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Obter ou Sintetizar
Carboidratos Lipdios
Em geral, as bactrias necessitam de uma fonte de carbono e nitrognio, uma fonte de energia, gua e vrios ons para seu crescimento.
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Crescimento microbiano*
* Crescimento microbiano:
em microbiologia, refere-se ao aumento do nmero de clulas.
Fatores qumicos: fontes de carbono, nitrognio, enxofre, fsforo, oligoelementos, oxignio, fatores orgnicos de crescimento (vitaminas, aminocidos, purinas, pirimidinas).
Crescimento microbiano
o aumento no nmero de clulas. Importante seu conhecimento para o desenvolvimento, por exemplo, de mtodos de controle. Fisso binria: modo mais comum de reproduo bacteriana Outros modos: brotamento (Hiphomicrobium), conidisporos (actinomicetes).
Crescimento microbiano
Fisso Binria
Fisso Binria
Protenas Fts: formam o divisomo, aparelho de diviso da clula (Filamento termossensvel). Divisomo: acredita-se que coordena a sntese da nova membrana citoplasmtica e da parede celular em ambas as direes clula alongada. Trmino da sntese de DNA o sinal para a formao do anel FtsZ, que fica no espao entre os nucleides duplicados.
O anel FtsZ e a diviso celular. (a) Viso em corte de um bacilo, com o anel FtsZ. (b) Ciclo celular de 8 E. coli, mostrando o surgimento e o desaparecimento do anel FtsZ. Fonte: Madigan et al., 2004.
Crescimento populacional
O aumento do nmero de clulas tambm pode ser medido pelo aumento da massa microbiana
Taxa de crescimento: variao de nmero de clulas ou da massa celular por unidade de tempo;
Gerao: intervalo em que uma clula origina duas novas; Tempo de gerao: tempo necessrio para que uma populao dobre de nmero (Tempo de duplicao);
Crescimento populacional
Coordenadas logartmicas
Coordenadas aritmticas
Converso do nmero de clulas de uma populao em uma expresso logartmica desse nmero.
Representao grfica logartmica (linha pontilhada) e aritmtica (linha contnua) da curva de crescimento de uma populao em 10 fase de crescimento exponencial.
Crescimento populacional
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Tempo de gerao
Tempo de Gerao: intervalo de tempo em que uma clula origina duas novas clulas ou tempo necessrio para uma populao dobrar de nmero. Muitas das bactrias estudadas apresentam tg de 1 a 3 h (pode variar de 10 min a >24h). Tg de E. coli = 20 min 20 geraes (~7 horas), 1 clula torna-se em > 1 milho de clulas! Tg pode ser influenciado pelas condies de cultivo (tipo de meio, temperatura, etc.).
N=No.2n log N = log N0 + n log2 n = (log N - log N0) / log 2 n= log N log No /0,301
onde N= nmero final de clulas, N o= nmero inicial de clulas, n= nmero de geraes.
onde tg= tempo de gerao, t= tempo de crescimento e n= nmero de geraes, como determinado acima. 12
Tempo de gerao
2000 1000
UFC
2h n= 1 (uma gerao = tempo para duplicar a populao!) t=2 tg = t/n tg = 2/1 = 2 tempo de gerao = 2
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Taxa de crescimento*
o nmero de geraes formadas, por unidade de tempo, de uma cultura em crescimento exponencial ou variao no nmero ou massa por unidade de tempo.
Constante de taxa de crescimento K = ln2/tg = 0,693/tg (h-1) *Esse termo tambm descrito como a velocidade de crescimento especfico e representado por m.
No caso anterior K = 0,693/2 = 0,346
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Fases do crescimento
m=0,125
m=0,0057
m=0,0013
m ~ 0, cultura desnutrida
Curvas de crescimento de Pseudomonas fluorescens em culturas de batelada, iniciadas com inculos em diferentes fases de crescimento, indicadas pelos ms velocidade especfica de crescimento (h-1).
Fonte: Panikov, N.S. Microbial growth kinetics. UK: Chapman & Hall, 1995.
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Curva de crescimento tpica de uma populao bacteriana, a partir de uma cultura em batelada* (Fonte: Madigan et al., 2004). * Cultura que se desenvolve em um volume fixo de meio de cultura.
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Fases do crescimento
LAG Pouca ou ausncia de diviso celular. Sntese enzimtica e de molculas variadas. Pode ser curta ou longa, dependendo das condies fisiolgicas do inculo.
Fases do crescimento
EXPONENCIAL OU Log
Crescimento exponencial das clulas Tempo de Gerao constante linha reta no grfico.
Fase que as clulas esto mais saudveis utilizadas para estudos enzimticos e de outros componentes celulares.
Taxa de crescimento exponencial (nmero de geraes por unidade de tempo) de uma populao pode ser influenciada pelas condies de cultivo, por exemplo.
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Fases do crescimento
ESTACIONRIA No h crescimento lquido da populao, ou seja, o nmero de clulas que se divide equivalente ao nmero de clulas que morrem (crescimento crptico).
Sntese de vrios metablitos secundrios (antibiticos e algumas enzimas). Tambm pode ocorrer a esporulao das bactrias.
Alteraes de fentipo por quorum sensing (processo de comunicao celular mediado pela densidade populacional).
Causas: esgotamento de nutrientes essenciais, acmulo de produtos de excreo em concentraes inibitrias, alteraes no pH.
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Fases do crescimento
MORTE OU DECLNIO Nmero de clulas mortas excede o de clulas vivas. Na maioria dos casos, a taxa de morte inferior taxa de crescimento exponencial. A contagem total permanece relativamente constante, enquanto a de viveis cai lentamente. Em alguns casos h a lise celular.
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Diretas
contagens de clulas totais
verificao da turbidez
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Contagem das clulas viveis Parte de trs princpios: -Cada colnia originada de uma nica bactria -Inculo original sempre homogneo -No existe agregao de clulas Desvantagem: precisa de um perodo de incubao (24h)
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Procedimento de contagem de viveis por meio de diluies em srie da amostra e o mtodo de semeadura em profundidade (pour plate).
Madigan et al., 2004.
Dificulta contagem, Contagem errnea devido saturao que impede o crescimento de algumas colnias
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Contagem de bactrias utilizando o mtodo de filtrao. MEV de superfcie de membrana de filtro com bactrias (esquerda). Membrana em placa de Petri, mergulhada em meio lquido Endo, seletivo para Gram negativo (direita). Fonte: Tortora et al., 2005. 27
Contagem microscpica direta, utilizando a cmara de contagem Petroff-Hausser. Fonte: Tortora et al., 2005. 28
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Quanto maior o nmero de bactrias em uma amostra, maior ser o nmero de diluies necessrias para eliminar totalmente o crescimento nos tubos contendo meio de cultura Utilizado para contar microrganismos que no crescem em meios slidos
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Mtodo do nmero mais provvel (NMP). esquerda, srie de diluies do mtodo. direita, tabela do NMP que permite calcular o nmero estatisticamente provvel de bactrias presentes na amostra. O ndice de 110 NMP/100mL indica que 95% das amostras de gua que apresentam esse resultado contm entre 40 300 CFU Fonte: Tortora et al., 2005.
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Diretas
contagens de clulas totais
verificao da turbidez
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Medidas turbidimtricas do crescimento microbiano por espectrofotmetro ou fotmetro. Fonte: Madigan et al., 2004.
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(b) Curva de crescimento tpica, obtida em unidades Klett ou densidade ptica (DO), de dois organismos que apresentam diferentes velocidades de crescimento. Qual organismo est crescendo mais rapidamente ?(calcule o n, tg e m). (c) Relao entre o nmero de clulas, ou peso seco, e as medidas de turbidez.
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Sistema de fluxo ao qual um volume constante de meio fresco continuamente adicionado, sendo o mesmo volume de meio removido. Equilbrio do sistema (steadystate): quando o nmero de clulas e a quantidade de nutrientes permanece constante.
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Crescimento microbiano*
Fatores qumicos: fontes de carbono, nitrognio, enxofre, fsforo, oligoelementos, oxignio, fatores orgnicos de crescimento (vitaminas, aminocidos, purinas, pirimidinas).
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Taxa de crescimento = variao do nmero de clulas ou da massa celular por unidade de tempo
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Temperatura
Temperatura de crescimento pode ser mnima, tima e mxima. Maioria cresce em um intervalo de 30oC entre mnima e mxima. Psicrfilos: profundezas de oceanos e regies polares (algas clorofceas e diatomceas). Mesfilos: Temperatura tima entre 25 e 40oC. Maioria das bactrias. Termfilos Temperatura entre 45 e 80oC. Fontes termais, camadas superiores de solos que sofrem intensa radiao solar, esterco e silo em fermentao. Hipertermfilos: Temperatura tima superior 80oC. Fontes termais, como as do Parque Yellowstone. Principalmente membros de Archaea.
Relao da temperatura com as taxas de crescimento. As temperaturas timas de cada organismo esto indicadas. (Fonte: Madigan et al., 2004).
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Adaptaes moleculares psicrofilia: Enzimas ativas em baixas temperaturas apresentam maior quantidade de estruturas secundrias em alfa-hlice (estrutura mais flexvel). Contedo elevado de cidos graxos insaturados, que auxilia na manuteno do estado semi-fluido. Obs.: Adio de crioprotetores (glicerol 10%) ao meio ajuda na preservao de culturas em baixas temperaturas (-70 a 196oC). Adaptaes moleculares termofilia: Lipdeos da membrana ricos em cidos graxos saturados geram ambientes altamente hidrofbicos colaborando para estabilidade da membrana citoplasmtica. Protenas termoestveis tendem a formar ncleos altamente hidrofbicos, diminuindo a tendncia ao desdobramento. DNA girase reversa em Archaea: promove um superenovelamento positivo do DNA, mais termoestvel. Outras protenas termoestveis ajudam a manter a dupla fita do DNA unida. membrana citoplasmtica em monocamada lipdica nas Archaea (estruturalmente mais 40 resistente que a bicamada).
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pH
pH timo de crescimento refere-se ao pH do meio externo; o pH intracelular deve permanecer prximo neutralidade. Maior parte das bactrias cresce entre pH 6,5 e 7,5. Acidfilos: muitos fungos (pH timo em torno de 5 ou inferior), vrios gneros de Archaea. Alcaliflicos: muitas espcies de Bacillus e algumas arquias (que tambm so haloflicas). Adio de sais de fosfato (KH2PO4) em meios de cultura funcionam como tampo para neutralizar, por exemplo, cidos produzidos por bactrias em crescimento.
A escala de pH. (Fonte: Madigan et al., 2004).
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Presso osmtica
Os microrganismos que tem necessidades especficas de NaCl para seu crescimento timo podem ser : halfilos discretos: [ ] baixas 1 a 6% halfilos moderados: [ ] moderadas 6 a 15% halfilos extremos: [ ] altas 15 a 30%
Efeito da concentrao do on sdio no crescimento de microrganismos com diferentes tolerncias ou necessidades de sal.
(Fonte: Madigan et al., 2004).
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Presso osmtica
plasmlise
Inibio do crescimento no momento em que a membrana plasmtica se separa da parede celular. Preservao de alimentos!!!
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Aerbios
Microaerfilos
Aerbios facultativos
Obrigatrios Anaerbios
Aerotolerantes
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Oxignio
Formas txicas de oxignio, todos subprodutos formados na reduo do O2 a H2O durante a respirao: nion superxido (O2-) perxido de hidrognio (H2O2) radical hidroxil (OH)
Quatro reaes de reduo de O2 a gua pela adio seqencial de eltrons. Todos os intermedirios formados so reativos e txicos clula, exceto a gua. Fonte: Madigan et al., 2004.
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-Superxido desmutase (SOD): enzima produzida em bactrias aerbias, anaerbias facultativas crescendo aerobiamente e anaerbios aerotolerantes que neutraliza os radicais superxidos livres (O2-) O2- + O2- + 2H+ H2O2 + O2
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-Catalase:
O perxido de hidrognio (H2O2) produzido tambm txico devido ao nion perxido (O22-)!!!! A enzima catalase neutraliza a ao deste nion, convertendo o perxido de hidrognio em gua e oxignio: 2H2O2 2H2O + O2
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-Peroxidase:
Outra enzima que neutraliza o perxido de hidrognio: H2O2 + H+ + NADH 2H2O +NAD
Organismos anaerbios obrigatrios no produzem nem catalase, nem superxido dismutase. So super sensveis ao oxignio, provavelmente devido ao acmulo de radicais livres.
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microrganismos sobrevivncia.
necessitam
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- Anaerbios obrigatrios ou estritos So microrganismos que no utilizam o O2 para reaes de produo de energia. O2 pode ser um produto danoso para muitos destes. Exemplo: Gnero Clostridium = ttano e botulismo
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Aerbios e facultativos
Enzimas que destroem espcies txicas de oxignio. Catalases (a) e peroxidases (b) so protenas que contm porfirina. As SOD (c) contm metal como cobre e zinco, mangans ou ferro. A SOR (e) catalisa a reduo de um eltron de O 2- a H2O2 utilizando o citocromo c reduzido como doador de eltron. Adaptado de Madigan et al., 2004.
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Oxignio
Relaes dos microrganismos com o oxignio
Grupo Relao com o O2 Tipo de metabolismo Aerbios Obrigatrios Exigido No exigido, mas com melhor crescimento em O2 Exigido, mas em nveis inferiores ao atmosfrico Resp.aerbia Resp. aerbia, anaerbia, fermentao Micrococcus luteus Pele, poeira Exemplo Habitat tpico
Facultativos
Escherichia coli
Microaerofilos
Resp. aerbia
Spirillum volutans
gua de lagos
Aerotolerantes
Fermentao
Streptococcus pyogenes
Obrigatrios
Methanobacterium formicicum
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Oxignio
Representao dos tipos de crescimento bacteriano quanto presena de oxignio em meio caldo tioglicolato + gar (+ denso). (a) aerbios obrigatrios. (b) anaerbios obrigatrios. (c) aerbios facultativos. (d) microaerfilos. (e) anaerbios aerotolerantes. Fonte: Madigan et al., 2004.
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Cultivo de anaerbios
- necessidade de fervura da gua para eliminar o oxignio dissolvido. meio deve conter um agente redutor tioglicolato de sdio que se combina com o oxignio dissolvido residual, eliminando essa forma do meio.
Jarra para cultivo de bactrias anaerbias em placa de Petri ( esquerda): aps a adio de gua embalagem contendo o bicarbonato de sdio e boroidreto de sdio, ocorre a liberao de dixido de carbono e hidrognio. No catalisador de paldio ocorrer a reao entre o oxignio e o hidrognio, formando a gua. Cmara de anaerobiose ( direita). Fonte: Tortora et al., 2005.
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Cultivo de anaerbios
Jarra de anaerobiose. O envelope acondicionado na jarra produz uma reao qumica que gera H2 + CO2. O H2 reage com o O2 da jarra, na superfcie de um catalisador de paldio, originando H2O. A atmosfera final gerada na jarra composta por N2, H2 e CO2.
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Cultivo de anaerbios
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Nutrientes
Macronutrientes Micronutrientes
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Macronutrientes
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Micronutrientes (elementos-trao)
Algumas bactrias necessitam de fontes extracelulares de vitaminas, que atuam como coenzimas. Ex. bactrias lcticas (Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc)
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Dever conter:
Em certos casos:
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Meios de Cultura
Solues nutrientes utilizadas para promover o crescimento de microrganismos em laboratrio. Inculo: microrganismos que so colocados em um meio de cultura para iniciar o crescimento. Cultura: microrganismos que crescem e se multiplicam nos meios de cultura.
Quimicamente definidos: Quantidades precisas de compostos qumicos inorgnicos ou orgnicos altamente purificados, adicionados a gua destilada.
Meios
Complexos (ou indefinidos): No se conhece a composio precisa de alguns componentes. Empregam produtos de digesto da casena (protena do leite), de carne, de soja, de leveduras, extratos de plantas, entre outros.
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Meios de cultura
Utilizados para o cultivo dos microrganismos; Quimicamente definidos Definio exata
Retirando ou adicionando um constituinte ao meio definido, pode-se saber se aquele constituinte essencial para o crescimento do microrganismo.
de
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Meios comerciais
J contm todos os componentes desejados; Adiciona-se gua Esteriliza-se 121C durante 20 minutos. Distribui-se em placas de Petri tambm esterilizadas. Armazena-se em geladeira embaladas em sacos plsticos para diminuir a desidratao.
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-Seletivo -Diferencial
-Enriquecedor
-Transporte
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Meios Seletivos
Favorece o crescimento da bactria de interesse impedindo o crescimento de outras bactrias. Inibidores: substncias capazes de inibir algumas bactrias que no so de interesse. 1) Corantes: verde brilhante, eosina, cristal violeta... 2) Metais pesados: Bismuto; 3) Substncias qumicas: azida, citrato, desoxicolato, selenito e lcool feniletlico... 4) Agentes antimicrobianos: vancomicina, cloranfenicol 5) Meio hipertnico: alta concentrao de sal (7,5%)
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Meio Diferencial
Utilizado para fcil deteco da colnia da bactria de interesse quando existem outras bactrias crescendo na mesma placa do meio
Substncias utilizadas como indicadores de atividade enzimticas que auxiliam na identificao
pH cido
rseo amarelo amarelo amarelo vermelho vermelho amarelo
pH bsico
amarelo prpura azul vermelho amarelo amarelo vermelho
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Peptona ..........................................................7
Extrato de levedura........................................2 Extrato de carne.............................................2 Cistina......................................................0,128 Lactose..........................................................10 Azul de Bromotimol..................................0,03 gar...............................................................12
Nitrognio e carbono
Acar Indicador de pH
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Lactose + (Amarelo)
Meio diferencial
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Lactose + (Rosa)
Meio diferencial
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gar MacConkey Peptona de carne...................................................3 Peptona de casena..............................................17 NaCl.........................................................................5 Lactose..................................................................10 Sais biliares.........................................................1,5 Vermelho neutro................................................0,03 Cristal violeta...................................................0,001 gar....................................................................13,5
Acar Inibidor de Gram+ Nitrognio e carbono
Indicador de pH
Inibidor de Gram+
80
40
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Lactose Lactose +
MacConkey Cultura mista!!!!!! Seletivo para enterobactrias (Gram-negativo) a partir de fezes, urina, alimentos, gua...
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MacConkey
Cultura mista!!!!!!
1. Lactose 2. Lactose +
Peptona...............................................................10
Extrato de carne..................................................1
Inibidor NaCl.....................................................................75 Gram+ ede algumasdas Gram
carboidrato Indicador de pH
gar....................................................................12
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Manitol +
A degradao do manitol est relacionada com a patogenicidade, indicativo da presena de Staphylococcus aureus.
85 Crescem apenas bactrias que suportam grande concentrao de sal!
E.M.B. (Eosina Azul de metileno) Para isolamento de Enterobactrias (Gramnegativo) Corantes inibem Gram-positivo
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E.M.B. (Eosina Azul de metileno) Para isolamento de Enterobactrias (Gramnegativo) Corantes inibem Gram-positivo Colnias pardo rsea Enterobacter sp
X.L.D. Xilose Lisina Descarboxicolato Xilose lactose e sacarose + Amarelo! Xilose, lactose e sacarose Vermelho!!! Produo de H2S Negro!!! Cultura mista!!!!!!!!!!! Seletivo e diferencial para enterobactrias patognicas, especialmente Shigella e Salmonella.
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Meios de Cultura
Seletivo: Favorece o crescimento do microrganismo de interesse e impede o crescimento de outros. Ex.: gar sulfeto de bismuto para isolamento de Salmonella typhi a partir das fezes.
Meios
Diferencial: Permite a fcil identificao da colnia da bactria de interesse, dentre as colnias de outras bactrias crescidas no meio. Ex.: Meio gar sangue para detectar a presena de Streptococcus pyogenes (forma-se um halo claro em torno da colnia pela lise das hemceas)
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Meio de enriquecimento
Incrementa o crescimento de certas espcies bacterianas ao mesmo tempo que inibe o desenvolvimento de microrganismos que no sejam de interesse.
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As espcies de Salmonella e Shigella so menos inibidas, entram em uma fase de crescimento exponencial (Log) e so isoladas com mais facilidade de amostras fecais.
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Citrato de sdio..................................................5
Desoxicolato de sdio....................................0,5
Inibidores de Gram+
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Indicador de pH
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gar SS (Salmonella/Shigella) Salmonella sp Lactose (Transparente) Produo de H2S (Com centro negro)
Meio Seletivo e diferencial: verde brilhante, bile e alta concentrao de tiossulfato e citrato inibem a microbiota acompanhante de fezes, alimentos e outros materiais.
Lactose + E. coli - cor rosa
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microrganismos exigentes.
Ex: gar Mueller Hinton suplementado com 5% de sangue de carneiro e gar chocolate
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Colnia
Hemlise
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Meios de Cultura
Seletivo: Favorece o crescimento do microrganismo de interesse e impede o crescimento de outros. Ex.: gar sulfeto de bismuto para isolamento de Salmonella typhi a partir das fezes. Diferencial: Permite a fcil identificao da colnia da bactria de interesse, dentre as colnias de outras bactrias crescidas no meio. Ex.: Meio gar sangue para detectar a presena de Streptococcus pyogenes (forma-se um halo claro em torno da colnia pela lise das hemceas)
Meios
de Enriquecimento: Semelhante ao seletivo, mas suplementado por nutrientes especiais, com a caracterstica de aumentar o nmero da bactria de interesse tornando-a detectvel.
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Meio de transporte
Stuart
Mantem o microrganismo vivel, mas impede o crescimento e multiplicao at o subcultivo em meio
adequado.
Glicerol fosfato de sdio .......................................10 Tioglicolato de sdio................................................1 Cloreto de clcio....................................................0,1 Azul de metileno................................................0,002 gar............................................................................8
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100
50