CURSO DE ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS E BIOTECNOLOGIA UNIDADE BENTO GONALVES LABORATRIO DE BIOLOGIA MOLECULAR Prof.

Fbio Lius Maciel

CAMILA ECKERT GRAZIELA PILETTI JEAN BRESSAN ALBARELLO MARCEL RAMOS DA SILVA

RELATRIO EXPERIMENTO 02 - REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) -

Novo Hamburgo 2011

1. Introduo

Reao em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) um mtodo de amplificao de DNA sem o uso de um organismo vivo, por exemplo, Escherichia coli (bactria) ou leveduras. O processo foi descrito por Kary Mullis, em 1983, sendo patenteado em 1989, pela Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation. O mtodo PCR usado habitualmente nos laboratrios de investigao mdica e biolgica para uma variedade de tarefas, como a deteco de doenas hereditrias, a construo de rvores filogenticas, a clonagem de genes, testes de paternidade, etc. O principal propsito da PCR fazer um nmero imenso de copias de um determinado fragmento gnico, ao qual o tamanho pode variar de poucos pb (pares de bases) at milhares de pb. A tcnica explora funo natural da enzima chamada de taq polimerase, extrada da bactria Thermus aquaticus, esta enzima semelhante enzima DNA polimerase que capaz de sintetizar DNA a partir de seus precursores no sentido 5 3. Para catalisarem essa sntese, os precursores de DNA devem estar presente sob a forma de desoxirribonucleotdeos trifosfatos (dATP, dTTP, dGTP e dCTP). Para utilizar esta tcnica necessrio ter um conhecimento prvio da seqncia dos genes a serem amplificados, e a partir disso so sintetizados dois primers ou iniciadores, ou seja, a partir deles que se inicia a sntese do DNA pela enzima taq polimerase. A sntese se desenvolve sempre no sentido 5 3. A Reao em cadeia da Polimerase um mtodo muito sensvel de anlise e, por isso, realizado com muito cuidado para evitar contaminaes. O presente relatrio descreve o experimento realizado no laboratrio de Biologia Molecular da Universidade Estadual do Rio Grande do Sul, unidade de Novo Hamburgo, no dia 10 de novembro de 2011, que teve como objetivo, amplificar um fragmento de DNA no vetor PETCKIB.

2. Materiais e Mtodos

2.1. Reao em Cadeia da Polimerase

Para a realizao da Reao em Cadeia da Polimerase (PCR), foram utilizados os seguintes materiais: Pipeta de 20,0 l Iniciadores de cadeia direto (anela na extremidade 5 do molde) Iniciadores de cadeia inverso (anela na extremidade 3' do molde) DNA-molde (pETCKIB) dNTPs (desoxirribonucleotdeos): dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Tampo da Taq DNA-polimerase Taq DNA-polimerase gua bidestilada MgCl2

O primeiro passo foi pipetar as solues, na ordem e quantidades indicadas na tabela 1, em dois tubos de centrfuga de 0,2 ml, identificados como controle positivo e controle negativo.

Ordem 1 2 3 4 5 6 7 8

Quantidade (l) Controle - Controle + gua Bidestilada 12,4 13,4 Tampo da Taq DNA-polimerase (10X) 2,0 2,0 Iniciador 5' (20 pmol/l) 1,0 1,0 Iniciador 3' (20 pmol/l) 1,0 1,0 dNTP's (10 mM) 1,0 1,0 DNA molde (50 ng/l) 1,0 MgCl2 0,6 0,6 Taq DNA-polimerase (0,5 U/l) 1,0 1,0
Tabela 1 Solues utilizadas para a PCR.

Solues

Com as solues pipetadas, obteve-se um volume final de 20,0l em cada tubo. Os tubos foram colocados em um termociclador, com uma programao pr-definida, passando pelas seguintes etapas: 1 - Na primeira etapa do ciclo a temperatura elevada a 95C durante 2 minutos. Nesta etapa ocorre a separao da dupla cadeia de DNA (Desnaturao). O primeiro ciclo iniciado mantendo-se a temperatura a 95C durante 30 segundos. 2 - Na segunda etapa, a temperatura reduzida para 45C, durante 30 segundos, para que os acontea o pareamento dos primers com a fita molde de DNA (Anelamento). 3 - Na ltima etapa do ciclo a temperatura elevada a 72 C, durante 90 segundos, para que a enzima possa funcionar sintetizando a nova molcula (Extenso). 4 - Os ciclos so repetidos 30 vezes. 5 - Realiza-se o ciclo final, a uma temperatura de 72C, durante 5 minutos para eventual complementao de fitas no estendidas. O resultado da PCR foi analisado atravs de uma eletroforese em gel de agarose 0,8%.

2.2. Anlise de DNA por eletroforese em gel de agarose

Para o preparo do gel, foi feita uma soluo de agarose em frasco de Erlenmeyer e aquecida (at a fervura) em forno de microondas at a sua completa solubilizao. O frasco foi coberto durante o aquecimento, e agitado freqentemente para homogeneizao e para evitar transboradamento. Aps a solubilizao, a soluo de agarose foi resfriada por alguns minutos. Em seguida, foi adicionado 20 l de uma soluo de brometo de etdio 1 mg/ml (concentrao final de 0,2 g/ml). A soluo foi agitada e derramada sobre uma placa-molde de gel com o pente j montado, conforme na figura 1.

Figura 1 - Preparo do gel de agarose.

Para a gelificao, a soluo foi mantida em temperatura ambiente por 30 minutos a 1 hora. Em seguida, o gel foi transferido para a cuba de eletroforese, mergulhada em tampo TBE 1X. Aps, as reaes foram preparadas para serem aplicadas no gel. As amostras foram preparadas com DNA + tampo de amostra, e seguiram a ordem: 1. Marcador de peso molecular; 2. Amostras de DNA da Extrao de Morango; 3. Amostras de DNA do fragmento amplificado do vetor Controle negativo; 4. Amostras de DNA do fragmento amplificado do vetor Controle positivo.

Figura 2 Preparo da eletroforese.

Por fim, o gel foi visualizado em transilumidor ultravioleta.

3. Resultados e Discusses

Cada reagente utilizado para a reao em cadeia da polimerase tem uma finalidade especfica, e so eles: DNA molde: DNA a ser amplificado, neste caso, fragmento do vetor PETCKIB; Tampo 10X: basicamente, estas solues contm ons diversos (Na+, Cl-, K+, entre outros) que otimizam as condies de reao e mantm pH ideal para funcionamento; dNTPs: desoxinucleotdeos so a matria-prima propriamente dita para a sntese das fitas-filhas. So compostos por nucleotdeos (ATP, TTP, CTP, GTP) desoxilados no carbono 5 da desoxirribose. So adicionados pela polimerase complementarmente fita-me. Adiciona-se uma mistura de todos os dNTPs em concentraes iguais reao; Iniciadores (primers): so pequenas seqncias de DNA (12 a 35 bases) complementares s bordas que servem para indicar onde a enzima deve ligarse, para dar incio amplificao; MgCl: doador muito estvel de ons Mg2+, que so cofatores

indispensveis para atividade da enzima; Taq DNA Polimerase: Taq ainda mais utilizada, numa concentrao que varia de 1 a 4U por microlitro de soluo, a pea chave para a cpia do fragmento, por ser a enzima responsvel por ligar os dNTPs ao stio de amplificao, a partir dos primers (a enzima deve ser adicionado por ltimo, pois ela deve ser sempre mantida em gelo para no perder sua identidade); gua: utilizada para completar a reao ao seu volume correto. As condies ideais de ciclagem foram determinadas em um programa no Termociclador. A quantidade de ciclos corresponde quantidade de vezes em que haver a amplificao (cpia) do fragmento de interesse. O resultado da reao de PCR foi corrida em eletroforese com gel de agarose 0,8%. Os ensaios de eletroforese se valem do princpio que determina que a carga global de uma fita de DNA negativa. Portanto, uma soluo que possua ons livres (eletroltica) e que tenha molculas de DNA em suspenso

pode ser purificada aplicandose uma dada voltagem. Ao final do processo as cadeias de DNA estaro prximas ao catodo (positivo), atraente de molculas de carga negativa. No entanto, o foco da tcnica separar os fragmentos por tamanho, uma vez que a reao gera fragmentos de mesma extenso. A soluo peneirar o resultado da PCR por peneiras moleculares o (gel, neste caso de agarose). As cadeias so empurradas atravs da peneira pela corrente eltrica, e de acordo com o tamanho dos furos dela, elas sero retidas ou liberadas. Na verdade, nos valemos do fato de que cadeias maiores demoram mais tempo para passar pelos poros da peneira, e cadeias menores viajam mais rapidamente atravs dela. A distncia que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicao comparada com a distncia que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. Esta distncia percorrida analisada comparando -a a um marcador de peso molecular, que mostra vrias bandas com pesos moleculares diferentes (quanto mais alto no gel, maior o peso), servindo de mapa para a anlise de bandas no gel. O marcador utilizado foi de DNA de fago e Hind III. O preparo do gel foi feito com agarose e dissolvido numa soluotampo eletroltica, no caso TBE, e por fim foi adicionado Brometo de Etdeo. O Brometo de Etdeo uma substncia altamente mutagnica e utilizada pois ele tem a capacidade de inserir-se nas fendas da cadeia de DNA, apresentando fluorescncia quando excitado com radiao ultravioleta, clivado com Eco RI

possibilitando a visualizao das bandas de DNA. A soluo-tampo de preparo do gel deve ser obrigatoriamente a mesma que o recobrir na cuba de eletroforese e possibilitar a passagem de corrente eltrica (Tampo de Corrida). As amostras aplicadas no gel receberam tampo de amostra, que tem como funo aumentar a viscosidade da amostra e assim impedir que esta comece a flutuar no tampo de corrida antes que a voltagem seja aplicada no sistema, alm disto, ela possui um corante que possibilita a visualizao do andamento da corrida. A corrida foi feita a 100V.

A revelao foi feita atravs do transiluminador, o qual demostrou que a reao do nosso grupo no amplificou o fragmento esperado, ou seja, no deu certo. Isto pode ocorrer por diversos fatores, mas principalmente pela falta de prtica do grupo em manusear pipetas e tcnicas de biologia molecular. A demora para pipetar, assim como a dificuldade para manusear quantidades to pequenas de reagentes, que eram praticamente invisveis aos olhos, foi fator relevante na falha da nossa reao. Ademais, a oportunidade de observar e "tentar" praticar tcnicas e experimentos de biologia molecular muito vlido, pois a experincia o que fica, mesmo que nossa reao no ocorreu como esperado.

4. Concluses

A Reao em Cadeia da Polimerase uma tcnica muito utilizada por ser especfica e sensvel. Para observar o resultado da reao as amostras foram analisadas em eletroforese com gel de agarose. A revelao foi feita no transiluminador com Brometo de Etdeo. A reao do nosso grupo no amplificou, e foi atribudo a isto a falta de prtica com equipamentos de laboratrio e tcnicas de biologia molecular dos colegas. Reaes de outros grupos se mostraram boas, amplificando o gene de interesse, e confirmando a especificidade da tcnica de PCR.

5. Referncias Bibliogrficas

Reao em Cadeia da Polimerase. Acesso em 14/11/2011. Disponvel em: http://pt.wikipedia.org/wiki/Rea%C3%A7%C3%A3o_em_cadeia_da_polimerase

PCR. Acesso em 14/11/2011. Disponvel em: http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio33/pcr.pdf

Principio do PCR Acesso em 14/11/2011. Disponvel em: http://www.fisiologia.kit.net/biomol/4.htm

Reao em cadeia da Polimerase. Acesso em 15/11/2011. Disponvel em: http://www.scribd.com/doc/15362706/Reacao-em-cadeia-da-polimerase-PCR

PCR. Acesso em 15/11/2011. Disponvel em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechPCR.shtml