario e incubar en las mismas condiciones.
d) Realizar algunas pruebas preliminares como catalasa, oxidasa, etc., de acuerdo a lo
observado en los cultivos y examen microscpico.
Tercer perodo
a) Realizar la identicacin de el o los microorganismos de inters clnico utilizando
los esquemas de identicacin (ver anexos) de acuerdo a la orientacin.
b) Realizar el antibiograma por el mtodo de Kirby-Bauer.
Cuarto perodo
a) Lectura de las pruebas bioqumicas y pruebas de susceptibilidad.
Etapa post-analtica
Cultivo
a) Interpretacin de las pruebas bioqumicas y antibiograma.
b) Reporte de los resultados
62
Frotis
a) Realizar el reporte del resultado (Anexo 2).
Autoevaluacin
1. Seale la utilidad de la coloracin de Gram en el procesamiento de una muestra de
esputo.
2. Seale tres agentes etiolgicos bacterianos ms frecuentemente implicados en in-
fecciones del tracto respiratorio inferior.
3. Seale los objetivos de la baciloscopa.
4. Si en una baciloscopa se observan de 1 a 4 bacilos en promedio por campo. Seale
la conducta a seguir.
5. Qu conducta se debe seguir si al procesar una muestra de esputo se observan 25
clulas epiteliales y 10-25 leucocitos por campo de bajo aumento (10X)?
6. Cmo se explica el siguiente resultado: Baciloscopa: Negativa (no se observan
BAR en 100 campos observados); Cultivo: Positivo para M. tuberculosis?
7. Se puede establecer el diagnstico etiolgico cuando se observan BAR en el exa-
men directo de esputo?
8. Seale la importancia del proceso de decontaminacin para el cultivo de micobac-
terias.
9. Al procesar una muestra de esputo se obtienen los siguientes resultados:
- Lxumon uIioclo [CoIoiucIon uo Gium): -1u cIuIus oIloIIuIos y 2-8u PMN oi
campo de bajo aumento. Se observ predominio de cocos grampositivos en pa-
res y cadenas cortas.
- CoIoiucIon uo ZIoIl-NooIson: No so ohsoivuion BAR on 1uu cumos ohsoivu-
dos.
- CuIlIvo: coIonIus oquonus, cIicuIuios, liunsuionlos, hiIIIunlos, -hemolticas
hasta el tercer cuadrante.
- CuluIusu nogulIvu, LAP nogulIvu y uI Gium so ohsoivu Iu mIsmu moiIoIogIu ohsoi-
vada en el examen directo.
a) Seale las pruebas que se le realizaran para hacer la identicacin denitiva
del microorganismo.
b) Qu valor diagnstico Ud. le dara a los hallazgos obtenidos?
63
Bibliografa
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65
prctica 5
Diagnstico microbiolgico
de las infecciones ticas
Emma Araujo y Aurora Longa
Objetivo general
Aplicar los mtodos convencionales para el diagnstico microbiolgico de las in-
fecciones ticas.
1. Describir las condiciones adecuadas para la toma de muestra en los sitios anatmi-
cos relacionados con el cuadro clnico.
2. Analizar macroscpicamente y microscpicamente la muestra en estudio.
3. Cultivar la muestra obtenida para el aislamiento de los agentes patgenos.
4. Valorar el crecimiento obtenido en los distintos medios de cultivo.
5. Identicar los microorganismos de inters clnico.
6. Realizar pruebas de susceptibilidad antimicrobiana a los agentes etiolgicos bacte-
rianos.
7. Analizar los resultados obtenidos.
8. Elaborar el reporte de los resultados.
Aspectos tericos
La mayor parte de las infecciones del odo afectan el conducto auditivo externo
(otitis externa) o la cavidad media (otitis media) que contiene los huecesillos y est ro-
deada por otras estructuras seas y la membrana timpnica. La otitis es una enfermedad
del odo caracterizada por inamacin de la mucosa del odo externo, medio o interno
(mastoides), perforacin de la membrana timpnica y otorrea. Esta patologa se puede
clasicar sobre la base de consideraciones clnicas o histopatolgicas. Segn su dura-
cin se puede subdividir en fase aguda y crnica. La fase aguda se reere a la inltracin
66
PRCTICA 5 Diagnstico microbiolgico de las infecciones ticas
de polimorfonucleares y a los signos clsicos de inicio brusco y duracin breve y la fase
crnica se reere a procesos prolongados y con menos signos inamatorios.(1)
- Otitis oxtornu: se dene como la infeccin aguda o crnica del odo externo. Los
factores de importancia en la patogenia de la otitis externa incluyen: traumatismo
local, furunculosis, cuerpos extraos, o humedad excesiva, que causa maceracin
del epitelio del odo externo (odo del nadador). Algunas veces se desarrolla otitis
externa como extensin de una infeccin del odo medio, con drenaje purulento a
travs de la membrana timpnica perforada.(1)
- Otitis modiu: el trmino de otitis media se reere a la inamacin del odo medio e
incluye no solo a esa cavidad sino tambin a la trompa de Eustaquio y mastoides.
Se produce inltracin por polimorfonucleares y se observan los signos clsicos de
inamacin aguda. Segn la duracin, puede dividirse en aguda y crnica.(2) La
trompa de Eustaquio, que comunica el odo medio con la nasofaringe y realiza tres
funciones: ventilacin, proteccin y limpieza a travs del transporte mucociliar,
parece tener una participacin importante en la predisposicin de los pacientes
a este tipo de infeccin. Las infecciones virales respiratorias superiores o los tras-
tornos alrgicos pueden causar inamacin y edema de la trompa de Eustaquio
o su oricio alterando sus funciones, la ms importante puede ser la ventilacin,
cuando sta se pierde se absorbe oxgeno del aire hacia el odo medio y se genera
presin negativa. La presin a su vez permite la entrada de bacterias potencialmen-
te patgenas de la nasofaringe hacia el odo medio y el fracaso de su eliminacin
normal puede ocasionar colonizacin e infeccin. Otros factores que pueden llevar
a afecciones de la funcin de la trompa de Eustaquio son anomalas anatmicas,
como hipertroa tisular o cicatrizacin alrededor del oricio, disfuncin muscular
vinculada con paladar hendido y falta de rigidez de la pared de la trompa. Esta l-
tima, es frecuente en la lactancia y la niez temprana, mejora con la edad y puede
explicar en parte por qu la otitis media aparece ms a menudo en lactantes de seis
a 18 meses de edad y despus disminuye de frecuencia al establecerse la permeabi-
lidad de la trompa de Eustaquio.(1)
- Otitis modiu ugudu (OMA}: es una inamacin de la cavidad del odo medio aso-
ciada a una infeccin aguda, con acmulo de lquido generalmente purulento y
que se asocia a signos como: membrana timpnica opaca o hipermica, que puede
estar abombada y con poca movilidad a la neumatoscopia y sntomas como: otalgia,
ebre, irritabilidad, anorexia, vmito y disminucin de la audicin.
Es una complicacin frecuente (30%) de las infecciones agudas de las vas respi-
ratorias en nios de 3 meses a 3 aos de edad, que se incrementa en aquellos que
asisten a guardera. Existen varias entidades nosolgicas dentro de la otitis media
67
Emma Araujo y Aurora Longa 5
aguda y del adecuado reconocimiento de cada una de ellas depender el manejo
apropiado del paciente.
- Otitis modiu sornsu: es la presencia de un trasudado lquido en la cavidad del odo
medio en un paciente asintomtico (sin datos de infeccin aguda). Con frecuencia
es posible visualizar un trasudado de color mbar o ligeramente azulado a travs
de una membrana timpnica translcida intacta. Sin embargo, el hallazgo ms fre-
cuente es una membrana timpnica opaca.
- Otitis modiu ugudu rocurronto: es la presencia de episodios repetidos de OMA
con periodos de completa recuperacin (sin secrecin) del odo medio entre cada
uno de stos. Para que un nio sea diagnosticado con OMA recurrente debe haber
tenido tres o ms episodios de OMA en los ltimos seis meses, o cuatro durante el
ltimo ao.
- Otitis modiu ugudu nn cnmplicudu: es la presencia de OMA en un nio sin la pre-
sencia simultnea de otras complicaciones tales como bacteremia, mastoiditis, me-
ningitis, sinusitis o absceso cerebral.(3)
- Otitis modiu crnicu (OMC}: El nombre de otitis crnica se aplica a la inltracin
del mucoperiostio por clulas esfricas, es decir, las de inamacin crnica. Suele
ser producto de infeccin aguda que no se ha resuelto de modo apropiado, ya sea
por tratamiento inadecuado en la fase aguda o por factores del husped que perpe-
tan el proceso inamatorio (ej. disfuncin continua de la trompa de Eustaquio por
factores alrgicos, anatmicos o inmunodeciencia). Las secuelas incluyen destruc-
cin progresiva de las estructuras del odo medio y riesgo signicativo de sordera
permanente. La patognesis de la OMC no es bien conocida. Las causas de la OMC
son complejas y varan de un paciente a otro; entre ellas se incluyen defectos del
desarrollo, como en el caso de la sura palatina, movilidad disminuida del extremo
farngeo de la trompa de Eustaquio (adenoides grandes, tumores), infecciones de
adenoides o de los senos paranasales con estasis linftica en la trompa, tumefac-
ciones alrgicas de la mucosa tubotimpnica. Tambin se han descrito condiciones
anatomofuncionales locales predisponentes como la disfuncin tubaria y escasa
neumatizacin mastoidea. Puede ser supurada o no, en el primer caso hace referen-
cia a una infeccin clnica activa.(1, 2)
Epidemiologa
La otitis media sornsu (socrotnriu} se reconoce como la patologa mas frecuente
de la edad peditrica y una de las patologas sobre la que ms inters, discusiones y
controversias se producen, debido fundamentalmente a las especiales caractersticas
que la acompaan. La ms importante es, sin duda, que usualmente no produce los sn-
tomas que esperamos encontrar en una patologa que puede ocasionar complicaciones
68
tan serias, anatmicas y funcionales, en el paciente que la padece. Es por esto que se le
denomina sndrome silencioso. Por este motivo gran cantidad de episodios de otitis
medias secretorias pasan sin ser diagnosticadas con las consecuentes alteraciones fsicas
y de desarrollo intelectual como: retraso en la adquisicin del lenguaje, retraso escolar y
alteraciones del comportamiento.
Todas estas caractersticas hacen que la incidencia real de la enfermedad sea desco-
nocida, aunque muchos autores han tratado de establecer porcentajes aproximados.(4)
La OMA es una de las enfermedades que se diagnostican con mayor frecuencia en ni-
os menores de 5 aos en todo el mundo. Un reporte mostr que se identica desde 22,7%
de los nios durante el primer ao de vida hasta 40% en nios de 4 a 5 aos de edad.(3)
La prevalencia de infecciones recurrentes del odo medio parece ir en aumento debido
a una asistencia cada vez mayor de nios a guarderas, o a problemas alrgicos. Algunos
estudios prospectivos han demostrado que en nios de 3 meses a 3 aos de edad con infec-
ciones agudas de vas respiratorias superiores, una tercera parte llegan a complicarse con
OMA, y que los nios menores de 2 aos que asisten a guarderas tienen episodios de OMA
y sntomas de vas respiratorias persistentes con una frecuencia aun mayor.
Otros factores de riesgo conocidos para el desarrollo de OMA temprana en nios son
el tabaquismo pasivo, el uso del chupn y la alimentacin con bibern en posicin horizon-
tal.(3)
En algunos casos hay persistencia de secrecin estril posterior a la resolucin de la
infeccin aguda, sta puede variar entre 1 y 3 meses. Existen factores de riesgo implicados
en esta persistencia como: bajo peso al nacer y prematuridad, sexo masculino, condiciones
socioeconmicas desfavorables, asistencia a guarderas, polucin y tabaco, tipo de lactancia,
la edad del primer episodio, factores genticos e inmunitarios y cambios en la climatologa;
adems, inuyen en la aparicin, recurrencia y evolucin de la enfermedad. Estas mltiples
causas van a dar lugar a una disfuncin de la trompa de Eustaquio, esta situacin es tambin
favorecida por las diferencias entre la trompa infantil y la adulta.(4)
Una de las complicaciones ms frecuentes de la OMA es el desarrollo de OM serosa
con la consiguiente disminucin de la audicin. Cuando sta se prolonga, se acompaa
de una afectacin potencial en el aprendizaje y en la expresin del lenguaje. Otras menos
frecuentes, que si no son reconocidas a tiempo pueden poner en riesgo la vida de los nios,
son la mastoiditis y los abscesos intracerebrales. Aunque estudios con controles histricos
indican que estas complicaciones supurativas parecan ocurrir con mayor frecuencia en la
era preantibitica, 13 de los casos reportados en la era postantibitica con frecuencia se aso-
cian a un manejo inapropiado del episodio de OMA.
De acuerdo con una estimacin de la Organizacin Mundial de la Salud en pases en
vas de desarrollo, el nmero de muertes asociadas a las complicaciones de la OMA en nios
menores de cinco aos llega a 50.000 al ao. Esto podra estar asociado a un reconocimiento
tardo de dichas complicaciones o al efecto de un estado nutricional precario.(3)
69
Manifestaciones
La otitis externa se caracteriza por inamacin del conducto auditivo y drenaje
purulento, que puede ser muy doloroso con extensin de la celulitis a los tejidos blan-
dos adyacentes. Una forma frecuente se vincula con la natacin en agua tal vez conta-
minada por microorganismos aerobios gramnegativos como especies de Pseudomonas.
La otitis externa maligna es una forma considerablemente ms grave de infeccin del
conducto auditivo externo, que puede llevar a la invasin del cartlago y hueso adyacen-
tes y en ocasiones a la parlisis de nervios craneales y la muerte. Se observa con mayor
frecuencia en ancianos con diabetes mellitus y en pacientes de cualquier edad con in-
munosupresin. El agente patgeno causal ms frecuente es P. aeruginosa.
La otitis media aguda, casi siempre producida por bacterias, suele ser una com-
plicacin de las enfermedades virales agudas de las vas respiratorias superiores. Se
maniesta frecuentemente con ebre, irritabilidad y dolor agudo y el estudio otoscpico
revela protrusin de la membrana timpnica, mala movilidad y ocultamiento de los
puntos de referencia anatmicos normales por la presencia de lquido y clulas inama-
torias bajo presin. En algunos casos la membrana timpnica est inamada de manera
aguda y presenta ampollas en su supercie externa (miringitis). Si se trata de forma
inadecuada, la infeccin puede avanzar hasta afectar estructuras adyacentes, como las
clulas areas mastoideas (mastoiditis), o causar la perforacin con drenaje espontneo
a travs de la membrana timpnica. Las posibles secuelas supurativas agudas incluyen
extensin hacia el sistema nervioso central y septicemia.
Como ya se haba mencionado antes, la otitis media crnica suele ser producto de
una infeccin aguda que no se resolvi de modo apropiado.
La otitis media serosa puede representar una forma de otitis media o inamacin
relacionada con alergia crnica. Tiende a ser crnica, produce dcit auditivo y se vin-
cula con secreciones espesas en el odo medio que por lo general no son purulentas.
1
Flora habitual del odo externo
La microbiota general del odo externo es similar a la de la piel, predominando
Staphylococcus (coagulasa-negativo) y miembros del gnero Corynebacterium. Con
menos frecuencia se observan especies de Bacillus, Micrococcus y Neisseria. En esta
localizacin se han aislado tambin otros microorganismos que colonizan la piel en
forma transitoria como Streptococcus pneumoniae, P. aeruginosa y especies de la fa-
milia Enterobacteriaceae, entre ellos, los gneros Proteus, Escherichia, Enterobacter
y Klebsiella. Estudios micolgicos demuestran que los siguientes gneros de hongos
pertenecen a la microbiota normal: Aspergillus, Alternaria, Penicillium, Candida y
Saccharomyces.(5,6)
70
Agentes causales comunes
Desde hace dcadas, los patgenos bacterianos asociados a OMA han permanecido
sin cambios signicativos, en los distintos grupos de edad as como en reas geogrcas
(Tabla 13). Despus de los primeros tres meses de vida, S. pneumoniae es el agente cau-
sal ms aislado de otitis media aguda y representa 35 a 40% de los casos. H. inuenzae
tambin es comn (14-27%), en particular, en pacientes menores de cinco aos de edad.
Casi ningn tipo de H. inuenzae aislado del odo medio se puede identicar; por tanto,
no cabra esperar que la vacuna actual contra la cepa de tipo b redujera de manera
notoria la incidencia de otitis media aguda.
TABLA 13. Agentes etiolgicos ms frecuentes de infecciones ticas
Sin embargo, slo en el 58 a 75% de los casos se logra aislar alguna bacteria. Estu-
dios realizados para la identicacin de agentes virales en el lquido del odo medio de
pacientes con OMA han demostrado su presencia en 41% de ellos, pudiendo coexistir
hasta tres virus de manera simultnea, que por orden de frecuencia son: Virus sincicial
respiratorio, virus parainuenza e inuenza. La coexistencia bacterias-virus en el lqui-
do del odo medio es una causa de otitis media aguda persistente y un retraso de 2 a 4
das en la esterilizacin del lquido por los antimicrobianos.(1,3)
Cuadro clnico Agentes etiolgicos
Otitis externa Es frecuente Pseudomonas aeruginosa; en ocasiones, especies de
Proteus, E. coli y S. aureus; las bacterias que se encuentran en la oti-
tis media tambin pueden recuperarse si el proceso es secundario a
la infeccin del odo medio con perforacin y drenaje a travs de la
membrana timpnica; los hongos, como las especies de Aspergillus,
participan en ocasiones.
Otitis media aguda Streptococcus pneumoniae, Estreptococos del grupo B,
< 3 meses de edad Haemophilus influenzae, S. aureus, P. aeruginosa y bacterias
entricas gramnegativas.

> 3 meses de edad Streptococcus pneumoniae y Haemophilus inuenzae son
los ms frecuentes; otros incluyen Streptococcus pyogenes,
Moraxella catarrhalis y S. aureus.
Otitis media crnica Flora mixta en 40% de los casos con cultivo. Los microorganis-
mos frecuentes incluyen P. aeruginosa, Haemophilus inuenzae,
S. aureus, especies de Proteus, K. pneumoniae, Moraxella
catarrhalis y bacterias anaerobias grampositivas y gramnegativas.
Otitis media serosa Igual que la otitis media crnica; sin embargo, muchos de esos
derrames son estriles, con relativamente pocas clulas inama-
torias agudas.
Tomado de: Ryan y Ray, 2004.
71
Diagnstico
El diagnstico de las infecciones ticas se establece con base a la exploracin
clnica. En casos de sospecha de otitis media se puede hacer timpanometra para de-
tectar la presencia de lquido en el odo medio y valorar la funcin de la membrana
timpnica. La causa especca de la otitis externa puede determinarse por cultivo
de material obtenido del conducto auditivo afectado; no obstante, debe tenerse en
cuenta que la contaminacin supercial y la ora cutnea normal pueden originar
cultivos mixtos que son origen de confusin. Por ello, es recomendable tomar mues-
tra del material de ambos conductos auditivos.
En la otitis media, el mtodo diagnstico ms preciso es la aspiracin cuidadosa
con una aguja estril a travs de la membrana timpnica, despus de descontaminar
el conducto auditivo. La tincin de Gram y el cultivo de tales aspirados son muy
conables; empero, dichos procedimientos se reservan para pacientes en los que
las posibles causas son muy variadas, como en lactantes pequeos o cuando existe
inadecuada respuesta clnica al tratamiento antimicrobiano usual. No se puede con-
ar en los cultivos del aparato respiratorio ni en los de nasofaringe para emitir un
diagnstico causal.(1)
Para el anlisis de secrecin tica, se debe tomar en cuenta el tipo de otitis que
presente el paciente: otitis externa, otitis media serosa con o sin ruptura timpnica.
Una vez hecho esto se tomar la muestra dependiendo del caso. Si se trata de una
otitis externa se limpia el canal externo con solucin salina siolgica estril y se
introduce un hisopo estril en el conducto auditivo externo. Los cultivos de canal
auditivo externo generalmente no reejan la causa bacteriana de la otitis media, a
menos que haya habido una ruptura reciente de membrana del tmpano.
Con respecto a la secrecin tica de odo medio, sta es una muestra que debe
ser obtenida a travs de un procedimiento mdico; posterior a la limpieza del canal
auditivo externo con un antisptico suave, se recolecta la muestra mediante aspira-
cin, desde el tmpano o ms atrs.(7)
Si las muestras no son tomadas en el laboratorio stas pueden ser transportadas
en frasco estril o en medio de transporte Stuart, mantenindose a temperatura am-
biente hasta 2 horas luego de la toma.
Para investigar hongos es necesario incluir exmenes en fresco que permitan
observar sus estructuras caractersticas as como medios de cultivo que permitan su
desarrollo y posterior identicacin.
Si se requiere la realizacin de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana tener
en cuenta la eleccin del agar Mueller Hinton (Mueller Hinton bsico, Mueller Hin-
ton con 5% de sangre y Mueller Hinton con 2% de cloruro de sodio) dependiendo
del microorganismo identicado.
72
Tratamiento
Excepto en casos graves, la otitis externa puede tratarse mediante limpieza sua-
ve con soluciones tpicas. Las bacterias gramnegativas ms a menudo referidas son
susceptibles a un ambiente cido y suelen ser ecaces las soluciones ticas amorti-
guadas a un pH bajo (3.0 o menos), como aquellas con cido actico al 0,25%. Se dis-
pone de varios preparados, de los cuales un gran porcentaje de los mismos tambin
contienen antimicrobianos.
La otitis media aguda requiere de antimicrobianos y vigilancia cuidadosa de
la evolucin para asegurar su resolucin. La seleccin del antimicrobiano suele ser
emprica, ideada de forma especca para cubrir a los patgenos bacterianos ms
frecuentes, porque la aspiracin directa para nes diagnsticos casi nunca es nece-
saria. En el caso habitual, esos microorganismos patgenos son S. pneumoniae y H.
inuenzae. Si hay presin extrema con dolor intenso, tal vez sea necesario el drenaje
de los exudados del odo medio mediante incisin cuidadosa de la membrana tim-
pnica. En pacientes con otitis media serosa o crnica, el tratamiento tal vez sea ms
complejo y suele aconsejarse buscar interconsulta otorrinolaringolgica para deter-
minar procedimientos diagnsticos adicionales, as como planear posibles medidas
teraputicas mdicas y quirrgicas.(1)
5 Actividad prctica
Etapa pre-analtica
Aspectos a considerar del paciente
- So uoho lomui on cuonlu lIo uo olIlIs quo iosonlu.
- Nomhio, ouuu, sexo, cdula de identidad, ocupacin, procedencia
- SIgnos y sInlomus, ImiosIon uIugnoslIcu
- HIsloiIu cIInIcu uoI ucIonlo
- SI osl iocIhIonuo o iocIhIo uIgn lIo uo liulumIonlo
Aspectos a considerar de la muestra
- SI oI IuhoiuloiIo osl on cuucIuuu uo lomui y iocosui Iu muosliu uiu oI oxumon io-
querido.
- SI Iu muosliu no Iuo lomuuu on oI IuhoiuloiIo so uoho lonoi on cuonlu: sI vIono hIon
rotulada, transportada de forma adecuada, tiempo de toma de la muestra, si es apta
para el tipo de anlisis a realizar, si est en suciente cantidad.
73
Etapa analtica
Primer perodo
Materiales
- HIsoos osliIIos - KOH uI 1u
- SoIucIon suIInu LsIoIogIcu osliII [SSI) - Ln cuso uo luhoi ohsoivuuo osliucluius
fngicas: Agar saboraud dextrosa con y sin
antibiticos, agar actidione, bilis-agar.
- Ln cuso uo quo Iu muosliu sou lomuuu
a distancia del laboratorio debe trans-
portarse en el medio Stuart.
- MouIos uo cuIlIvo: ugui sungio, ugui
chocolate suplementado, agar Mac-
Conkey y agar manitol salado.
- LquIos uiu lIncIon uo Gium
- LmInus y IumInIIIus
Procedimiento
Toma de muestra del conducto auditivo externo:
1. Limpiar el canal auditivo externo con un hisopo impregnado con SSF.
2. Humedecer varios hisopos estriles con solucin salina igualmente estril y to-
mar la muestra del conducto auditivo externo de cada odo. Introducir el hisopo
siguiendo una direccin oblicua de atrs hacia delante y de abajo hacia arriba.
Obtener la muestra del margen activo, incluyendo la secrecin fresca de reas pro-
fundas.
3. Realizar un examen directo y colorearlo con la tincin de Gram con muestra prove-
niente de cada odo, los hisopos se descartan una vez utilizados.
4. Preparar exmenes en fresco con SSF y KOH si se sospecha de hongos.
Describa lo observado:
Gram de odo derecho Gram de odo izquierdo
SSF KOH 10%
74
5. Sembrar la muestra de cada odo por separado en una misma placa. Hacer este pro-
cedimiento con cada uno de los agares (Fig. 10).
6. Diseminar e incubar bajo condiciones de microaerolia a 37
o
C por 24-72 horas los
medios de agar sangre y agar chocolate suplementado y en aerobiosis el agar Mac-
Conkey y el agar manitol salado

Figura 10. Procedimiento para el cultivo de secrecin tica
Segundo perodo
Materiales
- HIsoos osliIIos - Pulion uo McIuiIunu.
- SoIucIon suIInu LsIoIogIcu osliII [SSI) - DIscos uo unlIhIolIcos.
- MouIos uo cuIlIvo: Agui MuoIIoi HInlon,
agar Mueller Hinton ms 5% de sangre.*,
Mueller Hinton ms 2% de cloruro de sodio*
- LquIos uiu lIncIon uo Gium
- LmInus
- Piuohus hIoquImIcus uoonuIon-
do de la bacteria en estudio.
* Depende del microorganismo aislado.
Muestra
(Conducto auditivo externo)
Gram
SSF
KOH al 10 % * AS ACH AMK AMS
Incubar a 36 C
por 24 h en
microaerofilia
Incubar a 36 C
por 24 h en
aerobiosis
Estudio macroscpico
de colonias
de un patgeno
Pruebas bioqumicas
Antibiograma
Identificacin bioqumica y
lectura del antibiograma
Reporte
Gram
Observacin de elementos
fngicos
Sembrar en agar Saboraud
dextrosa con y sin antibitico,
bilis esculina, agar actidione.
Positivo
Identificacin
Incubar
3-8 das
a TA
Incubacin 36 C
x 18-24 h
Si no se observan colonias de
inters reincubar hasta 48 h en
las mismas condiciones.
Sembrar en agar Saboraud
dextrosa con y sin antibitico,
agar bilis, agar actidione.
36 C
36 C
36 C
75
Procedimiento
1. Revisin de los cultivos sembrados cada 24 horas hasta las 72 horas de incubacin.
Describa las caractersticas observadas en cada medio de cultivo:
Agar sangre
Agar chocolate con suplemento
Agar Mac Conkey
Agar manitol salado
2. Hacer un extendido para la coloracin Gram y observar microscpicamente los
diferentes tipos de colonias encontrados en el cultivo.
Describa lo observado:
3. Hacer una suspensin en caldo BHI de la bacteria en estudio, si fuere necesario.
4. Realizar las pruebas bioqumicas dependiendo de la bacteria aislada por identicar
e incubar dichas pruebas a temperatura y tiempo adecuado.
76
5. Realizar prueba de susceptibilidad a los agentes antimicrobianos.
Tercer perodo
Materiales
- RouclIvo uiu iuohu uo oxIuusu.
- RouclIvo uiu iuohu uo culuIusu.
(Perxido de hidrgeno).
- PuoI uo LIlio.
- PuIIIIos uo muuoiu.
Lectura e interpretacin de las pruebas bioqumicas.
Anote los resultados:
1. Cotejar con tablas de identicacin bacteriana.
2. Leer prueba de susceptibilidad a los agentes antimicrobianos.
Etapa post-analtica
Realizar el reporte nal (Anexo 2).
Autoevaluacin
1. Cules son los diferentes tipos de muestra para el diagnstico microbiolgico de
una infeccin tica?
2. Qu medios de cultivo utilizara usted en una secrecin tica?
77
3. Qu factor contribuye a que en un nio de corta edad se instalen con mayor
facilidad grmenes de la regin rinofarngea?
4. Describa detalladamente los pasos a seguir para realizar una toma de muestra de
secrecin tica del conducto auditivo externo.
5. Qu medios de transporte utilizara usted para trasladar una muestra tomada a
distancia?
6. Nombre las diferentes bacterias patgenas que originan problemas ticos.
7. Por qu se incluye examen en fresco con SSF y KOH 10%?
8. Por qu los nios menores de 5 aos son ms propensos a sufrir de OMA?
9. Describa los pasos a seguir al realizar el informe de un paciente con secrecin
tica.
Bibliografa
(1) Ryan K, Ray C. Sherris. Microbiologa mdica. 4 ed. Mxico: Mc Graw Hill; 2004.
(2) Bernldez P, Morales G, Quantin L, Hernndez C, Litterio M. Otitis media crnica
supurada en nios. Arch. Argent Pediatr 2004; 102(3):174-179.
(3) Villaseor Sierra, A. Actualidades en el diagnstico, tratamiento y prevencin de la
otitis media aguda. Enferm Infec Microbiol 2004; 24 (3). Disponible en red: www.ami-
mc.org.mx/revista/2004/vol_24-3/actualidades.htm
(4) Prez-Piero B, Campos M, Castro-Conde J, Lpez-Aguado D. Otitis media serosa.
Canarias Peditrica 2000; 24 (1): 65-76.
(5) Murray P, Rosenthal K, Kobayashi G, Pfaller M. Microbiologa mdica. 4 ed. Espaa:
Mosby; 2004.
(6) Prescott L, Harley J, Klein D. Microbiologa. 4 ed. Madrid: McGraw-Hill; 2000.
(7) Montiel F, Lam M. Manual de microbiologa clnica. Chile: Publicaciones Mediterrneo;
2001.
79
prctica 6
oculares
Kiralba Snchez
Objetivo general
Desarrollar la estrategia metodolgica para el diagnstico de infecciones oculares.
1. Enumerar los microorganismos de la ora habitual y los principales patgenos
del rgano de la visin.
2. Describir los principales cuadros infecciosos que afectan al rgano de la vi-
sin.
3. Describir las condiciones del paciente y la tcnica adecuada para la obtencin
de secrecin y raspado conjuntival.
4. Obtener y procesar muestras de secrecin y raspado conjuntival para la investi-
gacin de agentes productores de conjuntivitis.
5. Identicar los microorganismos de inters clnico segn los esquemas conven-
cionales del diagnstico microbiolgico.
6. Distinguir un proceso infeccioso de un proceso alrgico a travs de la deteccin
de eosinlos.
Aspectos tericos
El rgano de la visin en su conjunto cuenta con un sistema altamente espe-
cializado para hacerle frente a las injurias del medio ambiente externo, como una
capa resistente de colgeno que recubre las estructuras intraoculares y membranas
conjuntivales que tapizan los prpados y se extienden sobre la supercie del globo
ocular. Las pestaas previenen la entrada de cuerpos extraos en el ojo durante el
parpadeo (aproximadamente de 5 a 20 veces por minuto). Las secreciones de las
80
PRCTICA 6 Diagnstico microbiolgico de las infecciones oculares
glndulas lagrimales y de las clulas caliciformes arrastran las bacterias y materiales
extraos. Por otra parte, la lisozima y la Ig A son secretadas localmente coadyuvando
en la defensa natural del ojo.(1)
En el saco conjuntival existe una microbiota habitual relativamente escasa. En-
tre los microorganismos que se encuentran con mayor frecuencia se citan: Staphylo-
coccus epidermidis, Lactobacillus sp. y Corynebacterium sp. Entre 0-30% de las
personas son portadores de S. aureus y Haemophilus inuenzae no tipicables en
0,4-25%. En un pequeo porcentaje de individuos se presentan Moraxella catarrha-
lis, algunas Enterobacterias, S. pyogenes, S. pneumoniae, otros alfa y beta-hemolti-
cos.(2)
Cuadros clnicos y etiologa
- Cnn|untivitis: es una de las causas ms frecuentes de enfermedad ocular. Se
dene como un estado inamatorio de la conjuntiva, con hiperemia conjuntival
(dilatacin de los vasos sanguneos) o con hemorragia subconjuntival. La mayo-
ra de las conjuntivitis son de etiologa infecciosa (ocasionadas principalmente
por virus o bacterias) y en algunos casos por procesos alrgicos.(3) En la tabla
14, se presentan los signos y sntomas diferenciales de la conjuntivitis aguda.
TABLA 14. Rasgos diferenciales de la conjuntivitis aguda
Tomado de: Beer y Berkow, 1999.
La conjuntivitis aguda es la presentacin clnica ms comn, segn su etiologa se
clasica en:(3,4,5)
- Conjuntivitis no gonoccica: ocasionada frecuentemente por S. aureus, S. pneumo-
niae y H. inuenzae biogrupo aegyptius, Moraxella lacunata; stos se adquieren
por inoculacin mano-ojo y por fmites.
Etiologa
Caractersticas
de la secrecin
Tipo celular
predominante
Edema
palpebral
Prurito Adenopata
Bacteriana purulenta
leucocitos poli-
morfonucleares
Moderado no no
Viral clara mononucleares mnimo no frecuente
Alrgica
clara, mucoi-
de en hebras
eosinlos
Moderado
a intenso
intenso no
81
Kiralba Snchez 6
- Conjuntivitis gonoccica: producida por N. gonorrhoeae, afecta principalmente
a los adultos que se contagian por un contacto sexual con sujetos con gonorrea
o por autoinoculacin (genital-mano-ojo). El neonato puede infectarse durante
el paso por el canal de parto de la madre con infeccin gonoccica.
- Conjuntivitis de inclusin: causada por Chlamydia trachomatis serotipos D has-
ta la K, se produce en los adultos (por autoinoculacin) y en los neonatos (du-
rante el paso por el canal de parto infectado).
- Conjuntivitis alrgica: producida por una reaccin de hipersensibilidad tipo I o
analctica frente a determinados antgenos, como plenes que son transporta-
dos por el aire.
La conjuntivitis crnica: se caracteriza por exacerbaciones y remisiones duran-
te meses o aos. Los sntomas son similares a los de la conjuntivitis aguda, aunque
menos intensos, puede presentarse hiperemia conjuntival con secrecin acuosa, mu-
coide o sin ella. Las causas son variadas: infecciosas, alrgicas, iatrognicas, entre
otras.(3)
El tracoma: es un tipo de conjuntivitis crnica producida por C. trachomatis
serotipos A, B, Ba y C; cursa con hipertroa folicular conjuntival, neovasculariza-
cin corneal y cicatrizacin grave de la conjuntiva, crnea y prpados, que pueden
conducir a una prdida irreversible de la visin.(5)
Otros cuadros clnicos menos frecuentes se citan a continuacin:
- Queratitis: es la inamacin de la crnea producto de la aplicacin de medidas
quirrgicas con nes curativos o correctivos y del uso indiscriminado de ciertos
medicamentos tipo corticoesteroides o antibiticos, as mismo estn implicados
en un 60-90% las infecciones bacterianas producidas por: Pseudomonas aeru-
ginosa, S. aureus o Streptococcus del grupo viridans, tambin levaduras como
Candida albicans.(6)
- Blefaritis: es una inamacin del borde palpebral con hiperemia, engrosamien-
to y formacin de escamas o costras o lceras superciales. Las de origen infec-
cioso son producidas principalmente por S. aureus. La blefaritis crnica es cau-
sada por Demodex folliculorum, especies de Corynebacterium y Staphylococcus
sp.(3,6)
- Orzuelo: induracin redondeada y dolorosa localizada en el folculo de la pes-
taa o en una o ms glndulas de Zeis, Moll o de Meibomio. El microorganismo
implicado generalmente es S. aureus.(3)
82
Diagnstico
El diagnstico etiolgico de las infecciones oculares requiere de un cuidado mi-
nucioso en el momento de la obtencin de la muestra. Es de resaltar que la muestra
a seleccionar juega un papel muy importante para la deteccin de algunos microor-
ganismos fastidiosos y complejos para su deteccin.
Etapa pre-analtica
El estudio epidemiolgico del paciente incluye, adems de los datos liatorios
del paciente, la impresin diagnstica, evolucin clnica del proceso infeccioso (ver
cuadros clnicos), antecedentes de traumatismos, enfermedades subyacentes, usos
de lentes de contacto, uso de corticoesteroides tpicos, entre otros.(2)
Etapa analtica
La obtencin de la muestra constituye un punto clave para la consecucin de
un resultado conable. En la tabla 15 se especican los tipos de muestras que son
requeridos segn el cuadro clnico, asimismo, los microorganismos patgenos y po-
tencialmente patgenos que se asocian a cada caso.(3,7)
83
Kiralba Snchez 6
TABLA 15. Tipos de muestras y patgenos a investigar
en infecciones oculares
Cuadro clnico Tipo de muestra Patgenos a investigar
Conjuntivitis aguda
Secrecin conjuntival
Raspado conjuntival
C. trachomatis
1
H. inuenzae biogrupo aegyptius
S. aureus
S. pneumoniae
N. gonorrhoeae
Moraxella lacunata
Enterobacterias
2
P. aeruginosa
2
Queratitis Raspado de cornea
3
S. aureus
P. aeruginosa
Streptococcus del grupo viridans
Staphylococcus coagulasa negativo
Aspergillus niger
Fusarium sp.
Acanthamoeba sp.
4
Endoftalmitis
Aspirado de humor vtreo, lqui-
do de cmara anterior por para-
centesis
3

S. aureus
S. pneumoniae
P. aeruginosa
B. subtilis
5
Mycobacterium sp.
Streptococcus sp.
Celulitis orbital
Secrecin purulenta
Aspirado de lesin
S. aureus
S. pyogenes
S. pneumoniae
H. inuenzae
Blefaritis
Raspado palpebral
Pestaas
6
S. aureus
Staphylococcus sp.
Corynebacterium sp.
Demodex folliculorum
1
Para la investigacin de C. trachomatis obtener raspado conjuntival.
2
En pacientes inmunocomprometidos.
3
Muestras obtenidas por el especialista en oftalmologa.
4
En pacientes que usan lentes de contacto blandos.
5
En pacientes con antecedentes de traumatismo.
6
Slo para la bsqueda de Demodex folliculorum.
Tomado de: Beers y Berkow, 1999; Mandell y col., 2002; Ryan y Ray, 2005.
84
Obtencin y procesamiento de secrecin ocular
Condiciones previas del paciente
- No uIIcuiso liulumIonlos loIcos.
- No oslui iocIhIonuo liulumIonlos unlImIciohIunos.
- No Iuvuiso Ios ojos uiu oI momonlo uo Iu ohloncIon uo Iu muosliu.
Procedimiento
En el caso de conjuntivitis, la muestra se obtendr del ngulo interno del ojo.
1. Utilizar hisopos estriles de algodn o alginato de calcio
2. Humedecer el hisopo en solucin salina siolgica estril
3. Rotar suavemente el hisopo en el ngulo interno del ojo
4. Cultivar cada ojo por separado en una misma placa AS y ACHs (Fig. 11).
5. Incubar a 36 C, bajo condiciones microaerlas por 24 h hasta 72 h.
6. Obtener muestras de cada ojo para realizar los preparados directos en lminas para
teir con Gram y Hansel.
7. Obtener raspado conjuntival del borde interno del prpado superior e inferior para
la investigacin de C. trachomatis, realizar el frotis siguiendo las instrucciones del
docente y teir con la coloracin de Giemsa.
Observacin: Para la investigacin de otros microorganismos poco frecuentes en
infecciones oculares se recomiendan los siguientes medios de cultivo:(2)
Anaerobios: caldo tioglicolato, agar sangre con base Schaedler
Micobacterias: Lowestein-Jensen
Corynebacterium diphtheriae: medio inclinado de Loefer, agar telurito de potasio
Hongos: Saboraud-glucosa con y sin antibiticos, agar bilis semislido.
Interpretacin del examen directo
Gram: observar la presencia de clulas epiteliales y microorganismos intra o extra-
celulares, presencia de clulas inamatorias.
Hansel: para la investigacin de polimorfonucleares eosinlos, que orientan a un
proceso alrgico.
Giemsa: para la observacin de cuerpos de inclusin intracitoplasmticos, sugesti-
vos de infeccin clamidial.
85
Kiralba Snchez 6
Revisin de los cultivos
1. Revisar los cultivos cada 24 horas, hasta las 72 horas
2. Inspeccionar las placas de AS y ACH, estimar el nmero de cada microorganismo
en cada placa. El desarrollo de moderado o abundante crecimiento bacteriano, ter-
cer o cuarto cuadrante de la placa respectivamente, podra indicar una etiologa
bacteriana de la infeccin. Al crecimiento de escasas colonias de algn patgeno,
se le debe dar importancia. Estos hallazgos deben correlacionarse con el examen
directo (Gram).
Figura 11. Procedimiento para el cultivo de secrecin ocular y raspado conjuntival
Deteccin de Chlamydia trachomatis
C. trachomatis es uno de los microorganismos comnmente involucrado en infec-
ciones oculares tanto en el adulto como en el neonato. C. trachomatis es una bacteria
intracelular obligada, por lo tanto, debe ser cultivada en lneas celulares, lo cual resulta
imprctico para uso rutinario en los laboratorios de diagnstico clnico. Entre los mto-
dos de diagnstico disponibles para detectar la infeccin clamidial se incluyen el exa-
men microscpico directo a partir de raspado tisular, teidos con Giemsa, ste mtodo
tiene una sensibilidad del 60% a partir de este tipo de muestra.(8)
Muestra
Secrecin ocular y Raspado conjuntival
Medio AMIES
Gram
Hansel
Giemsa
Inmunoflluorescencia
directa (C. trachomatis)
AS
ACH
AMS
*
*Se adiciona slo cuando hay sospecha
clnica y epidemiolgica de gonococo
TM
Incubacin

36 C
CO
2
24-48 h
CO
2
4 das
CO
2
24-48 h
aerobiosis
X 24 h
Gram
Pruebas bioqumicas
Antibiograma
Reporte
Estudio macroscpico
de colonias
x
86
Alternativamente, existe en el comercio una prueba rpida de inmunodiagnstico
como la Inmunouorescencia Directa (IFD) que muestra una buena sensibilidad y espe-
cicidad a partir de raspado ocular. Otras tcnicas disponibles comercialmente para la
investigacin de patgenos fastidiosos como es el caso de C. trachomatis son las prue-
bas de amplicacin de cidos nucleicos: reaccin en cadena de la polimerasa (RCP),
reaccin en cadena de la Ligasa (RCL) y la amplicacin mediada por transcripcin
(AMT).(8)
Un aspecto fundamental que inuye en la deteccin de Chlamydia, es la obtencin
de la muestra, esta bacteria infecta especcamente a las clulas del epitelio columnar
del tejido conjuntival, por lo que la muestra debe ser obtenida por raspado, teniendo
cuidado de retirar previamente las secreciones purulentas que cubran la mucosa.(4)
Etapa post-analtica
- DosciIhIi Ios luIIuzgos uI oxumon uIioclo [Gium): lIncIon y moiIoIogIu uo louos Ios
microorganismos con signicancia clnica. As mismo, registrar si los microorga-
nismos se encuentran intra o extracelularmente y la presencia de clulas inamato-
rias. A partir de Hansel reportar los eosinlos; del extendido teido con Giemsa,
los hallazgos positivos se reportan: Se observaron cuerpos de inclusin sugestivos
de Chlamydia trachomatis.
- Rooilui Iu cunlIuuu [oscusu, mouoiuuu o uhunuunlo) uoI mIciooigunIsmo uIsIuuo
en cultivo puro o aquel que se le haya dado valor por su crecimiento predominante.
- SI osln iosonlos mIciooigunIsmos InuIgonus y so lu uoloimInuuo quo son con-
taminantes para el caso, incluir el siguiente comentario: Presencia de microbiota
indgena conjuntival o Desarrollo de microbiota habitual de la regin.(6)
6 Actividad prctica
Primer perodo: Obtencin y siembra de secrecin ocular y raspado conjuntival
Materiales
- HIsoos osliIIos - SoIucIon suIInu LsIoIogIcu osliII.
- LmInus oiluohjolos - Asu uo IulIno
- MouIos uo cuIlIvo: ugui Sungio,
agar chocolate suplementado,
agar manitol salado.
- CoIoiucIon uo Gium, HunsoI y GIomsu.
87
Kiralba Snchez 6
Procedimiento
1. Elaborar la cha clnico-epidemiolgica del paciente (Anexo1).
2. Preparar todo el material necesario para la obtencin de la muestra. Rotular las
placas que contienen los medios de cultivo y las lminas portaobjetos con el cdigo
correspondiente.
3. Recolectar la secrecin del ngulo interno del ojo afectado. Proceder a inocular
los medios de cultivo y estriar la muestra por agotamiento. Se recomienda obtener
secrecin del ojo no afectado para tener un patrn de referencia acerca de la micro-
biota habitual ocular del paciente. Incubar bajo las condiciones mencionadas.
4. Con un hisopo realice dos lminas, una, para teir con Gram, y otra, para teir con Hansel.
5. Practicar la obtencin de raspado conjuntival, para ello retire con un hisopo estril
el exceso de secrecin, proceda al raspado de la conjuntiva inferior y superior luego
de la eversin del prpado.
6. Realizar el frotis con la muestra obtenida, distribuyendo la misma siguiendo un
patrn en zig-zag, tratando de que la muestra quede bien extendida sin formar ac-
mulos (Fig. 12).
7. Fijar las lminas segn las indicaciones para cada tcnica de coloracin.
Segundo perodo: Revisin de los cultivos.
Materiales
- LmInus oiluohjolo
- BuloiIu hIoquImIcu uiu IuonlILcucIon hucloiIunu.
- Pulion Mc IuiIunu u, - Asu uo IulIno
- SoIucIon suIInu LsIoIogIcu osliII - PuoI LIlio y uIIIIos uo muuoiu
- MouIos uo cuIlIvo: AS, ATS, cuIuo
BHI, agar Mueller Hinton (MH)
- LquIo uo coIoiucIon uo Gium
- VIuIos con uIscos uo unlIhIolIcos. - Aguu oxIgonuuu uI 8
Figura 12. Representacin esquemtica
del extendido para Giemsa
Coloracin de Giemsa
Fije la lmina con metanol absoluto por 5
min.
Cubra la lmina con una solucin de Giemsa
(3 gotas del colorante comercial para 1 ml de
agua de chorro) durante 1 h.
Lave con agua de chorro.
Decolore con unas gotas de metanol al 30%.
Dejar secar y examinar el extendido con obje-
tivo de 10x y 40x.
N
88
Procedimiento
1. Evaluar cada placa de cultivo segn el desarrollo bacteriano (escaso, moderado o
abundante), las caractersticas morfolgicas de las colonias y la presencia o no de
hemlisis.
2. Seleccionar el microorganismo que desarrolle en cantidad moderada o abundante,
cuidando que se corresponda con lo observado en el examen directo. Proceder a la
puricacin de la o las colonias de inters microbiolgico en AS ATS y en caldo
BHI.
3. Inocular la batera bioqumica adecuada segn las caractersticas morfolgicas y
tintoriales del microorganismo.
4. Realizar el antibiograma (mtodo Kirby-Bauer).
Materiales
- PoioxIuo uo oxIgono uI 8 - PuIIIIos uo muuoiu
- LmInus oiluohjolo - TuhIus uo IuonlILcucIon hucloiIunu
Procedimiento
1. Leer las pruebas bioqumicas inoculadas en el perodo anterior.
2. Practicar (si aplica) la prueba de la catalasa a partir del caldo BHI, segn el caso.
3. Cotejar con las tablas de identicacin bacteriana.
4. Leer e interpretar el antibiograma.
5. Registrar y elaborar el reporte respectivo (Anexo 2).
Autoevaluacin
1. Enumerar los microorganismos que forman parte de la microbiota habitual del r-
gano de la visin.
2. Seale los agentes infecciosos ms importantes productores de infecciones ocula-
res y mencione para cada caso el tipo de muestra a seleccionar.
3. Explique la importancia de la coloracin de Hansel en el diagnstico de una conjuntivitis.
4. Esquematice el diagnstico de una conjuntivitis por C. trachomatis.
5. Cul es la importancia de los mtodos moleculares en el diagnstico de las infec-
ciones oculares?
89
Kiralba Snchez 6
Bibliografa
(1) Mandell G, Bennett J, Dolin R. Enfermedades infecciosas. Principios y prctica. 5 ed.
(2) Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. Diagnstico microbiolgico.
Texto y atlas color. 5 ed. Espaa: Mdica Panamericana; 2001.
(3) Beers M, Berkow R. El Manual Merck. 10 ed. Espaa: Harcourt; 1999.
(4) Murray P, Rosenthal K, Kobayashi G, Pfaller M. Microbiologa mdica. Texto Atlas
Color. 4 ed. Espaa: Mosby Elsevier Science; 2002.
(5) Ryan K, Ray C. Sherris Microbiologa mdica. 4 ed. Mxico: McGraw-Hill Interamericana;
2005.
(6) Isenberg H, editor. Clinical Microbiology Procedures Handbook. Washington (DC):
American Society for Microbiology;1992.
(7) Araque M, Nieves B, Snchez, K, Velsquez A, Velazco E, Vizcaya L. Manual prctico
de bacteriologa. Universidad de Los Andes. Venezuela; 1999.
(8) Di Bartolomeo S, Janer D, Rodrguez F, Sauka D, Margarinas T. Incidente of Chlamydia
trachomatis and other potencial pathogens in neonatal conjuntivitis. Int J Infect Dis
2001; 5:139-143.
91
prctica 7
Diagnstico microbiolgico de las Infecciones
del Tracto Urinario (ITU). Urocultivo
Aurora Longa / Judith Velasco
Objetivo general
Aplicar los mtodos convencionales para el diagnstico microbiolgico de infec-
ciones del tracto urinario (ITU).
1. Describir las condiciones adecuadas para la toma y transporte de la muestra de orina.
2. Sembrar la muestra de orina por el mtodo del asa calibrada.
3. Cuanticar la carga bacteriana.
4. Identicar el (los) microorganismo(s) aislado(s).
5. Determinar la susceptibilidad antimicrobiana del (los) microorganismo(s)
aislado(s).
7. Reportar los resultados siguiendo las normas de taxonoma y de pruebas de suscep-
tibilidad antimicrobiana.
Aspectos tericos
El trmino ITU dene la presencia de microorganismos en las vas urinarias, siendo
las patologas ms frecuentes cistitis (infeccin de la vejiga) y pielonefritis (infeccin del
rin y su pelvis).(1)
Epidemiologa
Las ITU son de las enfermedades ms frecuentes, en particular en mujeres. Su pre-
valencia es dependiente de la edad y el gnero. Casi 1% de los nios, muchos con
92
PRCTICA 7 Diagnstico microbiolgico de las Infecciones del Tracto Urinario (ITU). Urocultivo
anomalas funcionales o anatmicas del aparato urinario, presenta infeccin durante el
perodo neonatal.(2) Se calcula que 20% o ms de la poblacin femenina sufre alguna
forma de ITU en su vida. La infeccin en la poblacin masculina es rara hasta el quinto
decenio de la vida, cuando el crecimiento de la prstata empieza a obstaculizar el vacia-
miento de la vejiga. En los ancianos de ambos sexos las intervenciones quirrgicas gine-
colgicas o prostticas, la incontinencia, la instrumentacin y el sondeo uretral crnico
favorecen tasas de ITU de 30 a 40%. Un solo sondeo vesical conlleva riesgo de infeccin
del 1% y al menos 10% de los individuos con sondas a permanencia se infecta.(3)
Patogenia
La orina, producida en el rin y descargada a travs de la pelvis renal y los ur-
teres hacia la vejiga, es estril en el individuo sano. Se desarrolla infeccin cuando las
bacterias logran ingresar a ese ambiente y pueden persistir en l, sobre todo a travs de
una va ascendente de bacterias residente de la ora perineal, provenientes de la ora
del intestino grueso. Entre los factores que favorecen el acceso de las bacterias el ms
importante es el coito, que desplaza bacterias de forma transitoria al interior de la vejiga
y pone en riesgo a la mujer por la corta longitud de la uretra. Otro es la manipulacin
de la uretra como el sondeo. Las bacterias tambin pueden alcanzar las vas urinarias
desde la corriente sangunea, lo cual es menos frecuente y requiere una infeccin en otro
sitio. La persistencia se favorece por factores del hospedero que interrumpen o retar-
dan el ujo urinario, como instrumentacin, obstruccin o anomalas estructurales. Los
factores bacterianos incluyen la capacidad de adherirse al uroepitelio y producir otros
factores como las exotoxinas. Los miembros del gnero Proteus, productores de ureasa,
se vinculan con clculos urinarios, que por s mismos son factores que predisponen a la
infeccin.(3)
Diagnstico
El diagnstico de laboratorio de una ITU se realiza a travs del urocultivo, el cual
consiste en el cultivo bacteriolgico de la orina para determinar la presencia y cuanti-
cacin de grmenes patgenos. Para la evaluacin de estos grmenes y de su potencial
importancia en un proceso infeccioso de las vas urinarias es imperativo conocer los
siguientes aspectos:(1)

Flora habitual de los genitales externos y la uretra anterior
Estalococos coagulasa negativa, Corinebacterias no patgenas (difteroides), En-
terobacterias: Escherichia sp., Proteus sp., Klebsiella sp., Enterobacter sp. entre otras.
93
Aurora Longa / Judith Velasco 7
Micobacterias saprofticas, especialmente Mycobacterium smegmatis, Levaduras y
Streptococcus sp. Todos estos microorganismos pueden contaminar fcilmente las mues-
tras de orina sin que ello signique infeccin, por eso se deben seguir estrictamente las
normas que se explican ms adelante, que permiten recolectar y conservar correctamen-
te las muestras para urocultivo.
Agentes productores de ITU
Todo microorganismo puede potencialmente producir infeccin urinaria; sin em-
bargo, las ms frecuentes son:
Escherichia coli (85% aproximadamente), Proteus sp. (especialmente Proteus
mirabilis), Klebsiella pneumoniae, Enterococcus sp., Enterobacter sp.
Pseudomonas sp., Serratia y Acinetobacter generalmente en pacientes hospitaliza-
dos con sondas permanentes o con otra patologa de base.
Levaduras, Staphylococcus saprophyticus (generalmente en mujeres en edad repro-
ductiva), Haemophilus, principalmente en nios.
Del hospedero
Para interpretar correctamente el resultado del urocultivo es importante conocer la
epidemiologa, condiciones generales y la clnica del paciente, tales como: enfermeda-
des metablicas, estrechez uretral, hipertroa prosttica, desrdenes neurognicos.
En estos casos una buena relacin entre el mdico y el microbilogo es determinan-
te para un diagnstico preciso.
Urocultivo
Etapa pre-analtica
Antes de iniciar el estudio de la muestra, el microbilogo debe conocer algunos
datos concernientes al paciente: edad, gnero, factores predisponentes, sntomas, ante-
cedentes de ITU, tratamiento actual o previo con antibiticos. El paciente no debe haber
recibido terapia antimicrobiana durante los tres das anteriores a la recoleccin, excepto
en los casos de control de tratamiento y pacientes gravemente enfermos.
94
Recomendaciones previas a la toma de muestra
Mujeres: se debe higienizar la zona genital con agua y jabn, de adelante hacia
atrs, secarse con toalla limpia, se deben colocar un tapn vaginal (torunda de gasa o
algodn) y se recomienda orinar separando los labios mayores.
Hombres: se debe retraer el prepucio e higienizar el glande y surco balanoprepucial
con agua y jabn (no usar antispticos). Se elimina el primer chorro de orina y luego se
recolecta en un envase estril la fraccin siguiente.
Recoleccin de la muestra
- Nins y uJu|lns que cnnlrn|un es]Inleres: La muestra de eleccin es el chorro me-
dio miccional, entre 15 a 30 ml. El tiempo de retencin deseado es por lo menos 3
o 4 horas, siendo la muestra ms representativa la primera orina de la maana.
- Nins y uJu|lns que nn cnnlrn|un es]Inleres
Al acecho: se aplica a los lactantes y es similar al descrito para los pacientes que
controlan esfnteres. El operador deber esperar el momento de la miccin y re-
coger en un envase estril lo que seguramente ser la porcin media del chorro
miccional.
Puncin suprapbica: se reserva para casos especiales por ejemplo: pacientes
cuyos urocultivos previos presentan resultados conictivos, neonatos graves,
entre otros. Deber ser realizada por mdicos entrenados.
Cateterizacin: Debe ser realizada por personal entrenado y se recomienda en
enfermos con vejiga neurognica, lactantes entre otros. La muestra recolectada
debe ser la porcin media del chorro de orina que sale por la sonda.
- En]ermns snnJuJns: Nunca tomar la orina que uye del extremo distal de una
sonda que no es nueva. En caso de estar recin colocada tomarla directamente del
extremo distal en un recipiente estril.
Puncin de la sonda: se realiza en aquellos pacientes con sonda permanente. Se
obtura la sonda con una pinza ad hoc, se espera unos minutos, se desinfecta la parte
externa de la sonda en la zona proximal con alcohol yodado y se punza con una jeringa
estril, colocando posteriormente el contenido en un envase estril.
Conservacin y trasporte de la muestra: La muestra para urocultivo debe refrigerar-
se a 4 8 C inmediatamente despus de recolectada. Si el traslado al laboratorio demora
ms de 15 minutos, debe colocarse el recipiente con la orina dentro de un contenedor
con hielo. Este procedimiento permitir que el nmero de microorganismos permanezca
relativamente constante por un tiempo no mayor de 24 horas.
95
Etapa analtica
Procesamiento de la muestra: antes de iniciar el estudio de la muestra, el microbi-
logo debe conocer algunos datos concernientes a la misma.
Muestra: tipo de recoleccin: chorro medio, puncin suprapbica, sonda (puncin,
sonda nueva). Conservacin.
Examen directo
1. Examen macroscpico: olor, color, aspecto, pH, densidad.
2. Examen microscpico: estudio del sedimento (en fresco): se centrifuga entre 10 -
15 ml de orina a 3000 rpm durante 10 min, el sedimento obtenido se coloca entre
lmina y laminilla y se observa al microscopio con objetivo de 40X.
Interpretacin
- PiosoncIu uo o ms IoucocIlos oi cumo, os sIgno InoquIvoco uo IuiIu y ioIuoizu
el diagnstico de infeccin.
- Lu uomosliucIon uo cIIInuios IoucocIluiIos on unu muosliu on Iu quo so lu IuonlIL-
cado un germen con recuento signicativo, sugiere posibilidades de pielonefritis.
- Ln InIoccIonos vosIcuIos uguuus, uuoms uo IuiIu, uouo comiohuiso lomuluiIu.
- Lu iosoncIu uo giun cunlIuuu uo cIuIus oIloIIuIos oscumosus, ovIuoncIu conlumI-
nacin y la necesidad de repetir la muestra.
3. Preparacin del frotis: Se toma una gota (con pipeta Pasteur) o una asada de orina,
se coloca sobre una lmina portaobjeto y se deja secar sin extender, luego se ja y se
colorea con la tcnica de Gram. Cuando se sospecha de tuberculosis renal, la orina
se centrifuga y se toma una gota del sedimento, se coloca sobre una lmina portao-
bjeto, se deja secar sin extender, se ja y se colorea con la tcnica de Zielh Neelsen,
para la bsqueda de bacilos cidos resistentes.
Interpretacin
- Lu ohsoivucIon uo unu o ms cIuIus mIciohIunus oi cumo uo InmoisIon so io-
senta en muestras con contajes mayores de 100.000 colonias/ml de orina, acompa-
adas generalmente por al menos un leucocito cuando existe piuria.
- Ln Ius muoslius quo conlIonon conlujos monoios uo 1uu.uuu coIonIuslmI uo oiInu,
generalmente no se observan microorganismos ni clulas.
96
- Lu iosoncIu uo muclus cIuIus oIloIIuIos oscumosus usI como uo unu oiu vugInuI
mixta, evidencia contaminacin y la necesidad de repetir la muestra.
4. Cultivo y recuento de colonias: Permite diferenciar la verdadera bacteriuria de una
contaminacin. Se conocen varios mtodos para determinar la cantidad de micro-
organismos.
- Mtndn do dilucin on tubn n mtndn do Kuss: Es un mtodo poco prctico, muy
laborioso, est basado en diluciones 1:100 y luego 1:10.000 de la orina, depositadas
en placas estriles a las que se les agrega el agar fundido. Despus de varios pasos
se observa el crecimiento en las diferentes placas.
- Mtndn dol usu culibrudu: Es un mtodo prctico, sencillo y econmico, que con-
siste en sembrar la orina sin centrifugar con un asa calibrada a 0.001 ml (3mm de
dimetro) o 0,01 ml (4mm de dimetro).
En la eleccin de los medios de cultivo debe considerarse la recuperacin de la
mayora de los patgenos, con el menor costo posible. Generalmente se recomienda la
utilizacin de un agar sangre (AS) y un agar CLED o un medio selectivo diferencial como
MK o EMB. En nios incluir un agar chocolate suplementado para la recuperacin de
Haemophilus.(4)
Agar CLED (cistina-lactosa-electrolito-deciente): utilizado como medio diferencial
para el aislamiento, contaje e identicacin de microorganismos en orina; su contenido
en cistina y lactosa y la presencia del azul de bromotimol (como indicador de pH) facili-
tan diferenciar a las bacterias fermentadoras de lactosa, que acidican el medio, virando
el indicador de pH al color amarillo (color que toman las colonias). Por otra parte, la
deciencia en electrolitos inhibe el carcter invasor de las colonias de Proteus.(5, 6)
Nota: en caso de muestras obtenidas por puncin suprapbica, se recomienda utili-
zar un medio para la recuperacin de bacterias anaerobias (Ver prctica infecciones por
bacterias anaerobias).
Procedimiento
1. Mezclar cuidadosamente la orina restante.
2. Insertar el asa estril verticalmente en la muestra y luego diseminarla sobre la
supercie de la placa desde el centro, formando una lnea y posteriormente hacer
estras sobre la placa cruzando la lnea del inculo varias veces (Fig. 14).
3. Incubar las placas durante 1824 horas a 37 C en aerobiosis y el AS en microae-
rolia y en anaerobiosis si la muestra as lo exigiera. En caso de tener cultivos
negativos a las 24 horas, se deben incubar 2448 horas ms.
97
Anlisis cualitativo
La identicacin de los agentes se hace mediante el estudio de las caractersticas
microscpicas de las colonias y la utilizacin de los sustratos del medio, ejemplo: lacto-
sa, hemlisis y la identicacin nal a travs de pruebas siolgicas diferenciales, como
la prueba de la oxidasa, accin sobre azcares.
Anlisis cuantitativo
Contar el nmero de colonias y multiplicar por el factor 1000 o 100, de acuerdo a
la capacidad del asa utilizada, para determinar las unidades formadoras de colonia por
mililitro de orina (UFC/ml).
Pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos
Generalmente se usa el mtodo de Kirby Bauer, tomando en cuenta para la eleccin
de los antibiticos el agente aislado y aquellos que ms se utilizan en el tratamiento de
las ITU.
Etapa post-analtica
Informe de resultados
Datos personales del paciente: Nombre y apellidos, cdula de identidad.
Nombre del mdico tratante
Fecha de recepcin de la muestra y emisin del reporte.
Tipo de muestra: Orina (especicar mtodo de recoleccin)
Examen realizado: Urocultivo o cultivo y antibiograma
Resultados del examen directo: fresco o frotis
Agente microbiano aislado (gnero y especie) y recuento de colonias:
Recuento de colonias:
Generalmente un recuento de 10.000 o menos colonias por ml de orina indica con-
taminacin y un recuento de 100.000 o ms, indica infeccin.
Cuando se obtienen valores intermedios, el examen debe ser repetido, ya que exis-
ten factores como, por ejemplo, la obstruccin uretral, diuresis, infecciones crnicas e
infecciones por cocos grampositivos, que pueden explicar recuentos bajos en infeccio-
nes urinarias verdaderas.
Antibiograma.
98
Rocuontn do
cnlnnius (UFC/ml}
Mtodo de recoleccin
Microorganismo
(s} prosontos
Pasos a seguir
0 Ninguno Reporte negativo
Cualquier recuento Puncin suprapbica Todas las especies Identicar microorganismo
10.000 100.000
Cualquier mtodo
y condicin
Cultivo puro de levaduras
Cultivo puro de
Staphylococcus aureus
Identicar microorganismo
1.000
Orina por sonda uretral
Hombre sintomtico
Control post-tratamiento
Cultivo puro
de probables patgenos
10.000 Orina por sonda uretral
Dos especies de probables
patgenos
100.000
Orina de chorro medio
Cultivo puro de probables
patgenos
Dos especies de probables
patgenos e infeccin
Sintomtica
Tres o ms especies
Tomado de: Montiel y Lam, 2001.
TABLA 16. Criterios para informar recuentos en urocultivos
7 Actividad prctica
Urocultivo
Primer perodo
Materiales
- Muosliu uo oiInu
- Asu cuIIhiuuu
- CoIoiucIon uo Gium
- LmInus oiluohjolos y cuhioohjolos.
- Agui sungio y ugui CLLD, MucConloy o LBM.
1. Llenar la planilla de registro del laboratorio con los datos personales, epidemiol-
gicos y clnicos del paciente.
2. Realizar el examen macroscpico y microscpico (Sedimento y Gram) de una mues-
tra de orina y describir lo observado en cada caso.
3. Sembrar la muestra de orina en AS y CLED o MK o EMB, utilizando el asa calibrada
e incubar en las condiciones ya sealadas (Fig. 13 y 14).
99
Figura 13. Urocultivo
Figura 14. Mtodo del asa calibrada
Examen al fresco
(Sedimento)
Gram

AS AMK CLED
Incubar a 36 C
por 18-24 h
Microaerofilia
Aerobiosis
Negativo Positivo
Reincubar 48 h
Negativo Positivo
Recuento de colonias
Pruebas bioqumicas
Antibiograma
Muestra de orina
Incubar a 36 C por 24 h
Identificacin de la bacteria aislada
y lectura del antibiograma
Reporte
Mtodo para introducir un asa calibrada en la orina para que
se adhiera a ella el volumen apropiado de muestra
El asa toca el centro
de la placa
El inculo se extiende en
forma de una lnea (como
indica la figura) a lo largo del
dimetro de la placa
Sin quemar el asa ni
agregar ms orina realizar
trazados horizontales
cruzando la lnea del
inculo inicial
Segundo perodo
Materiales
- Piuohus hIoquImIcus - Agui MuoIIoi HInlon
- RouclIvo uo oxIuusu - Pulion uo MucIuiIunu u,
- RouclIvo uiu Iu iuohu uo culuIusu - HIsoos osliIIos
- PuoI uo LIlio - DIscos uo unlIhIolIcos
- PuIIIIos uo muuoiu - PInzu sIn uIonlos
Procedimiento
1. Observar las placas sembradas en el perodo anterior, describa las caractersticas
observadas en cada medio y realice el contaje de colonias.
2. De acuerdo a las caractersticas macroscpicas y microscpicas observadas, sospe-
cha de un agente en particular? Escriba el nombre.
3. Con base en la morfologa y tincin observada en el examen directo de la muestra
de orina coloreada con Gram y el estudio de las caractersticas de las colonias y su
efecto sobre el medio del agente etiolgico, seleccione y siembre las pruebas sio-
lgicas que le permitirn identicar el microorganismo, as como los antibiticos
para la prueba de sensibilidad de acuerdo al agente presuntamente identicado y
los datos clnicos y epidemiolgicos.
4. Incubar a 37 C durante 24 horas.
Tercer perodo
Materiales
- RouclIvo uo Kovucs
- RouclIvo uo oxIuusu
- RouclIvo IoCI
3
Procedimiento
1. Realizar la prueba de la oxidasa si es el caso.
2. Realizar la lectura de las pruebas siolgicas montadas en el perodo anterior e
identique el agente aislado.
3. Realizar la lectura de la prueba de susceptibilidad antimicrobiana.
4. Elaborar el informe denitivo de los resultados.
Cultivos negativos: Negativo a las 48 horas de incubacin o no se observ desarro-
llo bacteriano hasta las 48 horas de incubacin.
Cultivos positivos: Desarrollo de nmero de UFC/ml de orina de nombre del mi-
croorganismo.
Ejemplo: Desarrollo de ms de 100.000 de UFC/ml de orina de Escherichia coli.
Autoevaluacin
1. Mencionar en orden de frecuencia las especies bacterianas productoras de ITU.
2. Describir la tcnica ms utilizada para el diagnstico microbiolgico de una ITU.
3. Sealar las condiciones de conservacin y transporte de una muestra de orina para
urocultivo, justicar la respuesta.
4. Mencionar los antibiticos ms utilizados para el tratamiento de una ITU.
5. Denir los siguientes trminos: disuria, poliaquiuria, piuria, cistitis, pielonefritis.
6. Mencionar la ventaja de incorporar el medio CLED en el urocultivo.
Bibliografa
(1) Vizcaya L. En Araque M, Nieves B, Snchez K, Velsquez A, Velazco E, Vizcaya L. Manual
prctico de bacteriologa. Universidad de Los Andes, Facultad de Farmacia, Escuela de
Bioanlisis, Departamento de Microbiologa y Parasitologa, Ctedra de Bacteriologa
Clnica. 1.999.
(2) Zorc J, Kiddoo D, Shaw K. Diagnosis and management of pediatric urinary tract
infections. Clin Microbiol Rev 2005, 18(2): 417-422.
(3) Ryan K, Ray C. Sherris, Microbiologa mdica. 4 ed. Mxico: Mc GrawHill
Interamericana; 2004.
(4) Alcoba J, Gutirrez I, Batista N, Garca V. Infeccin urinaria por Haemophilus inuenzae
como manifestacin inicial de alteracin renal. Enferm Infec Microbiol Clin 2004;
22(2):125-127.
(5) Universidad Central de Venezuela, Facultad de Medicina, Escuela de Medicina Luis
Razetti, Ctedra de Microbiologa. Gua de trabajos prcticos, Caracas 2000.
(6) Delgado A, Amich S, Prieto S, Salve M. Manual de laboratorio clnico bsico:
Microbiologa. Colombia: McGraw-Hill; 2000.
(7) Montiel F, Lam M. Manual de microbiologa clnica. Chile: Publicaciones Tcnicas
Mediterrneo Ltda.; 2001.
103
prctica 8
Diagnstico microbiolgico de la Enfermedad
Diarreica Aguda (EDA). Coprocultivo
Judith Velasco / Aurora Longa
Objetivo general
Aplicar los mtodos convencionales para el diagnstico microbiolgico de la Enfer-
medad Diarreica Aguda (EDA).
1. Describir las condiciones adecuadas para la toma y transporte de la muestra de heces.
2. Aislar los agentes etiolgicos bacterianos involucrados en la EDA.
3. Identicar los agentes etiolgicos bacterianos involucrados en la EDA.
4. Determinar la susceptibilidad antimicrobiana del (los) microorganismo(s)
aislado(s).
6. Reportar los resultados obtenidos, siguiendo las normas de taxonoma y de pruebas
de susceptibilidad antimicrobiana.
Aspectos tericos
Enfermedad diarreica
Las infecciones del tracto gastrointestinal representan un grave problema de salud
pblica. La diarrea es la manifestacin ms comn de esas infecciones, las cuales cons-
tituyen una de las causas ms importantes de morbilidad y mortalidad en lactantes y
nios menores de cinco aos, con el mayor nmero de casos en los pases en vas de
desarrollo de Asia, frica y Latinoamrica.(1,2)
La terapia de rehidratacin oral, se ha identicado como la medida ms ecaz para
la reduccin de la mortalidad por diarrea. Una mayor reduccin de la misma se alcan-
104
PRCTICA 8 Diagnstico microbiolgico de la Enfermedad Diarreica Aguda (EDA). Coprocultivo.
zar al lograr el tratamiento integral de los casos, particularmente en los cuadros de
disentera y de diarrea persistente.(1)
La etiologa de la enfermedad diarreica es diversa y numerosos esfuerzos se han
realizado para tratar de explicarla, observndose que el factor infeccioso continua sien-
do el ms importante, sin duda, por su carcter transmisible. De los agentes infecciosos,
los bacterianos se encuentran entre los ms frecuentes en todos los pases del mundo.
La utilidad del diagnstico de la diarrea se enfoca fundamentalmente desde dos
puntos de vista:
1. El clnico, para la atencin y seguimiento de pacientes, particularmente cuando
est indicado el tratamiento con antibitico-terapia, como, por ejemplo, en la disen-
tera.
2. Desde el punto de vista de salud pblica: control de brotes, vigilancia epidemiol-
gica y estudio sobre vacunas.
Deniciones operativas:
- Diurrou ugudu: incremento en el nmero o volumen de las heces de 72 horas o me-
nos de duracin.
- Diurrou crnicu n porsistonto: incremento en el nmero o volumen de las heces de
ms de 14 das de duracin.
- Disontoru: historia de moco o sangre en las heces con tenesmo o dolor al defecar y
temperatura axilar de 38,5 C.
- Gustrnontoritis: diarrea lquida de color amarillo verdosa o no, acompaada con
vmito y ebre en algunas oportunidades.
- Fiobro ontricu: ebre, cefalea, dolor abdominal, bradicardia relativa, esplenome-
galia y leucopenia. Ej: Fiebre tifoidea.
El estudio de la material fecal, para el aislamiento e identicacin de las bacterias
productoras de diarrea se denomina: coprocultivo.
Al realizar un coprocultivo es importante tener presente:
Flora bacteriana intestinal
En el intestino delgado, el duodeno es estril, en el yeyuno aparecen enteroco-
cos, lactobacilos y difteroides, en el leon se suman algunos miembros de la familia
Enterobacteriaceae y anaerobios gramnegativos, en una proporcin de aproximada-
mente 10
5
por gramo de heces.
En el intestino grueso, la ora habitual constituye el 50% del peso seco de las heces.
105
Judith Velasco / Aurora Longa 8
Las bacterias anaerobias que se encuentran en mayor proporcin son las siguientes:
Bacteroides 100%, Peptococcus, Fusobacterium, Peptostrepotococcus, Lactobacillus y
Clostridium.
Las bacterias anaerobias facultativas o aerobias son las siguientes: E. coli 100%,
Klebsiella y Enterobacter 40 80%, Proteus 5-50%, Citrobacter sp., Pseudomonas sp.,
Enterococccus sp. 100%, Staphylococcus 30-50%.
Esta ora se mantiene en equilibrio por diferentes mecanismos tales como: produc-
cin de bacteriocinas y sustancias txicas como cidos grasos, entre otras.
Etiologa y patogenia
En la trascendencia del proceso diarreico, interviene no solo la patogenicidad del
agente, sino la respuesta particular del husped y de su propio ecosistema microbiano,
esto trae como consecuencia que el espectro de respuestas clnicas vare de un indivi-
duo a otro, manifestndose en unos, con enfermedades clnicas graves, en otros, con
sntomas leves, y en otros, con infeccin intestinal subclnica, de all que algunas veces
al realizar coprocultivos en personas sin diarrea, se aislen enteropatgenos.
En la Tabla 17, se exponen los microorganismos relacionados ms a menudo con proce-
sos diarreicos, el posible mecanismo de patogenicidad del agente y el sitio de accin.
TABLA 17. Caractersticas de los sndromes infecciosos gastro-
intestinales
Microorganismo Sndrome clnico Mecanismo de patogenicidad
Localizacin
anatmica
Microscopa
de heces
Virus
Rotavirus Diarrea acuosa Alteracin de clulas absortivas Intestino grueso -
Bacterias
ECET Diarrea acuosa Enterotoxina(s) Intestino delgado -
ECEP Diarrea acuosa
Adherencia y destruccin
de microvellosidades
Intestino delgado -
ECEH Colitis hemorrgica Citotoxina Intestino grueso GR
ECEI Diarrea disentrica Invasin de la mucosa Intestino grueso PMN (85%), GR
Serotipos de
Salmonella
Disentera Invasin de la mucosa
Intestino delga-
do/grueso
PMN
Salmonella typhi
Fiebre entrica o
tifoidea
Translocacin bacteriana intesti-
nal (penetracin y diseminacin)
Intestino delga-
do/grueso
Monocitos (95%)
Shigella sp. Diarrea disentrica Invasin de la mucosa, citotoxina Intestino grueso PMN (84%), GR
Yersinia
enterololitica
Fiebre entrica
Translocacin bacteriana intesti-
nal (penetracin y diseminacin)
Intestino delga-
do/grueso
-
106
Plesiomonas
shigelloides
Diarrea acuosa
Diarrea disentrica
Enterotoxina
Invasin de la mucosa
Intestino delgado
/ grueso
-
PMN, GR
Campylobacter
jejuni
Diarrea disentrica Invasin de la mucosa, citotoxina
Intestino delgado
/grueso
PMN, GR
Diarrea acuosa Enterotoxina Intestino delgado -
Aeromonas sp.
Diarrea
disentrica
Invasin de la mucosa
Intestino delgado
/grueso
PMN, GR
Diarrea acuosa Enterotoxina Intestino delgado -
Vibrio cholerae Diarrea acuosa Enterotoxina Intestino delgado -
Vibrio
parahaemolyticus
Diarrea acuosa Se desconoce Intestino delgado -
Parsitos
Entamoeba
histolytica
Diarrea disentrica Invasin de la mucosa Intestino grueso Monocitos
Giardia lamblia Diarrea acuosa Irritacin de la mucosa Intestino delgado -
Cryptosporidium sp. Diarrea acuosa Enterotoxina? Intestino delgado -
Blastocystis
hominis
Desconocido
Intestino delga-
do/grueso
-
ECET: Escherichia coli enterotoxignica; ECEP: Escherichia coli enteropatgena; ECEH: Escherichia coli
enterohemorrgica; ECEI: Escherichia coli enteroinvasiva; PMN: Leucocitos polimorfonucleares; GR: Gl-
bulos rojos.
Tomado de: Vizcaya y col, 1999; Romero y Herrera, 2002; Ryan y Ray, 2004.
Coprocultivo
Etapa pre-analtica
Muestra: La muestra de heces o hisopado rectal debe ser recolectada durante el
perodo agudo de la enfermedad, antes de iniciar el tratamiento antimicrobiano. Utilizar
un envase de boca ancha, tapa hermtica, preferiblemente estril, en caso de muestras
lquidas se recomienda recolectarla en un envase para recoleccin de orina.
Conservacin y transporte de la muestra: Si la muestra no se cultiva de inmediato,
antes de las dos horas, se recomienda colocarla en un medio de transporte: Cary Blair y
mantenerla a temperatura ambiente por un lapso no mayor a 5 das.
Datos clnicos y epidemiolgicos del paciente: Edad, sntomas, tiempo de evolu-
cin del cuadro diarreico, tipo de alimentos ingeridos, contacto con animales y cules,
procedencia, ocupacin.
Microorganismo Sndrome clnico Mecanismo de patogenicidad
Localizacin
anatmica
Microscopa
de heces
Continuacin TABLA 17.
107
Etapa analtica
Examen directo
Examen macroscpico: consistencia, color, olor, presencia o ausencia de moco y/o
sangre.
Examen microscpico: para determinar rpidamente la naturaleza de una enferme-
dad diarreica es de gran ayuda y tiene un alto grado de conabilidad la Investigacin de
leucocitos fecales, que consiste en determinar el tipo de clulas inamatorias presentes
en las heces; esta informacin orienta sobre la naturaleza del proceso infeccioso, ejem-
plo, en la shigelosis hay abundancia de neutrlos polimorfonucleares.
Deteccin de leucocitos fecales
1. Colocar una pequea cantidad de moco o de heces en una lmina y mezclar con 2-3
gotas de azul de metileno al 1%.
2. Cubrir con una laminilla y esperar 2 a 3 minutos con la nalidad de obtener una
buena coloracin nuclear.
3. Observar al microscopio con los objetivos secos (10X y 40X).
Nota: Tambin se puede realizar un frotis y colorearlo con una coloracin simple o
compuesta.
Interpretacin
La presencia de 5 o ms leucocitos por campo microscpico sugiere la presencia
de un agente enteroinvasor. La ausencia de clulas inamatorias sugiere la presencia de
un agente toxignico (Tabla 17).
Aislamiento bacteriano
En las muestras de heces, las bacterias entricas patgenas se encuentran siempre
asociadas a una gran variedad de bacterias comensales, es por ello, que para facilitar el
aislamiento y posterior identicacin de estas bacterias, se emplean diferentes medios
de enriquecimiento, selectivos y selectivos diferenciales (Fig. 15).(1)
108
Medios selectivos y selectivos diferenciales
La muestra completa (Suspensin fecal en solucin salina siolgica) o conservada
en Cary Blair se siembra en los medios agar MacConkey (MK), agar xilosa-lisina-desoxi-
colato (XLD), agar salmonella-shigella (SS), agar cefsulodin-irgasan-novoviocina (CIN),
agar desoxirribonuclico-ampicilina (ADN-AMP), agar tiosulfato-citaro-sales biliares
(TCBS) y agar preston modicado (PM). Todos los medios a excepcin del CIN y PM,
son incubados a 36 C durante 24 horas y luego a temperatura ambiente por 24 horas
ms. Los medios CIN y PM se incuban durante 48 horas a temperatura ambiente (25 C),
42 C y en microaerolia, respectivamente.(1)
Medios de enriquecimiento: Se utiliza el caldo selenito (para enterobacterias) y
agua peptonada alcalina (APA) pH 8,4, para Vibrio, los cuales despus de transcurridos
6-8 horas de incubacin a 36C, del caldo selenito se toma una muestra con el asa en
aro de la parte ms supercial del caldo y se inoculan los medios agar MK, XLD y SS,
y del mismo modo a partir del APA al agar TCBS, luego estos medios se incuban en las
condiciones anteriormente sealadas.(1)
Muestra de heces
o hisopado rectal
Gram
Azul de metileno
%
Examen macroscpico
Medio Cary
Blair
Suspensin fecal
en SSF
Caldo selenito
APA
AMK XLD SS TCBS CIN PM AMK XLD SS TCBS
Incubar a 36 C por 24 h
en aerobiosis
E. coli
diarreognica
Shigella sp
Salmonella sp
Aeromonas sp
Plesiomonas shigelloides
Vibrio sp
Incubar
48 h
TA
(25 C)
42 C en
microaerofili
Yersinia enterocolitica
Campylobacter sp.
Pruebas bioqumicas
Pruebas bioqumicas
Shigella sp
Salmonella sp
Aeromonas sp
Vibrio sp
Pruebas bioqumicas
Incubar 6-8 h a 36 C
y subcultivar
Incubar a 36 C en
aerobiosis
Figura 15. Coprocultivo
AMK XLD SS TCBS CIN PM AMK XLD SS TCBS
.
.
.
.
.
.
.
.
109
Identificacin
Escherichiu cn|i diarreognicas:
Se investigan cuatro tipos: E. coli enteropatgena (ECEP), E. coli enteroinvasiva (ECEI)
E. coli enterotoxignica productora de la toxina termolbil (ECET-TL), E. coli enterohemo-
rrgica O:157 H:7 (ECEH). Para ello se seleccionan del agar MK, de la siembra directa con
la materia fecal, 5 colonias fermentadoras de la lactosa sugestivas de E. coli, las colonias
seleccionadas se identican como E. coli mediante las pruebas de: oxidasa, Kligler, Indol-
motilidad, citrato. A esta bioqumica inicial se le adiciona el medio lisina-hierro-agar (LIA),
cuando se sospecha de ECEI (particularmente cuando el recuento de leucocitos es superior
a 5 x campo microscpico), la cual no decarboxila la lisina. Cuando se sospecha de ECEH
serotipo O:157 H:7, se adiciona caldo sorbitol, la cual no fermenta el sorbitol, tambin se re-
comienda el uso de agar MK con sorbitol para la recuperacin de este serotipo (Fig. 16).(1)

MK
siembra
5 colonias Lactosa
Purezas
en TS 3%
Pruebas bioqumicas:
Kligler
Indol-motilidad
Citrato
LIA (decarboxilacin lisina negativa
sospecha de ECEI)
Sorbitol (negativo: sospecha de
ECEH O:157 H:7)

Oxidasa
E. coli
Negativ Positiv
Identificacin
de Aeromonas
Serologa para
ECEP, ECET-TL,
ECEI, ECEH,
segn el cuadro
clnico y la edad
d l
Pruebas
bioqumicas:
Kligler
LIA
MIO
Citrato
Urea
Inositol
Figura 16. Investigacin de Eschericha coli diarreognicas
a a
del paciente
Inositol
5 colonias Lactosa (+)
110
Luego en el caso de ECEP, ECEI y ECEH, se procede a realizar la identicacin
serolgica, utilizando antisueros comerciales anti O y la determinacin de la toxina
termolbil en el caso de ECET-TL.
En la actualidad, la identicacin denitiva de estas categoras de E. coli se realiza
mediante tcnicas de biologa molecular, detectando genes que codican fundamental-
mente factores de virulencia.
Gneros Su|mnne||u y Shige||u: La recuperacin e identicacin de estos gneros, se
realiza seleccionando colonias no fermentadoras de la lactosa de los medios MK, XLD y SS,
de la siembra directa y a partir de la siembra en estos medios del caldo selenito. Tambin se
seleccionan como colonias sospechosas de Salmonella, las no fermentadoras de la lactosa y
con produccin de H
2
S que han desarrollado en los medios XLD y SS (Fig. 17). La identi-
cacin bioqumica se realiza mediante las pruebas de oxidasa, kligler, LIA, motilidad-indol-
ornitina (MIO), citrato, urea y otras que se consideren necesarias (Anexo 15, 16, 17).(1,6)

Colonias Lactosa (-) en MK
Colonias Lactosa (-) con o sin H
2
S en XLD y SS
Purezas en
TS 3%
Pruebas
bioqumicas:
Kligler
LIA
MIO
Citrato
Urea
Oxidasa
Positiva Negativa
Diagnstico presuntivo por
pruebas bioqumicas
Shigella Salmonella
Serologa Serologa
Shigella dysenteriae (A)
Shigella flexneri (B)
Shigella boydii (C)
Shigella sonnei (D)
Salmonella
Grupos A, B, C, D,
E y F
Identificacin de
Aeromonas y
MK XLD SS
Siembra directa o a partir del caldo
l
Figura 17. Investigacin de Shigella y Salmonella
selenito
111
La identicacin serolgica se realiza con antisueros polivalente anti O para los
grupos A, B, C y D en el caso de Shigella y antisueros anti O para los grupos A,B, C,
C1-2, D, E y F en el gnero Salmonella.
Gnero Yersiniu: Se investiga fundamentalmente en el medio CIN. Despus de 48
horas de incubacin a temperatura ambiente (22 C), se seleccionan colonias fermen-
tadoras del manitol, la identicacin bioqumica se realiza mediante las pruebas de:
oxidasa, kligler, urea, motilidad a 36 y 22 C (Fig. 18).(1,6)
Gnero Aernmnnus (Fig. 16, 17): La bsqueda de este gnero bacteriano se realiza
en los medios MK, XLD, y SS, sembrados directamente con la materia fecal o a partir
del caldo selenito. En algunas oportunidades se puede recuperar del agar TCBS. En los
primeros medios se recupera como una colonia no fermentadora de la lactosa, pero al-
gunas especies son fermentadoras de este carbohidrato. Del medio TCBS, puede aislarse
como fermentadora o no de la sacarosa. En el caso del ADN-AMP, la bsqueda se facilita
porque adems del carcter selectivo del medio, la mayora de las cepas hidrolizan el
ADN, lo cual se evidencia por el viraje del indicador de pH azul de toluidina, de azul a

Purezas en
TS 3%
Pruebas
bioqumicas:
Kligler:
(K/A, A/A)
Urea
Motilidad a :
36 C y 22 C
Oxidasa
Negativa
CIN
Incubar 22 C
(TA Mrida)
48 horas
Colonias puntiformes
Manitol + (rosadas)
Figura 18. Investigacin de Yersinia enterocolitica

112
rosado. La identicacin bioqumica se realiza mediante las pruebas de oxidasa (positi-
va), fermentacin de glucosa y se debe realizar la diferenciacin con el gnero Vibrio y
Plesiomonas shigelloides (Anexo 15, 16, 17).
P|esinmnnus shige||niJes: Se investiga en los medios MK, XLD y SS de la siembra
directa o a partir del caldo selenito (Fig. 17). Se seleccionan colonias no fermentado-
ras de la lactosa que deben ser positivas a las pruebas de oxidasa y fermentacin de la
glucosa; al igual que en el gnero Aeromonas, realizar diferenciacin con los gneros
relacionados (Anexo 15, 16).
Vihrin chn|erue: Del medio TCBS de la siembra directa o a partir del APA, se selec-
cionan colonias fermentadoras de la sacarosa (Fig. 19). Con la coloracin de Gram de las
colonias sugestivas se conrma que sean bacilos gramnegativos para continuar la iden-
ticacin. Luego se comprueba que sean oxidasa positiva, fermentadoras de la glucosa,
no productoras de gas, crecimiento en caldo nutritivo con cloruro de sodio 1% pero no
al 6,5%. Se deben realizar otras pruebas bioqumicas para diferenciar a V. cholerae de
otros gneros relacionados (Anexo 15, 16).

TCBS
Siembra directa o a partir del
Colonias fermentadoras o
no de la sacarosa
Purezas
en TS
%
Pruebas bioqumicas:
Kligler
LIA
MIO
Fermentacin inositol
Crecimiento en NaCl, otras
Diagnstico presuntivo por
pruebas bioqumicas
Oxidasa
Positiva
Serologa O1 y O139
V. cholerae Otros Vibrio
V. cholerae O1
Serotipos: Owaga,
Inaga o Hikojima
V. cholerae O1
Biotipos:
Clsico o El Tor
Figura 19. Investigacin de Vibrio
Siembra directa o a partir del APA
113
Luego se realiza la tipicacin serolgica, con antisueros O1 y O139. En el caso
de O1, se debe realizar la serotipicacin para determinar si es el serotipo Owaga o
Inaba, y la biotipicacin si se trata del biotipo Clsico o El Tor (Anexo 20). En los la-
boratorios de referencia se debe determinar si la cepa aislada es productora o no de la
toxina termolbil.
Cumpy|nhucler sp.: A partir del medio PM, despus del perodo de incubacin
durante 48 horas a 42 C en microaerolia (frasco con la vela), se investigan las campi-
lobacterias termotolerantes, las colonias sospechosas son de color gris, brillantes, con
aspecto de gota de agua, algunas pueden seguir la lnea de siembra, adherentes, a las
cuales se les practica una coloracin de Gram con el n de observar bacilos gramnegati-
vos curvos, en forma de coma o con apariencia de alas de gaviota. La identicacin de
las especies ms involucradas en trastornos diarreicos se realiza mediante la prueba de
oxidasa (positiva) y las descritas en la Figura 20.

PM
Colonias sospechosas: color gris, brillantes,
con aspecto de gota de agua.
Gram: Bacilos curvos gramnegativos (alas
de gaviota o coma)
Oxidasa (+)
Catalasa
Negativa
1,2,3,4
Positiva
5
Nitratos: +
Hipurato: -
AN: R
C : R
Nitratos
Positivo
1,3,4
Negativo
2
Hipurato
Positivo
1
AN: S
C :R
Negativo
3 y 4
AN
S: 3
C: R
R: 4
C: R
1: Campylobacter jejuni
2: C. jejuni subsp. doylei
3: C. coli
4: C. lari
5: C. concicus
AN: cido nalidxico
C: Cefalotina
S: Sensible
R: Resistente
Figura 20. Investigacin de Campylobacter sp., especies ms asociadas a problemas diarreicos
114
Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana
Las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana para el tratamiento especco se
realizan en los siguientes casos:
u} Fiebre tifoidea causada clsicamente por S. typhi, sin embargo, otras salmonelas
como S. paratyphi A, B, S. cholerasuis producen cuadros clnicos similares.
b} Sndrome disentrico: los agentes asociados son diversos: Shigella sp., ECEI,
Campylobacter jejuni, Aeromonas sp., Plesiomonas shigelloides, S. typhimu-
rium, V. parahaemoliticus entre otros. Se recomienda tratamiento especco
para Salmonella sp. en el caso de menores de un ao o cuando se sospeche de
infeccin extraintestinal.
c} Diarrea crnica o persistente que puede ser causada por C. jejuni, Salmonella
sp. y ECEP.
d} Clera: producido por V. cholerae O1 y O139. El tratamiento no cura la enferme-
dad, pero acorta el volumen y duracin de la diarrea y reduce el perodo de ex-
crecin del Vibrio. Se recomienda sugerir al mdico tratante realizar un estudio
de control post-tratamiento.
Etapa post-analtica
Informe de resultados
Datos personales del paciente: Nombre y apellidos, cdula de identidad.
Nombre del mdico tratante
Fecha de recepcin de la muestra y emisin del reporte.
Tipo de muestra: Heces completas o hisopado rectal
Examen realizado: Coprocultivo o cultivo y antibiograma
Resultados del examen directo: fresco o frotis: Azul de metileno al 1% o Gram:
Observacin o no de leucocitos mononucleares o polimorfonucleares (cantidad
x campo microscpico).
Agente microbiano aislado (gnero y especie):
Antibiograma: Solo se debe realizar en aquellos casos que se mencionaron an-
teriormente.
Observaciones: Mencionar solo los microorganismos investigados.
115

8 Actividad prctica
Coprocultivo
Primer perodo
Materiales
- Muosliu uo locos - AzuI uo molIIono uI 1
- MouIos uo cuIlIvo: Cuiy BIuIi, CuIuo
Selenito, APA, agar MK, XLD, SS,
TCBS, PM, CIN.
- SoIucIon suIInu LsIoIogIcu [SSI)
- LmInus oiluohjolos y cuhioohjolos
Procedimiento
1. Llenar la planilla de registro del laboratorio con los datos personales, epidemiol-
gicos y clnicos del paciente.
2. Realizar el examen macroscpico y microscpico (leucocitos fecales) de una mues-
tra de heces y describir lo observado en cada caso.
3. Preparar una suspensin fecal en SSF y sembrar con pipeta Pasteur en los dife-
rentes medios selectivos-diferenciales, selectivos y de enriquecimiento, diseminar
por agotamiento en las placas de agar e incubar en las condiciones ya sealadas
(Fig.16).
Segundo perodo
Materiales
- Agui TiIlIcusu Soyu [TS) uI 8
- Piuohus hIoquImIcus: KIIgIoi, LIA, MIO, IM, Iiou, CIl
Procedimiento
1. Observar las placas sembradas en el perodo anterior,
describa las caractersticas observadas en cada medio
y seleccione las colonias de inters, realizar la puri-
cacin correspondiente en agar TS 3%, inocular las
pruebas bioqumicas segn el caso, incubar a 37 C en
aerobiosis durante 12-18 horas.
116
Tercer perodo
Materiales
- RouclIvo uo oxIuusu - Agui MuoIIoi HInlon
- RouclIvo uo Kovucs - Pulion uo MucIuiIunu
- PuoI uo LIlio y uIIIIos uo muuoiu - HIsoos osliIIos
- AnlIsuoios - DIscos uo unlIhIolIcos
Procedimiento
1. Realizar la prueba de oxidasa de las colonias puricadas y ubicar la bacteria segn
el resultado obtenido, utilizando el anexo 15.
2. Realizar la lectura de las pruebas bioqumicas montadas en el perodo anterior e
identicar la(s) bacteria(s) presente(s), utilizando las tablas y esquemas.
3. Realizar las pruebas serolgicas en caso necesario.
4. Realizar el antibiograma si el caso lo amerita, de lo contrario realizar el reporte
Cuarto perodo
Realizar la lectura del antibiograma
Etapa post-analtica
Realizar el reporte del resultado (Anexo 2)
Autoevaluacin
1. Mencionar en orden de frecuencia los microorganismos productores de EDA.
2. Sealar las condiciones de conservacin y transporte de una muestra de heces para
coprocultivo.
3. Mencionar la importancia del examen directo de una muestra de heces en el copro-
cultivo.
4. Explicar la utilidad de cada uno de los medios utilizados en el coprocultivo.
5. Explicar la importancia de la etiologa y patogenia en el diagnstico microbiolgico
de la EDA.
117
Bibliografa
(1) Vizcaya, L. En Araque M, Nieves B, Snchez K, Velsquez A, Velazco E, Vizcaya L.
Manual prctico de bacteriologa. Universidad de Los Andes, Facultad de Farmacia,
Escuela de Bioanlisis, Departamento de Microbiologa y Parasitologa, Ctedra de
Bacteriologa Clnica. 1.999.
(2) Ryan K, Ray C. Sherris, Microbiologa mdica. 4 ed. Mxico: Mc GrawHill
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(3) Cheng A, McDonald J, Thielman N. Infectious diarrhea in developed and developing
countries. J Clin Gastroenterol 2005; 39(9): 757-773.
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Microbiologa. Colombia: McGraw Hill; 2000.
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Panamericana; 2002.
Mediterrneo; 2001.
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Razetti, Ctedra de Microbiologa. Gua de trabajos prcticos, Caracas, 2000.
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Microbiologa, Captulo de Mrida. XXII Jornadas Venezolanas de Microbiologa Dr.
Jos A. Serrano. MridaVenezuela. 1994.
(9) Castro G, Aguilera M, Hernndez C, Arteaga R, Carmona A, Prez A, Giono S, Figueras
M, Aparicio G. La identicacin gentica de Aeromonas, una realidad y una necesidad
para la microbiologa diagnstica. Bioquimia 2003; 28(4): 11-18.
(10) Velasco J, Vizcaya L, Nieves B, Prez I, Carrero A, Hernndez J, Snchez
K. Campilobacterias termotolerantes como causa de enfermedad diarreica aguda
(EDA) en nios merideos. Revista de la Facultad de Farmacia 2001; 42: 47- 54.
119
prctica 9
del aparato circulatorio. Hemocultivo
Elsa Velazco
Objetivo general
Determinar mediante el hemocultivo el diagnstico microbiolgico de una infec-
cin del aparato circulatorio.
1. Reconocer y aplicar los pasos a seguir en la toma adecuada de muestra de sangre
para la realizacin del hemocultivo.
2. Aplicar las tcnicas microbiolgicas convencionales para el aislamiento e identi-
cacin de bacterias involucradas en infecciones del aparato circulatorio.
3. Determinar el patrn de susceptibilidad antimicrobiana de las bacterias aisladas en sangre.
Aspectos tericos
El aparato circulatorio, es un sitio naturalmente estril, por lo tanto, la presencia de
microorganismos o sus productos (ej: toxinas) constituyen un problema para todos los
rganos y sistemas que son irrigados por el mismo.(1) La deteccin e identicacin de
los diversos agentes microbianos, es de vital importancia desde el punto de vista clnico
y epidemiolgico. Desde el punto de vista clnico, ofrece informacin necesaria para
instaurar una terapia antimicrobiana adecuada, as como para establecer el pronstico
del paciente; y desde el punto de vista epidemiolgico, permite registrar la etiologa, la
frecuencia y el tipo de poblacin afectada por estas infecciones a nivel local, logrndose
establecer e implementar medidas de prevencin y control especcas en las mismas.
Se han descrito diferentes tipos de infecciones en el aparato circulatorio, tales
como: (2,3,4)
- Buctoromiu: Presencia de bacterias en la sangre. De acuerdo a su origen se clasican
en primarias y secundarias.
120
PRCTICA 9 Diagnstico microbiolgico de las infecciones del aparato circulatorio. Hemocultivo
Bacteremia primaria: Ausencia de foco primario de infeccin.
Bacteremia secundaria: Existe una asociacin clnica, temporal y bacteriolgica con
un sitio reconocido de infeccin en el paciente. Los sitios de origen ms frecuentes
son: infecciones genitourinarias, pulmonares, endovasculares, intraabdominales,
de heridas quirrgicas y cutneas. Cabe destacar, que las bacteremias asociadas con
complicaciones de terapias intravenosas, como celulitis y tromboebitis, se consi-
deran bacteremias secundarias.
- Fungomiu: Presencia de hongos en la sangre.
- Sopticomiu: Es un conjunto de alteraciones siolgicas resultante de la presencia
de los microorganismos (Tabla 18) o sus productos en el torrente sanguneo o en los
tejidos, con capacidad de producir invasin e infecciones a distancia. Actualmente
se considera como una respuesta sistmica a una infeccin, esta respuesta se mani-
esta por dos o ms de los siguientes parmetros como resultado de una infeccin:
temperatura mayor de 38 C o menor de 36 C, ritmo cardaco mayor de 90 latidos
por minuto, ritmo respiratorio mayor de 20 respiraciones por minuto o pCO
2
menor
de 32 mm Hg,

recuento leucocitario mayor de 12.000 clulas por mL
3
o mayor del
10% de formas inmaduras (en banda). El progreso de la enfermedad se denomina
choque (shock) sptico.
- Chnquo (shnck} spticn: Sepsis con hipotensin, a pesar de una reanimacin ade-
cuada con lquidos el paciente no responde, adems se observa alteracin de la
perfusin orgnica, que puede incluir disminucin del gasto urinario, cambios del
estado mental, acidosis sistmica e hipoxemia.
- Infoccinnos ondnvusculuros: Consisten en infecciones localizadas en el torrente intra-
vascular, incluido el corazn y los grandes vasos con o sin la presencia de prtesis
como vlvulas, injertos o parches, as como sitios de acceso intravenoso perifrico,
central y para hemodilisis.
De acuerdo a estas deniciones se entiende que el ambiente hospitalario es el lugar don-
de se concentra el mayor nmero de este tipo de infecciones, no excluyendo cifras impor-
tantes de bacteremias en la comunidad (ej: zonas endmicas de brucelosis humana).(3,5)
La etiologa microbiana de este tipo de infecciones est inuenciada por varios fac-
tores: edad, procedimiento mdico y rgano comprometido en el paciente
5
. En general,
de los microorganismos involucrados, las bacterias gramnegativas, ocupan el primer
lugar, representadas por las enterobacterias, seguidas de especies de estalococos (S.
aureus resistente a la meticilina y Staphylococcus coagulasa negativa), enterococos y
especies de Candida. Ocasionalmente pueden presentarse micobacterias, ricketsias y
virus como agentes etiolgicos.(1)
Mundialmente, la septicemia bacteriana nosocomial constituye una de las enfer-
medades infecciosas ms graves ya que su mortalidad oscila entre el 40 y el 60% de los
casos.(3) Es por ello que la deteccin e identicacin bacteriana es una de las funcio-
121
Elsa Velazco 9
nes ms importantes del laboratorio de microbiologa y para ello se necesita establecer
pautas a seguir desde la toma de muestra y su transporte para garantizar un anlisis y
reporte de resultados veraces.
En el caso de las bacteremias y septicemias es necesario el cultivo de sangre as
como en las infecciones endovasculares el cultivo de la punta de catter para el diagns-
tico microbiolgico de los mismos.(1)
Existen varios mtodos para el cultivo y/o deteccin de microorganismos en san-
gre: mtodos manuales cuantitativos, semicuantitativos (isolator) y cualitativos. Por otra
parte, existen mtodos automatizados, los cuales permiten un monitoreo continuo de la
muestra mediante la incorporacin de un mtodo de deteccin, incubador y un meca-
nismo de agitacin, lo cual optimiza el estudio microbiolgico.(6,7)
Tabla 18. Sepsis. Microorganismos segn el foco de origen
Terapia endovenosa
Sistema de infusin contaminado
Catter infectado
Fluidos intravenosos contaminados
Nutricin parenteral
Sangre y derivados contaminados
Serratia, S. epidermidis, S. aureus, Klebsiella
Enterobacter, Serratia, Enterococcus, Candida
Enterobacter, Klebsiella
Candida, enterobacterias
Enterobacter, Salmonella.
Aparato circulatorio Pseudomonas, Serratia, enterobacterias,
S. aureus, S. pneumoniae.
Aparato digestivo
Intestino grueso
Hepato biliar
Peritonitis espontnea
B. fragilis, E. coli, Enterobacter, Klesiella, Enterococcus,
Clostridium y cocos anaerbicos
E. coli, Klebsiella, Enterobacter, Enterococcus, Serratia
E. coli, S. pneumoniae, Listeria monocytogenes.
Endocarditis
Injertos vasculares
S. grupo viridans, Enterococcus, S. aureus, S. epidermidis,
enterobacterias.
S. epidermidis, S. aureus, E. coli, Klebsiella, Serratia,
Salmonella.
Infeccin urinaria
Enfermedad inamatoria plvica
E. coli, Klesiella, Proteus, Enterococcus, Pseudomonas.
B. fragilis. Peptostreptococcus, Clostridium, N. gonorrhoeae,
Streptococcus del grupo B
Paciente inmunodeprimido Pseudomonas, E. coli, Candida, S. aureus, Aspergillus.
Tomado de: Martnez, 1996.
Sistema cardiovascular
Aparato genitourinario
122
En el trabajo prctico, desarrollaremos el mtodo manual cualitativo, por ser ms
econmico manteniendo sensibilidad y especicidad aceptables en el diagnstico mi-
crobiolgico de este tipo de infecciones.
Se har referencia al mtodo de rodamiento en placa til para el cultivo de punta de
catter, el cual permanece como mtodo de referencia para la investigacin de microor-
ganismos asociados a los diversos procesos infecciosos mencionados en esta prctica.
Hemocultivo (8)
Toma de muestra de sangre
El momento ideal para la toma de muestra es durante el ascenso de la curva febril,
sin esperar que se presente el pico mximo de temperatura, ya que en este momento hay
mayor destruccin de los microorganismos.(9)
1. Seleccionar el sitio. Seleccionar los posibles sitios de los cuales se pueda obtener
la muestra. Es importante destacar que cada sitio de venopuncin representa un
hemocultivo, independientemente del nmero de frascos que se inoculen.
2. Preparacin del sitio para la venopuncin. Lavar vigorosamente con agua y jabn.
Limpiar con alcohol etlico o isoproplico al 70%. Si el paciente no es alrgico al
yodo, lavar en forma concntrica con tintura de yodo por 30 segundos con solucin
de yodopovidona por un minuto. Si existe alguna duda despus de la preparacin
el personal entrenado slo podr palpar con guantes estriles.
3. Desinfectar las tapas de las botellas para el hemocultivo con alcohol o yodo.
4. Proceder a la venopuncin con la jeringa en un ngulo no mayor de 45, extraer el
volumen de sangre necesario para obtener una dilucin en una proporcin de 1:5 o
1:10 de acuerdo al volmen y nmero de medios de cultivo a utilizar.
5. Dispensar el volmen de sangre obtenido rpida y suavemente en el medio de cul-
tivo lquido con anticoagulante, previo al ameo con el mechero del oricio del
envase que contiene el medio de cultivo.
6. Limpiar con alcohol al 70% para remover el yodo el cual puede causar irritacin en
algunos pacientes.
Transportes de muestras: Los medios de cultivos deben ser transportados inmedia-
tamente al laboratorio evitando una agitacin vigorosa.
Incubacin de los medios: Deben ser incubados en aerobiosis y anaerobiosis a una
temperatura de 36 C por un perodo mximo de 7 das (para detalles del cultivo anae-
rbico referirse a la prctica correspondiente). La metodologa a seguir en el diagnstico
microbiolgico de bacteremia y septicemia por hemocultivos se detalla en la Figura 21
y la Tabla N 19.
123
Elsa Velazco 9
Tabla 19. Aspectos a considerar en un hemocultivo
Poblacin
Pacientes con ebre o con hipotermia que pertenezcan a grupos de
alto riesgo.
Toma de muestra Personal entrenado. Normas de bioseguridad.
Volmen de la muestra
Neonatos 0,5 mL. Nios 1-5 mL y adultos 10 a 30 mL. Todas por
venopuncin.
Nmero de cultivos
2 muestras con antecedentes de patgenos no comunes.
3 muestras en caso de endocarditis u otra infeccin endovascular
4 o ms si se aislan bacterias de la microbiota habitual. (Staphylo-
coccus coagulasa negativa)
Intervalos de las muestras
Pacientes graves: 10 a 15 minutos.
Pacientes estables: 1 hora o ms.
Medios de cultivo
Caldo SDC (Soya Casena Digestiva) y caldo BHI ms peptona, para
la recuperacin de hongos y bacterias.
Caldo Columbia+Peptona (anaerobios)
Caldo Tripticasa Soya
Caldo Tioglicolato
Sistema bifsico Septi-check.
Anticoagulante
SPS (Polianetosulfonato de sodio):
- InlIho IsoonzImus
- InuclIvu unlIhIolIcos
- InlIho Iu IugocIlosIs
- Su oIoclo InlIhIloiIo uouo soi conliuiiosluuo
por la gelatina al 1,2%.
- SAS [AmIIulo SuIIulo uo SouIo)
- InlIho uIgunus hucloiIus uoiohIcus y unuoiohIcus.
Interpretacin de resultados
Tomar en cuenta el tipo de proceso infeccioso de base, el nmero de
cultivos y el agente etiolgico identicado considerando la micro-
biota habitual del hombre.
124
Figura 21 . Diagnstico microbiolgico de bacteremia y septicemia por hemocultivo
Cultivo de catteres en infecciones endovasculares
El cultivo de catteres asociados a infecciones endovasculares son tiles cuando un
paciente bajo terapia endovenosa desarrolla ebre o bacteremia sin un foco infeccioso
clnicamente aparente. Para ello Maki y col, 1967 citado en
1
introdujeron un mtodo
semicuantitativo de cultivo de los catteres el cual puede ser til para distinguir entre
una contaminacin o infeccin microbiana. El mtodo consiste en los siguientes pasos:
1. Realizar una antisepsia cuidadosa del sitio de insercin y retirar el catter.
2. Cortar con tcnica estril a 4 5 cm del extremo del catter.
3. Colocar la punta en un tubo estril para ser enviada al laboratorio.
4. Una vez en el laboratorio se procede a inocular mediante rodamiento en una placa
de agar sangre la punta del catter.
5. La placa de agar sangre debe ser incubada en microaerolia a una temperatura de
36C durante un mximo de 72 horas con lecturas intermedias cada 24 horas.
Inoculacin del
medio proporcin 1/10
Caldo nutriente,
caldo tioglicolato
o
caldo BHI
+ anticoagulante
Incubacin a 36 C
x 24 h
Transparent Turbide
Reincubar hasta 7 das
Hacer lectura a los 3, 5 y 7 das
Subcultivo a ciegas en
AS a los 3,5 y 7 das
Sin desarrollo
Desarrollo bacteriano
Tincin de Gram
Subcultivo en
AS
Positivo Negativo
x Pruebas bioqumicas
x Antibiograma
Identificacin del microorganismo
y lectura del antibiograma
Reporte de finitivo
Tincin de Gram de
subcultivo y hemocultivo
Reincubar por 24 h
Negativo
Repetir subcultivo
Reporte
Prelimina
Reporte preliminar
Observar
hemocultivo
Existe correlacin
Repetir subcultivo
No existe correlacin
Incubar a 36 C x 24 h
Preliminar
Turbidez Transparente
125
Elsa Velazco 9
6. Despus de la incubacin, realizar contaje del nmero de colonias bacterianas y si
el nmero de colonias en la placa es igual o mayor de 15, la posibilidad de septice-
mia con este punto de origen es alta.
7. Identicacin de los microorganismos aislados mediante la realizacin de la colo-
racin de Gram y pruebas bioqumicas diferenciales.
8. Realizar las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana de acuerdo al microorganis-
mo identicado.
9 Actividad prctica
Etapa pre-analtica
1. Seleccione los datos clnicos y epidemiolgicos a considerar en una bacteremia o
septicemia de la solicitud del mdico tratante.
2. Registre los datos del paciente en la hoja de consumo interno del laboratorio dise-
ada para tal n.
Etapa analtica
Primer perodo
Materiales
- ToinIquolo - Aguu juhonosu
- Guunlos, uIgouon y gusu osliIIos - Youo o soIucIon uo youoovIuonu
- Tuuhocu - JoiIngu uo uguju uo 21 x 1 1l2
- Mocloio
- AIcoloI olIIIco o IsoioIIIco uI 7u
- Iiuscos o luhos con luu uo ioscu con cuIuo BHI
(con anticoagulante).
Procedimiento
Realizar la toma de muestra de sangre, transporte e incubacin de los medios de
cultivo de acuerdo a lo descrito previamente.
126
Segundo perodo
Materiales
- LmInus oilu y cuhioohjolo
- LquIo uo coIoiucIon uo Gium
- Aguios: Sungio y ClocoIulo [uiu muos-
tras de origen comunitario).
- Aguios: Sungio, McConloy y ugui MunIloI
Salado (muestras de origen hospitalario).
- Asu uo IulIno, Iolus Pusloui osliIIos
- Agui TiIlIcusu Soyu.
Procedimiento
Observar el aspecto del hemocultivo (transparente o turbio) y de acuerdo a ello se-
guir la metodologa descrita en la gura 21.
En la realizacin del frotis para la coloracin de Gram es importante considerar:
1. Se debe abrir cuidadosamente el recipiente cerca del mechero, introducir el asa de
platino en anillo previamente esterilizada por el calor directo de la llama o en su
defecto utilizar una pipeta Pasteur estril con el propsito de minimizar el riesgo
de contaminacin del medio.
2. Colocar la gota del lquido y dejarla secar al aire sin esparcirla por la lmina por-
taobjeto. El propsito es concentrar el mayor nmero posible de microorganismos
presentes en el volumen de muestra tomada.
3. Si en la coloracin de GRAM se observa morfologa bacteriana se debe realizar un
reporte preliminar y noticarlo inmediatamente al mdico tratante.
Tercer perodo
Materiales
- LquIo uiu Iu coIoiucIon uo Gium - RouclIvos uo oxIuusu y culuIusu
- PuoI uo LIlio
- PuIIIIos uo muuoiu
- Piuohus hIoquImIcus
Procedimiento
1. Observar el desarrollo bacteriano en los diferentes medios de cultivo utilizados.
2. Realizar la coloracin de Gram.
3. Realizar la prueba de la oxidasa o catalasa del agar tripticasa soya
4. De acuerdo a las pruebas de identicacin preliminares, selecccionar e inocular en
los medios de cultivo diferenciales para la identicacin bacteriana denitiva.
127
Elsa Velazco 9
Cuarto perodo
Materiales
- HIsoos osliIIos
- Pulion u, y 2 uo Muc IuiIunu
- RouclIvos: Kovus y liIcIoiuio IiiIco.
- DIscos uo unlIhIolIcos
- Agui MuoIIoi-HInlon [MH), MH con 2 uo
cloruro de sodio, MH con 5% de sangre.
Procedimiento
Realizar la lectura de los medios de cultivo diferenciales para la identicacin bac-
teriana (ver anexos). De acuerdo al microorganismo aislado seleccionar el tipo de agar
MH y los discos de antibiticos para realizar el antibiograma (ver prctica de pruebas de
susceptibilidad antimicrobiana).
Quinto perodo
Materiales
- RogIu mIIImoliuuu
- TuhIus uo Iu NCCLS uiu Iu InloiiolucIon uo Ios luIos uo InlIhIcIon uo Ios unlIhIolIcos onsuyuuos [voi
prctica de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana).
Procedimiento
Lectura de antibiograma e interpretacin de los resultados obtenidos en todas las
etapas del diagnstico microbiolgico.
Etapa post-analtica
Elaborar el reporte denitivo de los resultados (Anexo 2).
Autoevaluacin
1. Establezca la diferencia entre un sitio anatmico naturalmente estril y natural-
mente contaminado
2. Cules son los hallazgos clnicos y epidemiolgicos que se deben considerar en
una infeccin del aparato circulatorio de origen nosocomial?
128
3. Clasique las metodologas para el diagnstico microbiolgico de una infeccin en
el aparto circulatorio.
4. Explique los aspectos a considerar para un hemocutlivo
5. Describa los pasos a seguir en la toma de muestra para un hemocultivo.
6. Explique la utilidad del reporte preliminar en el caso del hemocultivo.
7. Establezca la diferencia de un reporte de hemocultivo con reportes de muestras de
urocultivo, coprocultivo e infecciones del tracto respiratorio superior.
Bibliografa
(1) Martnez J. Infecciones sistmicas: Septicemia y endocarditis infecciosa. En: Garca
Rodrguez y Picazo. Microbiologa mdica. (ed) Tomo 2. Ediciones Mosby/Doyma 1996.
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(2) Stanford S., Phair J., Peterson,L., Warren J. Enfermedades infecciosas. Bases clnicas y
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(3) Nieto, J. Fisiopatologa de la infeccin. En Infecciones intrahospitalarias. Malagn G.,
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(4) Reimer,L. Update on Detection of Bacteremia and Fungemia. Clin Microbiol Rev 1997;
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Velsquez A, Velazco E, Vizcaya L. Manual prctico de bacteriologa. Universidad de Los
Andes, Facultad de Farmacia, Escuela de Bioanlisis, Departamento de Microbiologa y
Parasitologa, Ctedra de Bacteriologa Clnica. 1.999.
(9) Ballows A, Hausler W, Herrmann K, Isenberg H and Shadomy H. Manual of clinical
microbiology. 5
a
. ed. Washington D.C.: Americam Society for Microbiology; 1991.
129
prctica 10
del sistema nervioso central.
Lquido Cefalorraqudeo (LCR)
Objetivos generales
Determinar mediante el cultivo del Lquido Cefalorraqudeo (LCR) el diagnstico
microbiolgico de una infeccin del Sistema Nervioso Central (SNC).
1. Conocer los pasos a seguir en la toma adecuada de muestras de LCR para la realiza-
cin de estudios microbiolgicos.
2. Analizar macroscpica y microscpicamente una muestra de LCR y realizar el re-
porte adecuado de este estudio.
3. Aplicar las tcnicas microbiolgicas convencionales para el aislamiento e identi-
cacin de bacterias involucradas en las infecciones del SNC.
4. Determinar el patrn de susceptibilidad de las bacterias aisladas en el LCR a los
agentes antimicrobianos.
5. Elaborar y reportar correctamente los resultados del cultivo y el antibiograma de
patgenos aislados en LCR.
Aspectos tericos
El estudio del Lquido Cefalorraqudeo (LCR) en pacientes sospechosos de tener un
proceso infeccioso del Sistema Nervioso Central (SNC), representa uno de los ms im-
portantes procedimientos de urgencia que debe realizar el laboratorio de microbiologa
clnica. Esto se debe a la urgente necesidad de instalar una terapia antimicrobiana ecaz
cuando se identica el agente infeccioso involucrado.
Las patologas infecciosas del SNC son variadas y pueden involucrar ms de una
estructura anatmica o tejido cerebral, es por ello que debemos realizar una revisin de al-
gunos trminos comnmente utilizados:(1-3)
130
PRCTICA 10 Diagnstico microbiolgico...
- Moningitis: Inamacin de las meninges, identicada por una cuanticacin anormal
de leucocitos en LCR y con manifestaciones clnicas dependientes de la evolucin del
cuadro clnico.
- Fncofulitis: Inamacin o infeccin del tejido cerebral o ambos fenmenos, con o sin
edema secundario.
- Moningnoncofulitis: Inamacin o infeccin del cerebro o ambas alteraciones con afec-
cin de las meninges.
- Moningitis buctoriunu: Inamacin menngea causada por una bacteria patgena pre-
sente en LCR. La infeccin provocada por Mycobacterium tuberculosis constituye una
entidad particular denominada meningitis tuberculosa.
- Moningitis uspticu: Inamacin menngea de causa diversa, sin evidencia de un mi-
croorganismo patgeno detectable en LCR, aplicando tcnicas usuales de laboratorio.
Las infecciones del SNC pueden ser causadas por bacterias, virus, hongos o par-
sitos que se hallan en el medio ambiente o que forman parte de la ora normal de las
supercies corporales (Tabla 20). Por lo general, en las infecciones del SNC los agentes
causales son introducidos previamente en los tejidos perifricos del hospedero y se di-
rigen al SNC a travs de la circulacin sistmica como es el caso de agentes patgenos
que colonizan el tracto respiratorio (ej: virus de la encefalitis equina), por las vas ner-
viosas (ej: virus de la rabia), o a travs de la placenta (ej: virus de la rubola). Otra forma
de ingreso de los microorganismos en el SNC es por inoculacin directa, ocasionado por los
traumatismos craneoenceflicos (2,3).
TABLA 20. Causas frecuentes de infecciones purulentas del sistema nervioso central
Grupo etario Agente
Recin nacidos (< un mes de edad)
Streptococcus del grupo B, Escherichia coli, Listeria
monocytogenes, especies de Klebsiella y otras enterobacterias.
Lactantes y nios
Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis,
Haemophilus inuenzae.
Adultos S. pneumoniae, Neisseria meningitidis
Circunstancias especiales
Meningitis o abscesos intracraneales vincula-
dos con traumatismos, intervenciones neuro-
quirrgicas o cuerpos extraos intracraneales.
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,
S. pneumoniae, bacterias anaerobias gramnegativas y
grampositivas, especies de Pseudomonas.
Abscesos intracraneales no vinculados con
traumatismos o intervencin quirrgica.
Estreptococos microarlos o anaerobios, bacterias
gramnegativas anaerobias y ora mixta.
131
Es importante destacar que en algunas infecciones los microorganismos estn
alojados en el SNC en un estado de latencia, tal es el caso de Mycobacterium
tuberculosis o Treponema pallidum. Estos agentes producen la enfermedad activa
algn tiempo despus o cuando las condiciones inmunolgicas del husped as lo
permitan.
Aunque los abscesos del SNC son relativamente raros en comparacin con otras
infecciones del SNC, representan un problema microbiolgico y clnico especial.
Estos pueden hallarse en el interior de los tejidos del SNC o en los espacios subdural
o epidural. Algunas veces son una complicacin de la meningitis pigena. Ms a me-
nudo, los abscesos del SNC son producto de la embolizacin de bacterias u hongos
desde un sitio distante infectado, como es el caso de la endocarditis bacteriana o el
absceso pulmonar pigeno, extensin de un foco contiguo de infeccin (sinusitis o
mastoiditis) o consecuencia de una complicacin quirrgica o traumatismo no qui-
rrgico.(3)
Las infecciones del SNC suelen tener consecuencias graves. La meningitis bacteria-
na no tratada, es letal en un 70% de los casos. Sin embargo, los avances en las diversas
tcnicas diagnsticas, as como el desarrollo de nuevos agentes antimicrobianos han
reducido la mortalidad por estas enfermedades en un 10%. Por otro lado, algunas infec-
ciones del SNC ocurridas durante la infancia dejan severas secuelas neurolgicas que
alteran el desarrollo mental y psicomotor del individuo.(1-3)
La infeccin aguda del SNC constituye un problema diagnstico de gran urgen-
cia. El examen del lquido cefalorraqudeo (LCR) es absolutamente necesario cuando se
sospecha de infecciones agudas del SNC. La muestra de LCR se obtiene realizando una
puncin lumbar, la tcnica debe ser realizada por el personal competente y bajo estrictas
condiciones de asepsia, por lo tanto, todos los organismos recuperados de los cultivos
son patgenos potenciales.(3,4)
Los elementos de la respuesta inamatoria en el LCR son de gran ayuda para de-
terminar si la infeccin es bacteriana o viral, incluso puede sugerir la presencia de un
determinado agente infeccioso. En la tabla 21, se muestra el perl inamatorio reejado
en el LCR en diversas infecciones del SNC.
El cultivo del LCR es la forma clsica de establecer de manera denitiva la etiologa
y es til para hacer la evaluacin de la susceptibilidad a los diferentes agentes antimi-
crobianos. Sin embargo, existen otras tcnicas para detectar la presencia del microorga-
nismos en LCR, como la deteccin de antgenos especcos (bsqueda inmunolgica)
o la deteccin de clulas bacterianas no viables (tcnicas moleculares). Estas pruebas
permiten realizar un diagnstico rpido, as como la deteccin de bajos niveles de ant-
genos, clulas muertas o material gentico especco.(4)
132
TABLA 21. Patrn habitual del LCR y en diversas infecciones del SNC
Situacin clnica Leucocitos/mm
3
% polimorfonucleares Glucosa
a
Protenas(mg/dl)
Nios y adultos
Normal 0-5 0 > 60 < 30
Infeccin viral 2-2000 (80)
b
< 50 > 60 30-80
Infeccin bacteriana 5-5000 (800) > 60 < 45 > 60
Tuberculosis y micosis 5-2000 (100) < 60 < 45 > 60
Rocin nucidns
Normales a trmino 0-32 (8) < 60 > 60 20-170 (90)
Normales pretrmino 0-29 (9) < 60 > 60 65-150 (115)
a
Los valores deben interpretarse de acuerdo a la glucosa en sangre.
b
Los nmeros entre parntesis representan cifras medias.
10 Actividad prctica
Estudio microbiolgico del lquido cefalorraqudeo
(Aislamiento de bacterias comunes)
Materiales
- Muosliu uo LCR u osluuIui.
- LmInus oiluohjolo.
- LquIo uiu coIoiucIon uo Gium.
- LquIo uiu uoloccIon InmunoIogIcu [o-
cional).
- PIolus Pusloui.
- Asu uo IulIno.
- Medios de cultivo: agar sangre con 5% de
sangre de carnero, agar chocolate. Caldos:
tripticasa soya, tioglicolato sin indicador
(opcional).
Toma de la muestra
Las muestras de LCR deben ser coleccionadas antes de la terapia antimicrobiana y
por el mdico tratante.
Puncin lumbar
1. Limpiar el sitio de puncin con solucin antisptica y alcohol antes de la insercin
de la aguja.
2. Insertar una aguja biselada de calibre y tamao adecuado en los interespacios ver-
tebrales L3-L4, L4-L5 o L5-S1, hasta alcanzar el espacio subaracnoideo (Fig. 22).
133
3. Colocar el LCR en tubos hermticos estriles. Se sugiere por lo menos la coleccin
de la muestra en tres (3) tubos separados, para ser analizado en qumica, hematolo-
ga y para el cultivo microbiolgico (se preere el segundo tubo o el ms turbio para
el anlisis microbiolgico).
4. El tubo que ser enviado al laboratorio de microbiologa debe contener preferi-
blemente un volumen mnimo de 5 ml. Sin embargo, existen circunstancias sio-
lgicas y clnicas en la cual la obtencin de LCR es menor a 5 ml. No obstante,
en cualquiera de los casos la muestra se distribuir de manera que se asegure la
investigacin de bacterias de crecimiento rpido, estudio micolgico y cultivo para
micobacterias.
Figura 22. Posicin correcta para la toma de muestra de LCR por puncin lumbar
Primer perodo
Anlisis macroscpico de la muestra, examen directo e inoculacin en medios de
cultivo (Fig. 23).
1. Registre los datos personales del paciente y elabore una cha de laboratorio con los
datos epidemiolgicos y clnicos del paciente, segn anexo 1 (consulte la historia
clnica del paciente o comunquese con el mdico tratante).
2. Registre el volumen, apariencia y/o color del LCR.
3. Recuerde que de acuerdo al volumen del LCR, usted decidir si se debe centrifugar o
no muestra (volumen mayor de 1 ml centrifugar a 3.000 rpm durante 10 minutos)
Cola de
caballo
Filamento
terminal
Tercera vrtebra lumbar
Espacio subaracnoideo
Duramadre
Cono
medular
134
4. Con una gota de la muestra obtenida en el punto 3, prepare un frotis sin extender
para ser teido con la coloracin de Gram.
Recomendacin:
Deje secar la lmina al aire o sobre una supercie caliente (evitar el calor directo o
secar con la llama del mechero). Se recomienda jar la muestra con metanol porque
previene la lisis de los eritrocitos y permite obtener un frotis ms limpio. Deje secar
el metanol y luego coloree con la tincin de Gram (deje secar al aire).
5. Dibuje y describa lo observado.
6. Los resultados del Gram deben comunicarse inmediatamente al mdico tratante.
7. Elabore el reporte (Anexo 2).
8. Tome una o dos gotas del LCR con una pipeta Pasteur estril e inocule los medios
de cultivo slidos (agar sangre y agar chocolate) y lquidos.
9. Si el laboratorio cuenta con pruebas para deteccin de antgeno, realice estas prue-
bas con una pequea cantidad de la muestra de LCR, o utilice el sobrenadante del
LCR obtenido en el punto 3.
10. Incube los medios de cultivo slidos en atmsfera de microaerolia (10% CO
2
) y
los lquidos en aerobiosis a 36 C.
11. Revise los cultivos a las 24 horas.
Segundo perodo
1. Examine todos los medios de cultivo para evidenciar si hay o no desarrollo de mi-
croorganismos:
Si no se observa crecimiento sobre los medios slidos stos deben ser reincubados
por 72 horas antes de ser descartados. Los caldos deben ser revisados diariamente
por 5 a 7 das antes de ser descartados.
Si hay desarrollo de microorganismos sobre los medios de cultivo slidos realice
la coloracin de Gram, de acuerdo a lo observado, proceda a montar las pruebas
de identicacin denitivas. Si el desarrollo de microorganismos se observa en
los medios lquidos se realizar el Gram y se inocular en medios slidos en forma
semicuantitativa. Simultneamente se pueden montar las pruebas de identicacin
denitivas.
1.1. Describa y dibuje lo observado al Gram.
1.2. Todos estos hallazgos deben ser noticados inmediatamente al mdico tratan-
te. Elabore el reporte.
2. De acuerdo a lo observado en el o los frotis coloreados con Gram, y las reacciones
observadas en los medios de cultivo slidos, proceda a montar las pruebas bio-
135
qumicas claves que le permitirn identicar denitivamente el microorganismo
sospechoso. En esta misma etapa, monte el antibiograma (tenga en cuenta las re-
comendaciones sealadas en la prctica de pruebas de susceptibilidad). Incube las
pruebas y el antibiograma por 24 horas en aerobiosis a 37 C.
Seale las pruebas de identicacin elegidas y los discos de antibiticos seleccio-
nados para el antibiograma:
Pruebas bioqumicas de identicacin Discos de antibiticos seleccionados
Tercer perodo
Lectura de la pruebas de identicacin y antibiograma.
1. Registre y analice los resultados observados en las pruebas de identicacin. Proce-
da a realizar la identicacin denitiva del microorganismo.
Pruebas bioqumicas de identicacin Rosultudn
Identicacin del microorganismo: ___________________________________________
136
Lquido Cefalorraqudeo
Centrifugar 2000 a 3000 rpm x 10
Sedimento Sobrenadante
Pruebas inmunolgicas y
moleculares
Gram
AS
ACH
Caldo tioglicolato
o Tripticasa de soya
Negativo
Incubar a 36 C x 24 h
Reincubar
a 36 C x 24 h
Negativo Positivo
Positivo
x Tincin de Gram
x Pruebas bioqumicas
x Antibiograma
Incubar a 36 C
x 24 h
Reporte
Reporte
Figura 23. Estudio microbiolgico de LCR
Identificacin de la
bacteria aislada y lectura
del antibiograma
2. Realice la lectura del antibiograma y proceda a registrar los resultados en la siguiente tabla:
Disco de antibitico Dimetro en mm Interpretacin
Recomendacin:
Si el microorganismo aislado es un Haemophilus inuenzae o Neisseria meningitidis
es importante realizar la prueba de deteccin de -lactamasas (prueba de la cenasa).
En el caso de que se aisle una enterobacteria o un microorganismo no fermentador
de la glucosa, la deteccin de -lactamasas se realizar con la prueba del doble disco
(segn las indicaciones del profesor).
3. Elabore el reporte denitivo (Anexo 2)
Figura 23. Estudio microbiolgico del LCR
Reincubar
a 36C x 24 h
microaerolia
Incubar a 36C x 24 h microaerolia
137
Autoevaluacin
1. Por qu se considera el estudio microbiolgico del LCR una emergencia para el
microbilogo clnico?
2. Mencione algunas contraindicaciones para la toma de muestra de LCR por puncin
lumbar.
3. Mencione algunos casos en los cuales una muestra de LCR debe ser rechazada para
estudio microbiolgico.
4. Por qu es importante conocer la citologa del LCR cuando se realizan estudios
microbiolgicos de esta muestra?
Bibliografa
(1) Corts A. Infecciones del sistema nervioso central. En: Gmez A, lvarez CA, Len A.
Enfermedades infecciosas en UCI. 1a ed. Bogot: Distribuna Editorial Mdica; 2004. p.
370-386.
(2) Palmieri OJ. Meningitis infecciosa. En: Palmieri, OJ. Enfermedades infecciosas. 1era
ed. Santiago de Chile: McGraw-Hill Interamericana; 2001. p. 128-45.
(3) Ray, CG. Infecciones del sistema nervioso central. En: Ryan KJ, Ray CG. Sherris Micro-
biologa mdica. 4ta. ed. Mxico: McGraw-Hill Interamericana; 2004. p. 949-56.
(4) Montiel F, Lam M. Procedimientos para realizar cultivos aerobios segn la muestra.
En: Montiel F, Lam M. Manual de microbiologa clnica. Chile: Publicaciones Tcnicas
Mediterrneo; 2001. p. 53-86.
139
prctica 11
Diagnstico microbiolgico
de las infecciones del tracto genital
Kiralba Snchez
Objetivo general
Desarrollar la estrategia metodolgica para el diagnstico de infecciones del tracto genital.
1. Distinguir los microorganismos de la microbiota habitual y los principales patge-
nos del tracto genital tanto femenino como masculino.
2. Clasicar los procesos infecciosos que afectan al tracto genital.
3. Describir las condiciones del paciente y las tcnicas adecuadas para la obtencin de
muestras genitales.
4. Aplicar la metodologa microbiolgica convencional para el anlisis de muestras
vaginales, cervicales y uretrales.
5. Reconocer la importancia del examen directo como una herramienta til para el
diagnstico diferencial de infecciones del tracto genital.
Aspectos tericos
La mucosa genital es una regin vulnerable a la infeccin producida tanto por mi-
croorganismos constitutivos de la microbiota habitual como por los adquiridos de forma
exgena a travs del contacto sexual. La primera porcin de la uretra en el hombre, la
vulva y la vagina en la mujer estn normalmente colonizadas por diferentes microorga-
nismos, que incluyen estalococos coagulasa negativo, corinebacterias, estreptococos,
micoplasmas, bacterias anaerobias y, con menos frecuencia, levaduras (Tabla 22).
En el caso de la mujer en edad reproductiva destaca la presencia de cantidades
signicativas de Lactobacillus acidophilus, este agente ejerce un control biolgico
140
PRCTICA 11 Diagnstico microbiolgico de las infecciones del tracto genital
sobre otros microorganismos, constituyndose en un mecanismo de defensa muy im-
portante para el epitelio vaginal. En ocasiones las infecciones del tracto genital femeni-
no pueden ser de origen endgeno, causadas principalmente por: Gardnerella vaginalis,
Streptococcus agalactiae o Candida sp.(1)
Tanto en el hombre como en la mujer las infecciones genitales mas relevantes desde
el punto de vista clnico, epidemiolgico y de salud pblica son las infecciones de trans-
misin sexual (ITS). Dentro de stas tenemos las ITS clsicas: gonorrea, slis, chancro
blando, linfogranuloma venreo y granuloma inguinal. Las ITS de nueva generacin
comprenden las infecciones producidas por Chlamydia trachomatis (serovariedades D
hasta la K), Virus Herpes Simplex, Virus Papiloma Humano y el Virus de la Inmunode-
ciencia Humana.(2)
Producto de las infecciones genitales se genera un variado espectro clnico con
manifestaciones o sin ellas, que pueden derivar en complicaciones graves como la enfer-
medad inamatoria plvica, problemas ginecoobsttricos, esterilidad, cncer e incluso
la muerte.(3)
En los ltimos aos ha habido avances sustanciales en el diagnstico de las infec-
ciones de transmisin sexual, entre ellos, el uso de nuevas muestras para el anlisis
como orina o saliva y la aparicin de nuevos mtodos diagnsticos. Particularmente el
diagnstico de las ITS ha cambiado histricamente, debido a las dicultades que existen
para la obtencin de muestras representativas; por otra parte, los microorganismos como
C. trachomatis, Treponema pallidum y los virus no se pueden detectar por metodologas
convencionales. As tenemos los mtodos inmunolgicos, aun cuando adolecen de baja
sensibilidad, son utilizados ampliamente en el diagnstico de algunos microorganis-
mos fastidiosos, debido a su disponibilidad comercial y costo accesible. Actualmente se
cuenta con mtodos sosticados y econmicamente ms costosos, de amplicacin de
cidos nucleicos (AAN) como la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), la reaccin
en cadena de la ligasa (LCR) o la amplicacin mediada por transcriptasa (TMA) que
mejoran la sensibilidad (90-95%) y la especicidad (95%) al detectar hasta 10 organis-
mos.(4)
Tabla 22. Microbiota habitual del tracto genital
Rogin unutmicu Microorganismos
Uretra
Staphylococcus sp., Streptococcus sp., Corynebacterium sp., Mycoplasma
sp., Enterococcus sp., Ureaplasma urealyticum, Propionibacterium sp., En-
terobacterias, Candida sp.
Vagina
Lactobacillus sp., Gardnerella vaginalis, Corynebacterium sp., Staphylococcus
sp., Streptococcus sp., Enterococcus sp., Ureaplasma sp., Mycoplasma sp.,
Enterobacterias, Bacteroides sp., Peptostreptococcus sp., Bidobacterium
sp., Peptococcus sp., Candida sp.
Tomado de: Koneman y col., 2001; Murray y col., 2002
141
Kiralba Snchez 11
Cuadros clnicos
En la mujer sexualmente activa las infecciones vaginales y cervicales son causa fre-
cuente de consulta mdica. Bajo la inuencia de los estrgenos, el epitelio vaginal normal
se cornica, adquiriendo una resistencia relativa a la infeccin por algunos patgenos. No
obstante, el ecosistema vaginal es dinmico y est sometido a cambios constantes, dados
por factores endgenos y exgenos, entre los que se sealan: el estado hormonal, uso de
contraceptivos orales, tratamientos genitales tpicos, embarazo, duchas vaginales, relacio-
nes sexuales, uso de dispositivos intrauterinos (DIU), infecciones, stress, cambio de parejas
sexuales, entre otros. (5,6) Los cuadros clnicos que con frecuencia se presentan en la mujer
se especican a continuacin:
- Vuginitis: es la inamacin de la vagina que se acompaa comnmente con secre-
cin vaginal o leucorrea. Los sntomas no son especcos, lo que implica que el diagnstico
debera ser conrmado por pruebas de laboratorio y as evitar los tratamientos empricos.
La etiologa generalmente es infecciosa, aunque tambin puede estar originada por
causas no infecciosas: iatrognicas causada por agentes qumicos, reaccin a un cuerpo
extrao o lavado muy frecuente; puede haber vaginitis alrgica a los componentes de
espermicidas, semen, o productos de higiene sanitaria, ropa interior, entre otros. La
vaginitis atrca se presenta frecuentemente en la mujer postmenopusica, siendo pro-
ducto del adelgazamiento del epitelio vaginal y la falta de glucgeno, lo que conlleva a
una reduccin de la produccin de cido lctico y un incremento del pH vaginal. Estos
cambios producen un sobrecrecimiento de bacterias coliformes no acidlas; la leuco-
rrea no es profusa.(7)
Las vaginitis infecciosas comnmente padecidas por la mujer sexualmente activa son:
la candidosis y la tricomoniasis. En algunos casos pueden ser ocasionadas por G. vaginalis,
Mycoplasma sp., Staphylococcus aureus o Escherichia coli.(5,8)
Otras manifestaciones que pueden estar presente en los casos de vaginitis son: ardor,
prurito, dolor durante las relaciones sexuales (coitalgia), sangramiento, entre otros.
- Vuginnsis buctoriunu (VB}: es la causa ms frecuente de infeccin vaginal entre las
mujeres en edad frtil. Se caracteriza por la presencia de un ujo homogneo, blanquecino o
grisceo, que puede estar presente en cantidad escasa, moderada o abundante; la secrecin
se adhiere fcilmente a la pared vaginal y puede expeler un olor ftido. El hallazgo mas re-
saltante es el reemplazo de los lactobacilos por microbiota bacteriana, predominantemente
anaerbica, representada por G. vaginalis y especies de Mobiluncus, Prevotella, Porphyro-
monas y Mycoplasma. Otro aspecto importante es la ausencia de inamacin. Es de destacar
que aproximadamente el 50% de las mujeres que cursan con VB son asintomticas. Los
siguientes se consideran factores de riesgo: duchas vaginales, embarazo, uso de DIU, pro-
miscuidad, nuevo compaero sexual, entre otros.(8)
142
- Vuginnsis citnlticu: esta entidad clnica est caracterizada por un sobrecrecimiento
de los lactobacilos que normalmente estn presentes en la vagina; esto lleva a la acumu-
lacin de grandes cantidades de cido lctico, lo que hace que baje el pH y se produzcan
signos y sntomas como: irritacin e inamacin vulvar, prurito, disuria, dispareunia. Estas
manifestaciones pueden orientar hacia una candidosis vaginal, de all la importancia del
laboratorio para el diagnstico diferencial, el cual se puede llevar a cabo fcilmente con la
observacin microscpica de un extendido de la secrecin vaginal.(9)
Las entidades clnicas anteriormente descritas, se presentan en mujeres en edad frtil,
sin que necesariamente sean producto de un contacto sexual, a excepcin de la tricomonia-
sis. Los cuadros que a continuacin se reeren son producidos generalmente por microorga-
nismos de transmisin sexual:
- Corvicitis: es un proceso generalmente asintomtico pero con importantes compli-
caciones y secuelas a largo plazo. De hecho, es la va de inicio ms frecuente de las infec-
ciones ginecolgicas altas y de sus importantes implicaciones en la reproduccin femenina.
La cervicitis o endocervicitis se describe como la inamacin del epitelio endocervical y la
existencia de una secrecin mucopurulenta. Microscpicamente se dene como la presen-
cia de 10 o ms polimorfonucleares por campo en los frotis endocervicales.(1)
En la actualidad, se reconocen cuatro agentes importantes productores de cervici-
tis: C. trachomatis, N. gonorrhoeae, virus del herpes simple (VHS) y el virus del papilo-
ma humano (VPH).
- Urotritis: consiste en la inamacin de la uretra, que ocasiona sntomas como: disu-
ria, dispareunia, secrecin uretral mucopurulenta y eritema del meato. La secrecin uretral
es ms cuantiosa y purulenta en la uretritis gonoccica. A diferencia de la infeccin en la
mujer, el 90 % de las uretritis en el hombre son sintomticas. La uretritis no gonoccica
(UNG) es el cuadro ms comn en el hombre y su principal agente etiolgico es C. tracho-
matis. Desde el punto de vista microscpico se establece como criterio clnico de uretritis la
presencia de 5 o ms polimorfonucleares por campo, bajo objetivo de inmersin.(1)
Las ITS comprenden un grupo de infecciones transmisibles a travs del contacto sexual,
la etiologa es muy amplia, algunos autores reeren la existencia de ms de 20 agentes in-
fecciosos productores de ITS, entre bacterias, virus, hongos y parsitos (Tabla 23). (10) Clni-
camente, los signos y sntomas son muy variables y han servido de base en la clasicacin
sindrmica de las ITS, para el manejo, diagnstico y tratamiento de estas infecciones (Tabla
24). (11)
143
Kiralba Snchez 11
Tabla 23. Agentes productores de infecciones de transmisin sexual
BACTERIAS VIRUS HONGOS PARSITOS
Neisseria gonorrhoeae
Chlamydia trachomatis
Treponema pallidum
Haemophilus ducreyi
Klebsiella granulomatis
Gardnerella vaginalis
Mycoplasmas sp.
Ureaplasma sp.
Inmunodeciencia humana
Herpes simple tipo II
Papiloma humano
Molusco contagioso
Citomegalovirus
Hepatitis B
Hepatitis A
Tomado de: Drew, 2004
TABLA 24. Clasificacin sindrmica de las infecciones de transmisin sexual
Sndrome Enfermedad
ITS supurativas
Gonorrea no
complicada
Uretritis, cervicitis, proctitis
Gonorrea complicada
Sndrome de artritis-dermatitis,
perihepatitis, endocarditis
Uretritis no gonoccica
Uretritis,
endocervicitis
Vaginitis
Tricomoniasis
Candidiasis
Ulcorus gonitulos
Slis 1
Herpes genital
Granulomas
Chancro blando
Granuloma inguinal
Linfogranuloma venreo
Verrugas genitales
Condiloma o papiloma
Molusco contagioso
Ectoparasitosis
Pediculosis pbica
Escabiosis
ITS Sistmicas
Infeccin por VIH
Hepatitis B
Slis 2
Tomado de: Morbility and Mortality Weekly Report, 2002; Mandell y col., 2002
Candida albicans
Trichophyton sp
Microsporum sp
Trichomonas vaginalis
Phthirus pubis
Sarcoptes scabiei
Giardia lamblia
Entamoeba histolytica
144
Diagnstico
El xito del diagnstico de las infecciones genitales, depende primordialmente de
que la muestra a procesar sea representativa del proceso infeccioso, que la misma sea
recolectada en condiciones ptimas y transportadas adecuada y rpidamente al labora-
torio. As mismo, es necesario el conocimiento de la microbiota habitual, los patgenos
potenciales y de los diferentes factores que conforman el ecosistema genital. Todos estos
aspectos repercuten en la validez del diagnstico microbiolgico.(6)
El diagnstico de la mayora de las infecciones genitales, y particularmente de las
ITS, se fundamenta en el cuadro clnico, ya que los anlisis de laboratorio no estn dis-
ponibles o son demasiado costosos. Es por ello que desde 1990, la organizacin mundial
de la salud (OMS), recomienda el manejo de las ITS con base en el diagnstico sindr-
mico, que recae sobre el mdico.(12)
No obstante, el mtodo tradicional por anlisis de laboratorio, se sigue fomentando
en la resolucin de casos que no se resuelven con el tratamiento emprico y en las pa-
cientes que acuden a las consultas de ginecologa y obstetricia para el manejo adecuado
y no exponerlas a tratamientos excesivos.
Etapa pre-analtica
La valoracin de un paciente con sntomas genitales requiere de una exploracin
fsica y una anamnsis detallada. Adems de los datos liatorios y clnicos, es preciso
obtener otros datos que pueden orientar el diagnstico microbiolgico, entre los que se
citan:
- Ln oI cuso uo Iu mujoi: uso uo iouuclos uo lIgIono IomonInu, lcnIcu unlIconco-
tiva, uso de antibiticos que pueden alterar el ecosistema vaginal, antecedentes
familiares de diabetes, ciclo menstrual, uso de duchas vaginales, entre otros.
- Ln cuso uo lomhio y mujoi: InvoslIgui sohio oI nmoio uo uiojus soxuuIos, Ioclu uo
contacto sospechoso, nuevo compaero sexual, inicio de los sntomas, anteceden-
tes de ITS, estilo de vida, hbitos sexuales (relaciones genito-oral, genito-anal), uso
de antibiticos, sintomatologa genital (dolor, prurito, dispareunia, ardor, disuria).
Etapa analtica
En la Tabla 25 se sealan las muestras requeridas segn el cuadro clnico o sndro-
me y los microorganismos a investigar.
145
Kiralba Snchez 11
Tabla 25. Muestras a procesar segn el sndrome infeccioso
y el patgeno a investigar
Cuadro clnico Muestra clnica Patgeno
Uretritis
Hisopado uretral
Orina de primer chorro
N. gonorrhoeae
C. trachomatis
Virus del Herpes simple
Cervicitis Hisopado de endocrvix
N. gonorrhoeae
C. trachomatis
Virus Papiloma Humano
Vulvo-vaginitis
Hisopado de fondo de saco
Hisopado de introito vaginal (nias o
prepberes)
C. albicans
Trichomonas vaginalis
Enterobacterias
Lactobacillus sp.
Gardnerella vaginalis
Ulceras Exudado o raspado de la lcera
T. pallidum
H. ducreyi
Slis Suero T. pallidum
Tomado de: Koneman y col., 2001; Black, 2000.
Obtencin de muestras del tracto genital femenino
Condiciones previas: La paciente no debe estar recibiendo tratamiento antimicro-
biano. No practicarse duchas vaginales, ni tener relaciones sexuales 24 horas antes de
la obtencin de la muestra. As mismo, no debe baarse el da de la recoleccin de la
misma.
Materiales
- LscuIo osliII
- HIsoos uo uIgInulo uo cuIcIo o uo uIgouon
previamente buferados y esterilizados
- SoIucIon suIInu LsIoIogIcu osliII
- MouIo uo liunsoilo: AmIos o Sluuil
- LmInus oiluohjolos IImIus y uosongiusuuus.
146
Procedimiento: Para la obtencin de la muestra vaginal y/o cervical, se debe em-
plear un espculo; la maniobra puede ser realizada por el mdico en la consulta o por
el microbilogo en el laboratorio, siempre que se disponga de una camilla ginecolgica.
Por lo general, las muestras son enviadas al laboratorio, por ello es importante la instruc-
cin del personal que recolectar las mismas.(13)
Observacin: si la muestra es recolectada en el laboratorio de microbiologa, se
debe disponer adems de los medios de cultivo necesarios, segn el tipo de muestra a
obtener.
Procedimiento para la investigacin microbiolgica de muestras vaginales
1. Caractersticas macroscpicas de la muestra: Valorar e identicar las siguientes
caractersticas en la secrecin genital:
- CunlIuuu
- ConsIsloncIu
- OIoi
- H
- CoIoi
2. Caractersticas microscpicas de la muestra: Con la muestra vaginal obtenida se
debe realizar un montaje en fresco entre lmina y laminilla y dos extendidos nos
para teir al Gram.
- Fxumon ul froscn: informar la presencia de clulas descamativas, leucocitos y bacte-
rias, presencia o ausencia de levaduras y de trofozooitos de Trichomonas vaginalis.
- Grum: Herramienta citolgica muy til para el diagnstico diferencial entre vagini-
tis y vaginosis bacteriana o citoltica.
- LvuIuui y somIcuunlILcui Ios moiIolIos hucloiIunos iouomInunlos, colojui Ios
resultados con la tabla conocida como sistema de gradacin de Nugent (Tabla 26).
- IuonlILcui Ius cIuIus guIu o cIuvo, os uocIi, cIuIus uoscumulIvus iocuhIoilus oi
cocobacilos gramvaribles.
- VuIoiui Iu mIciohIolu luhIluuI iosonlo: Iu ohsoivucIon uo > 8u hucIIos giumo-
sitivos largos y delgados (Lactobacillus sp.) por campo de inmersin y escasa
microbiota bacteriana mixta, se considera un frotis normal.
- VuIoiui y iooilui Iu iosoncIu uo IoucocIlos oIImoiIonucIouios, Iovuuuius y sIg-
nos de citlisis (destruccin de clulas con presencia de ncleos desnudos).(14)
147
Kiralba Snchez 11
Tabla 26. Sistema de gradacin de Nugent
Puntaje
Cantidades de morfotipos observados con mayor aumento de:
Lactobacilos
GurJnere||u
Prevnle||u/Pnrphyrnmnnus
Bacilos
gramvariables curvos
0 4+ 0 0
1 3+ 1+ 1+ 2+
2 2+ 2+ 3+ 4+
3 1+ 3+
4 0 4+
Cuanticacin: 0: ningn organismo; 1+: < 1 morfotipo; 2+: 1 a 5 morfotipos; 3+: 6 a 30 morfotipos; 4+:
> 30 morfotipos.
Interpretacin: Puntaje total: 0-3: Negativo para VB; 4-6: ora vaginal alterada; 7-10: Vaginosis bacteriana.
Tomado de: Nugent y col., 1991
3. Cultivo de secrecin vaginal: En la gura 24 se presenta el protocolo para la inves-
tigacin microbiolgica de una secrecin vaginal. Es de destacar que el cultivo es
requerido en casos particulares: en mujeres embarazadas y en mujeres con leuco-
rreas inespeccas o resistentes al tratamiento. En VB no se recomienda el cultivo
de G. vaginalis por cuanto forma parte del ecosistema vaginal normal, no obstante,
se dispone de una serie de criterios clnicos y microscpicos bien establecidos que
orientan al diagnstico hacia una VB (Tabla 27 y 28).(15,16) Se recomienda la siem-
bra de la secrecin en un agar bilis semislido para la recuperacin de Candida sp.
Tabla 27. Criterios clnicos de Amsel para el diagnstico
de vaginosis bacteriana
- Presencia de una secrecin homognea, na y adherente
- H > 4.
- PiosoncIu uo uI monos 2u uo cIuIus cIuvos uoI loluI uo cIuIus oIloIIuIos.
- Piuohu uo umInus voIlIIos osIlIvu uI ugiogui lIuioxIuo uo olusIo [1u) u Iu sociocIon
La presencia de al menos 3 de estos criterios evidencia el diagnstico
clnico de vaginosis bacteriana
Tomado de: Navarrete y col., 2000.
148
Tabla 28. Diagnstico diferencial entre vaginitis y vaginosis
Variable Candidiasis Tricomoniasis Vaginosis bacteriana Vaginosis citoltica
Caractersticas
del flujo
Moderado a
abundante, blanco,
como leche cor-
tada, olor cido
Moderado a abun-
dante, purulento,
espumoso,
olor ftido
Escaso, moderado o
abundante, adhe-
rente, homogneo,
blanco a grisceo,
olor a pescado
Moderado a
abundante, blanco
homogneo, olor
cido o inodoro
pH del ujo 4-4.5 5-6 > 4.5 3.5-4.5
Test de aminas Negativo Variable
Positivo
(70-80%)
Negativo
PMN Escasos
Moderado a
abundante
< 1xcampo Escasos
Lactobacilos
Presentes
(< 30xc)
Escasos
(< 10xc)
Ausentes o dis-
minuidos
Abundantes
(> 30xc)
Presencia de
blastoconidias
y pseudohifas
Positivo (70%) Negativo Negativo Negativo
Trofozoitos de
T. vaginalis
Negativo Positivo (60%) Negativo Negativo
Presencia de c-
lulas gua o clave
Negativo Negativo Positivo (90%) Negativo
Citlisis Leve Ausente Ausente Intensa
PMN: polimorfonucleares
Tomado de: Sobel, 1997; Navarrete y col., 2000
4. Anlisis de los cultivos: Revisar los cultivos entre las 24, 48 o 72 horas de incuba-
cin. Correlacionar la cantidad y variedad de morfotipos coloniales con los resulta-
dos observados en el Gram. La valoracin de la cantidad de crecimiento, sigue los
criterios de interpretacin que hasta ahora se han manejado con otras secreciones,
es decir, por cuadrantes. As tenemos que si el desarrollo se observa en primer y
segundo cuadrante, se estima crecimiento escaso; la observacin de colonias hasta
el tercer y cuarto cuadrante se considera un crecimiento moderado o abundante
respectivamente.(13)
El desarrollo moderado o abundante de microorganismos indgenas debe ser con-
siderado y repetirse la obtencin de la muestra. En caso de persistir el mismo patrn,
se le dar importancia siempre que: se descarte la presencia de patgenos, persistan los
signos y sntomas de infeccin y al examen microscpico el posible patgeno se observe
en forma predominante sobre las otras bacterias, disminucin de los lactobacilos y aso-
ciado a clulas inamatorias.(5,7,14)
149
Kiralba Snchez 11
Muestra
(Secrecin vaginal)
Gram
Suspensin con SSF
Incubar a 36 C
por 24 h en
microaerofilia
Incubar a 36 C
por 24 h en
aerobiosis
Desarrollo significativo
de algn morfotipo colonial
(entre 3 4 cuadrante)
C. albicans x Pruebas bioqumicas
x Antibiograma
lectura del antibiograma Reporte
Gram
x Morfotipos bacterianos
x Clulas inflamatorias
x Clulas levaduriformes
x Clulas claves
AS AMK
Incubar a 36 C
por 24-48 h
Bsqueda de trofozotos
de Trichomonas vaginalis
o clulas levaduriformes
Observacin de
clamidoconidia
Medio de transporte Stuart
Cultivo aerbico
Agar
bilis
Colonias puntiformes con
-hemlisis difusa
Gram
Cocobacilos
gramvariables
Sospechar de G. vaginalis
Medios slidos y lquidos
enriquecidos con suero
de caballo
Mycoplama y
Ureaplasma
Identificacin
Anexo 21
A partir del medio agar-bilis se realiza una preparacin hmeda para la bsque-
da de estructuras levaduriformes, primordialmente clamidoconidias que nos daran el
diagnstico de Candida albicans.
Figura 24. Estudio microbiolgico de secrecin vaginal
Obtencin de secrecin uretral
Esta muestra puede ser obtenida en el laboratorio de microbiologa previo entrena-
miento del personal.
Condiciones previas del paciente: No debe estar recibiendo tratamiento antimicro-
biano, abstencin sexual de 24 horas, el paciente no se baar el da de la recoleccin de
la muestra y debe tener una retencin urinaria de al menos 4 horas.
Materiales
- HIsoos muscuIInos, huIoiuuos y osliIIos
- SoIucIon suIInu LsIoIogIcu
- LmInus oiluohjolo, IImIus, uosongiusuuus
- MouIo uo liunsoilo: AmIos o Sluuil
- MouIos uo cuIlIvo: ugui sungio [AS), ugui Tluyoi-
Martin (ATM) y agar Mac Conkey (AMK)
28

Observacin de
clamidoconidia
C. albicans
150
Procedimiento
Se recomienda obtener la muestra en la maana. Previa retraccin del prepucio,
inspeccionar la presencia de la gota matinal, en su defecto, practicar la asepsia del mea-
to urinario con un hisopo y solucin salina siolgica estril. Indicar al paciente previo
lavado de manos que presione el glande para estimular la salida de la secrecin. Intro-
ducir y rotar el hisopo dentro de la uretra aproximadamente 2 centmetros y obtener la
muestra.
Otro espcimen recomendado con este propsito es la orina de primer chorro, para
lo cual se solicita al paciente que evacue los primeros 10 mL de orina en un recolector
estril.
Procesamiento de secrecin uretral y cervical
Estas muestras generalmente son remitidas al laboratorio para la investigacin de
patgenos sexualmente transmisibles. En la gura 25 se esquematiza el protocolo con-
vencional de uretritis y cervicitis.
Examen directo
Fresco: para detectar los trofozoitos de T. vaginalis.
Gram: investigar la presencia de diplococos gramnegativos intracelulares o extrace-
lulares y la presencia de clulas inamatorias.
Giemsa: observar la presencia de cuerpos de inclusin sugestivos de C. trachomatis.
Tincin con anticuerpos uorescentes: para la investigacin de C. trachomatis.
Inoculacin de los medios de cultivo: A partir de la muestra directa o del Stuart,
proceder a la siembra de la secrecin en AS, ATM y AMK. En el caso de la orina de pri-
mer chorro se centrifuga y se siembra el sedimento.
Anlisis de los cultivos: Revisar los medios inoculados entre 48-72 horas de incu-
bacin. En ATM, evale la presencia de colonias sospechosas de N. gonorrhoeae y pro-
ceda a su identicacin (Anexo 12). Los medios AS y AMK permitirn investigar otros
grupos bacterianos grampositivos y gramnegativos que estn asociados al gonococo o
como agentes etiolgicos de uretritis o cervicitis.
El desarrollo moderado o abundante de microorganismos potencialmente patge-
nos, debe ser considerado de importancia clnica siempre que: se descarte la presencia
de patgenos, hallazgos de signos y sntomas de infeccin, asociados a una respuesta
inamatoria.(6)
151
Kiralba Snchez 11
Investigacin de otros microorganismos patgenos o potencialmente
patgenos
- Ch|umyJiu lruchnmulis es la principal causa de infecciones genitales tanto en
hombres como en mujeres jvenes. Los mtodos citolgicos para la investigacin
de Chlamydia tienen una baja sensibilidad (45-62%), las tcnicas inmunolgicas
(EIA e IFD) pueden alcanzar hasta una sensibilidad de 75%. Los mtodos de ampli-
cacin de cidos nucleicos (PCR, LCR y TMA) hoy por hoy se han convertido en
el patrn de oro para el diagnstico de la infeccin clamidial.(2)
- Ureup|usmu sp. y Mycnp|usmu genilu|ium: son los agentes infecciosos ms im-
portantes (despus de Chlamydia) productores de uretritis no gonoccica. El culti-
vo de estos microorganismos es complicado por ser microorganismos muy exigen-
tes, sin embargo Ureaplasma sp. se puede recuperar a partir de medios de cultivo
enriquecidos con suero de caballo. En el comercio existen equipos que detectan la
presencia de este microorganismo y que permiten a su vez conocer los patrones de
sensibilidad antimicrobiana. La deteccin de M. genitalium es ms complicado por
ser un microorganismo anaerobio muy exigente, por lo que se han diseado mto-
dos moleculares para su diagnstico a travs de RCP.(2)
Figura 25. Estudio microbiolgico de secrecin cervical o uretral
Muestra
(Secrecin cervical o uretral)
Gram Giemsa*
Incubar a 36 C
por 24 h en
microaerofilia
Incubar a 36 C
por 24 h en
aerobiosis
Desarrollo significativo
de algn morfotipo colonial
(entre 2, 3 4 cuadrante)
Gram
xPruebas bioqumicas
xAntibiograma
Reporte
Gram
x Morfotipos bacterianos
x Clulas inflamatorias
x Clulas levaduriformes
AS AMK ATM
Incubar a 36 C
por 24-48 h, 6% CO
2

en cmara hmeda
Cuerpos de inclusin
sugestivos de
C. trachomatis
Colonias pequeas,
grisceas, brillantes
Diplococos gramnegativos
Identificacin de
N. gonorhoeae (Anexo 7)
*Se debe obtener raspado cervical
o uretral segn el caso
Medio de transporte Stuart
(Anexo 12)

152
Etapa post-analtica
Para el reporte de los resultados se debe seguir el formato del Anexo 2. Es importan-
te resaltar que a diferencia de otros informes, los de las muestras genitales, en ocasiones
debe ir acompaado con algunas interpretaciones relevantes.
- InIoimo uoI oxumon uIioclo: uoI Iiosco, Gium y GIomsu [on Ios cusos quo uIIquo).
Detallando semicuantitativamente los diferentes morfotipos microbianos y la pre-
sencia de clulas (epiteliales e inamatorias). Del examen al fresco se puede repor-
tar directamente la presencia de tricomonas: Se observaron trofozoitos de Tricho-
monas vaginalis
- A uilIi uo unu muosliu uo sociocIon vugInuI, sIguIonuo Ios ciIloiIos uo Nugonl, InIoi-
mar: Negativo para vaginosis bacteriana, o Microbiota bacteriana alterada o Vagi-
nosis Bacteriana
- Ln Ios cuuuios uo uioliIlIs uguuu con sociocIon uiuIonlu o mucouiuIonlu uon-
de se observe la morfologa tpica de neiseria, es decir diplococos gramnegativos,
reportar su presencia intra o extracelular. En estos casos, el Gram constituye un
diagnstico presuntivo de N. gonorrhoeae y se debe emitir el resultado del Gram
sin esperar el cultivo.
- Lu ohsoivucIon uo cuoios uo IncIusIon uonlio uoI cIloIusmu uo Ius cIuIus uoI
epitelio escamo-columnar, a travs de la coloracin de Giemsa se reportar: Se
observaron cuerpos de inclusin intracitoplasmticos sugestivos de Chlamydia tra-
chomatis.
- Rooilo oI mIciooigunIsmo uIsIuuo uo munoiu somIcuunlIlulIvu sI so liulu uo mIcio-
organismos potencialmente patgenos.
- Ln oI cuso uo cuIlIvos osIlIvos uiu gonococo, so iooilu DosuiioIIo uo Neisseria go-
norrhoeae.
- Ln oI cuso uo cuIlIvos nogulIvos o uosuiioIIo uo mIciooigunIsmos luhIluuIos, io-
portar: No hubo crecimiento microbiano en 72 h de incubacin o Desarrollo de
microbiota habitual de la regin, respectivamente.
153
Kiralba Snchez 11
Primer perodo: Procesamiento de muestras vaginales, cervicales y uretrales
Materiales
- Muosliu on mouIo uo liunsoilo y on soIucIon
salina siolgica.
- HIsoos osliIIos
- Asu uo IulIno
- LmInus oilu ohjolo
- LumInIIIus cuhio ohjolo
- MouIos uo cuIlIvo: AS, ATM, AMK y ugui hIIIs
- LxlonuIuos uo sociocIon vugInuI, coivIcuI y uioliuI.
- CoIoiucIon uo GIomsu
Procedimiento
1. Elaborar la cha clnico-epidemiolgica del paciente
2. Realizar el examen al fresco lo ms pronto posible, entre lmina y laminilla y obser-
varlo con objetivo de 10X y 40X
3. Proceder a la siembra de las muestras cervical y uretral por la tcnica de agotamien-
to en AS, ATM y AMK
4. Incubar AS y ATM en microaerolia, a 36 C hasta por 72 horas, con revisin peri-
dica cada 24 h. AMK en aerobiosis por 24-48 h.
5. La secrecin vaginal se sembrar en AS, AMK y en agar bilis. Incubar AS en mi-
croaerolia, los dems en aerobiosis por 24 a 48 h.
6. Fije las lminas suministradas con calor para proceder a teirlas con la tcnica de
Gram.
7. Los extendidos de secrecin vaginal teidos al Gram, se analizarn e informarn
siguiendo los criterios de Nugent.(15)
8. Uno de los frotis de secrecin cervical y uretral se jar con metanol absoluto para
proceder a realizar la tcnica de Giemsa (ver Prctica N 6). Observe al microscopio
con objetivos de 10X y 40X.
9. Registre los resultados de la observacin de los exmenes directos.
Segundo perodo: Revisin de los cultivos
Materiales
- Asu uo IulIno
- LmInus oilu ohjolo
- LumInIIIus cuhio ohjolo
- BuloiIu hIoquImIcu uiu Neisseria
- BuloiIu hIoquImIcu uiu Gardnerella
154
Procedimiento
1. Revisin de los cultivos sembrados en el primer perodo, evaluar semicuantitativa-
mente el desarrollo bacteriano. Realizar Gram a cada colonia diferente que desarro-
lle en cada uno de los medios de cultivo (esto con el n de reconocer la microbiota
habitual).
2. Las colonias de valor diagnstico se analizarn siguiendo los esquemas de iden-
ticacin propuestos, dependiendo de la morfologa y reaccin al Gram. Para la
identicacin de G. vaginalis ver anexo 28.
3. Inocular las pruebas bioqumicas suministradas a partir de purezas de las cepas de
inters clnico.
4. Realizar una preparacin hmeda a partir del agar bilis entre lmina y laminilla,
para investigar la presencia de blastoconidias, hifas y clamidoconidias.
5. Registre los resultados de los exmenes microscpicos.
1. Identicar el o los microorganismos de inters clnico, cotejando los resultados con
las tablas de identicacin que se han manejado en el manual y en esta prctica en
particular.
2. Registre los resultados y elabore el reporte (Anexo 2).
Autoevaluacin
1. Explique la utilidad del Gram en el diagnstico microbiolgico de infecciones del
tracto genital
2. Cul es la importancia de la microbiota habitual en el tracto genital femenino?
3. Enumere los patgenos clsicos del tracto genital
4. Elabore un cuadro donde seale para cada ITS los microorganismos etiolgicos y el
mtodo de diagnstico a emplear
5. En las secreciones genitales, hacia qu diagnstico clnico orienta la presencia de:
a) clulas gua: _____________________________________________________________
b) citlisis: _______________________________________________________________
c) diplococos gramnegativos intracelulares: ___________________________________
d) pH mayor de 4.5: ________________________________________________________
e) polimorfonucleares mayor de 10 x c de inmersin:__________________________
6. Mencione los factores de riesgo para adquirir una ITS y para el desarrollo de una VB.
7. Seale las diferencias entre vulvovaginitis y vaginosis bacteriana.
8. Segn la utilidad en el laboratorio cmo se clasica el medio ATM y explique las
ventajas para su uso.
155
Kiralba Snchez 11
Bibliografa
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157
prctica 12
Diagnstico microbiolgico de las
infecciones por bacterias anaerobias
Beatriz Nieves
Objetivo general
Describir el procedimiento convencional para aislar e identicar bacterias anaero-
bias a partir de muestras clnicas.
1. Describir las caractersticas clnicas que sugieren una infeccin anaerbica
2. Describir los hallazgos bacteriolgicos que sugieren una infeccin por bacterias
anaerobias.
3. Nombrar las infecciones anaerbicas ms frecuentes y sus posibles agentes etiolgicos
4. Explicar el procedimiento a seguir para la coleccin, transporte y cultivo adecuado
de la muestra para el diagnstico de una infeccin anaerbica y establecer las dife-
rencias con el procedimiento a seguir para la investigacin de bacterias aerobias.
5. Sealar los mtodos utilizados para la identicacin de bacterias anaerobias.
Aspectos tericos
Las bacterias anaerobias son patgenos importantes en una amplia variedad de infec-
ciones en el hombre. Ellas pueden estar involucradas en esencialmente cualquier tipo de
infeccin bacteriana en humanos, desempeando un papel importante en la mayora de las
categoras de infecciones de piel y tejidos blandos, osteomielitis, infecciones pleuropulmo-
nares, intra-abdominales y del tracto genital femenino (Tabla 29) (1,2,3,7,8). Del amplio n-
mero de bacterias anaerobias que forman parte de la ora normal, solo unos pocos gneros
estn involucrados como agentes etiolgicos de infecciones en humanos. (4)
Los anaerobios varan en su requerimientos nutricionales y en su sensibilidad al oxige-
no, por lo que una apropiada coleccin, cultivo e incubacin es vital para su recuperacin.
158
PRCTICA 12 Diagnstico microbiolgico de las infecciones por bacterias anaerobias
Principios generales
Seleccin y coleccin de los especmenes clnicos
Las muestras naturalmente contaminadas no son adecuadas para la bsqueda de
bacterias anaerobias, salvo ciertos especmenes, como por ejemplo, heces para la bs-
queda de Clostridium difcile en caso de sospecha de colitis pseudomembranosa o dia-
rrea asociada al consumo de antibiticos. (9)
TABLA 29. Aislamiento de bacterias anaerobias en pacientes
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Sangre 1 1 2 1 0 1
LCR 2 1 1 2 0 1
Cabeza y cuello 3. 1 1 3 0 3
Torcica 2 1 1 3 0 3
Abdominal 3 3 3 1 1 1
Gineco-obsttrica 3 2 1 1 2 1
Piel y tejidos blandos 2 1 2 2 1 1
Las muestras provenientes de sitios normalmente estriles obtenidas por puncin,
previa asepsia de la piel, son las ms convenientes. (9)
0: Ninguno
1: Raro (1% - 33%)
2: Comn (34% - 66%)
3: Muy comn (67% - 100%)
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159
Beatriz Nieves 12
En caso de infecciones de las vas urinarias, la orina debe obtenerse por pun-
cin suprapbica, en caso de infecciones del tracto respiratorio inferior, la aspiracin
transtraqueal o puncin pulmonar es la forma ms adecuada para obtener la muestra
(Tabla 30) (1, 5, 10).
TABLA 30. Coleccin de especmenes
Apropiadas No apropiadas
- BIosIu uo lojIuos ohlonIuos quIiigIcumonlo.
- AsIiuuo uImonui
- LIquIuo uilIcuIui
- LIquIuo oiIlonouI
- ConlonIuo uo uhscosos
- OiInu coIocluuu oi usIiucIon suiuhIcu.
- HIsouuo nusuI, nusoIuiIngoo
- Lsulo oxocloiuuo
- Luvuuo hioncouIvooIui
- ConlonIuo gsliIco
- Hocos, oxcolo uiu hsquouu uo C. difcile, C.
perfringens
- OiInu omIlIuu oi mIccIon o culoloiIzuuu
- HIsouuo vugInuI, uioliuI coivIcuI.
- CuuIquIoi muloiIuI uuyuconlo u unu momhiunu
mucosa que no haya sido apropiadamente des-
contaminada.
Transporte
Un medio de transporte ptimo debe contrarrestar los efectos ambientales letales
para las bacterias anaerobias, tales como, oxgeno molecular, temperaturas bajas, pH
elevado, sobrecrecimiento de bacterias aerobias o facultativas.
Cuando la muestra se va a procesar de inmediato, luego de su coleccin, se puede
transportar en la misma jeringa, expulsando previamente el aire contenido en ella.
En el mercado existen envases especiales que contienen una mezcla de gases libres
de oxgeno. En caso de muestras coleccionadas con hisopos, el medio de transporte pre-
reducido soporta la viabilidad de los anaerobios por unas pocas horas (9 ).
Cultivo
Para el cultivo de muestras donde se sospeche la participacin de ora bacteriana
mixta, tanto anaerobia como facultativa, se recomienda el uso de medios de cultivo no
selectivos y selectivos. Como agar base se emplea agar Schaedler, agar Brucella, agar
Wilkins Chalgren, agar CDC. (8, 9)
Dichos medios pueden hacerse selectivos con la incorporacin de ciertas sustan-
cias como kanamicina, gentamicina, feniletilalcohol, vancomicina, cido nalidxico,
entre otras. ( 9 )
160
Las frmulas comerciales de algunas de estas bases contienen vitamina K y hemina,
cofactores necesarios para el crecimiento de algunos anaerobios gramnegativos de los
gneros Prevotella y Porphyromonas. (7, 8)
Cabe destacar que existen tambin bases comerciales especiales para el aislamiento
de ciertos anaerobios como C. penfringens, C difcile y especies del grupo Bacteroides
fragilis.
Los medios se deben incubar bajo condiciones anaerbicas utilizando sobres gene-
radores de CO
2
e H
2
, durante 5-7 das a 36 C.
Ciertos anaerobios como C. difcile y C. perfringens son de crecimiento rpido, por
lo que los medios especiales para estos grmenes se pueden inspeccionar a las 2448
horas (Tabla 31). (8, 9 )
TABLA 31. Medios de cultivos selectivos
Medio Usn
- Agui hIIIs oscuIInu
- Agui sungio* IonIIolII uIcoloI
- Agui sungio* KunumIcInu vuncomIcInu
- CIcIosoiInu coIoxIlIn yomu uo luovo.
- Agui suILlo oIImIxInu suIIuuIuzInu yomu
de huevo.
- AIsIumIonlo giuo B. fragilis.
- AIsIumIonlo uo unuoiohIos Gium osIlIvos y nogulIvos.
- AIsIumIonlo uo unuoiohIos Gium nogulIvos
- AIsIumIonlo uo C difcile.
- AIsIumIonlo uo C. perfringens
.
Aislamiento primario e identificacin ( 9 )
- CuiucloiIslIcus mucio y mIcioscoIcus uo Ius coIonIus. Ln Iu TuhIu 82 so muosliun
algunas caractersticas tiles en la identicacin de algunas bacterias anaerobias.
- SuhcuIlIvos on cuIuo cuino Icuuu u olio cuIuo osocIuI quo sooilo oI ciocImIonlo,
como caldo tioglicolato, caldo Schaedler, caldo Wilkins Chalgren.
- ConlioI unuoiohIco uoI ciocImIonlo on cuIuo y coIoiucIon uo Gium uoI oxlonuIuo
para vericar pureza.
- IuonlILcucIon hIoquImIcu
* Con cualquiera de las bases mencionadas anteriormente: Agar Schaedler, Agar CDC, Agar Wilkin
Shaedler, Agar Brucella.
161
Beatriz Nieves 12
TABLA 32. Identificacin preliminar en cultivos primarios
Caractersticas Identicacin posible
Corroe el agar.
Pigmentacin negra.

Fluorescencia roja brillante.
Fluorescencia azul.
Doble zona de hemlisis
Huevo Frito
Enverdece el agar
Grandes con bordes irregulares
Cabeza de medusa
Diente molar
Migas de pan
Crecimiento extendido (Swarming)
.
Grupo Bacteroides
urealyticus
Porphyromonas, Prevotella
Prevotella intermedia, P. loeschii
Fusobacterium sp.
Clostridium perfringens
Fusobacterium varium.
Fusobacterium spp.
Clostridium spp.
Clostridium septicum
Actinomyces spp.
Fusobacterium nucleatum
Clostridium
Mtodo convencional: Galera de medios diferenciales que ponen en evidencia la
capacidad de microorganismos para utilizar carbohidratos, licuar la gelatina, producir
indol y ureasa, reducir los nitratos, hidrolizar la esculina, crecer en bilis al 20 %, produ-
cir lecitinasa o lipasa, entre otras, son las ms utilizadas. En las tablas 34 y 35 se mues-
tran las pruebas diferenciales para el nivel I y II de identicacin de bacterias anaerobias
Gram negativas y Gram positivas, respectivamente.
162
Mtodos bioqumicos rpidos miniaturizados: API 20: utiliza 20 sustratos: 15 car-
bohidratos, rea, gelatina, esculina, medio para detectar indol.
Requiere incubacin anaerbica durante 48 horas.
Mtodos enzimticos: RAPID ID32 detecta enzimas preformadas en unas pocas ho-
ras despus de la inoculacin, se incuba aerbicamente. Al igual que el API, este sistema
posee como base de datos un libro codicado.
Identicacin por mtodos moleculares: Se han utilizado sondas para la toxina
A en la identicacin de aislados de C. difcile, tambin se ha usado la PCR para am-
plicar el gen de la enterotoxina A de este microorganismo. Igualmente se ha aplicado
esta tcnica en la deteccin de otros anaerobios, como P. gingivalis, Mobiluncus sp, B.
fragilis.(6, 11)
En la gura 26 se resumen los pasos a seguir para el aislamiento e identicacin de
bacterias anaerobias.
Figura 26. Aislamiento e identicacin de bacterias anaerobias
El diagnstico de las infecciones anaerbicas se puede predecir por el reconoci-
miento de ciertos signos clnicos, los cuales se resumen en la tabla 33. Aunque mucho
de estos indicios no son especcos, la presencia de ms de uno de ellos en un paciente
Muestra
Examen directo
(Gram)
AS-Sch
BE
AS-Sch-AN AS-Sch-ANV
Dependiendo de la muestra
AYH
Incubacin anaerbica (3-7 das)
Colonias aisladas
Gram
Caldo carne o
caldo Schaedler
Incubacin
aerbica
Aerotoleranciaa
Pruebas bioqumicas Identificacin
48
Aerotolerancia
163
Beatriz Nieves 12
puede ser sugestivo de una infeccin anaerbica. Las condiciones predisponentes e in-
dicios bacteriolgicos alertaran al clnico, quien puede entonces, vericar la naturaleza
del patgeno y la extensin de la infeccin.
TABLA 33. Indicios clnicos que sugieren una infeccin anaerbica
- InIoccIon uuyuconlo u unu suoiLcIo mucosu.
- MuI oIoi uo Iu IosIon o sociocIon.
- TojIuo nociolIco gungionoso, gus, IoimucIon uo uhscoso.
- BucloiomIu o onuocuiuIlIs sIn ciocImIonlo on lomocuIlIvos uoiohIcos.
- InIoccIon ioIucIonuuu con oI uso uo unlIhIolIcos oIoclIvos soIo conliu uoiohIos [oj. coIluzIuImu,
aminoglucsidos).
- InIoccIon ioIucIonuuu con lumoios.
- TiomhoohIlIs slIcu.
- InIoccIon soguIuu u moiuouuius unImuI o lumunu.
- GinuIos uo uzuIio on Iu sociocIon.
- ConuIcIon cIInIcu quo iouIsono u unu InIoccIon unuoiohIcu [Lj. umnIonIlIs muloinuI, oiIoiu-
cin del intestino)
Un nmero de hallazgos bacteriolgicos son tambin sugestivos de infeccin anae-
rbica, los cuales se resumen en la Tabla 34. Casi todas las infecciones anaerbicas se
originan de la propia microora del paciente.
TABLA 34. Hallazgos bacteriolgicos que sugieren una infeccin anaerbica
- CuIlIvos uoiohIcos nogulIvos uo mIciooigunIsmos vIslos on Iu lIncIon uo Gium uoI muloiIuI oiIgInuI
- MoiIoIogIu lIIcu uiu unuoiohIos on Iu lIncIon uo Gium.
- CiocImIonlo unuoiohIco on mouIos quo conlIonon unlIhIolIcos quo InlIhon uoiohIos
- CiocImIonlo nogulIvo on cuIlIvos hucloiIoIogIcos uo iulInu
- CiocImIonlo osIlIvo on zonu unuoiohIcu uo mouIos IIquIuos
- Gus, muI oIoi on Iu muosliu o cuIlIvo unuoiohIco
- CuiucloiIslIcus uo Ius coIonIus on cuIlIvo unuoiohIco
164
Secuencia de la identificacin de bacterias anaerobias
1. Extensiones del espcimen clnico teidos con la coloracin de Gram.
1.1. Celularidad y presencia del polimorfonucleares (PMN).
1.2. Presencia de ora bacteriana, morfotipos y abundancia.
Reporte al clnico informando estos datos
2. Identicacin presuntiva (I y II Nivel)(Tablas 35 y 36).
2.1. Caractersticas morfolgicas de las colonias aisladas.
2.2. Resultados del Gram hecho a las colonias.
2.3. Efecto selectivo de algunos antibiticos (kanamicina, colistin, vancomicina
entre otros) sobre el crecimiento bacteriano.
Reporte al clnico informando gnero probable (Anexo 2)
3. Identicacin denitiva (III Nivel)
a) Pruebas de fermentacin.
b) Produccin de catabolitos: Indol, H2S, Nitritos, Hidrlisis de gelatina, de la esculina, etc.
c) Deteccin de productos terminales de fermentacin por cromatografa de gases.
165
Beatriz Nieves 12
Reporte al clnico informando gnero o especie identificada (Anexo 2)
TABLA 35. Nivel I de identificacin de grupo y especies de
organismos anaerobios Gram negativos.
Microorganismo
p
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Grupo B. fragilis - R R R R - - V V - - -
Grupo B. urealyticus - S R S S + + - -+ - V V
B. gracilis - S R S V + + - - - - -
B. urealyticus - S R S S + + - -+ - + -
Wolinella /
Campylobacter
- S R S S + + - - - - +
Bilophila sp. - S R S R - + - + - -+ -
Fusobacterium sp. - S R S V - - V - V -+ -
F. necrophorum - S R S SR - - + - + - -
F. nucleatum - S R S S - - - - - - -
F. mortiferum/varium - S R S R - - -+ - -+ - -
Porphyromonas sp. + R S R S - - - - - - -
Prevotella sp.
Pigmentada
+ R R V S - - V - V - -
P. intermedia + R R S S - - + - + - -
Otras Prevotella sp. - R R V S - -+ -+ -+ -+ - -
Cocos gramnegativos - S R S S - V V V - -
Veillonella sp. - S R S S - + - -+ -+ - -
R: Resistente; S: Sensible; V: Variable; F/F: Formato/Fumarato.
166
TABLA 36. Nivel II de identificacin de grupo y especies de
organismos anaerobios Gram positivos
Microorganismos
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Cocos anaerobios GP C - V S R V V
-
+
V
P. anaerobius
C/
CB
- RS S R S - - -
P. assaccharolyticus C - S S R R + - -+
P. hydrogenalis C - S S R R + -
Clostridium sp.
Naegler-positiva
B + V SR R V V - V
Clostridium sp. B + S S R V V - +
C. perfringens B + S S R - V - + + + + -
C. bifermentans B + S S R + - - + - - - -
C. sordelli
Naegler-negativa
B + S S R + - - + - - - +
Clostridium sp. B + V SR R V V - V V
C. difcile B + S S R - - - - - +
Bacilos no esporulados
CB/
B
- S SR R V V V
P. acnes B - S S R +- + +
E. lentum
CB/
B
- S S R - + -+ + V
C: Cocos; CB: Cocobacilos; B: Bacilos; V: Variable; S: Sensible; R: Resistente; CCFA: cicloserina cefoxitin
fructosa agar; SPS: Sodio Polianetol sulfonato.
Materiales
- CuIlIvo iImuiIo uo unu muosliu iovonIonlo uo unu ucIonlo con InIoccIon oiIouonluI
inoculada en agar sangre base Schaedler.
- CuIlIvo iImuiIo uo unu muosliu iovonIonlo uo un ucIonlo con unu InIoccIon uhuomInuI
inoculada en agar sangre Schaedler selectivo y en agar bilis esculina
- CoIoiucIon uo Gium.
- Piuohus hIoquImIcus y iouclIvos uiu Iu Iocluiu.
- CuIlIvo on ugui sungio huso ugui ScluouIoi uo osocIos conocIuus uo unuoiohIos.
167
Beatriz Nieves 12
Procedimiento
Inspeccione y anote las caractersticas morfolgicas y microscpicas de las distin-
tas colonias desarrolladas en el cultivo primario.
Caractersticas de cultivo
a) ___________________________________________________________________________
b) ___________________________________________________________________________
c) __________________________________________________________________________
d) ___________________________________________________________________________
Caractersticas microscpicas

a b c d
Inspeccione y anote las caractersticas macroscpicas y microscpicas de las cepas
en estudio crecidas en agar sangre.
Caractersticas microscpicas
a b c d
168
Caractersticas macroscpicas
a) ___________________________________________________________________________
b) ___________________________________________________________________________
c) ___________________________________________________________________________
d) ___________________________________________________________________________
Siga las instrucciones del profesor, proceda a la lectura de las pruebas bioqumicas
de las cepas en estudio. Registre los resultados.
Pruebas Rosultudns
Identicacin___________________________________________________________________
Reporte de resultados (Anexo 2).
Autoevaluacin
1. Nombre, por los menos, 6 indicios clnicos que sugieren una infeccin anaerbica.
2. Nombre, por lo menos, 6 infecciones asociadas a bacterias anaerobias asociada fre-
cuentemente a infecciones en humanos
3. Describa, por lo menos, 4 gneros de bacterias anaerobias asociadas frecuentemente
a infecciones en humanos.
4. Nombre, por lo menos, 5 hallazgos bacteriolgicos sugestivos de una infeccin anaer-
bica.
169
Beatriz Nieves 12
5. Mencione las muestras adecuadas para el diagnstico de una infeccin anaerbica
segn su localizacin
6. Nombre los medios selectivos y no selectivos para el aislamiento de bacterias anae-
robias, especicando su uso
7. Nombre los mtodos utilizados para la identicacin de bacterias anaerobias, d
ejemplos.
8. Mencione las precauciones a seguir para aislar con xito bacterias anaerobias.
9. Describa las diferencias entre los procedimientos a seguir para el aislamiento de
bacterias aerobias y anaerobias.
Bibliografa
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ria. Int J Urol 2004; 11(3): 133-41.
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7
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thods for the PCR detection of oral anaerobic pathogens. Lett Appl Microbiol 2003; 36
(2):101-105.
171
Anexos
Anexo 1. Ficha de registro de datos

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOANLISIS
DPTO. DE MICROBIOLOGA Y PARASITOLOGA
MICROBIOLOGA CLNICA

N Lab.: _______________

Nombre y apellido:________________________________________ Edad: _______ Sexo: ________
Procedencia: __________________ N de historia: ___________ Servicio: ____________________
Fecha de toma de muestra: _______________ Tipo de muestra: ___________________________
Examen solicitado: _____________________________ Diagnstico: __________________________
Resumen de la historia clnica: ________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
Recibe antibiticos: ____________ Especifique droga y ltima dosis: _______________________
________________________________________ Tiene cultivo anterior:________________________
Especifique tipo de muestra y resultado: ________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
Observaciones: _______________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________
Medico solicitante: __________________________________ Firma: __________________________

172
Anexos
Anexo 2. Reporte de resultados

REPORTE DE RESULTADOS:
Nombre y apellidos: __________________________________ Edad: _________ Sexo: ________
Fecha de toma de muestra: ___________________ Fecha de emisin: _____________________
Tipo de muestra: ______________________________ Examen realizado: __________________
______________________________________ Mdico tratante: ___________________________

Examen directo (tcnica utilizada): __________________________________________________
___________________________________________________________________________________

Cultivo: ___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________

Antibiograma: _____________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________

Observaciones: ____________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________

Firma y sello

173
Anexos
Anexo 3. Esquema de identificacin de cocos grampositivos
Catalasa
Positiva Negativa
Disposicin al
Gram
Racimos Cadenas o pares
Staphylococcus Streptococcus y Enterococcus
Identificin
Anexo 4 y 5
Hemlisis
D J
S. pneumoniae
S. grupo D
S. grupo viridans
Enterococcus sp.
S. pyogenes
S. grupo B,C,F,G
Enterococcus sp.
S. grupo viridans
Enterococcus sp.
Otros Streptococcus
Esquema de identificacin de cocos gramposivos

Prueba
clave
Identificacin
Anexos 6 y 8
Identificacin
Anexos 7 y 9
Identificacin
Anexo 10
Cocos grampostivos
Cocos grampositivos
9 8
174
Anexos
Sensible (=10mm)
Oxida glucosa
Anexo 4. Esquema de identificacin de Staphylococcus aureus
Cocos grampositivos
Catalasa positivo
Staphylococcus
Micrococcus
Bacitracina
0.04 U
O/F glucosa
Resistente ( 10mm)
Fermenta la glucosa
Micrococcus
Staphylococcus
Coagulasa
Positiva Negativa
S. uureus Staphylococcus
coagulasa-negativa
Identicacin
Anexo 5
175
Anexos
Anexo 5. Clave dicotmica para la identificacin de los estafilococos
humanos coagulasa negativa ms frecuentes

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F
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+
U
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a
176
Anexos
Anexo 6. Esquema de identificacin de Streptococcus pneumoniae
Muestra clnica
Cultivo:
Agar sangre de carnero 5%, agar
chocolate.
Incubar 36C x 18-24 h, en
microaerofilia
Frotis directo coloreado con
Gram: Cocos grampositivos
asociados a leucocitos PMN
Colonias aisladas:
Lisas, pequeas,
redondas, mucoides,
transparente,
brillantes
Coloracin de Gram:
Cocos Gram positivos
en cadenas cortas o
pares
Prueba de la catalasa:
Negativa
Prueba de LAP:
Positiva
-hemolticas
Optoquin
Sensible Resistente
Solubilidad en bilis
S. pneumoniae
Positiva Negativa
Hidrlisis de PYR
Bilis Esculina
Tolerancia a NaCl 6,5 %
Enterococcus sp.
Streptococcus grupo D
Streptococcus grupo
viridans
Optoquina
viridans
177
Anexos
Anexo 7. Esquema de identificacin de Streptococcus pyogenes
Cocos grampositivos
Catalasa positivo
Hemlisis en agar sangre
- hemoltico
Streptococcus
Enterococcus
Bacitracina
0,04 U
Sensible Resistente
Streptococcus grupo B, C, D, F, G
Enterococcus sp.
Diagnstico presuntivo
Streptococcus grupo A
Pruebas diferenciales
(Anexo 8)
Diagnstico confirmatorio
Aglutinacin con
partculas de ltex.
178
Anexos
Identificacin de cocos grampositivos, catalasa negativa, -hemolticos
Microorganismo B SXT CAMP
Hidrlisis
del hipurato
PYR
Bilis
Esculina
Des. en
NaCl
6,5%
Streptococcus
Grupo A

S

R

-

-

+

-

-
Streptococcus
Grupo B

R

R

+

+

-

-

-
Streptococcus
Grupo C,F,G
V S - - - - -
Enterococcus R R - V + + +
B: Bacitracina; Des. Desarrollo; +: reaccion positiva; -: reaccin negativa; S: sensible;
R: resistente; V: variable.
Tomado de: Koneman y col., 1999.
Anexo 8. Identificacin de cocos grampositivos, catalasa negativa,
-hemolticos
A
A = Taxo de bacitracina de 0.04U; Des. Desarrollo; + = reaccin positiva; - = reaccin
negativa; S = sensible; R = resistente; V = variable; SXT = trimetropina-sulfametoxazole;
PYR = pirrolidonil-betanaftilamida.
179
Anexos
-hemolticos.

Identificacin de cocos grampositivos, catalasa negativa, -hemolticos
Microorganismo O
Solubilidad
en bilis
Bilis
Esculina
NaCl 6,5% PYR

S. pneumoniae

S

+

-

-

-

Enterococus sp

R

-
+ + +

Streptococcus
grupo D

R
- + - -

Streptococcus
grupo viridans*

R

-

V

-

-
O
a
O = optoquina; + = positivo; - = negativo; V = variable;
a
= sembrar en placas de agar sangre con un hisopo estril en cuatro direcciones,
en un cuadrante de la placa y colocar el taxo de optoquina (P), incubar a 37C en
microaerofilia durante 18 a 24 h. S = sensible (halo > 14 min); R = resistente (crecimien-
to no inhibido alrededor del disco y halo < 14 min);
b
= Sembrar en placas de agar sangre despus de la incubacin respectiva, agregar una
gota de desoxicolato de sodio al 2%. Lectura 30 (positivo = hidrlisis de colonias
donde se agreg el reactivo; negativo = no se observa cambio en el crecimiento.); PYR
= pirrolidonil-betanaftilamida.
b
viridans*
.
R
180
Anexos
-hemolticos
Microorganismo
Bilis
esculina
NaCl 6,5 %

Enterococus sp.

+ +
Streptococcus
grupo D
+ -

Otros Streptococcus

- -
Cocos
gramnegativos
Oxidasa
Positiva
Neisseria y Moraxella
Identificacin
Anexos 12, 13 y 14
Esquema de identificacin de cocos gramnegativos
Anexo 11. Esquema de identificacin de cocos gramnegativos
+ = positivo; - = negativo.
181
Anexos
Anexo 12. Esquema de identificacin de Neisseria gonorrhoeae
Agar Thayer Martin o
Agar Chocolate
Incubacin a 36C, 6% CO
2
, cmara hmeda x 48 h.
Colonias pequeas, grises, brillantes.
Gram
Oxidasa
Positiva
Utilizucin do
carbohidratos
Glucosa (+)
Maltosa (-)
Lactosa (-)
Sacarosa (-)
Neisseriu gnnnrrhneue
Determinacin de beta-lactamasa
182
Anexos
Anexo 13. Identificacin de cocos gramnegativos

Identificacin de cocos gramnegativos

Microorganismo

G
l
u
c
o
s
a

M
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l
t
o
s
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F
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o
s

N. gonorrhoeae

+ - - - - - - -

N. meningitidis

+ + - - - - - -

M. catarrhalis

- - - - - + + +
+ = positivo; - = negativo; AN = agar nutriente. Para los azcares se utiliza el agar CTA.
183
Anexos
Anexo 14. Identificacin de Moraxella catarrhalis
Identificacin de Moraxella catarrhalis

Prueba Reaccin

Morfologa y reaccin al Gram

Catalasa +
Oxidasa +
Motilidad -
Desarrollo en agar nutritivo +
Produccin de cido a partir de:
Glucosa
Lactosa
Maltosa
Sacarosa

-
-
-
-
DNasa +
Butirato-esterasa +
- galactosidasa -
184
Anexos
Anexo 15. Esquema de identificacin de bacilos gramnegativos no
exigentes (BGNNE)

I
d
e
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t
i
f
i
c
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c
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A
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6
,

1
9

y

2
0

B
G
N
N
F
185
Anexos
Anexo 16. Esquema general para identificacin de algunos bacilos
gramnegativos no exigentes (BGNNE)
Bacilos gramnegativos
Crecimiento en MK, XLD, SS
Lact + Lact -
H
2
S -
Oxi +
Lact -
H
2
S +
Oxi +
Lact -
H
2
S -
Oxi -
H
2
S + H
2
S -
Oxi Oxi
+
1, 3
(3.2)
O/129
R
1
S
3
(3.2)
O/F glucosa
+
1,2,
3,6
-
4
Inositol
-
1,3,6,
+
2
NaCL 0 %
-
6
+
1,3
Sacarosa
R
1
S
3
-
3,2
+
3.1
Serologa
O1 y O139
O/F glucosa O/F glucosa
-
4.1
-
4
+
1
+
5,6
6.1
Nitratos - Nitritos
-
6.1
+
5
-
5
+
1
O/129
Tomado y modificado: Vizcaya y col., 1994.
1 Aeromonas
2 Plesiomonas. shigelloides
3 Vibrios no halfilos
3.1 Vibrio cholerae
3.2 Vibrio mimicus
4 Bacilo gramnegativo no
fermentador de glucosa
4.1 Shewanella sp.
5 Enterobacteriaceae
6 Vibrios halfilos
6.1 Vibrio metschnikovii

Lact: Fermentacin de lactosa
Oxi: Oxidasa
O/F: Oxidacin/Fermentacin
H
2
S: Sulfuro de hidrgeno
S: Sensible
R: Resistente
Tomado y modicado de: Vizcaya y col., 1994.
186
Anexos
Anexo 17. Identificacin de bacilos gramnegativos no exigentes (BGNNE)

I
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e
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c
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y

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,

1
9
9
9
.
187
Anexos
Identificacin de las especies de Aeromonas
consideradas de importancia clnica

+: Positivo; -: Negativo; V:Variable; ND: dato no disponible;
bv: biovariedad

Tomado de: Castro y col., 2003.

Caracterstica

A
.
.

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r
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Indol + + + +
Gas de glucosa + - + + + - +
Arginina
dihidrolasa
+ + + + + - +
Decarboxilacin
de:
Lisina
Ornitina

+
-

-
-

+
-
+ + -

+
-
Voges-Proskauer + - + + + + -
cido de:
L-arabinosa
Lactosa
Sacarosa
Inositol
D-manitol
Salicina
Celobiosa

+
-
+
-
+
+
V

+
+
+
-
+
+
+

-
-
+
-
+
-
V

-
-
+
-
+
+
V

-
ND
-
-
-
-
-

-
-
-
-
-
-
-

-
ND
-
-
+
-
+
Hidrlisis de
Esculina
+ + - + - - -
Beta hemlisis en
sangre de carnero
+ - + + + V V
Sensibilidad a:
Cefalotina
Ampicilina

-
-

-
-

+
-

+
-

-
-

+
-

-
+
Susceptibilidad a
O/129
10 g
150 g

-
-

-
-

-
-

-
-

-
-

-
-

-
-
Anexo 18. Identificacin de las especies de Aeromonas consideradas
de importancia clnica
188
Anexos
Anexo 19. Ocho pruebas diferenciales clave para divir las 12 especies
clnicamente significativas de Vibrio en seis grupos.
O
c
h
o

P
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1
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1

G
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2

G
r
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p
o

3

G
r
u
p
o

4

G
r
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p
o

5

G
r
u
p
o

6

P
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b
a

V . c h o l e r a e
V . m i m i c u s
V . m e t s c h n i k o v i i
V . c i n c i n a t i e n s i s
V . h o l l i s a e
V . d a m s e l a
V . f l u v i a l i s
V . f u r n i s s i i
V . a l g i n o l i t y c u s
V . p a r a h a e m o l y t i c u s

V . v u l n i f i c u s
V . c a r c h a r i a e
D
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189
Anexos
Anexo 20. Diferenciacin entre biotipos de Vibrio cholerae
Diferenciacin entre biotipos de Vibrio cholerae

R: Resistente; S: Sensible; - : Prueba negativa; + : Prueba positiva.
Biotipo
Prueba
Clsico El Tor
Betahemlisis en agar sangre de carnero - +
Prueba CAMP - +
Prueba de Voges-Proskauer - +
Aglutinacin de eritrocitos de pollo - +
Sensibilidad a 50 U de Polimixina B S R
Sensibilidad al fago IV S R
Anexo 21. Identificacin de Arcanobacterium haemolyticum
Identificacin de Arcanobacterium haemolyticum
Nombre de la prueba Reaccin
Morfologa y reaccin al
Gram
Bacilos grampositivos
Hemlisis Beta
Catalasa -
CAMP reverso +
Hidrlisis de la Esculina -
Reduccion de nitratos -
DNAsa +
Glucosa +
Maltosa +
Sucrosa V
Manitol -
Xilosa -
Ureasa -
+: positivo; -: negativo; V: variable
Tomado de: Koneman y col., 1999; Lopardo y col., 1999.
190
Anexos
Anexo 22. Esquema de identificacin de Haemophilus influenzae
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Anexos
Anexo 23. Caractersticas de las especies de Haemophilus aisladas del
ser humano

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Anexos
Anexo 24. Procedimiento para el diagnstico microbiolgico
de la difteria
Muestra: Pseudomembrana
exudado farngeo o nasofarngeo

Gram
AS
Incubar a 36 C
por 18-48 h
en microaerofilia

Estudio macroscpico
de las colonias
Gram y
Catalasa
Coloracin de Lffler
Pruebas bioqumicas
Enviar a laboratorio
de referencia

Coloracin de
Leffler
Predominio de bacilos
fusiformes y espiroquetas
de Angina de Vincent
Bacilos con grnulos
metacromticos con
disposicin difteroide
de especies de Corynebacterium
ATP
ML
Colonias gris-negras
con halo marrn
Incubar 36 C
por 4-8 h
Coloracin de
de Lffler
Incubar a 36 C
8-12 h
Negativo
Reincubar
18 h
Positivo

Pruebas
bioqumicas
ML
Pruebas bioqumicas
ATP
de angina de Vincent
ATP = Agar telurito de potasio; ML = Medio de lffler.
193
Anexos
Anexo 25. Esquema de identificacin de Bordetella pertussis
Muestra: hisopado o
aspirado nasofarngeo.
Examen directo
Inmunouorescencia directa
Cultivo
- Agar Bordet-Gengou
- Agar Regan-Lowe
(selectivos y no selectivos)
Incubacin 36C,
cmara hmeda, 4-5 das.
Colonias pequeas, gris,
perla, elevadas como gotas
de mercurio.
Gram
Bacilos cortos
gramnegativos
Pruebas presuntivas
Catalasa V
Oxidasa +
Motilidad -
Ureasa -
Citrato -
Reduccin de
nitratos -
Prueba conrmatoria
Prueba de aglutinacin con
anticuerpos uorescentes
anti-Bordetella pertussis.
194
Anexos
Anexo 26. Esquema de identificacin de Legionella sp.

Muestra clnica*
Cultivo:
Agar BCYE
Caldo extracto de levadura
Incubar 35-37C x 24-48 h, en
microaerofilia
Frotis directo coloreado
con Gram: bacilos
gramnegativos
Colonias aisladas:
blanco-grisceas a
verdes azuladas,
brillantes,
convexas,
circulares
Coloracin de
Gram:
Cocosbacilos
Gramnegativos
pleomrficos
Prueba de la oxidasa:
Variable
Licuefaccin de
gelatina
Inmunofluorescencia
Prueba de la catalasa:
Positiva (dbil)
Diagnstico serolgico
* Cuando se sospecha de la enfermedad
de los legionarios las muestras deben ser
procesadas en campana de seguridad
biolgica clase II
Produccin de
pigmento
fluorescente
Cocobacilos
195
Anexos
Anexo 27. Esquema de identificacin de Mycobacterium tuberculosis
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196
Anexos
Anexo 28. Identificacin de Gardnerella vaginalis

Identificacin de Gardnerella vaginalis

Prueba Resultado

Morfologa y reaccin al
Gram

Cocobacilos gramvariable
HomoIIsIs --lomoIIlIco
OxIuusu -
CuluIusu -
HIuioIIsIsuoIlIuiulo +
HIuioIIsIsuoIuImIuon +
GIucosu +
MuIlosu +
Sucuiosu +
MunIloI -

InlIhIcIoncon:
MolionIuuzoI[uug)
TiImolioiIm[ug)
SuIIonumIuu[1ug)
PoIIunoloIsuIIonulo
uosouIo[SPS)

Sensible
+:osIlIvo;-:nogulIvo
Tomuuouo:KonomunycoI.,1uuu;MonlIoIyLum,2uu1.

197
Anexos
Bibliografa
(1) Koneman E., Allen S., Jandon W., Schreckenberger P., Winn W. Diagnstico microbio-
lgico. Texto y atlas a color. 5 ed. Argentina: Mdica Panamericana; 1999.
(2) Lopardo H., Hernndez C., Soloaga R. Diagnstico microbiolgico de las Infecciones
Respiratorias Bacterianas [en lnea] 1999 [fecha de acceso 18 de Abril de 2005]; URL
disponible en www.ifcc.org/ria/div/britanis/az_19.htm
Mediterrneo; 2001.
(4) Vizcaya L, Bravo L, Fonte L, Velasco J, Flores A. Diagnstico de laboratorio de la Enfer-
medad Diarreica Aguda (EDA). Curso terico-prctico. Sociedad Venezolana de Micro-
biologa, Captulo de Mrida. XXII Jornadas Venezolanas de Microbiologa Dr. Jos A.
Serrano. MridaVenezuela. 1994.
(5) Castro G, Aguilera M, Hernndez C, Arteaga R, Carmona A, Prez A, Giono S, Figueras
M, Aparicio G. La identicacin gentica de Aeromonas, una realidad y una necesidad
para la microbiologa diagnstica. Bioquimia 2003; 28(4): 11-18.
(6) Finegold S, Baron E. Diagnstico microbiolgico Bayley Scout. 7a ed. Argentina: Edi-
torial mdica Panamericana; 1989.
Glosario
A/A: cido/cido, Fermentacin de lactosa y glucosa
AMK: Agar MacConkey
AMS: Agar manitol salado
AMT: Amplicacin mediada por transcriptasa
AN: Agar nutritivo
APA: Agua peptonada alcalina
AS: Agar sangre
AS-Sch: Agar sangre base Schaedler
ATM: Agar Thayer-Martin
ATP: Agar telurito de potasio
AYH: Agar yema de huevo
BHI: Infusin cerebro corazn
BE: Agar bilis-esculina
CH: Agar chocolate
CIN: Agar Cefsulodin-Irgasan-Novobiocina
CLED: Agar cistina-lactosa-electrolito-deciente
DIU: Dispositivo intrauterino
DNA-AMP: Agar DNA-ampicilina
EIA: Enzimoinmunoanlisis
IFD: Inmunouorescencia directa
ITRS: Infecciones del tracto respiratorio superior
K/A: Alcalino/cido, no fermenta la lactosa/fermentacin de la glucosa
MH: Mueller Hinton
MIO: Agar motilidad-indol-ornitina
ML: Medio Lefer
LCR: Lquido cefalorraqudeo
LIA: Agar Lisina hierro
PM: Agar Preston modicado
PMN: Polimorfonucleares
PYR: L-pirrodil-beta-naftilamida
RCP: Reaccin en cadena de la polimerasa
200
Glosario
RCL: Reaccin en cadena de la ligasa
SNC: Sistema nervioso central
SS: Agar Shigella-Salmonella
SSF: Solucin salina siolgica
SXT: Trimetoprim sulfametoxazol
TA: Temperatura ambiente
TCBS: Agar Tiosulfato-citrato sales biliares
TH: Caldo Tood Hewitt
TR: Tracto respiratorio
TRI: Tracto respiratorio inferior
TRS: Tracto respiratorio superior
TS: Agar tripticasa soya
UNG: Uretritis no gonoccica
VB: Vaginosis bacteriana
VHS: Virus herpes simple
VPH: Virus papiloma humano
XLD: Agar xilosa-lisina-desoxicolato de sodio
Los autores
Judith Velasco ............................................................... 1
Licenciada en Bioanlisis. Especialidad en Microbiologa Clnica. Profesora asociada,
adscrita a la Ctedra de Bacteriologa Dpto. de Microbiologa y Parasitologa, Escuela
de Bioanlisis, Facultad de Farmacia y Bioanlisis, Universidad de Los Andes.
Mara del Carmen Araque ......................................... 1
Mdica Cirujana. Magister Scientae y Doctorado en Ciencias Mdicas Fundamentales.
Profesora asociada, adscrita a la Ctedra de Bacteriologa Dpto. de Microbiologa y
Parasitologa, Escuela de Bioanlisis, Facultad de Farmacia y Bioanlisis, Universidad
de Los Andes.
Emma Araujo .................................................................. 1
Licenciada en Bioanlisis. Bioanalista al Servicio adscrita al Dpto. de Microbiologa y
de Los Andes.
Aurora Longa .................................................................. 1
Licenciada en Bioanlisis. Especialidad y Magister Scientiae en Microbiologa Clnica.
Profesora asistente, adscrita a la Ctedra de Bacteriologa Dpto. de Microbiologa y
de Los Andes.
Beatriz Nieves ................................................................ 1
Licenciada en Bioanlisis. PhD en Biologa mencin Microbiologa. Profesora titular,
adscrita a la Ctedra de Bacteriologa Dpto. de Microbiologa y Parasitologa, Escuela
de Bioanlisis, Facultad de Farmacia y Bioanlisis, Universidad de Los Andes.
Ana Carolina Ramrez ................................................. 1
Licenciada en Bioanlisis. Magister Scientiae en Microbiologa Clnica. Profesora asis-
tente, adscrita a la Ctedra de Bacteriologa Dpto. de Microbiologa y Parasitologa, Es-
cuela de Bioanlisis, Facultad de Farmacia y Bioanlisis, Universidad de Los Andes.
Kiralba Snchez ............................................................ 1
de los Andes.
Elsa Velazco .................................................................... 1
de Los Andes.
ndice
7 Prefacio
1 prctica
9 Principios diagnsticos de las enfermedades infecciosas
2 prctica
25 Prueba de susceptibilidad antimicrobiana
3 prctica
31 Diagnstico microbiolgico de las infecciones del tracto respiratorio superior
4 prctica
47 Diagnstico microbiolgico de las infecciones del tracto respiratorio inferior
5 prctica
65 Diagnstico microbiolgico de las infecciones ticas
6 prctica
79 Diagnstico microbiolgico de las infecciones oculares
7 prctica
91 Diagnstico microbiolgico de las Infecciones del Tracto Urinario (ITU). Urocultivo
8 prctica
103 Diagnstico microbiolgico de la Enfermedad Diarreica Aguda (EDA). Coprocultivo
9 prctica
119 Diagnstico microbiolgico de las infecciones del aparato circulatorio. Hemocultivo
10 prctica
129 Diagnstico microbiolgico de las infecciones del sistema nervioso central.
Lquido Cefalorraqudeo (LCR)
11 prctica
139 Diagnstico microbiolgico de las infecciones del tracto genital
12 prctica
157 Diagnstico microbiolgico de las infecciones por bacterias anaerobias

171 Anexos
199 Glosario
201 Los Autores

Manual de Bacteriologia

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