FOSFATASA ALCALINA (ALP)

FOSFATASA ALCALINA (ALP) - SL

Nmeros de catlogo: 328-10 328-30 Presentacin: R1: 1 x 100 mL, R2: 1 x 25 mL R1: 3 x 100 mL, R2: 1 x 75 mL

USO Para la determinacin cuantitativa in vitro de fosfatasa alcalina (ALP) en suero. PRECAUCIONES Evite la ingestin y el contacto con la piel y los ojos. Vea la Hoja de Seguridad del Producto. REACTIVOS R1: Reactivo Amortiguador de ALP-SL; R2: Reactivo de Sustrato de ALP-SL Las concentraciones en la prueba: 0.84 mol/L de 2-amino-2-metil-1-propanol (pH 10.4 a 25C), 2.0 mmol/L de acetato de magnesio, 1.0 mmol/L de sulfato de zinc, 2.0 mmol/L de HEDTA, 50 mmol/L de p-nitrofenilfosfato, 50 mmol/L de fenol y un conservador. ANTECEDENTES El aumento de la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) en suero es importante en el diagnstico de diversas enfermedades incluyendo trastornos hepatobiliares y enfermedades seas asociadas con una mayor actividad osteoblstica. La actividad de la fosfatasa alcalina en suero puede elevarse debido a ictericia obstructiva, oclusin del ducto comn de la bilis y el hgado, y cirrosis. (1) La actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) fue medida por primera vez por Kay (2). Desde entonces, se han utilizado muchos sustratos como el fosfato de glicerol y el fosfato de fenilo. Bessey, Lowry y Brock (3) introdujeron un sustrato ms sensible el fosfato de p-nitrofenilo (p-NPP). Se han hecho varias recomendaciones sobre las condiciones ptimas para la determinacin de ALP en suero. Estas sugerencias han sido propuestas por la German Society for Clinical Chemistry (4) as como por el comit sobre enzimas de la Scandinavian Society for Clinical Chemistry (5). Este mtodo es una modificacin de las recomendaciones de la International Federation of Clinical Chemistry (IFCC) para la determinacin de fosfatasa alcalina en suero (6). PRINCIPIO La fosfatasa alcalina hidroliza el p-NPP para formar el cromgeno amarillo p-nitrofenol de acuerdo con la siguiente ecuacin. Fosfatasa alcalina
Fosfato de p-nitrofenilo + H2O p-Nitrofenol + HPO4
2

+ 2H+

El incremento en la absorbancia de la mezcla de reaccin a 415 nm debido a la formacin del p-nitrofenol, es proporcional a la actividad de la fosfatasa alcalina. PREPARACION DEL REACTIVO Los reactivos suministrados estn listos para su uso. Puede prepararse un reactivo de trabajo de ALP al mezclar 4 partes de reactivo amortiguador de ALP-SL (R1) con una parte de reactivo sustrato de ALP-SL (R2). ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO Los reactivos suministrados son estables hasta la fecha de caducidad especificada en las etiquetas a 2-8C. El reactivo de trabajo es estable por 28 das a 2-8C o 7 das a 18-26C. Todas las declaraciones de estabilidad se basan en estudios en tiempo real realizados en los laboratorios de Diagnostic Chemicals Limited
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DETERIORO DEL REACTIVO Las soluciones de reactivo debe ser claras. La turbidez indicara deterioro. INSTRUMENTOS Puede usarse cualquier analizador con control de temperatura de 0.5C que sea capaz de leer la absorbancia con exactitud y una sensibilidad de 0.001 a 415 nm. El ancho de banda debe ser de 10 nm menos, la desviacin de la luz de 0.5% menos y la exactitud de longitud de onda dentro de 2 nm. RECOLECCION Y PREPARACION DE LA MUESTRA La muestra de eleccin es suero fresco, claro y no hemolizado. El EDTA, oxalato y citrato inhiben la accin de la fosfatasa alcalina por lo que debe evitarse su empleo. Las muestras almacenadas a temperatura ambiente deben analizarse antes de 4 horas. Las muestras retenidas por ms de 4 horas pueden almacenarse a 2-8C hasta por 3 das. Se ha encontrado que la actividad de la fosfatasa alcalina aumenta significativamente conforme las muestras se calientan despus de su rfrigeracin o congelamiento (7). SUBSTANCIAS DE INTERFERENCIA Se evaluaron las interferencias por ictericia, lipemia y hemlisis para este mtodo en un analizador Hitachi utilizando un criterio de significancia de variacin >10% a partir del control. No se encontr interferencia importante por lipemia a concentraciones de intralpidos de 0-1000 mg/dL [0-33.9 mmol/L (0-3000 mg/dL) de triglicridos] en una muestra de ALP de 121 U/L. No se encontr interferencia importante por ictericia a niveles de bilirrubina de 0-684 mol/L (0-40 mg/dL) en una muestra de ALP de 134 U/L. Se evalu la interferencia de hemoglobina a concentraciones de 0-155 mol/L (0-1000 mg/dL) con resultados aceptables a una concentracin de 31.0 mol/L (200 mg/dL). A una concentracin de hemoglobina de 31.0 mol/L (200 mg/dL) se obtuvo una interferencia negativa de 7.4% con una muestra de ALP de 135 U/L. Se puede encontrar un resumen de la influencia de drogas en pruebas de laboratorio clnico consultando a Young, D.S. (8). PROCEDIMIENTO Materiales Proporcionados Se proporcionan los reactivos necesarios para la determinacin de fosfatasa alcalina. Siga los procedimientos indicados para su adaptacin a analizadores automatizados especficos. Condiciones Longitud de onda (Primaria)....................................... (Secundaria)................................... Temperatura .............................................................. Paso de luz ................................................................ Tipo de reaccin ........................................................ Tiempo de reaccin ................................................... Volumen de muestra ................................................. Volumen de reactivo ................................................. Volumen total ............................................................ Relacin muestra/reactivo .........................................

415 nm 660 nm 37C 1 cm Cintica 5 minutos 5 L R1 280 L; R2 70 L 355 L 1/70

CALIBRACION No se utiliza un estndar para calibrar el procedimiento de fosfatasa alcalina. Los resultados son calculados usando el coeficiente de extincin molar y la frmula dada.

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CONTROL DE CALIDAD Se deben analizar sueros control de nivel normal y anormal con cada corrida de muestras y los resultados deben caer dentro de 2 desviaciones estndar del valor establecido. Se obtienen mejores resultados si la prueba de fosfatasa alcalina se lleva a cabo a intervalos de tiempo iguales despus de la reconstitucin del suero control cada da (9,10) CALCULOS Y RESULTADOS Resultados La actividad de la fosfatasa alcalina es expresa en unidades/litro U/L. Limitaciones Una muestra con una actividad de fosfatasa alcalina que exceda el lmite de linealidad deber diluirse con solucin salina a 0.9% y reanalizarse incorporando el factor de dilucin en el clculo del resultado. VALORES ESPERADOS (11) Menos de 103 U/L (30C) Menos de 138 U/L (37C) Estos valores son sugeridos. Se ha encontrado que las concentraciones de fosfatasa alcalina varan con la edad y el sexo. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios rangos normales para el rea donde est localizado. CARACTERISTICAS DE RENDIMIENTO Estas caractersticas de rendimiento se obtuvieron en laboratorios de DCL con procedimientos automatizados. Estudio de Recuperacin Se agreg fosfatasa alcalina a un grupo de sueros humanos para aumentar la concentracin de ALP en 70 U/L, 89.5 U/L y 148 U/L. La recuperacin de fosfatasa alcalina agregada promedi 95.7%. Rango Reportable (NCCLS EP6-P) El rango reportable depende de la proporcin muestra/reactivo utilizada. Una relacin muestra / reactivo de 1:70 dio un rango reportable de 4.3 a 2000 U/L. Estudios de Precisin (NCCLS EP5-T2) Se recopilaron los datos de dos sueros control utilizando un solo lote de reactivo en 40 corridas llevadas a cabo durante 20 das.
Muestra Suero 1 Suero 2 Media (U/L) 47 214 DE Total (U/L) 2.1 7.4 CV Total % 4.6 3.5 DE durante la corrida U/L 1.1 2.1 CV durante la corrida % 2.4 1.0

Exactitud (NCCLS EP9-P) Se compar el rendimiento de este mtodo (y) con el de un mtodo similar para fosfatasa alcalina (x) en un analizador Hitachi 717. Las muestras de suero de 40 pacientes que oscilaron de 16 a 1895 U/L dieron un coeficiente de correlacin de 1.0000. El anlisis de regresin lineal dio la siguiente ecuacin: Este mtodo = 1.0276 (mtodo de referencia) 1.0 U/L.

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REFERENCIAS 1. Burtis, C.A. and Ashwood, E.R. (Eds), Tietz Textbook of Clinical Chemistry, Second Edition, W.B. Saunders Co., Philadelphia, (1994). 2. Kay, H.D., Plasma Phosphatase, 1:Method Determination, J.Biol. Chem. 89, 235 (1930). 3. Bessey, O.A., Lowry, S.H., Brock, M.H., A Method for the Rapid Determination of Alkaline Phosphatase with Five Cubic Milliliters of Serum, J. Biol. Chem. 164, 321 (1946). 4. Recommendations of the German Society of Clinical Chemistry, Standardization of Methods for the Estimation of Enzyme Activity in Biological Fluids, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 8, 182-192 (1972). 5. The Committee on Enzymes of the Scandinavian Society for Clinical Chemistry and Clinical Physiology: Four Enzymes in Blood, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 33, 291-306 (1974). 6. Tietz, N.W., Rinker, A.D.U., Shaw, L.M. (1983). IFCC Methods for the Measurement of Catalytic Concentration of Enzymes. Part 5. IFCC Method for Alkaline Phosphatase, J. Clin. Chem. Biochem. 21, 731-478. 7. Kaplan, L.A. and Pesce, A.J., Clinical Chemistry: Theory, Analysis, Correlation, Third Edition, Mosby, NY, p. 1072 (1996). 8. Young, D.S., Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests, AACC Press, Third Edition, Washington, 1990. 9. Szasz, G., Increase of Alkaline Phosphatase Activity in Commercial Reference Sera After Reconstitution, Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 126, 29, 12.7 (1972) Abstract. 10. Massion, C.G., Frankenfeld, J.K., Alkaline Phosphatase Lability in Fresh and Frozen Human Serum and in Lyophilized Control Material, Clin. Chem. 18, 366 (1972). 11. Pesce, A.J., Kaplan, L. A., Methods In Clinical Chemistry, Toronto, C.V. Mosby Co., 1078 (1987). IN32830-6 Mayo 13, 2005

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