UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS Y FARMACIA

VALIDACIN DE LA METODOLOGA ANALTICA DE CUANTIFICACIN DE CLORFENIRAMINA MALEATO, DEXTROMETORFANO BROMOHIDRATO, FENILEFRINA CLORHIDRATO Y GUAIFENESINA EN DOS JARABES COMERCIALES POR CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN

FRIDA LUCITANIA VALLEJO GARCIA

QUMICA FARMACUTICA

GUATEMALA, ABRIL DE 2009

UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS Y FARMACIA

VALIDACIN DE LA METODOLOGA ANALTICA DE CUANTIFICACIN DE CLORFENIRAMINA MALEATO, DEXTROMETORFANO BROMHIDRATO, FENILEFRINA CLORHIDRATO Y GUAIFENESINA EN DOS JARABES COMERCIALES POR CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN

INFORME DE TESIS

PRESENTADO POR FRIDA LUCITANIA VALLEJO GARCIA

PARA OPTAR AL TTULO DE QUMICA FARMACUTICA

GUATEMALA, ABRIL DE 2009.

JUNTA DIRECTIVA
FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS Y FARMACIA UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

Lic. Oscar Cbar Pinto, Ph.D. Lic. Pablo Ernesto Oliva Soto Licda. Lillian Raquel Irving Antilln, M.A. Licda. Liliana Vides de Urizar Lic. Luis Antonio Glvez Sanchinelli Br. Andrea Alejandra Alvarado lvarez Br. Anbal Rodrigo Sevillanos Cambronero

Decano Secretario Vocal I Vocal II Vocal III Vocal IV Vocal V

DEDICATORIA

A mi amado Seor con gratitud infinita por sus tantas bendiciones y misericordias que me ha ofrecido. Ha trado muchos cambios a mi vida con paz, bondad y alegra. Y por eso te doy gracias por tus dones y el milagro de tu amor para iluminar mi camino y llegar al final con perseverancia. Te quiero con todo mi corazn. A mis padres Jos Efran Vallejo Rivas Q.E.P.D. y Lucy Garca viuda de Vallejo por brindarme su amor, apoyo incondicional, exhortacin y por sus esfuerzos para lograr mi formacin profesional y personal. A mi hija Dania Eunice Mndez Vallejo por llegar a mi vida a despertar el amor y la ternura e impulsarme a alcanzar esta meta.

A mis hermanos y familia Eddie Stuardo, Edgar Efran, Hjalmar Elas, Ivan Stuardo, Q.E.P.D., Gueyry Wotsvel por sus oraciones y apoyo que me alientan y me inspiran, y la confianza que restablece mi fe y seguridad.
A mis amigos por darle un toque a mi vida con sus consejos, nimo, alegra y hacerla especial. Y a Usted gracias por compartir conmigo este triunfo, Qu Dios lo bendiga!

AGRADECIMIENTOS
A la Universidad de San Carlos de Guatemala, Facultad y Escuela de Ciencias Qumicas y
Farmacia, Centro Guatemalteco de Informacin de Medicamentos -CEGIMED-, Centro de Documentacin/Biblioteca de Farmacia -CEDOBFAl cuerpo de catedrticos por transmitirme sus conocimientos y experiencias y al personal administrativo que en una u otra forma participaron en la formacin profesional y culminacin de mi carrera.

Al Laboratorio Transnacional de Guatemala Al personal administrativo, profesional y tcnico por la colaboracin integral y proveer el soporte instrumental, prstamo de cristalera, reactivos, espacios necesarios e instalaciones para el desarrollo de este estudio.

A mi asesores Licenciada Ibe Arriola por brindarme su amistad, su invaluable orientacin, consejos, sugerencias y por ser la promotora de la realizacin de esta tesis. Licenciada Lucrecia Martnez, Licenciada Vivian Sandoval y el Licenciado Estuardo Serrano que con su asesora y apoyo contribuyeron a mejorar y dar forma a esta investigacin.

NDICE
CONTENIDO 1. RESUMEN.. 2. INTRODUCCCIN 3. ANTECEDENTES. 4. JUSTIFICACIN 5. OBJETIVOS........... 6. HIPTESIS. 7. MATERIALES Y MTODOS 7.1 7.2 UNIVERSO DE TRABAJO. MEDIOS.. 7.2.1 RECURSOS HUMANOS 7.2.2 MATERIALES 7.2.3 INSTALACIONES. 7.3 RECURSOS MATERIALES. 7.3.1 EQUIPO.. 7.3.2 DATOS DE LA CALIBRACIN DEL EQUIPO. 7.3.3 REACTIVOS.. 7.3.4 CRISTALERA... 7.4 METODOLOGIA. 7.4.1 CUANTIFICACN DE GUAIFENESINA 7.4.1.1 PREPARACIN DE REACTIVOS 7.4.1.2 PREPARACIN DE LA SOLUCIN PATRN. 7.4.1.3 PREPARACIN DE LA MUESTRA.. 7.4.1.4 SISTEMA CROMATOGRFICO 7.4.1.5 PROCEDIMIENTO. 7.4.1.6 CLCULOS... 7.4.2 CUANTIFICACIN DE CLORFENIRAMINA MALEATO 7.4.2.1 PREPARACION DE REACTIVOS. 7.4.2.2 PREPARACIN DE LA SOLUCIN PATRN 7.4.2.3 PREPARACIN DE LA MUESTRA.. 7.4.2.4 SISTEMA CROMATOGRFICO 33 34 34 34 - 35 31 31 32 32 32 32 - 33 28 28 28 28 - 29 29 29 29 30 30 30 31 PGINA 1-2 3-4 5 - 24 25 26 27

7.4.2.5 PROCEDIMIENTO.. 7.4.2.6 CLCULOS.. 7.4.3 CUANTIFICACIN DE FENILEFRINA CLORHIDRATO 7.4.3.1 PREPARACIN DE REACTIVOS 7.4.3.2 PREPARACIN DE LA SOLUCIN PATRN.. 7.4.3.3 PREPARACIN DE LA MUESTRA. 7.4.3.4 SISTEMA CROMATOGRFICO.. 7.4.3.5 PROCEDIMIENTO. 7.4.3.6 CLCULOS.. 7.4.4 CUANTIFICACIN DE DEXTROMETROFANO BROMHIDRATO 7.4.3.1 PREPARACIN DE REACTIVOS 7.4.3.2 PREPARACIN DE LA SOLUCIN PATRN. 7.4.3.3 PREPARACIN DE LA MUESTRA. 7.4.3.4 SISTEMA CROMATOGRFICO.. 7.4.3.5 PROCEDIMIENTO. 7.4.3.6 CLCULOS..... 7.4.5 CUANTIFICACIN DE FENILEFRINA, DEXTROMETORFANO Y CLORFENIRAMINA EN JARABE A 7.4.5.1 PREPARACIN DE REACTIVOS 7.4.5.2 PREPARACIN DE LA SOLUCIN PATRN.. 7.4.5.3 PREPARACIN DE LA MUESTRA. 7.4.5.4 SISTEMA CROMATOGRFICO.. 7.4.5.5 PROCEDIMIENTO. 7.4.5.6 CLCULOS. 7.4.6 CUANTIFICACIN DE GUAIFENESINA, DEXTROMETORFANO Y CLORFENIRAMINA EN JARABE B 7.4.5.1 PREPARACIN DE REACTIVOS 7.4.5.2 PREPARACIN DE LA SOLUCIN PATRN.. 7.4.5.3 PREPARACIN DE LA MUESTRA. 7.4.5.4 SISTEMA CROMATOGRFICO.. 7.4.5.5 PROCEDIMIENTO . 7.4.5.6 CLCULOS. 7.4.7 PROCEDIMIENTO DE VALIDACIN DE LA METODOLOGA ANALTICA

35 35

36 36 36 - 37 37 37 37 - 38

38 39 39 39 39 39

40 - 41 41 42 42 42 42 - 44

44 - 45 45 45 45 46 46 48

48 - 51

7.4.8 TRATAMIENTO ESTADSTICO DE LOS RESULTADOS 8. RESULTADOS.. 9. DISCUSIN DE RESULTADOS 10. CONCLUSIONES. 11. RECOMENDACIONES... 12. BIBLIOGRAFA. 13. ANEXOS............

51 - 54 55 - 64 65 - 68 69 - 70 71 72 - 75 76

1. RESUMEN 1. RESUMEN
Este trabajo de investigacin consiste en la Validacin de la Metodologa Analtica empleada en el laboratorio para la Cuantificacin de Clorfeniramina Maleato, Fenilefrina Clorhidrato, Dextrometorfano Bromohidrato y Guaifenesina en dos Jarabes Comerciales por Cromatografa Lquida de Alta Resolucin. Tiene como propsito desarrollar y validar un mtodo analtico que cumpla con los parmetros establecidos de cromatografa y requerimientos de la Farmacopea Estadounidense (USP) e ICH (Conferencia Internacional Tripartita sobre Armonizacin). El diseo de este nuevo mtodo sirve de gua a la Industria Farmacutica para la cuantificacin de tres principios activos como materia prima y en un producto terminado; basndose en la cromatografa lquida de alta resolucin como una tcnica automatizada que permite analizar de forma rpida y eficiente la separacin, cuantificacin y deteccin de las muestras por medio de la identificacin de los picos en los cromatogramas. Para determinar que la metodologa es exacta y precisa se verific el cumplimiento de ciertos parmetros de validacin que incluyen la exactitud, precisin intermedia, repetibilidad, linealidad del sistema, linealidad del mtodo y especificidad que fueron evaluados durante todo el proceso analtico. Se utilizaron las siguientes condiciones cromatogrficas: cromatgrafo lquido de alta resolucin Hitachi, columna Whatman Partisil SCX, fase mvil fosfato dicido de potasio pH 4 y metanol HPLC (40:60), flujo 1 mL/min, longitud de onda de 220 nm y 20 L de volumen de inyeccin. Se prepararon estndares y muestras a las siguientes concentraciones: Clorfeniramina Maleato 0.08 mg/mL, Dextrometorfano Bromohidrato 0.08 mg/mL, Fenilefrina Clorhidrato 0.04 mg/mL y Guaifenesina 0.4mg/mL. La metodologa analtica cumple con los parmetros de aptitud del sistema, linealidad, exactitud, precisin (repetibilidad y precisin intermedia) para la cuantificacin de los principios activos de Clorfeniramina Maleato, Fenilefrina Clorhidrato y

2 Dextrometorfano Bromohidrato tanto en materia prima como en el Jarabe A y B, pero no demostr ser exacto en la cuantificacin de Guaifenesina en el Jarabe B. Para este proceso se emplearon las instalaciones del laboratorio, que por estar acreditado y cumplir con los requerimientos de las Buenas Prcticas de Manufactura, as como el equipo e instrumentos validados para desempear estas caractersticas, y muestras del mismo lote de fabricacin, estndares de referencia y reactivos de alta pureza. En general, el mtodo analtico desarrollado es efectivo y reproducible, cumple con las especificaciones necesarias para su aplicacin si se realiza a las mismas condiciones de laboratorio y con los mismos principios activos, permitiendo que se obtengan resultados satisfactorios y confiables.

2.

INTRODUCCIN

El adquirir conocimientos cientfico-tecnolgicos y de medicina contribuye a satisfacer una de las demandas de la sociedad, proporcionar solucin a problemas de salud, por medio de medicamentos que en las ltimas dcadas son reemplazados por frmacos especficos. Dichos medicamentos son elaborados por grandes laboratorios e industrias farmacuticas; quienes tienen que prestar atencin y cumplir con Buenas Prcticas de Manufactura y de Laboratorio, as tambin el control de calidad del producto fabricado es esencial para garantizar al consumidor final un medicamento confiable y seguro. El constante crecimiento y expansin del mercado exige que las empresas se preparen y busquen la calidad en sus productos y procesos, para utilizarlo como una ventaja competitiva. Lo anterior, aumenta la necesidad de obtener certificaciones que garanticen la calidad del producto, como por ejemplo la certificacin ISO 9001 y dentro de sus requisitos se encuentra que los productos deben tener metodologas de anlisis validadas. Los mtodos de anlisis utilizados en el control de calidad de productos farmacuticos que no se traten de mtodos oficiales de anlisis (registrados o contemplados en farmacopea), deben validarse previamente a su uso de rutina y tiene como finalidad demostrar la idoneidad de dicho mtodo para llevar a cabo un anlisis determinado.(1) Con la cromatografa lquida de alta resolucin que presenta ventajas sobre los mtodos tradicionales se pretende mejorar la eficacia de la tcnica analtica obteniendo tiempos de anlisis rpidos, separacin de sustancias de mezclas complejas con alta resolucin, ejecucin de anlisis con facilidad y exactitud, obteniendo errores relativos menores al 1%. Adems el beneficio de la tecnologa al brindar un sistema automatizado que inyecta la muestra, realiza la separacin, imprime la identificacin de cada pico y su concentracin para luego repetir el ciclo con la muestra siguiente.(2)

4 Este estudio procedi a validar el mtodo para cuantificar Clorfeniramina Maleato, Dextrometorfano Bromohidrato, y Fenilefrina Clorhidrato (Jarabe A) y tambin Clorfeniramina Maleato, Dextrometorfano Bromohidrato y Guaifenesina (Jarabe B), producidos en una industria farmacutica utilizado es confiable y preciso. La formulacin de los jarabes combina estos principios activos por su actividad teraputica y compatibilidad qumica para actuar en pacientes con trastornos de tos, gripe, resfriados o alergias. El mtodo de cromatografa de alta resolucin logra el anlisis de estos principios activos con eficacia al lograr identificarlos y separarlos en una mezcla. Los resultados fueron examinados con un programa de infrmatica certificado que integra los criterios de estadstica y aceptacin que especifica cada requisito, que permite generar resultados verdicos para asegurar y validar un mtodo analtico de medicamentos que puede ser aprobado y autorizado. para garantizar que el mtodo de anlisis

3.

ANTECEDENTES

3.1 MALEATO DE CLORFENIRAMINA 3.1.1 Usos. El Maleato de Clorfeniramina es un antihistamnico que probablemente sea eficaz en la rinitis alrgica y vasomotora, en la conjuntivitis alrgica, en la urticaria y el angioedema leve, en reacciones alrgicas a la sangre y el plasma en pacientes sensibles, en el dermografismo y como tratamiento auxiliar del shock anafilctico. Se utiliza como ingrediente de frmulas antitusgenas de marca registrada. (3) 3.1.2 Indicaciones. Tratamiento de diversas reacciones de hipersensibilidad, rinitis, eritema cutneo y prurito. (4)

3.1.3 Propiedades fsico-qumicas. o Estado fsico: polvo o Apariencia: blanco, cristalino o Olor: inodoro o pH: 4 - 5 (de una solucin al 1%) o pKa: 9.1 o Punto de fusin: 130-135 oC o Solubilidad: 0.25g/mL(agua), 0.1g/mL(alcohol), 0.1g/mL(cloroformo); ligeramente soluble en ter o benceno o Frmula molecular: C16H19ClN2.C4H4O4 o Peso molecular: 390.87 g/moL (5)

3.2 BROMOHIDRATO DE DEXTROMETORFANO 3.2.1 Usos. El Dextrometorfano, el d-ismero del anlogo codenico del levorfanol, se emplea como antitusgeno. Controla los espasmos de tos al deprimir el centro de la tos en el bulbo. Posee una potencia supresora de la tos de La aproximadamente la mitad de la potencia antitusgena de la codena.

6 administracin oral de 30 mg a un adulto proporciona una actividad antitusiva efectiva en un perodo de 8 a 12 horas. A diferencia de la codena, no posee propiedades analgsicas y produce poca o ninguna depresin del sistema nervioso central. El Dextrometorfano se combina a menudo con expectorantes u otras drogas en medicaciones de venta libre para la tos y el resfro. (3) 3.2.2 Indicaciones. Tratamiento para la supresin de la tos no productiva (crnica).
(4)

3.2.3 Propiedades fsico-qumicas. o Estado fsico: cristales o polvo o Apariencia: casi blanco o cristalino o Olor: dbil o pH: 5.2 - 6.5 (solucin de 1 en 1000) o Punto de fusin: 126 oC o Temperatura de descomposicin: 126 oC o Solubilidad: 1g en alrededor de 65 mL de agua; completamente soluble en alcohol o cloroformo; insoluble en ter. o Frmula molecular: C18H25NO.HBr o Peso molecular: 352.32 g/moL (5) 3.3 GUAIFENESINA 3.3.1 Usos. Se usa para el alivio sintomtico de los trastornos respiratorios La accin de la Guaifenesina mejora la tos seca no caracterizados por una tos seca no productiva, y por la presencia de moco en el tracto respiratorio. productiva al disminuir la viscosidad del esputo, la dificultad en la expectoracin y aumentar el volumen del esputo. Es un componente en muchas formulaciones expectorantes registradas. (3)

7 3.3.2 Indicaciones. Es un expectorante. Se usa para aliviar la congestin y la mucosidad para ayudar a respirar ms fcil. La Guaifenesina diluye la mucosidad, aumenta la lubricacin de las vas respiratorias (los pulmones, la nariz, y la garganta), y aumenta la eliminacin de mucosidad. (6) 3.3.3 Propiedades fsico-qumicas. o Estado fsico: polvo cristalino o Apariencia: blanco a levemente gris o Olor: leve, caracterstico o Sabor: amargo o pH: 5 - 7 (solucin de 1 en 100) o Punto de fusin: con un intervalo de 3o entre 78 y 82 oC o Temperatura de descomposicin: 126 oC o Solubilidad: 1g en 60 a 70 mL de agua; soluble en alcohol, cloroformo, glicerina o propilenglicol; insoluble en ter de petrleo o Frmula molecular: C10H14O4 o Peso molecular: 198.22 g/moL (5) 3.4 FENILEFRINA 3.4.1 Usos. La Fenilefrina es una amina simpaticomimtica que se utiliza por va intranasal para combatir la congestin nasal y por va oral en combinacin con otros frmacos en el tratamiento de la gripe, resfriados, etc. Aplicada tpicamente sobre los ojos, produce midriasis, siendo utilizada con fines de diagnstico en el examen del fondo de ojo.
(7)

Tambin en combinacin con

broncodilatadores administrados por inhalacin.

(3)

3.4.2 Indicaciones. La Fenilefrina parenteral est indicada para el mantenimiento de una presin arterial adecuada durante la anestesia general o espinal y para el tratamiento de una hipotensin grave debida a un shock, frmacos o estados de hipersensibilidad. Tambin se emplea en casos de taquicardia supraventricular paroxstica y, en la anestesia regional como vasoconstrictor local. (7)

3.4.3 Propiedades fsico-qumicas. o Estado fsico: polvo o Apariencia: blanco o Punto de congelacin: 143.00 - 145.00 oC o Frmula molecular: C9H13NO2.HCl o Peso molecular: 203.67 g/moL (8)

3.5 CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN 3.5.1 Fundamentos de la tcnica La cromatografa lquida de alta resolucin es actualmente la tcnica de separacin ms ampliamente utilizada debido a su versatilidad y amplio campo de aplicacin. Los componentes de la muestra, previamente disueltos en un disolvente adecuado (fase mvil), son forzados a atravesar la columna cromatogrfica gracias a la aplicacin de altas presiones. El material interno de la columna, fase estacionaria, est constituido por un relleno capaz de retener de forma selectiva los componentes de la mezcla. La resolucin de esta separacin depende de la interaccin entre la fase estacionaria y la fase mvil, pudiendo ser manipulada a travs de la eleccin de diferentes mezclas de disolventes y distintos tipo de relleno. Como resultado final los componentes de la mezcla salen de la columna separados en funcin de sus tiempos de retencin en lo que constituye el cromatograma. A travs del cromatograma se puede realizar la identificacin cualitativa y cuantitativa de las especies separadas. 3.5.2 Aplicaciones El campo de aplicacin de esta tcnica es muy extenso. Algunas de las aplicaciones se nombran a continuacin:

Productos farmacuticos: antibiticos, sedantes, esteroides, analgsicos Bioqumica: aminocidos, protenas, carbohidratos, lpidos Alimentacin: edulcorantes artificiales, antioxidantes, aditivos

Contaminantes: plaguicidas, herbicidas, fenoles, PCBs Qumica forense: drogas, venenos, alcohol en sangre, narcticos Medicina clnica: cidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina, estrgenos.

3.5.3 Requisitos y limitaciones

Las muestras se proporcionarn debidamente filtradas. La cantidad mnima para realizar el ensayo es de 0.5 mL. Con la entrega de la muestra se entregarn los patrones preparados en las mismas condiciones que esta. El rango de volumen de inyeccin que cubre el equipo es de 10 a 100 L. (9)

3.5.4 Instrumentacin Los componentes bsicos de un sistema para HPLC son: A) Depsitos para la fase mvil (disolventes) B) Sistema de bombeo para proporcionar presin a la fase mvil C) Sistema de inyeccin de muestras D) Columna cromatogrfica E) Termostatos para las columnas F) Detectores G) Sistema para el tratamiento de datos y registrador

10

Como algunas de las fases mviles usadas en

HPLC

pueden

ser

qumicamente activas como cidos, bases o lquidos corrosivos, es esencial que los componentes del sistema estn fabricados con materiales resistentes, por lo que la mayora de las partes en contacto con la fase mvil suelen estar fabricadas con acero inoxidable (Hernndez L. 2002). Los disolventes ms usados en HPLC son agua, disoluciones tampn acuosas y disolventes orgnicos como el metanol. Deben ser espectroscpicamente puros, exentos de partculas slidas y desgasificados, esto se lleva a cabo con un gas inerte muy poco soluble como el helio. Como fase estacionaria lo ms comn es usar partculas microporosas esfricas de slice muy puro, que son permeables al disolvente (Harris, D. 2001). A. Los recipientes que se utilicen para almacenar la fase mvil tienen que ser inertes, es decir, el disolvente no deber extraer especie alguna del material con el que estn construidos. Suelen ser botellas de vidrio y tubos de tefln. Estn provistos de unos filtros, indispensables para eliminar los gases disueltos y partculas que pueda contener la fase mvil (Loro J. F. 2001).

11 B. Debido a las elevadas presiones de trabajo y al pequeo tamao de las partculas de la fase estacionaria, se utiliza una bomba que es la encargada de introducir la fase mvil o disolvente a travs de la columna. Los sistemas de bombeo debern reunir las siguientes caractersticas: Generar presiones superiores a 6000 psi. Capaces de cubrir un amplio rango de flujo entre 0,1 y 10 mL/min con una precisin del 0,5% y que est libre de pulsaciones. Construidos con materiales inertes respecto a los disolventes empleados. Las bombas empleadas en HPLC son de tres tipos: Bombas recprocas o de vaivn, son las ms utilizadas. Estn formadas por una pequea cmara cilndrica que se llena y luego se vaca por oscilacin de un pistn de zafiro. El bombeo produce un flujo pulsado que despus debe amortiguarse. Sus principales ventajas son que se consiguen presiones elevadas y se suministra un caudal constante, consiguindose adaptar a la tcnica de elucin con gradiente, debido a su pequeo volumen interno (Skoog, D. A. et al. 2001). Bombas neumticas o de presin constante, hacen uso de la presin de un gas aplicado al recipiente conteniendo la fase mvil. Son sencillas, no provocan pulsaciones pero estn limitadas a presiones relativamente bajas. (Hernndez, L. 2002). Bombas de desplazamiento o tipo jeringa, consisten en una cmara equipada con un mecanismo de tornillo. Suministran

12 un flujo libre de pulsaciones pero con una capacidad limitada a unos 250 mL. (Loro J. F. 2001) C. Los volmenes que se inyectan de muestra debern ser pequeos para evitar la sobrecarga de la columna. Hay varios tipos: El mtodo ms simple es la utilizacin de una jeringa de alta presin con un diafragma (septum) a la entrada de la columna. Est limitado a una presin mxima de operacin de 1500 psi. Las vlvulas de inyeccin con bucles de volumen conocido, es el mtodo ms utilizado. D. En las columnas cromatogrficas es donde se produce la velocidad diferencial de los solutos que permite su separacin (Loro J. F. 2001). El material de las columnas cromatogrficas suele ser de acero inoxidable cuya longitud vara de 5 a 30 cm y un dimetro de 1 a 5 mm. La eficacia de las columnas aumenta al disminuir el tamao de las partculas de la fase estacionaria. El tamao tpico de las partculas es de 3-10 um. Las columnas son caras y se degradan con facilidad, por eso, se protege la entrada de la columna con otra ms corta, la precolumna, que retiene por adsorcin las impurezas de forma irreversible (Harris, D. 2001). E. No es necesario el control estricto de la temperatura de la columna, pero las separaciones resultan ms reproducibles cuando la temperatura se mantiene constante. Los instrumentos comerciales modernos estn equipados con calentadores que regulan la temperatura de la columna.

13 F. El papel del detector es indicar los momentos de aparicin de los componentes, y proporcionar indicacin cuantitativa y cualitativa de los mismos. El detector utilizado depende de la naturaleza de la muestra y deber reunir una serie de caractersticas como son, tener una sensibilidad elevada, buena estabilidad y reproducibilidad. Amplio margen de respuesta lineal, insensible a cambios en la presin y la temperatura. (Hernndez, L. 2002) El detector se coloca al final de las columnas, responde a la concentracin del soluto y se registra en funcin del tiempo y obtenindose una serie de picos, generndose un grfico que se denomina cromatograma. La posicin de los picos en el eje del tiempo puede servir para identificar los componentes de la muestra. Los detectores basados en una propiedad del soluto que no la suele presentar la fase mvil. Suelen ser muy selectivos y sensibles, los cuales son: Detectores de absorbancia ultravioleta, son los ms utilizados. Su fundamento es la espectrofotometra de absorcin de luz visible y ultravioleta de un componente a una determinada longitud de onda. Los ms potentes son los que utilizan un montaje de fotodiodos para registrar el espectro completo de cada soluto que pasa por el detector. Los datos de absorbancia se representan en funcin de la longitud de onda y del tiempo. Detectores de fluorescencia, son muy sensibles y selectivos, el principio de operacin se basa en la irradiacin con la luz UV al componente de inters y la posterior medida de la luz fluorescente emitida por ste.(Loro J. F. 2001)

14

Detectores electroqumicos, ofrece ventajas debido a su especificidad, sensibilidad y amplia aplicabilidad, especialmente para compuestos orgnicos. Responde a analitos que puedan oxidarse o reducirse. Es el ejemplo de fenoles, aminas, perxidos (pueden detectarse por oxidacin) y cetonas, aldehdos (detectados por reduccin). Las tcnicas electroqumicas ms utilizadas con esta finalidad son la amperometra, voltamperometra y culombimetra.

Los detectores basados en una propiedad de la disolucin, responden a un conjunto amplio de solutos, pero suelen ser poco sensibles: Detectores de ndice de refraccin, est formado por una celda con dos compartimentos, en uno se introduce el disolvente puro y en el otro la muestra, se hace pasar luz visible paralela. Cuando entra en la celda soluto de distinto ndice de refraccin al disolvente el has se desva y vara la seal dada por la fotoclula (Harris, D. C. 2001). El principal inconveniente es que son muy sensibles a los cambios de temperatura y no resultan apropiados para trabajar con la modalidad de elusin con gradiente. Detectores de conductividad, son los ms utilizados cuando los solutos eluidos son inicos, como cidos y bases, as como cationes y aniones inorgnicos despus de su separacin por cromatografa de cambio inico. Tienen elevada sensibilidad, baratos y de larga duracin. (9)

15 VENTAJA:

Sensibilidad de la tcnica. Fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas. Idoneidad para la separacin de especies no voltiles o termolbiles. Gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial inters en la industria, en general.
(10)

muchos campos de la ciencia y para la sociedad en

DESVENTAJA:

Por las presiones altas que se manejan en HPLC, el equipo necesario tiende a ser ms sofisticado y caro que el que se utiliza en otros tipos de cromatografa.

El solvente se debe filtrar a travs de una membrana o microport antes de utilizar. Utilizar solventes de grados HPLC o de alta pureza lo que eleva los costos. El detector de fluorescencia es limitado por ciertas sustancias ya que no todas las sustancias fluorescen.

3.6 VALIDACIN La validacin de un mtodo analtico es el proceso que establece mediante estudios en laboratorio, que las caractersticas de desempeo del mtodo cumplen los requisitos adecuados de exactitud y confiabilidad para las aplicaciones analticas previstas. Las caractersticas de desempeo analtico habituales que deben considerarse en la validacin de los tipos de mtodos descritos son exactitud, precisin, especificidad, lmite de deteccin, lmite de cuantificacin, linealidad e intervalo.

16 En el caso de mtodos farmacopeicos, puede resultar necesaria una nueva validacin en las siguientes circunstancias: presentacin a la USP de un mtodo analtico revisado o utilizacin de un mtodo general establecido con un nuevo producto o materia prima. Los documentos de la Conferencia Internacional Tripartita sobre Armonizacin (ICH) aconsejan sobre la necesidad de realizar una nueva validacin en las siguientes circunstancias: cambios en la sntesis del frmaco, cambios en la composicin del producto farmacutico y cambios en el procedimiento analtico.
(11)

Cualquier mtodo de anlisis requiere su validacin. El mtodo descrito debe incluir los principios en los que se basa y las referencias bibliogrficas correspondientes, las especificaciones de los instrumentos y del equipo, los requisitos del material a analizar, incluidas las condiciones de almacenamiento, los diferentes reactivos, su procedencia comercial y el grado de pureza, su preparacin y sus concentraciones expresadas en las unidades adecuadas, la descripcin detallada de todos los pasos (especialmente de los crticos), cualquier precaucin acerca de la seguridad en la manipulacin de las muestras, la eliminacin de los residuos, el procedimiento de calibracin de los instrumentos, el clculo de los resultados, las descripciones de los compuestos de referencia (estndar) y el intervalo analtico (intervalo de concentraciones de los compuestos en la muestra para el que puede aplicarse el mtodo sin modificacin). En la eleccin de mtodos de anlisis, los estudios de estabilidad requieren detectar pequeos cambios que pueden ser significativos a lo largo del tiempo de almacenamiento. La cromatografa de gases (CG) y la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), los mtodos espectromtricos, las valoraciones gravimtricas, volumtricas y electroqumicas, son capaces de tal precisin. El control de calidad del producto final (para su comercializacin) requiere la especificacin muy estrecha de los lmites de pureza y concentracin, para lo

17 que se usan la cromatografa lquida de alta resolucin HPLC o la cromatografa de gases CG, por su sencillez, velocidad, buena especificidad y excelente precisin. (12)

3.7

CARACTERSTICAS DE DESEMPEO ANALTICO Para asegurar la calidad de los resultados en un proceso de validacin se requiere del cumplimiento de ciertas caractersticas de labarotario que satisfacen los requerimientos de la aplicacin deseada.

3.7.1 EXACTITUD La exactitud de un mtodo analtico es la proximidad entre los resultados de la prueba obtenidos mediante ese mtodo, y el valor verdadero. La exactitud de un mtodo analtico debe establecerse en todo su intervalo. En la valoracin de un frmaco, la exactitud puede determinarse mediante la aplicacin del mtodo analtico con respecto a un analito de pureza conocida (por ejemplo, un estndar de referencia), o comparando los resultados del mtodo con los de un segundo mtodo bien caracterizado, cuya exactitud se haya comprobado o definido. En la valoracin de un frmaco en un producto formulado, la exactitud puede determinarse mediante la aplicacin del mtodo analtico a mezclas sintticas de los componentes del producto farmacutico al que se hayan aadido cantidades conocidas de analito dentro del intervalo del mtodo.

3.7.2 PRECISIN La precisin de un mtodo analtico es el grado de concordancia entre los resultados de las pruebas individuales cuando se aplica el mtodo repetidamente a mltiples muestreos de una muestra homognea. desviacin La precisin de un mtodo analtico habitualmente se expresa como la estndar o la desviacin estndar relativa (coeficiente de variacin) de una serie de mediciones. La precisin es una medida del grado

18 de reproducibilidad o de repetibilidad del mtodo analtico en condiciones normales de operacin. La repetibilidad se refiere a la utilizacin del procedimiento analtico en un laboratorio durante un perodo de tiempo corto realizado por el mismo analista con el mismo equipo. La precisin de un mtodo analtico se determina mediante el anlisis de un nmero suficiente de alcuotas de una muestra homognea que permita calcular estadsticamente estimaciones vlidas de la desviacin estndar o de la desviacin estndar relativa (coeficiente de variacin).

3.7.3 ESPECIFICIDAD Capacidad de evaluar de manera inequvoca el analito en presencia de aquellos componentes cuya presencia resulta previsible, como analtico individual puede impurezas, productos de degradacin y componentes de la matriz. La falta de especificidad de un procedimiento compensarse usando otros procedimientos analticos complementarios. En anlisis cualitativos (pruebas de identificacin), debe demostrarse la capacidad de distinguir compuestos de estructura estrechamente relacionada cuya presencia resulta probable. Esta capacidad debera confirmarse mediante la obtencin de resultados positivos a partir de muestras que contengan el analito (quizs mediante comparacin con un material de referencia conocido), junto con resultados negativos de muestras que no contengan dicho analito, y mediante la confirmacin de que no se obtiene una respuesta positiva de materiales con estructura similar o estrechamente relacionada a la del analito.

3.7.4 LMITE DE DETECCIN El lmite de deteccin es una caracterstica de las pruebas de lmite. Es la cantidad mnima de analito en una muestra que puede detectarse, aunque no necesariamente cuantificarse, en las condiciones experimentales indicadas. Las pruebas de lmite simplemente comprueban que la cantidad

19 de analito se encuentra por encima o por debajo de un nivel determinado. El lmite de deteccin se expresa habitualmente en forma de concentracin de analito (por ejemplo, porcentaje, partes por milln) en la muestra. Para mtodos no instrumentales, el lmite de deteccin se determina generalmente mediante el anlisis de muestras con concentraciones conocidas de analito, estableciendo el nivel mnimo del analito que puede detectarse confiablemente. Para procedimientos instrumentales, se puede utilizar el mismo mtodo que para los no instrumentales.

3.7.5 LMITE DE CUANTIFICACIN El lmite de cuantificacin es una caracterstica de las valoraciones cuantitativas de compuestos que se encuentran en baja concentracin en la matriz de una muestra, como por ejemplo: impurezas en frmacos a granel y productos de degradacin en productos farmacuticos terminados. Es la misma cantidad de analito en una muestra que se puede determinar con precisin y exactitud aceptables en las condiciones experimentales indicadas. El lmite de cuantificacin se expresa habitualmente en forma de concentracin de analito (por ejemplo, porcentaje, partes por milln) en la muestra. Para mtodos no instrumentales, el lmite cuantitativo se determina habitualmente mediante el anlisis de muestras con concentraciones conocidas de analito, estableciendo el nivel mnimo del analito que se puede determinar con exactitud y precisin aceptables. Para procedimientos instrumentales, se puede utilizar el mismo mtodo que para los no instrumentales.

3.7.6 LINEALIDAD E INTERVALO La linealidad de un mtodo analtico es su capacidad para obtener resultados de prueba que sean proporcionales ya sea directamente, o por

20 medio de una transformacin matemtica bien definida, a la concentracin del analito en muestras en un intervalo dado. El intervalo de un mtodo analtico es la amplitud entre la concentracin inferior y superior de analito (incluyendo esos niveles) en la cual se puede determinar al analito con un nivel adecuado de precisin, exactitud y linealidad utilizando el mtodo segn se describe por escrito. El intervalo se expresa normalmente en las mismas unidades que los resultados de la prueba (por ejemplo, porcentaje, partes por milln) obtenidos mediante el mtodo analtico. La linealidad debe establecerse en el intervalo completo del procedimiento analtico. Debera establecerse inicialmente mediante examen visual de un grfico de seales como funcin de concentracin de analito del contenido. Si aparece existir una relacin lineal, los resultados de la prueba deberan establecerse mediante mtodos estadsticos adecuados (por ejemplo, mediante el clculo de una lnea de regresin por el mtodo de los cuadrados mnimos).

3.7.7 TOLERANCIA, TAMBIN CONOCIDA COMO FORTALEZA O RESISTENCIA La tolerancia de un mtodo analtico es el grado de reproducibilidad de los resultados de las pruebas obtenidos mediante el anlisis de las mismas muestras en diversas condiciones, como por ejemplo en diferentes laboratorios, con diferentes analistas, instrumentos, lotes de reactivos, tiempo transcurrido durante la valoracin, temperaturas de valoracin o das. La tolerancia se expresa normalmente como la carencia de influencia de las variables operativas y ambientales del mtodo analtico sobre los resultados de las pruebas. La tolerancia es una medida de la reproducibilidad de los resultados de las pruebas sometidas a la variacin de condiciones que se esperaran normalmente entre distintos laboratorios o distintos analistas.

21 La tolerancia de un mtodo analtico se determina mediante el anlisis de alcuotas de lotes homogneos en diferentes laboratorios, por diferentes analistas, utilizando condiciones operativas y ambientales que pueden ser diferentes pero que continan encontrndose dentro de los parmetros especificados del anlisis.

3.7.8 ROBUSTEZ La robustez de un mtodo analtico es una medida de su capacidad para no resultar afectado por pequeas pero deliberadas variaciones en los parmetros del mtodo; adems proporciona una indicacin de su confiabilidad durante su uso normal.

3.7.9 APTITUD DEL SISTEMA Si las mediciones son susceptibles a variaciones en condiciones analticas, stas deben controlarse adecuadamente o incluirse en el mtodo una declaracin preventiva. Una consecuencia de la evaluacin de la tolerancia y la robustez sera el establecimiento de una serie de parmetros de aptitud del sistema que garantizan que se mantenga la validez del mtodo analtico siempre que se utilice. Las variaciones tpicas son la estabilidad de las soluciones y equipo analtico, y de los analistas. En la cromatografa lquida, las variaciones habituales son el pH de la fase mvil, la composicin de la fase mvil, diferentes lotes o proveedores de columnas, la temperatura y la velocidad de flujo. (12,13) Las pruebas de aptitud del sistema se basan en el concepto de que el equipo, el sistema electrnico, las operaciones analticas y las muestras a analizar constituyen un sistema integral que puede evaluarse como tal. Los parmetros de prueba de la aptitud del sistema que deben establecerse para un mtodo especfico dependen del tipo de mtodo que se est evaluando. (11)

22 Las farmacopeas no describen un mtodo analtico que pueda cuantificar en un slo ensayo los cuatro principios activos contenidos en los jarabes a ensayar y por eso se presenta este mtodo como una alternativa al anlisis descrito en las farmacopeas. En la farmacopea Britnica se encuentran las monografas de la materia prima Dextrometorfano Bromohidrato y de Guaifenesina, siendo el mtodo de cuantificacin por titulacin. En la farmacopea Mexicana estn las monografas de Clorfeniramina Maleato, Dextrometorfano Bromohidrato y Fenilefrina Clorhidrato pero los ensayos tambin son por titulacin. La farmacopea Estadounidense reporta las monografas de las materias primas de Clorfeniramina Maleato y Fenilefrina Clorhidrato por titulacin, el Dextrometorfano Bromohidrato y Guaifenesina se ensayan por mtodos diferentes en cromatografa lquida de alta resolucin. nicamente en la farmacopea cuantificacin Estadounidense de se encontr una monografa para la y Guaifenesina, Pseudoefedrina, Acetaminofn

Dextrometorfano Bromohidrato en soluciones orales, pero el ensayo se realiza por diferentes metodologas de anlisis en HPLC. En la actualidad se efectu una revisin bibliogrfica sobre los trabajos de tesis para optar la licenciatura de Qumico Farmacutico de la Universidad de San Carlos de Guatemala y de la Universidad del Valle de Guatemala, para verificar si exista alguna especfica en la validacin de la metodologa analtica de estos principios activos en la forma farmacutica analizada. En junio 2006, Herberth Ral Arvalo Alvarado trabaj una validacin retrospectiva de proceso de manufactura y mtodo de anlisis de cpsulas de Diclofenaco Sdico 50 mg.
(14)

Con esto se estableci que la

validacin retrospectiva es aplicable para mtodos o procesos repetidamente utilizados, que no han sido validados anteriormente y de los que se tiene

23 documentacin suficiente para probar el funcionamiento, tanto del proceso de manufactura como del mtodo de anlisis. Adems de esto, es utilizado para cualquier forma farmacutica slida, media vez se tenga los datos suficientes para que dicha validacin tenga significancia estadstica. En julio 2003, Mario Ren Pinzn Meza llev a cabo un estudio de implementacin de metodologa para Acido Valproico por cromatografa lquida de alta resolucin y validacin por cromatografa de gases con detector selectivo de masas en muestras sricas. (15) El mtodo validado para la determinacin de Acido Valproico por cromatografa de gases con detector selectivo de masas es eficaz, rpido y confiable, permite resultados rpidos, los que por su carcter de validacin son de completa confianza al cumplir con los parmetros de establecidos por la USP XXIV aplicables a muestras biolgicas. En mayo de 2002, Rossana Anleu Lainfiesta realiz una investigacin para validar un mtodo por cromatografa lquida de alta resolucin para la cuantificacin de Ibuprofeno en suspensin. (1) El mtodo demostr ser selectivo para Ibuprofeno ya que separa esta sustancia del resto de ingredientes en la formulacin; y es vlido porque puede utilizarse como un mtodo analtico, es decir, que cumple con las caractersticas necesarias para poder cuantificar Ibuprofeno en la forma farmacutica de suspensin. En noviembre de 2002, Anabelly Carolina Franco Flores elabor una gua para validar mtodos analticos nuevos o modificados para productos farmacuticos.
(16)

Se determin que para validar un mtodo analtico, es

indispensable disponer de un diseo experimental apropiado, establecer lmites expresados en trminos cuantificables, y un tratamiento estadstico adecuado de los datos obtenidos experimentalmente. As mismo, se debe tener en claro las caractersticas y requerimientos que debe satisfacer el

24 mtodo analtico a validar, que garantiza el buen funcionamiento del sistema en el momento del anlisis para su aplicacin rutinaria y la seguridad en obtener un rendimiento aceptable. En enero 1998, Sandra Patricia de Len Barrientos efectu un estudio sobre validacin del mtodo de cromatografa lquida de alta resolucin para cuantificacin de vitamina A en tabletas masticables.
(17)

Se

comprob que el mtodo propuesto es capaz de diferenciar Vitamina A de cualquier otra sustancia, ya sea activo o placebo, presente en la formulacin utilizada de dicho trabajo de tesis. En s, el sistema es capaz de detectar niveles de Vitamina A en tabletas multivitamnicas masticables que van desde 912.5 UI hasta 5475.0 UI.

25

4.

JUSTIFICACIN

El tiempo del proceso de fabricacin de un producto farmacutico es notablemente afectado por el tiempo utilizado en la elaboracin de sus respectivos anlisis fsicos, qumicos y microbiolgicos, mismos que deben realizarse para garantizar la calidad del producto. Por lo que es importante contar con metodologas de anlisis rpidos, precisos y confiables. La precisin y exactitud de un mtodo es determinado mediante el cumplimiento de los parmetros de validacin (linealidad, exactitud, precisin intermedia, especificidad, etc.). Es por ello que surge la necesidad de brindar una metodologa validada y rpida para la cuantificacin de maleato de clorfeniramina, bromohidrato de dextrometorfano, guaifenesina y fenilefrina clorhidrato, realizndose sta por cromatografa lquida de alta resolucin ya que esta tcnica brinda una mejor separacin de los activos de posibles componentes interferentes (excipientes). Estos medicamentos por su actividad antitusgena son combinados para potenciar la accin teraputica que beneficiar adquisicin. Los estudios recientes muestran que no hay un mtodo analtico que involucre la asociacin de cuatro principios activos. Debido a esto surgi la necesidad de realizar un estudio de validacin para la cuantificacin de maleato de clorfeniramina, bromohidrato de dextrometorfano, guaifenesina y fenilefrina clorhidrato, dos jarabes en un slo mtodo analtico. adultos y nios; as mismo, sus propiedades fisicoqumicas permiten elaborar un producto farmacolgico, homogneo y de fcil

26

5.
4.1 OBJETIVO GENERAL

OBJETIVOS

Desarrollar y validar un mtodo analtico por cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), que cumpla con los requerimientos y normas ICH y Farmacopea Estadounidense (USP 2006) para la cuantificacin de cuatro principios activos contenidos en dos medicamentos.

4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS 4.2.1 Disear un mtodo de anlisis selectivo para la cuantificacin de Maleato de Clorfeniramina, Bromohidrato de Dextrometorfano, Guaifenesina y Fenilefrina Clorhidrato utilizando cromatografa lquida de alta resolucin. 4.2.2 Determinar y demostrar que la metodologa propuesta cumple con los parmetros de linealidad, exactitud, repetibilidad, precisin intermedia y especificidad segn lo establece la Farmacopea Estadounidense (USP) y normas de Validation of Analitical procedures ICH. 4.2.4 Proveer una metodologa validada que sirva como gua a la industria farmacutica para la cuantificacin de estos principios activos, tomando en cuenta que si es utilizada en otros productos debe de ser ensayada y validada nuevamente.

27

6.

HIPTESIS

El mtodo analtico por cromatografa lquida de alta resolucin para la cuantificacin de clorfeniramina maleato, dextrometorfano bromohidrato, guaifenesina y fenilefrina clorhidrato en los jarabes sometidos al anlisis, cumple con los parmetros de validacin establecidos en la Farmacopea de los Estados Unidos versin en espaol USP 30 y normas ICH Q2B (Internacional Conference on Harmonised), por lo que proporciona datos precisos, reproducibles y confiables.

28

7.

MATERIALES Y MTODOS

7.1 UNIVERSO DE TRABAJO Muestras de dos jarabes comerciales. Jarabe A composicin terica. Clorfeniramina Maleato 1 mg/5mL Dextrometorfano Bromohidrato..5 mg/5mL Fenilefrina Clorhidrato2.5 mg/mL Jarabe B composicin terica Guaifenesina100 mg/5mL Clorfeniramina Maleato 2 mg/5mL Dextrometorfano Bromohidrato10 mg/5mL 7.2 MEDIOS 7.2.1 Recursos Humanos Autora: Frida Lucitania Vallejo Garca Asesora: Lcda. Ibe Arleth Arriola Daz Co-Asesor: Lic. Francisco Estuardo Serrano Vives Revisora: Lcda. Alma Lucrecia Martnez Cano Colaboradora: Lcda.Viviana Lisbeth Sandoval Lutn Personal profesional y tcnico del Laboratorio Transnacional del Departamento de Investigacin y Desarrollo

7.2.2 Materiales Libros Folletos Informacin por Internet Cmara digital Memoria USB

29

Papel bond para impresora Papel pH Filtros Wathman

7.2.3 Instalaciones Laboratorio transnacional Biblioteca de la Universidad del Valle de Guatemala Biblioteca Central de la Universidad de San Carlos de Guatemala Centro Guatemalteco de Informacin de Medicamentos CEGIMEDCentro de Documentacin/Biblioteca de Farmacia CEDOBF-

7.3 RECURSOS MATERIALES 7.3.1 Equipo Cromatgrafo lquido de alta resolucin Jeringa de 50 L Columna Whatman Partisil SCX Balanza analtica Esptula Bomba al vaco Estufa con calentador y agitador Magnetos Bao de Mara Bao de ultrasonido Potencimetro Computadora Impresora

30

7.3.2 Datos de la calibracin de equipos Descripcin del equipo: Cromatgrafo lquido de alta resolucin, marca Merck Hitachi Serie d-7000 con detector UV-VIS y automuestreador, cdigo ID-EE-056. Fecha de calibracin: 22 de septiembre del 2006. Frecuencia de calibracin: Cada 4 meses. Empresa y persona que lo calibr: Ing. Daniel Prez de MERCK. * Descripcin del equipo: Balanza analtica marca Mettler Toledo AG 204, cdigo ID-EE-052. Fecha de calibracin: 20 de junio del 2006. Empresa y persona que lo calibr: Sr. Jacobo Chum de PRESICIN. * (Ver copia de los certificados de calibracin en Anexos) 7.3.3 Reactivos Agua HPLC Metanol HPLC Fosfato Monobsico de Potasio cido fosfrico al 50% 7.3.4 Cristalera Balones volumtricos de 25, 50, 100, 1,000 y 2,000 mL Pipeta volumtrica de 1, 2 , 3, 4, 5, 6, 7 y 10 mL Beackers de 50, 100, 1,000 y 2,000 mL Embudos Kitazato y equipo de filtracin Varilla de vidrio Probetas de 100 mL Viales Micropipetas

Frecuencia de calibracin: Cada 6 meses. *

31 7.4 METODOLOGA 7.4.1 CUANTIFICACIN DE GUAIFENESINA La cuantificacin de Guaifenesina se llev a cabo mediante el Mtodo de Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC), el cual posee los siguientes procedimientos: 7.4.1.1 PREPARACIN DE REACTIVOS: Fase Mvil: En un recipiente adecuado se coloc 600 mL de metanol HPLC agregando 400 mL de buffer de fosfatos pH 4 para mezclar y filtrar a travs de una membrana de nylon 0.45 m que permiti desgasificar. cido Fosfrico al 20%: Se midi 25 mL de cido fosfrico al 85% y se transfirieron a un baln volumtrico de 100 mL que contena 50 mL de agua desmineralizada que se llev a volumen con el mismo solvente. Buffer de Fosfatos: Se pes 3.4 g de fosfato monobsico de potasio, disolvindolos en 450 mL de agua para ajustar a pH 4 con cido fosfrico al 20% (1 a 5 gotas) llevando a volumen de 500 mL. Solucin de Dilucin: Se prepar una solucin con 40% de agua y 60% de metanol HPLC que se filtr a travs de una membrana de nylon de 0.45 m para desgasificar. 7.4.1.2 PREPARACIN DE LA SOLUCIN PATRN: Se pesaron 200 mg de Guaifenesina que se transfirieron a un baln volumtrico de 100 mL, disolviendo con solucin de dilucin, sonificar y llevar a volumen con la misma solucin y luego mezclar. Posteriormente se transfirieron 5 mL de esta solucin a un baln volumtrico de 25 mL para llevar a volumen con la solucin de dilucin.

32 La concentracin final aproximada es de: Guaifenesina 0.4 mg/mL. 7.4.1.3 PREPARACIN DE LA MUESTRA: Para preparar la muestra se pes 200 mg de materia prima y se transfirieron a un baln volumtrico de 100 mL, disolviendo con solucin de dilucin, despus sonificar llevando a volumen con la misma solucin y finalmente mezclar. En seguida se transfirieron 5 mL de esta solucin a un baln volumtrico de 25 mL llevando a volumen con la solucin de dilucin. La concentracin final aproximada es de: Guaifenesina 0.4 mg/mL. 7.4.1.4 SISTEMA CROMATOGRFICO: Aparato: Columna: Longitud de onda: Cromatgrafo Lquido de Alta Resolucin Whatman 10 SCX (Con grupos arilsulfnicos) 220 nm

Volumen de inyeccin: 20 L Flujo de la fase mvil: 1.0 mL/min. Fase Mvil: Metanol HPLC: Buffer de fosfatos pH 4 (600:400) 7.4.1.5 PROCEDIMIENTO: Se inyect la solucin patrn y por duplicado la muestra de Guaifenesina segn el procedimiento del punto 7.4.1.3 7.4.1.6 CLCULOS: Para encontrar la concentracin de Guaifenesina se calcul la cantidad en % de Guaifenesina por cada 5 mL, mediante la siguiente frmula:

% =

Am Ap

x Cp x

P x

Dil x 100 Pm

33 Donde: Am = rea obtenida en la solucin muestra Ap = rea obtenida en la solucin patrn Cp = Concentracin del patrn en mg/mL de Guaifenesina P = Pureza del patrn (%100) Dil = Diluciones de la muestra Pm = Peso de la muestra 100 = Factor para reportar en %

7.4.2

CUANTIFICACIN DE CLORFENIRAMINA MALEATO La cuantificacin de Clorfeniramina Maleato se llev a cabo mediante el Mtodo de Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC), el cual posee los siguientes procedimientos: 7.4.2.1 PREPARACIN DE REACTIVOS: Fase Mvil: En un recipiente adecuado se coloc 600 mL de metanol HPLC agregando 400 mL de buffer de fosfatos pH 4 para mezclar y filtrar a travs de una membrana de nylon 0.45 m que permiti desgasificar. cido Fosfrico al 20%: Se midi 25 mL de cido fosfrico al 85% y se transfirieron a un baln volumtrico de 100 mL que contenan 50 mL de agua desmineralizada que se llev a volumen con el mismo solvente. Buffer de Fosfatos: Se pes 3.4 g de fosfato monobsico de potasio, disolvindolos en 450 mL de agua y ajustar a pH 4 con cido fosfrico al 20% (1 a 5 gotas) llevando a volumen de 500 mL.

34 Solucin de Dilucin: Se prepar una solucin que contenga 40% agua y 60% de metanol HPLC que se filtr a travs de una membrana de nylon de 0.45 m para desgasificar. 7.4.2.2 PREPARACIN DE LA SOLUCIN PATRN: Se pesaron 8 mg de Clorfeniramina Maleato que se transfirieron a un baln volumtrico de 100 mL, disolviendo con solucin de dilucin, sonificar y llevar a volumen con la misma solucin y luego mezclar. Posteriormente se transfirieron 5 mL de esta solucin a un baln volumtrico de 25 mL para llevar a volumen con la solucin de dilucin. La concentracin final aproximada es de: Clorfeniramina Maleato 0.08 mg/mL. 7.4.2.3 PREPARACIN DE LA MUESTRA Para preparar la muestra se pes 8 mg de materia prima y se transfirieron a un baln volumtrico de 100 mL, disolviendo con solucin de dilucin, despus sonificar llevando a volumen con la misma solucin y finalmente mezclar. En seguida se transfirieron 5 mL de esta solucin a un baln volumtrico de 25 mL llevando a volumen con la solucin de dilucin. La concentracin final aproximada es de: Clorfeniramina Maleato 0.08 mg/mL 7.4.2.4 SISTEMA CROMATOGRFICO: Aparato: Columna: Longitud de onda: Cromatgrafo Lquido de Alta Resolucin Whatman 10 SCX (Con grupos arilsulfnicos) 220 nm Volumen de inyeccin: 20 L

35 Flujo de la fase mvil: 1.0 mL/min. Fase Mvil: Metanol HPLC: buffer de fosfatos pH 4 (600:400) 7.4.2.5 PROCEDIMIENTO: Se inyect la solucin patrn y por duplicado la muestra de Clorfeniramina Maleato segn procedimiento del punto 7.4.2.3 7.4.2.6 CLCULOS: Para encontrar la concentracin de Clorfeniramina Maleato se calcul la cantidad en % de Clorfeniramina Maleato, mediante la siguiente frmula:

% =

Am Ap

x Cp x

P x

Dil x 100 Pm

Donde: Am = rea obtenida en la solucin muestra Ap = rea obtenida en la solucin patrn Cp = Concentracin del patrn en mg/mL de Clorfeniramina Maleato P = Pureza del patrn (%100) Dil = Diluciones de la muestra Pm = Peso de la muestra 100 = Factor para reportar en %

7.4.3

CUANTIFICACIN DE FENILEFRINA CLORHIDRATO La cuantificacin de Fenilefrina Clorhidrato se llev a cabo mediante el Mtodo de Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC), el cual posee los siguientes procedimientos:

36 7.4.3.1 PREPARACN DE REACTIVOS: Fase Mvil: En un recipiente adecuado se coloc 600 mL de metanol HPLC agregando 400 mL de buffer de fosfatos pH 4 para mezclar y filtrar a travs de una membrana de nylon 0.45 m que permiti desgasificar. cido Fosfrico al 20%: Se midi 25 mL de cido fosfrico al 85% y se transfirieron a un baln volumtrico de 100 mL que contena 50 mL de agua desmineralizada que se llev a volumen con el mismo solvente. Buffer de Fosfatos: Se pes 3.4 g de fosfato monobsico de potasio, disolvindolos en 450 mL de agua y ajustar a pH 4 con cido fosfrico al 20% (1 a 5 gotas) llevando a volumen de 500 mL. Solucin de Dilucin: Se prepar una solucin que contenga 40% agua y 60% de metanol HPLC que se filtr a travs de una membrana de nylon de 0.45 m para desgasificar. 7.4.3.2 PREPARACIN DE LA SOLUCIN PATRN: Se pesaron 20 mg de Fenilefrina Clorhidrato que se transfirieron a un baln volumtrico de 100 mL, disolviendo con solucin de dilucin, sonificar y llevar a volumen con la misma solucin y luego mezclar. Posteriormente se transfirieron 5 mL de esta solucin a un baln volumtrico de 25 mL para llevar a volumen con la solucin de dilucin. La concentracin final aproximada es de: Fenilefrina Clorhidrato 0.04 mg/mL 7.4.3.3 PREPARACIN DE LA MUESTRA: Para preparar la muestra se pes 20 mg de materia prima y se transfirieron a un baln volumtrico de 100 mL, disolviendo con

37 solucin de dilucin, sonificar y llevar a volumen con la misma solucin y finalmente mezclar. Enseguida se transfirieron 5 mL de esta solucin a un baln volumtrico de 25 mL llevando a volumen con la solucin de dilucin. La concentracin final aproximada es de: Fenilefrina Clorhidrato 0.04 mg/mL 7.4.3.4 SISTEMA CROMATOGRFICO: Aparato: Columna: Longitud de onda: Cromatgrafo Lquido de Alta Resolucin Whatman 10 SCX (Con grupos arilsulfnicos) 220 nm

Volumen de inyeccin: 20 L Flujo de la fase mvil: 1.0 mL/min. Fase Mvil: Metanol HPLC: Buffer de fosfatos pH 4 (600:400) 7.4.3.5 PROCEDIMIENTO: Se inyect la solucin patrn y por duplicado la muestra de Fenilefrina Clorhidrato segn procedimiento del punto 7.4.3.3 7.4.3.6 CLCULOS: Para encontrar la concentracin de Fenilefrina Clorhidrato se calcul la cantidad en % de Fenilefrina Clorhidrato, mediante la siguiente frmula:

% =

Am Ap

x Cp x

P x

Dil x 5 Pm

Donde: Am = rea obtenida en la solucin muestra Ap = rea obtenida en la solucin patrn

38 Cp = Concentracin del patrn en mg/mL de Fenilefrina Clorhidrato P = Pureza del patrn (%100) Dil = Diluciones de la muestra Pm = Peso de la muestra 100 = Factor para reportar en %

7.4.4

CUANTIFICACIN DE DEXTROMETORFANO BROMHIDRATO La cuantificacin de Dextrometorfano Bromhidrato se llev a cabo mediante el Mtodo de Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC), el cual posee los siguientes procedimientos: 7.4.4.1 PREPARACIN DE REACTIVOS: Fase Mvil: En un recipiente adecuado se coloc 600 mL de metanol HPLC agregando 400 mL de buffer de fosfatos pH 4 para mezclar y filtrar a travs de una membrana de nylon 0.45 m que permiti desgasificar. cido Fosfrico al 20%: Se midi 25 mL de cido fosfrico al 85% y se transfirieron a un baln volumtrico de 100 mL que contena 50 mL de agua desmineralizada que se llev a volumen con el mismo solvente. Buffer de Fosfatos: Se pes 3.4 g de fosfato monobsico de potasio, disolvindolos en 450 mL de agua y ajustar a pH 4 con cido fosfrico al 20% (1 a 5 gotas) llevando a volumen de 500 mL. Solucin de Dilucin: Se prepar una solucin que contenga 40% agua y 60% de metanol HPLC que se filtr a travs de una membrana de nylon de 0.45 m para desgasificar.

39 7.4.4.2 PREPARACIN DE LA SOLUCIN PATRN: Se pesaron 40 mg de Dextrometorfano Bromhidrato que se transfirieron a un baln volumtrico de 100 mL, disolviendo con solucin de dilucin, sonificar y llevar a volumen con la misma solucin y luego mezclar. Posteriormente se transfirieron 5 mL de esta solucin a un baln volumtrico de 25 mL para llevar a volumen con la solucin de dilucin. La concentracin final aproximada es de: Dextrometorfano Bromhidrato 0.08 mg/mL. 7.4.4.3 PREPARACIN DE LA MUESTRA: Para preparar la muestra se pes 40 mg de Dextrometorfano Bromhidrato, y se transfirieron a un baln volumtrico de 100 mL, disolviendo con solucin de dilucin, sonificar y llevar a volumen con la misma solucin y finalmente mezclar. Enseguida se transfirieron 5 mL de esta solucin a un baln volumtrico de 25 mL llevando a volumen con la solucin de dilucin. La concentracin final aproximada es de: Dextrometorfano Bromhidrato 0.08 mg/mL. 7.4.4.4 SISTEMA CROMATOGRFICO: Aparato: Columna: Longitud de onda: Cromatgrafo Lquido de Alta Resolucin Whatman 10 SCX (Con grupos arilsulfnicos) 220 nm Volumen de inyeccin: 20 L Flujo de la fase mvil: 1.0 mL/min. Fase Mvil: Metanol HPLC: Buffer de fosfatos pH 4 (600:400)

40 7.4.4.5 PROCEDIMIENTO: Se inyect la solucin patrn y por duplicado la muestra de Dextrometorfano Bromhidrato segn procedimiento del punto 7.4.4.3 7.4.4.6 CLCULOS: Para encontrar la concentracin de Dextrometorfano Bromhidrato se calcul la cantidad en % de Dextrometorfano Bromhidrato, mediante la siguiente frmula:

% =

Am Ap

x Cp x

P x

Dil x 100 Pm

Donde: Am = rea obtenida en la solucin muestra Ap = rea obtenida en la solucin patrn Cp = Concentracin del patrn en mg/mL de Dextrometorfano Bromhidrato P = Pureza del patrn (%100) Dil = Diluciones de la muestra Pm = Peso de la muestra 100 = Factor para reportar en %

7.4.5

CUANTIFICACIN DE FENILEFRINA, DEXTROMETORFANO Y CLORFENIRAMINA EN JARABE A La cuantificacin de Fenilefrina, Dextrometorfano y Clorfeniramina en Jarabe A se llev a cabo mediante el Mtodo de Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC), el cual posee los siguientes procedimientos:

41 7.4.5.1 PREPARACIN DE REACTIVOS: Fase Mvil: En un recipiente adecuado se coloc 600 mL de metanol HPLC agregando 400 mL de buffer de fosfatos pH 4 para mezclar y filtrar a travs de una membrana de nylon 0.45 m que permiti desgasificar. cido Fosfrico al 20%: Se midi 25 mL de cido fosfrico al 85% y se transfirieron a un baln volumtrico de 100 mL que contena 50 mL de agua desmineralizada que se llev a volumen con el mismo solvente. Buffer de Fosfatos: Se pes 3.4 g de fosfato monobsico de potasio, disolvindolos en 450 mL de agua y ajustar a pH 4 con cido fosfrico al 20% (1 a 5 gotas) llevando a volumen de 500 mL. Solucin de Dilucin: Se prepar una solucin que contenga 40% agua y 60% de metanol HPLC que se filtr a travs de una membrana de nylon de 0.45 m para desgasificar. 7.4.5.2 PREPARACIN DE LA SOLUCIN PATRN: Se pesaron 20 mg de Fenilefrina Clorhidrato, 40 mg de Dextrometorfano Bromhidrato y 8 mg de Clorfeniramina Maleato que se transfirieron a un baln volumtrico de 100 mL, disolviendo con solucin de dilucin, sonificar y llevar a volumen con la misma solucin y luego mezclar. Posteriormente se transfirieron 5 mL de esta solucin a un baln volumtrico de 25 mL para llevar a volumen con la solucin de dilucin. La concentracin final aproximada es de: Fenilefrina Clorhidrato 0.04 mg/mL, Dextrometorfano Bromhidrato 0.08 mg/mL, Clorfeniramina Maleato 0.016 mg/mL.

42 7.4.5.3 PREPARACIN DE LA MUESTRA: Para preparar la muestra se transfirieron 2 mL de Jarabe A a un baln volumtrico de 25 mL diluyendo con solucin de dilucin, sonificar y llevar a volumen con la misma solucin y luego mezclar. Enseguida se filtr a travs de un filtro Whatman No1. La concentracin final aproximada es de: Fenilefrina Clorhidrato 0.04 mg/mL, Dextrometorfano Bromhidrato 0.08 mg/mL y Clorfeniramina Maleato 0.016 mg/mL. 7.4.5.4 SISTEMA CROMATOGRFICO: Aparato: Columna: Longitud de onda: Cromatgrafo Lquido de Alta Resolucin Whatman 10 SCX (Con grupos arilsulfnicos) 220 nm Volumen de inyeccin: 20 L Flujo de la fase mvil: 1.0 mL/min. Fase Mvil: Metanol HPLC: Buffer de fosfatos pH 4 (600:400) 7.4.5.5 PROCEDIMIENTO: Se inyect la solucin patrn y por duplicado la muestra de Jarabe A segn procedimiento del punto 7.4.5.3 7.4.5.6 CLCULOS: Para encontrar la concentracin de Dextrometorfano Bromhidrato se calcul la cantidad en mg de Dextrometorfano por cada 5 mL, mediante la siguiente frmula:

mg de Dextrometo rfano Am = 5mL Ap

x Cp x

P x

Dil x 5 Vm

43 Donde: Am = rea obtenida en la solucin muestra Ap = rea obtenida en la solucin patrn Cp = Concentracin del patrn en mg/mL de Dextrometorfano Bromhidrato P = Pureza del patrn (%100) Dil = Diluciones de la muestra Vm = Volumen medido de la muestra en mL. 5 = Factor para reportar en mg/5mL.

Para encontrar la concentracin de Clorfeniramina Maleato se calcul la cantidad en mg de Clorfeniramina Maleato por cada 5 mL, mediante la siguiente frmula:
mg de Clorfenira min a Am = 5mL Ap

x Cp x

P x

Dil x 5 Vm

Donde: Am = rea obtenida en la solucin muestra Ap = rea obtenida en la solucin patrn Cp = Concentracin del patrn en mg/mL de Clorfeniramina Maleato. P = Pureza del patrn (%100) Dil = Diluciones de la muestra Vm = Volumen medido de la muestra 5 = Factor para reportar en mg/5mL

Para encontrar la concentracin de Fenilefrina se calcul la cantidad en mg de Fenilefrina por cada 5 mL, mediante la siguiente frmula:

44

mg de Fenilefrin a Am = 5 mL Ap

Cp x

P x

Dil x Vm

Donde: Am = rea obtenida en la solucin muestra Ap = rea obtenida en la solucin patrn Cp = Concentracin del patrn en mg/mL de Fenilefrina. P = Pureza del patrn Dil = Diluciones de la muestra Vm = Volumen medido de la muestra en mL. 5 = Factor para reportar en mg/5mL.

7.4.6 CUANTIFICACIN DE GUAIFENESINA, DEXTROMETORFANO Y CLORFENIRAMINA EN JARABE B La cuantificacin de Guaifenesina, Dextrometorfano y Clorfeniramina en Jarabe B se llev a cabo mediante el Mtodo de Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC), el cual posee los siguientes procedimientos: 7.4.6.1 PREPARACIN DE REACTIVOS: Fase Mvil: En un recipiente adecuado se coloc 600 mL de metanol HPLC agregando 400 mL de buffer de fosfatos pH 4 para mezclar y filtrar a travs de una membrana de nylon 0.45 m que permiti desgasificar. cido Fosfrico al 20%: Se midi 25 mL de cido fosfrico al 85% y se transfirieron a un baln volumtrico de 100 mL que contena 50 mL de agua desmineralizada que se llev a volumen con el mismo solvente.

45 Buffer de Fosfatos: Se pes 3.4 g de fosfato monobsico de potasio, disolvindolos en 450 mL de agua y ajustar a pH 4 con cido fosfrico al 20% (1 a 5 gotas) llevando a volumen de 500 mL. Solucin de Dilucin: Se prepar una solucin que contenga 40% agua y 60% de metanol HPLC que se filtr a travs de una membrana de nylon de 0.45 m para desgasificar. 7.4.6.2 PREPARACIN DE LA SOLUCIN PATRN: Se pesaron 200 mg de Guaifenesina, 40 mg de Dextrometorfano Bromhidrato y 8 mg de Clorfeniramina Maleato que se transfirieron a un baln volumtrico de 100 mL, disolviendo con solucin de dilucin, sonificar y llevar a volumen con la misma solucin y luego mezclar. Posteriormente se transfirieron 5 mL de esta solucin a un baln volumtrico de 25 mL para llevar a volumen con la solucin de dilucin. La concentracin final aproximada es de: Guaifenesina 0.4 mg/mL, Dextrometorfano Bromhidrato 0.08 mg/mL, Clorfeniramina Maleato 0.016 mg/mL. 7.4.6.3 PREPARACIN DE LA MUESTRA Para preparar la muestra se transfirieron 2 mL de Jarabe B a un baln volumtrico de 25 mL diluyendo con solucin de dilucin, sonificar y llevar a volumen con la misma solucin y luego mezclar. Enseguida se filtr a travs de un filtro Whatman No1. La concentracin final aproximada es de: Guaifenesina 0.4 mg/ mL, Dextrometorfano Bromhidrato 0.08 mg/mL y Clorfeniramina Maleato 0.016 mg/mL.

46 7.4.6.4 SISTEMA CROMATOGRFICO: Aparato: Columna: Longitud de onda: Flujo de la fase mvil: Cromatgrafo Lquido de Alta Resolucin Whatman 10 SCX (Con grupos arilsulfnicos) 220 nm 1.0 ml/min. Volumen de inyeccin: 20 L Fase Mvil: Metanol HPLC: Buffer de fosfatos pH 4 (600:400) 7.4.6.5 PROCEDIMIENTO: Se inyect la solucin patrn y por duplicado la muestra de Jarabe B segn procedimiento del punto 7.4.6.3 7.4.6.6 CLCULOS: Para encontrar la concentracin de Dextrometorfano se calcul la cantidad en mg de Dextrometorfano por cada 5 mL, mediante la siguiente frmula:

mg de Dextrometo rfano Am = 5mL Ap

x Cp x

P x

Dil x 5 Vm

Donde: Am = rea obtenida en la solucin muestra Ap = rea obtenida en la solucin patrn Cp = Concentracin del patrn en mg/mL de Dextrometorfano Bromhidrato P = Pureza del patrn (%100) Dil = Diluciones de la muestra Vm = Volumen medido de la muestra en mL 5 = Factor para reportar en mg/5mL

47 Para encontrar la concentracin de Clorfeniramina se calcul la cantidad en mg de Clorfeniramina Maleato por cada 5 mL, mediante la siguiente frmula:
mg de Clorfenira min a Am = 5mL Ap Dil x 5 Vm

x Cp x

P x

Donde: Am = rea obtenida en la solucin muestra Ap = rea obtenida en la solucin patrn Cp = Concentracin del patrn en mg/mL de Clorfeniramina Maleato. P = Pureza del patrn (%100) Dil = Diluciones de la muestra Vm = Volumen medido de la muestra 5 = Factor para reportar en mg/5mL

Para encontrar la concentracin de Fenilefrina se calcul la cantidad en mg de Fenilefrina por cada 5 mL, mediante la siguiente frmula:

mg de Fenilefrin a Am = 5 mL Ap

Cp x

P x

Dil x Vm

Donde: Am = rea obtenida en la solucin muestra Ap = rea obtenida en la solucin patrn Cp = Concentracin del patrn en mg/mL de Fenilefrina P = Pureza del patrn Dil = Diluciones de la muestra Vm = Volumen medido de la muestra en mL.

48 5 = Factor para reportar en mg/5mL.

7.4.7 PROCEDIMIENTO DE VALIDACIN DE LA METODOLOGA ANALTICA Un mtodo de anlisis para ser validado debi demostrar informacin documentada del procedimiento seguido, lo cual debi corresponder a un diseo experimental junto con un procedimiento estadstico apropiado y con evidencias de aceptacin de la funcionalidad del mtodo para las aplicaciones analticas propuestas.

EVALUACIN DE LOS PARAMETROS DE DESEMPEO Para validar una metodologa de anlisis se evaluaron los siguientes parmetros de desempeo analtico.

EXACTITUD La exactitud se determin mediante la aplicacin del mtodo analtico a una de las siguientes pruebas: Valoracin de un principio activo Se analizaron tres diferentes concentraciones del analito de pureza conocida cada una por triplicado (en base a un estndar de referencia). VALORACIN DE UN PRINCIPIO ACTIVO EN UN PRODUCTO TERMINADO Mtodo de acumulacin Se obtuvieron muestras de todos los componentes del producto farmacutico, agregando tres cantidades diferentes y conocidas del analito al producto farmacutico que corresponden a un lote de fabricacin determinado.

49 Antes de agregar el analito a la muestra fue necesario determinar el contenido promedio del analito en la muestra con el mtodo a validar y luego se procedi a enriquecer las muestras con el estndar. Los valores del analito sugeridos que se agregaron son del 100, 120 y 140% de la concentracin normal de trabajo del mtodo, pero variaban segn la prueba de validacin que se ensayaba; as mismo el nmero de datos que se empleaban en cada prueba. Para realizar los clculos del porcentaje de recuperacin del analito fue necesario restar el promedio de las concentraciones del analito contenidas en las muestras determinadas inicialmente para determinar el valor real utilizado.

PRECISIN La precisin es una medida del grado de repetibilidad o de la reproducibilidad del mtodo analtico en condiciones normales de operacin.

Repetibilidad Esta prueba se realiz analizando la muestra en un mismo laboratorio, bajo las mismas condiciones de operacin, por el mismo analista, con los mismos aparatos y reactivos y en el curso de la misma serie de anlisis efectuados. Se realiz el siguiente ensayo: Se analiz la muestra (materia prima y producto terminado) que en el ensayo fue tomada como el cien por ciento (concentracin normal de trabajo del mtodo sometido a validacin) un mnimo de seis veces.

Precisin intermedia Para la realizacin de esta prueba se analiz la muestra a la concentracin tomada como el cien por ciento y se obtuvieron variaciones en las condiciones de anlisis de la siguiente manera: Un mismo analista, dos das diferentes de anlisis, el mismo aparato o instrumento.

50

Dos analistas diferentes, en el mismo da de anlisis, el mismo aparato o instrumento.

Se evaluaron dos variaciones en las condiciones de anlisis y la muestra se analiz un mnimo de seis veces con cada variacin.

LINEALIDAD E INTERVALO DE LINEALIDAD Para este ensayo se realizaron las pruebas de Linealidad del Sistema y Linealidad del Mtodo.

Linealidad del Sistema Para la linealidad del sistema se prepar una solucin patrn (solucin madre) y a partir de sta se realizaron las diluciones necesarias obtenindose como mnimo cinco diferentes concentraciones (soluciones hijas). La curva de calibracin se obtuvo con los resultados de las soluciones hijas, las cuales se analizaron con el mismo mtodo analtico, bajo las mismas condiciones, el mismo aparato o instrumento, el mismo da y el mismo analista. Para la validacin de un principio activo (materia prima) o producto terminado se incluyeron las concentraciones del 60% al 140%. repiti tres veces. Este procedimiento se

Linealidad del mtodo Para la linealidad del mtodo se analizaron las muestras a tres diferentes concentraciones por triplicado, bajo las mismas condiciones de operacin, por el mismo analista y en el mismo da.

Intervalo de linealidad El intervalo de linealidad lo constituy el rango en el cual se examin la linealidad.

51

ESPECIFICIDAD Para realizar la prueba de especificidad se sometieron la muestra y la solucin de mezcla de estndares a diferentes condiciones que dieron origen a la formacin de productos de degradacin. La degradacin se obtuvo con los siguientes mtodos.

Degradacin cida: a la muestra se le agregaron 10 mL de cido clorhdrico 1.2N, se calentaron durante 30 minutos, neutralizndose con una solucin de NaOH diluido que enseguida se afor.

Degradacin bsica: a la muestra se le agregaron 10 mL de hidrxido de sodio 0.1N, se calentaron durante 30 minutos, se neutraliz con una solucin de HCl diluido que enseguida se afor.

Degradacin con agua oxigenada: a la muestra se le agregaron 10 mL de agua oxigenada de 10 volmenes, se calentaron durante 30 minutos que despus se afor.

Degradacin con sulfito de sodio: a la muestra se le agregaron 10 mL de sulfito de sodio al 10%, se calentaron durante 30 minutos que despus se afor.

7.4.8 TRATAMIENTO ESTADSTICO DE LOS RESULTADOS Los resultados obtenidos fueron ingresados en un programa estadstico para las pruebas de validacin llamado Validacin de Tcnicas Analticas, establecido y recomendado por ICH, FDA, USP 25, que permite analizarlos con base en los criterios de aceptacin de cada parmetro. (22)

EXACTITUD La exactitud se calcul como el porcentaje de recuperacin de la cantidad valorada con respecto a la cantidad conocida de analito aadida a la muestra o como la diferencia entre la medida de la valoracin y el valor verdadero aceptado, considerando los intervalos de confianza.

52 Se registraron los resultados obtenidos y se calcul lo siguiente: a) b) Porcentaje de recuperacin Coeficiente de variacin

Los resultados se compararon con los siguientes criterios de aceptacin: a) b) Porcentaje de recuperacin: %R: 98.00% - 102.00% Coeficiente de variacin: %CV menor o igual a 2.0%

PRECISIN Precisin Intermedia Se calcul el % de coeficiente de variacin, el cual tiene un criterio de aceptacin menor o igual al 2%.

Repetibilidad Se calcul: El porcentaje de coeficiente de variacin, el cual tiene un criterio de aceptacin no mayor al 2%. El porcentaje de recuperacin, el cual tiene un criterio de aceptacin del 98 al 102%.

ESPECIFICIDAD Se compararon las respuestas obtenidas del producto sin degradar con las respuestas obtenidas con el producto degradado por los diferentes mtodos. Los agentes de degradacin presentaron otra respuesta obtenida con las muestras no degradadas. El mtodo de anlisis es especfico porque los productos de degradacin aparecieron en diferentes tiempos de retencin en que eluyeron los analitos de inters para la materia prima y el Jarabe A; sin embargo para la Guaifenesina en el Jarabe B no era especfico este mtodo.

53

LINEALIDAD Linealidad del sistema Se determin la ecuacin de la regresin lineal (y = a + bx) calculada por el mtodo de mnimos cuadrados basada en lecturas (y) versus concentracin (x). Se evalu con p = 0.05. Se demostraron los resultados de: a) Ecuacin de la recta b) Coeficiente de correlacin r c) Coeficiente de determinacin r2 d) Grfica de linealidad e) Intervalo de confianza f) Intervalo de confianza Se presentaron los resultados de los criterios de aceptacin: a) Coeficiente de correlacin r mayor o igual a 0.990 b) Coeficiente de determinacin r2 mayor o igual a 0.980 c) El intervalo de confianza de la pendiente () no debe de incluir el cero

Linealidad del mtodo Se determin la ecuacin de la regresin lineal (y = a + bx) la cual debe ser calculada por el mtodo de mnimos cuadrados basado en lectura (y) versus concentracin (x). La evaluacin se realiz con p = 0.05. Se demostraron los resultados de: a) Ecuacin de la recta b) Coeficiente de correlacin r c) Coeficiente de determinacin r2 d) Grfica de linealidad e) Intervalo de confianza f) Intervalo de confianza

54 Se presentaron los resultados de los criterios de aceptacin: a) Coeficiente de correlacin r mayor o igual a 0.990 b) Coeficiente de determinacin r2 mayor o igual a 0.980 c) El intervalo de confianza del intercepto () debe de incluir el cero Despus de realizadas todas las pruebas se emiti la conclusin de cada caracterstica de validacin.

55

8.

RESULTADOS

8.1 PARMETRO DE EXACTITUD Los resultados que se obtuvieron en la exactitud de la materia prima se resumen en la siguiente tabla y se pueden observar en anexos de los cuadros No.1, 6, 11 y 16. TABLA No.1 EXACTITUD PARA EL MTODO DE ANLISIS DE CUANTIFICACIN DE CLORFENIRAMINA MALEATO, DEXTROMETORFANO BROMHIDRATO, FENILEFRINA CLORHIDRATO Y GUAIFENESINA Parmetro estadstico Concentracin 01 Concentracin 02 Nominal 80.00 % 100.00 % Valor medio 81.026200 100.495333 Coeficiente de variacin 0.105581 0.080164 % Recupe. 101.28% 100.49% Valor medio 80.074400 99.565133 Coeficiente de variacin 0.050058 0.021945 % Recupe. 100.01% 99.56% Valor medio 80.055033 98.631700 Coeficiente de variacin 0.161277 0.081733 % Recupe. 100.068% 98.63% Valor medio 80.659167 99.848600 Coeficiente 0.078580 0.117413 de variacin % Recupe. 100.82% 99.84%

Materia prima Clorfeniramina Maleato

Concentracin 03 120.00 % 120.192000 0.143847 100.16% 119.731667 0.688070 99.78% 119.497000 0.637414 99.58% 119.690667 0.695644 99.74%

Dextrometorfano Bromhidrato

Fenilefrina Clorhidrato

Guifenesina

Los resultados que se obtuvieron en la exactitud de las materias primas que componen los Jarabes A y B se resumen en la siguiente tabla y se pueden observar en anexos de los cuadros No. 21, 22, 23, 36, 37 y 38.

56

TABLA No. 2 EXACTITUD PARA EL MTODO DE ANLISIS DE CUANTIFICACIN DE CLORFENIRAMINA MALEATO Y DEXTROMETORFANO CLORHIDRATO EN JARABE A Y B Parmetro estadstico Nominal Valor medio Coeficiente de variacin % Recupe. Nominal Valor medio Coeficiente de variacin % Recupe. Concentracin 01 Concentracin 02 Concentracin 03 Dextro. Clorfe. Dextro. Clorfe. Dextro. Clorfe. 100.00% 100.00% 120.00% 120.00% 150.00% 150.00% 97.822867 93.876100 121.235667 120.238000 149.101333 148.531667 0.746033 0.745059 2.269117 97.82% 93.88% 101.03% 80.00% 80.00% 100.00% 80.845767 80.926000 100.458133 0.548386 101.06% 0.199305 101.16% 1.021266 100.46% 2.007170 100.20% 100.00% 99.948067 1.523579 99.95% 0.470224 0.210020 99.40% 99.02% 120.00% 120.00% 121.003000 121.120667 0.651161 100.84% 0.688135 100.93%

Jarabe

TABLA No. 3 EXACTITUD PARA EL MTODO DE ANLISIS DE CUANTIFICACIN EN FENILEFRINA CLORHIDRATO EN JARABE A Y GUAIFENESINA EN JARABE B Parmetro estadstico Concentracin 01 Concentracin 02 Concentracin 03 Nominal 100.00 % 120.00 % 150.00 % Valor medio 99.087600 121.275667 149.324667 Coeficiente de variacin 0.482636 2.350996 0.952139 % Recupe. 99.09% 101.06% 99.55% Nominal 80.00 % 100.00 % 120.00 % Valor medio 93.031700 113.751333 109.107667 Coeficiente de variacin 0.243840 1.114107 17.24 % Recupe. 116.29% 113.75% 90.93%

Jarabe A
Fenilefrina Clorhidrato

B
Guaifenesina

57

8.2 PARMETRO DE PRECISIN 8.2.1 REPETIBILIDAD Los resultados que se obtuvieron en la repetibilidad de las materias primas se resumen en la siguiente tabla y se pueden observar en anexos de los cuadros No. 3, 8, 13 y 18.

TABLA No. 4 REPETIBILIDAD PARA EL MTODO DE ANLISIS DE CUANTIFICACIN DE CLORFENIRAMINA MALEATO, DEXTROMETORFANO BROMHIDRATO, FENILEFRINA CLORHIDRATO Y GUAIFENESINA Parmetro estadstico Nmero de datos Valor medio Desviacin estndar Coeficiente de variacin (%) Intervalo de confianza Clorfeniramina Dextrometorfano Fenilefrina Clorhidrato Maleato Bromhidrato 6 6 6 102.593 102.297 99.912 1.959 1.910% 0.54 % 1.948 1.904% 0.54% 1.650 1.651% 0.45%

Guaifenesina 6 102.169 1.889 1.849% 0.52%

58 Los resultados que obtuvieron en la repetibilidad de las materias primas que componen los jarabes A y B se resumen en la siguiente tabla y se pueden observar en anexos de los cuadros No. 27, 28, 29, 42, 43 y 44.

TABLA No.5 REPETIBILIDAD PARA EL MTODO DE ANLISIS DE CUANTIFICACIN DE CLORFENIRAMINA MALEATO, DEXTROMETORFANO BROMHIDRATO, Y FENILEFRINA CLORHIDRATO EN JARABE A Parmetro estadstico Nmero de datos Valor medio Desviacin estndar Coeficiente de variacin (%) Intervalo de confianza Clorfeniramina Dextrometorfano Fenilefrina Maleato Bromhidrato Clorhidrato 6 6 6 97.482 99.405 99.912 0.461 0.473% 0.13% 0.554 0.558% 0.15% 1.650 1.651% 0.45%

TABLA No.6 REPETIBILIDAD PARA EL MTODO DE ANLISIS DE CUANTIFICACIN DE CLORFENIRAMINA MALEATO, DEXTROMETORFANO BROMHIDRATO, Y GUAIFENESINA EN JARABE B Parmetro Clorfeniramina Dextrometorfano Guaifenesina estadstico Maleato Bromhidrato Nmero de Datos 6 6 6 Valor medio 103.398 106.257 112.802 Desviacin estndar 1.361 1.509 1.444 Coeficiente de variacin (%) 1.316% 1.42% 1.280% Intervalo de 0.37% 0.42% 0.40% confianza

59 8.2.2 PRECISIN INTERMEDIA Los resultados que se obtuvieron en la precisin intermedia de la materia prima se resumen en la siguiente tabla y se pueden apreciar en anexos de los cuadros No. 2, 7, 12 y 17.

TABLA No. 7 PRECISIN INTERMEDIA PARA EL MTODO DE ANLISIS DE CUANTIFICACIN DE CLORFENIRAMINA MALEATO, DEXTROMETORFANO BROMHIDRATO, FENILEFRINA CLORHIDRATO Y GUAIFENESINA Condiciones: 2 analistas, 1 instrumento, 2 das Parmetro estadstico Valor medio Desviacin estndard Coeficiente de variacin (%): Nmero de datos Clorfeniramina Maleato 101.2958 0.0147 1.4520 14 Dextrometorfano Bromhidrato 101.1500 0.0188 1.8607 14 Fenilefrina Clorhidrato 99.4384 0.01209 1.2162 14

Guaifenesina 101.1584 0.0147 1.4511 14

60 Los resultados que se determinaron en la precisin intermedia de las materias primas que componen los Jarabes A y B se resumen en la siguiente tabla y se pueden apreciar en anexos de los cuadros No. 24, 25, 26, 39, 40 y 41. TABLA No. 8 PRECISIN INTERMEDIA PARA EL MTODO DE ANLISIS DE CUANTIFICACIN DE CLORFENIRAMINA MALEATO, DEXTROMETORFANO BROMHIDRATO Y FENILEFRINA CLORHIDRATO EN JARABE A Condiciones: 2 analistas, 1 instrumento, 2 das Parmetro estadstico Valor medio Desviacin estndard Coeficiente de variacin (%): Nmero de datos Clorfeniramina Maleato 97.0278 0.0316 2.00 12 TABLA No. 9 PRECISIN INTERMEDIA PARA EL MTODO DE ANLISIS DE CUANTIFICACIN DE CLORFENIRAMINA MALEATO, DEXTROMETORFANO BROMHIDRATO, Y GUAIFENESINA EN JARABE B Condiciones: 2 analistas, 1 instrumento, 2 das Parmetro estadstico Valor medio Desviacin estndard Coeficiente de variacin (%): Nmero de datos Clorfeniramina Maleato 100.7985 1.8911 1.8761 12 Dextrometorfano Bromhidrato 99.3392 2.0885 2.000 11 Dextrometorfano Bromhidrato 102.4180 0.0191 1.8638 12 Fenilefrina Clorhidrato 106.3059 0.0146 1.3774 14

Guaifenesina 100.1422 1.2948 1.2929 14

61

8.3 PARMETRO DE LINEALIDAD 8.3.1 LINEALIDAD DEL SISTEMA Los resultados que se determinaron en la linealidad del sistema de la materia prima se resumen en la siguiente tabla y se pueden observar en anexos de los cuadros No. 4, 9, 14 y 19.

TABLA No. 10 RESULTADOS DE LA PRUEBA DE LINEALIDAD DEL SISTEMA PARA CLORFENIRAMINA MALEATO, DEXTROMETORFANO BROMHIDRATO, FENILEFRINA CLORHIDRATO Y GUAIFENESINA Clorfeniramina Maleato Y= 26034882.26 X + -1551.90 0.999 0.998 Dextrometorfano Bromhidrato Y= 19120775.44 X + 29244.89 0.999 0.998 Fenilefrina Clorhidrato Y= 24036572.52 X + 20429.01 0.999 0.998

Resultados Ecuacin de la recta Coeficiente de correlacin r Coeficiente de determinacin r2

Guifenesina Y= 32252697.33 X + 560546.31 0.999 0.998

62 8.3.2 LINEALIDAD DEL MTODO Los resultados que se obtuvieron en la linealidad del mtodo de las materias primas se resumen en la siguiente tabla y se pueden observar en anexos de los cuadros No. 5, 10, 15 y 20. TABLA No. 11 RESULTADOS DE LA PRUEBA DE LINEALIDAD DEL MTODO PARA CLORFENIRAMINA MALEATO, DEXTROMETORFANO BROMHIDRATO, FENILEFRINA CLORHIDRATO Y GUAIFENESINA

Resultados Ecuacin de la recta Coeficiente de correlacin r Coeficiente de determinacin r2

Clorfeniramina Maleato Y= 27845729.04X + 26.32 1.000 1.000

Dextrometorfano Bromhidrato Y=34782588.49 X -2020.49 1.000 1.000

Fenilefrina Clorhidrato Y= 25237131.95 X -19.56 1.000 1.000

Guaifenesina Y= 34782588.49 X -2020.49 1.000 1.000

63 Los resultados que se obtuvieron en la linealidad del mtodo de las materias primas que constituyen los Jarabes A y B se resumen en la siguiente tabla y se pueden observar en anexos de los cuadros No. 33, 34, 35, 48, 49 y 50. TABLA No. 12 RESULTADOS DE LA PRUEBA DE LINEALIDAD DEL METODO PARA CLORFENIRAMINA MALEATO, DEXTROMETORFANO BROMHIDRATO, FENILEFRINA CLORHIDRATO EN JARABE A

Resultados Ecuacin de la recta Coeficiente de correlacin r Coeficiente de determinacin r2

Clorfeniramina Maleato Y= 27845729.04 X + 26.32 1.000 1.000

Dextrometorfano Bromhidrato Y= 34782588.49 X -2020.49 1.000 1.000

Fenilefrina Clorhidrato Y= 25236571.88 X + 11.09 1.000 1.000

TABLA No. 13 RESULTADOS DE LA PRUEBA DE LINEALIDAD DEL MTODO PARA CLORFENIRAMINA MALEATO, DEXTROMETORFANO BROMHIDRATO Y GUAIFENESINA EN JARABE B

Resultados Ecuacin de la recta Coeficiente de correlacin r Coeficiente de determinacin r2

Clorfeniramina Maleato Y= 27845729.04 X + 26.32 1.000 1.000

Dextrometorfano Bromhidrato Y= 34782588.49 X -2020.49 1.000 1.000

Guaifenesina Y= 34782588.49 X -2020.49 1.000 1.000

64

8.4 PARMETRO DE ESPECIFICIDAD Se determin la especificidad trabajando con muestras de materia prima de los principios activos Clorfeniramina Maleato, Dextrometorfano Bromhidrato, Fenilefrina Clorhidrato y Guaifenesina y tambin con muestras de producto terminado de los Jarabes A y B. Se sometieron a temperaturas y reacciones cidas (cido clorhdrico), bsicas (hidrxido de sodio), oxidacin (agua oxigenada) y reduccin (bisulfito de sodio). Se enfriaron las muestras y se ajust el pH a neutro de todas las muestras y luego se inyectaron en el equipo. En el mtodo analtico aplicado puede distinguirse la respuesta de las sustancias de inters del resto de los dems componentes de una muestra al comparar los resultados de muestras que contengan el analito junto con resultados de muestras que no contengan dicho analito. Ningn producto de degradacin eluye en el mismo tiempo de retencin de los picos de los analitos de inters.

65

9.

DISCUSIN DE RESULTADOS

PARMETRO DE EXACTITUD En los resultados de la exactitud para la materia prima en la tabla No. 1, la Clorfeniramina Maleato, Fenilefrina Clorhidrato, Dextrometorfano Bromhidrato y Guaifenesina, demuestran una recuperacin de la adicin de estndar a la matriz de los jarabes alrededor del 100% en la mayora de los resultados obtenidos esto es debido a que estn dentro del rango de aceptacin de 98 102%, por lo que hay concordancia entre el valor experimental y el valor verdadero adicionado. El coeficiente de variacin obtenido en la evaluacin de este parmetro para cada uno de los principios activos es menor al 2%, tal como lo establece el lmite de aceptacin. Con relacin al Jarabe A en la tabla No.2, en las tres concentraciones que fueron analizadas el Dextrometorfano Bromhidrato y Clorfeniramina Maleato muestran un porcentaje de recuperacin dentro del criterio de aceptacin y en la concentracin de 120% el coeficiente de variacin est un poco arriba del criterio de aceptacin se puede considerar dentro del rango de aceptacin. En la tabla No.3, la Guaifenesina correspondiente al Jarabe B, indica que no cumple con este parmetro porque se obtuvo un porcentaje de recuperacin mayor al lmite permitido (102%) en las tres concentraciones en que se evalu este principio activo. Esto demuestra una posible interferencia de la matriz de excipientes del Jarabe B, la cual eluye en el mismo tiempo de retencin que el pico de Guaifenesina.

PARMETRO DE PRECISION Este parmetro se evalo con dos pruebas: la repetibilidad y la precisin intermedia. Para la repetibilidad en la materia prima en la tabla No. 4 se observ que se obtuvo el valor medio o porcentaje de recuperacin en el lmite permitido (102%) para los principios activos Clorfeniramina Maleato (102.593%), Dextrometorfano Bromohidrato (102.297%) y

66 Guaifenesina (102.169%), estos valores al aproximarlos estn dentro del criterio de aceptacin, el cual debe ser de 98-102%. Al evaluar las muestras observadas en la tabla No. 5, Clorfeniramina Maleato, Dextrometorfano Bromohidrato y Fenilefrina Clorhidrato del Jarabe A, mostraron un porcentaje de recuperacin y coeficiente de variacin dentro de los criterios establecidos para este parmetro, lo que indica que al analizar varias veces la misma muestra por un mismo analista, en el mismo da y equipo cromatogrfico se obtienen datos con error relativo menor al 2%, el cual es debido a los errores en la preparacin de la muestra inherentes al analista y tambin el error probable al momento de la inyeccin en el equipo automuestreador, el cual tiene una desviacin estndar menor al 2% al momento de inyectar cualquier muestra. Los resultados de cuantificacin de los analitos estn alrededor del 98 al 102%, lo que indica que el mtodo de anlisis da resultados confiables con un 2% de variacin, alrededor de la concentracin al 100%. Para el Jarabe B los resultados descritos en la tabla No.6, indican que fueron analizadas las muestras de Clorfeniramina Maleato, Dextrometorfano Bromhidrato y Guaifenesina, las cuales presentaron un valor promedio que est fuera del rango del porcentaje de recuperacin establecido, debido posiblemente a que durante el procedimiento de fabricacin de las muestras se les adicion un pequeo porcentaje de exceso de principios activos para evitar prdidas durante el proceso de fabricacin, lo cual pudo provocar obtener valores de cuantificacin fuera del rango del 98 102%. Al realizar el ensayo de precisin intermedia se evalu como afectan al mtodo analtico la variacin de circunstancias ajenas a la metodologa analtica como la influencia de la preparacin de muestras por otro analista tomando en cuenta que cada persona trabaja de forma diferente adicionando errores inherentes a la preparacin de las muestras o estndares y la influencia de la variacin del da de anlisis. Al examinar las muestras de la materia prima segn la tabla No. 7, indica que los resultados del coeficiente de variacin estn dentro del criterio de aceptacin menor o igual a 2%; el Jarabe A en la tabla No. 8 y el Jarabe B en la tabla No. 9, tambin cumplen con este criterio al mantener todos los

67 resultados en este rango. Por lo que indica que el mtodo de anlisis de estos principios activos no se ve afectado por la variacin de analistas y el da en que se analice.

PARMETRO DE LINEALIDAD DEL SISTEMA La respuesta del equipo cromatgrafo lquido de alta resolucin (en absorbancia) ante las diferentes concentraciones (mg/mL) demostr un coeficiente de correlacin (r) de 0.999 lo que muestra que hay relacin entre las mediciones y las concentraciones de los analitos. El coeficiente de determinacin (r2) obtenido 0.998 demuestra que la curva de regresin se ajusta a los valores experimentales de las mediciones evaluadas. Entonces, la respuesta del equipo demostr ser directamente proporcional a las distintas concentraciones y por ello lineal en este rango de concentraciones, para todos los principios activos analizados.

PARMETRO DE LINEALIDAD DEL MTODO El ensayo de cuantificacin para las materias primas analizadas en la tabla No.11, mostr un coeficiente de correlacin r y un coeficiente de determinacin r2 aproximado a 1.000. En la tabla No.12, con respecto para la Fenilefrina en el Jarabe A es 0.999 en el coeficiente de correlacin r y 0.998 para el coeficiente de determinacin r2. Si los resultados son proporcionales entre las concentraciones del analito y respuesta, se considera que el mtodo es satisfactorio como sucede para la Guaifenesina en el Jarabe B de la tabla No. 13, que se obtuvo 1.000 para el coeficiente de correlacin r y para el coeficiente de determinacin r2. Al trabajar a las diferentes concentraciones indicadas tanto en las materias primas como en los Jarabes A y B, el coeficiente de correlacin refleja un grado de relacin lineal entre la respuesta del equipo y la variacin proporcional de las concentraciones.

PARMETRO DE ESPECIFICIDAD Este parmetro evalu si la respuesta del equipo era especfica para los analitos que no resultan ser afectados por la presencia de impurezas o excipientes. En la prctica se realiz

68 con las materias primas y los productos farmacuticos. Sometiendo para ello los estndares y muestras del Jarabe A y B a reacciones de oxidacin, reduccin, cidas y alcalinas y acelerando la cintica de las mismas por medio de calor, esto con el fin de generar productos de degradacin tanto de los principios activos como de excipientes. El mtodo es especfico para la cuantificacin de los principios activos en las materias primas en el Jarabe A, puesto que aunque hubo degradacin de los analitos de inters y se generaron productos de degradacin ninguno de estos eluy en el mismo tiempo de retencin que los principios activos, mas sin embargo no demostr ser especfico para la determinacin de Guaifenesina en el Jarabe B, debido a que se produce un compuesto de degradacin el cual eluye al mismo tiempo de retencin del principio activo por lo que interfiere en la cuantificacin exacta del mismo y se suma a la lectura detectada por el equipo. Se observ una reduccin en la concentracin de las materias primas y de los analitos en las muestras debido a la degradacin provocada al someterlos a condiciones de temperatura, oxidacin, reduccin y pH.

69

10.

CONCLUSIONES

1. Se desarroll y valid un mtodo analtico por cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) que cumpli con los requerimientos y normas ICH y Farmacopea Estadounidense (USP 2006) para la cuantificacin de tres principios activos contenidos en dos medicamentos. 2. Se dise un mtodo de anlisis selectivo para la cuantificacin de Maleato de Clorfeniramina, Bromohidrato de Dextrometorfano y Fenilefrina Clorhidrato utilizando cromatografa lquida de alta resolucin como tcnica. 3. Se determin y demostr que la metodologa propuesta cumple con los parmetros de linealidad, exactitud, repetibilidad, precisin intermedia y especificidad segn lo establece la Farmacopea Estadounidense (USP) y Normas de Validation of Analitical Procedures ICH. 4. Se proporcion una metodologa validada que se utiliza como gua a la industria farmacutica para la cuantificacin de estos principios activos y considerando que si se emplea en otros productos debe ser ensayada y validada nuevamente. 5. El mtodo de anlisis cumple con el parmetro de repetibilidad para el anlisis de Clorfeniramina Maleato, Dextrometorfano Bromohidrado y Fenilefrina en el Jarabe A y B, porque se obtuvo un coeficiente de variacin menor al 2% al evaluar varias muestras con la metodologa analtica a validar. 6. El mtodo utilizado demostr ser lineal cuando se trabaja a concentraciones de 60% al 140% para cada uno de los principios activos analizados, lo que significa que al trabajar en dicho rango la respuesta del equipo ser directamente proporcional a las concentraciones del analito.

70 7. El mtodo validado demostr no ser especfico y exacto para la cuantificacin de Guaifenesina en el Jarabe B, porque los productos de degradacin del mismo interfieren con su anlisis, no as para la cuantificacin de los analitos en materia prima y el Jarabe A ya que en los cromatogramas obtenidos para estas muestras, no se presentan picos de compuestos de degradacin que eluya en el mismo tiempo de retencin que los analitos de inters. 8. El mtodo de anlisis para la cuantificacin de materia prima y en Jarabes comerciales A y B, por cromatografa lquida de alta resolucin, cumple con los parmetros de precisin intermedia, linealidad del sistema y linealidad del mtodo. 9. El mtodo de anlisis para la cuantificacin de los principios activos y de los productos terminados Jarabe A y B, demostraron ser precisos cuando existan variaciones dentro del laboratorio como la preparacin de muestras por diferentes analistas y el desarrollo del anlisis en diferentes das. 10. La linealidad del sistema es aceptable en el mtodo de anlisis aplicado ya que los resultados presentan concordancia entre las concentraciones y las absorbancias por lo que se considera lineal.

71

11.

RECOMENDACIONES

1. Utilizar en todo el anlisis del ensayo septas en los viales de los estndares y muestras, de la misma clase para evitar la evaporacin de los solventes y que existan variaciones por problemas con la inyeccin de las muestras al no ser perforadas por la jeringa de la manera adecuada. 2. Colocar un estndar al principio, cada 6 muestras y al final de la cuantificacin de los principios activos y del producto terminado. 3. Desgasificar los solventes y el agua HPLC cada vez que se analiza y se utiliza el equipo. 4. Establecer la tcnica correcta de emplear las pipetas volumtricas al liberar el solvente, es decir sin soplar ni dar golpes. 5. Antes de iniciar el anlisis cuantitativo de los compuestos o de los jarabes realizar los clculos respectivos de la cantidad de fase mvil necesaria para el anlisis y las diluciones. 6. Buscar un mtodo alternativo para la cuantificacin de la Guaifenesina en el Jarabe B en el cual no interfieran los productos de degradacin o la matriz de dicho jarabe. 7. Si este mtodo pretenden utilizarlo otras empresas para cuantificacin de jarabes expectorantes es necesario tomar en cuenta que los parmetros de exactitud, especificidad y linealidad del mtodo se deben evaluar para el jarabe que se desea cuantificar debido a los posibles interferentes de los excipientes empleados.

72 p

12.

REFERENCIAS

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13. ANEXOS

13.1 GLOSARIO Mtodo analtico: Adaptacin especfica de una tcnica analtica para un propsito de medicin seleccionado. Procedimiento analtico: Forma en que se realiza el anlisis. Debe describir en detalle los pasos necesarios para realizar cada prueba analtica. Validacin de un mtodo analtico: Proceso que establece, mediante estudios en laboratorio, que las caractersticas de desempeo del mtodo, cumplen los requisitos para las aplicaciones analticas previstas. Parmetros de desempeo analtico: Caractersticas de validacin que necesitan ser evaluadas y que tpicamente corresponden a la siguiente lista: exactitud, precisin, especificidad, linealidad e intervalo de linealidad. Exactitud del mtodo: Es la capacidad del mtodo analtico para dar resultados lo ms prximos posibles al valor verdadero. Si la diferencia entre el valor hallado y el valor verdadero es pequea, la exactitud es buena. Una diferencia grande significa que la exactitud es inadecuada y revela la existencia de errores determinados que deberan corregirse. La exactitud se expresa como un porcentaje de recuperacin de la cantidad de analito presente en la muestra o bien en la forma de diferencia entre el valor hallado y el valor verdadero. Linealidad: Es la capacidad de un mtodo analtico de obtener resultados linealmente proporcionales a la concentracin de analito en la muestra, dentro de un intervalo determinado.

77 Intervalo de linealidad: mbito o rango entre la menor y la mayor concentracin de analito en la muestra (incluyendo estas concentraciones) para las cuales se ha demostrado que el procedimiento analtico tiene el nivel adecuado de precisin, exactitud y linealidad. Precisin del mtodo: Es el grado de concordancia entre los valores de una serie repetida de ensayos analticos efectuados sobre una muestra homognea o expresado de otra forma, la distribucin de los valores analticos alrededor de su media. Precisin intermedia: Es un trmino introducido recientemente y expresa la precisin dentro de un laboratorio cuando se emplea una muestra homognea y se analiza con una o ms condiciones diferentes, es decir diferentes analistas, o en das diferentes, o en equipos diferentes, etc. La precisin intermedia refleja las condiciones reales de un laboratorio. Repetibilidad: Es la medida de la precisin de un mtodo efectuado en las mismas condiciones, sobre la misma muestra, por un mismo analista, en el mismo laboratorio, con los mismos aparatos y reactivos, y en el curso de la misma serie de anlisis efectuados, generalmente en un corto intervalo de tiempo. Especificidad: Es la capacidad de evaluar sin equivocarse el analito en la presencia de los componentes que pueden suponerse se encuentren presentes, como impurezas, productos de degradacin y componentes de la matriz.

13.2 DESCRIPCIN DE CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN (HPLC) Las razones de la popularidad de esta tcnica son su sensibilidad, su fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas y su idoneidad para la separacin de especies no voltiles o termolbiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial inters en la industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad.

78 Algunos ejemplos para su utilizacin incluyen: aminocidos, protenas, cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, frmacos, terpenoides, plaguicidas, antibiticos, esteroides, especies organometlicas y una variedad de sustancias inorgnicas. Para evaluar la importancia de la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), es necesario distinguir entre los dos papeles que desempea la tcnica. El primer papel consiste en separar y el segundo en determinar los componentes separados. Los datos proporcionados por la seal del detector se utilizan generalmente para el anlisis cuantitativo y semicualitativo: 1. Alturas de los picos o sus reas dan informacin cuantitativa. Se comparan las reas de los estndares en las calibraciones. 2. Tiempos de retencin para la identificacin semicualitativa. No es cualitativo debido a que el tiempo de retencin puede coincidir con otro compuesto diferente en las mismas condiciones de anlisis cromatogrfico. Para la eleccin de la fase mvil se requiere el uso de fases mviles de dos o ms componentes. El tipo de cromatografa elegida y los detectores disponibles afectan en la eleccin de los lquidos que se utilizan en la composicin de la fase mvil. Generalmente la eleccin de la fase mvil depende de la solubilidad y estabilidad de la muestra, la cantidad de muestra, tipo de separacin que se requiere y pureza de la muestra. Las columnas (fase estacionaria) para cromatografa de lquidos se construyen de ordinario con tubo de acero inoxidable de dimetro interno uniforme. Las ms comunes se encuentran empacadas con esferas de resina. La eleccin de la fase estacionaria depende de diversos factores, como las caractersticas y la complejidad de la muestra y del tipo de separacin elegido. El detector de uso ms corriente es esencialmente el espectrofotmetro UV que puede trabajar a una longitud de onda fija o bien permitir la seleccin de la longitud de onda dentro de un intervalo determinado. Si se conocen las propiedades de los compuestos a separar es fcil de seleccionar el detector y la longitud de onda. Si los compuestos absorben dentro del intervalo del detector, se escoge esta longitud de onda. Aunque lo

79 mejor es conocer el espectro UV de los componentes de la muestra. Tambin es

conveniente usar informacin bibliogrfica pues es posible elegir la longitud de onda apropiada basndose en el trabajo efectuado por otros analistas con compuestos similares. Un detector ideal para HPLC debe poseer todas las propiedades listadas a continuacin: 1. Adecuada sensibilidad. 2. Buena estabilidad y reproducibilidad del detector al inyectar la misma muestra. 3. Respuesta lineal. 4. Tiempo de respuesta corto. 5. Alta fiabilidad y manejo sencillo. 6. Respuesta semejante para todos los analitos, o una respuesta selectiva y altamente predecible para una o ms clases de analitos. 7. No destructivo de la muestra (18).

80