Crecimiento Bacteriano Su medida y Ciclo

Para algunos, el crecimiento es la capacidad para multiplicarse que tienen las clulas individuales, sto es iniciar y completar una divisin celular. De esta forma, se considera a los microorganismos como partculas discretas y el crecimiento es entendido como un aumento en el nmero total de partculas bacterianas. Existen dos formas para determinar el nmero total de microorganismos en una muestra: Recuento microscpico de partculas Recuento electrnico de partculas Para otros, el crecimiento implica el aumento de los microorganismos capaces de formar colonias debido a que slo se tiene en cuenta el nmero de microorganismos viables, esto es capaces de crecer indefinidamente. Las determinaciones que se utilizan son:

Recuento de colonias Mtodo del nmero ms probable Para los fisilogos bacterianos, bioqumicos y bilogos moleculares una medida del crecimiento es el incremento de biomasa. Para ellos, la sntesis macromolecular y un incremento en la capacidad para la sntesis de los componentes celulares es una medida del crecimiento. Para este grupo la divisin celular es un proceso esencial pero menor que rara vez limita el crecimiento, ya que lo que limita el crecimiento es la capacidad del sistema enzimtico para utilizar los recursos del medio y formar biomasa. Determinacin de peso hmedo Determinacin de peso seco Determinacin de nitrgeno total Determinacin qumica de un cido nucleico Un ltimo grupo entiende al crecimiento sobre la base de la influencia que ejercen los microorganismos en los cambios qumicos de su entorno como consecuencia del incremento de la

biomasa. Recuentos Directos Recuento microscpico: Es una tcnica comn, rpida y barata que utiliza un equipamiento fcilmente disponible en un laboratorio de microbiologa. Para estos recuentos se utilizan generalmente cmaras de recuentos, aunque tambin pueden realizarse a partir de muestras filtradas en membranas y transparentizadas o teidas con colorantes fluorescentes (Naranja de acridina). La mayor dificultad del recuento en cmara es obtener reproductibilidad en el llenado de la cmara con lquido. Otra dificultad es la adsorcin de las clulas en las superficies del vidrio, incluyendo pipetas. Esta adsorcin es crtica en el proceso de dilucin de la muestra y se minimiza al realizar las diluciones en medios de alta fuerza inica (solucin fisiolgica o medios mnimos sin fuente de carbono).

Las cmaras ms utilizadas son las de Hawksley y la de Petroff-Hausser. La primera tiene la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersin, aunque la mayora de los recuentos se realizan con objetivos secos. Una de las mayores ventajas del recuento microscpico es brindar informacin adicional sobre el tamao y la morfologa de los objetos contados.

 1/Dilucin: Inversa de la dilucin utilizada para llenar la cmara de recuento. Nmero de cuadrados contados: Cantidad de cuadrados de la cmara que se utilizaron para contar un el nmero de bacterias. Volumen del cuadrado: Volumen de cada cuadrado de la cmara. Depende del tipo de cuadrado en donde se realiz el recuento. Por ejemplo, cada cuadrado pequeo tiene un volumen de 5 x 108 ml (50 m x 50 m x 20 m = 5 x 104 m3 = 5 x 10-8 ml). Recuento electrnico: Los contadores electrnicos permiten realizar recuentos de bacterias, levaduras no filamentosas y protozoarios, pero no de hongos y microorganismos filamentosos o miceliares. Estos instrumentos constan bsicamente de dos compartimientos comunicados a travs de un pequeo conducto. En ambos compartimientos hay electrodos que miden la resistencia elctrica del sistema, y como el orificio del conducto es muy pequeo y su resistencia es muy alta, la resistencia elctrica de cada compartimiento es independiente. El principio de funcionamiento de estos instrumentos es el que se explica a continuacin. Un volumen fijo de una suspensin bacteriana es forzada a pasar desde un compartimiento al otro a travs del pequeo conducto, en un muy breve intervalo de tiempo. Cuando un microorganismo pasa al nuevo compartimiento, la resistencia de ste se incrementa debido a que la conductividad de la clula es menor que la del medio. Estos cambios en la resistencia son convertidos en pulsos o voltaje y contados. Este tipo de recuento presenta algunos inconvenientes. Ciertas bacterias muy pequeas producen cambios en la resistencia que son comparables al "ruido" generado por la turbulencia que se desarrolla al pasar el fluido por el orificio. No pueden medirse clulas que formen filamentos o agregados o soluciones muy concentradas de microorganismos, debido a que el pasaje de ms de una clula en un breve perodo de tiempo va a ser tomado como una clula ms grande. Es comn la obstruccin del orificio por microorganismos muy grandes. Medida de la Biomasa La medida de la masa de los constituyentes de la clula bacteriana es utilizada frecuentemente como base para la medida de una actividad metablica, o de un constituyente metablico o qumico. Algunos de los mtodos para cuantificar la biomasa son obvios y confiables, pero pueden volverse complicados si se busca la exactitud.

Peso hmedo: Se obtiene a partir de una muestra en suspensin que es pesada luego de la separacin de las clulas por filtracin o centrifugacin. Es una tcnica til para grandes volmenes de muestra. La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de lquido retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de clulas bacterianas muy empaquetadas puede contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la forma y deformacin celular. Para corregir el peso hmedo se determina la cantidad de lquido que queda retenida en el espacio intercelular luego de una centrifugacin, para ello se utilizan soluciones de polmeros no inicos (como el Dextran) que pueden ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas. Peso seco: El peso seco (contenido de slidos) de las clulas bacterianas que se encuentran en una suspensin se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105C hasta peso constante. Esta tcnica es til para grandes volmenes de muestra, debido a que diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un gran nmero de bacterias. La desventaja de este mtodo es que componentes voltiles de la clula pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradacin. Tambin la muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta. Determinacin de acidos nucleicos: Es una tcnica que permite determinar indirectamente la masa de una poblacin bacteriana. Se determina la cantidad existente de un determinado cido nucleico (generalmente DNA) y a partir de este dato se estima la masa de la poblacin. Determinacion de nitrgeno: Es una tcnica que permite determinar indirectamente la masa de una poblacin bacteriana. Existen distintas tcnicas para determinar la cantidad de nitrgeno que contiene una muestra en relacin al compuesto que se quiera determinar. Puede analizarse el nitrgeno no proteico mediante el NO2-, NO3-, NH4+, el nitrgeno proteico mediante absorcin en UV, Reaccin de Biuret, Reaccin de Lowry, o el nitrgeno total mediante la Digestin de Kjeldahl. Incorporacin de precursores radiactivos: Es una tcnica que permite determinar indirectamente la masa de una poblacin bacteriana. En esta tcnica se adiciona al medio un compuesto marcado radiactivamente que puede ser incorporado a la clula, y luego se determina la cantidad de marca incorporada por toda la poblacin. Dispersin de la Luz Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partcula en suspensin, parte de la luz es reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida. La nefelometra mide la luz dispersada por una solucin de partculas. La turbidimetra mide la luz dispersada como un

decrecimiento de la luz transmitida a travs de la solucin. En relacin a la longitud de onda y al tamao de la partcula pueden existir tres tipos de dispersin. Los mtodos de dispersin de la luz son las tcnicas ms utilizadas para monitorear el crecimiento de los cultivos bacterianos. Son muy tiles y poderosos pero pueden llevar a resultados errneos. Principalmente, dan informacin sobre el peso seco (contenido macromolecular). Turbidimetra: La turbidimetra mide la reduccin de la transmisin de luz debido a partculas de una suspensin y cuantifica la luz residual transmitida. Estudios tericos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos de bacterias, independientemente del tamao celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentracin de peso seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamao celular del microorganismo. Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partcula o por UFC (Unidad Formadora de Colonia) cuando los tamaos de las clulas bacterianas son diferentes. Por esta razn, para estimar el nmero de microorganismos totales o el nmero de microorganismos viables de una suspensin bacteriana debe realizarse una "curva de calibracin" con cada tipo de microorganismo, slo de esta forma es posible relacionar Absorbancia (Densidad Optica) con el nmero de microorganismos totales o con UFC.

Absorbancia = K x Peso Seco

K: constante que vara con la longitud de onda utilizada y representa la inversa del peso seco del microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor de la absorbancia (1/W0).

Peso seco: Concentracin celular bacteriana expresada en unidades de peso seco (g/ml-mg/ml). La relacin directa entre la absorbancia y el peso seco slo se aplica para suspensiones diluidas de bacterias. Estas suspensiones no deben tener una absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores producen desviaciones de la ley de Beer. Sin embargo, el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas puede involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por el bajo nivel de absorcin.

En estos grficos se puede apreciar que suspensiones diluidas de dos microorganismos diferentes con igual peso seco tienen la misma absorbancia, mientras que para el mismo nmero de microorganismos totales la absorbancia de cada suspensin es distinta. Ciclo de crecimiento Un cultivo bacteriano simple y homogneo tiene un ciclo de crecimiento como el que se representa a continuacin.

Este ciclo tiene una morfologa y una divisin de clulas asincrnica. Se divide en cuatro fases: Fase de Latencia: Es la fase de adaptacin al medio, existe aumento de la masa celular pero no hay aumento en el nmero de clulas. Fase de Crecimiento Exponencial: Es la fase donde se produce un incremento exponencial del nmero de microorganismos. Fase Estacionaria: Es la fase a la que se llega cuando se ha agotado la fuente de energa. Fase de Muerte: Es la fase que se caracteriza por una disminucin exponencial del nmero de microorganismos. La fase de latencia puede ser inducida por un rpido cambio en las condiciones del cultivo. En un medio fresco, el largo de la fase de latencia va a depender del tamao del inculo, de la edad del inculo, y de los cambios en la composicin y concentracin de los nutrientes que experimenten las clulas. Un pequeo volumen de inculo transferido a un gran volumen de medio fresco va a producir una salida por difusin de iones, vitaminas y cofactores que son indispensables para la actividad de muchas enzimas intracelulares. Si las clulas provenientes de un medio rico son inoculadas en un medio mnimo, el tiempo de latencia puede estar afectado por el tamao del inculo como un resultado de los nutrientes remanentes del medio original. La edad del inculo va a influir en el tiempo de latencia en el medio fresco debido a la acumulacin de materiales txicos y a la falta de nutrientes esenciales dentro de la clula durante el crecimiento anterior. En general, inculos viejos alargan la fase de latencia.

Cambios en la composicin y concentracin de nutrientes entre el cultivo del inculo y el medio fresco pueden desencadenar el control y la regulacin de la actividad enzimtica dentro de las clulas o la diferenciacin morfolgica, como la formacin de esporas. Si las clulas son transferidas de un medio simple a un medio rico, se van a necesitar ms tiempo y nutrientes para incrementar la concentracin de enzimas necesarias para el metabolismo.

Chagasss

Los triatomas se infectan al ingerir la sangre de los mamferos que contienen tripomastigotos (A), en el intestino medio los parsitos se multiplican por fisin binaria como epimastigotos (B) y al cabo de 15 a 30 das se desarrollan los tripomastigotos metaciclicos en el intestino posterior del insecto (C). Cuando el insecto pica al mamfero emite deyecciones con tripomastigotos metaciclicos que atraviesan la piel o las mucosas (D), penetran en las clulas del tejido conectivo laxo y se transforman en amastigotos, los cuales se multiplican por fisin binaria, repletan la clula la que finalmente se rompe y salen a la circulacin como tripomastigotos diseminndose y repitiendo el ciclo (E), el cual se completa cuando los tripomastigotos son ingeridos por los triatomas.