TEMA: CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS 3.3.

1 INTRODUCCION Y CROMATOGRAFIA EN PAPEL Y CAPA FINA MTODOS CROMATOGRAFICOS La cromatografa es un proceso fisico dinamico en el cual las sustancias que componen una mezcla son separadas debido a sus diferentyes afinidades por dos sustancias a las que se denomina fases, una es fija o estacionaria y la otra movil. La fase movil puede ser liquida dando origen a un grupo de tecnicas conocidas como cromatografa liquida o puede ser un gas, en el cual el caso de la tecnica fundamental se conoce como cromatografa de gases. Ambas tecnicas son de inmenso valor para el analista de alimentos. Cromatografa LIQUIDA La cromatografa liquida es una tecnica de separacion en la cual los compuestos son repartidos entre dos fases: una estacionaria que tiene una gran superficie y una fase liquida movil que fluye sobre la fase estacionaria. La fase estacionaria puede ser un solido activo o liquido inmvil. De acuerdo con la seleccin de la fase movil, el tipo de partcula que se usa en la fase estacionaria y las condiciones de operacin, los componenrtes de la mezcla viajaran a diferentes velocidades, debido a lo cual son separados. La cromatografa liquida se puede dividir en cuatro tipos prioncipales: cromatogafia de absorcin o cromatografa liquido/ slido basada principalmente en las diferencias de afinidad relativa de de los compuestos por el adsorbente slido usado como fase estacionaria. Las separaciopnes que se obtienen se determinan casi totalmente por interacciones polares. Cromatografa de particin o cromatografa liquido/liquido, esta basada en las caracteristicas de solubilidad relativa de los solutos entre la fase movil y una fase estacionaria liquida. La fase liquida impregna un soporte poroso inerte. La cromatografa de intercambio ionico esta basada en la afinidad de los iones en solucion por los sitios de polaridad opuesta en la fase estacionaria. La cromatografa de exclusin la cual se conoce tambin como permeacion de gel, filtracin por gel o tamizado molecular, se base en la capacidad de materiales

de porosidad regulada para separar los componentes de una mezcla de acuerdo al tamao y forma de las molculas. Los principios de la cromatografa liquida se aplican en cuatro tcnicas analticas, cromatografa en papel, cromatografa en capa fina , cromatografa en columna y cromatografa liquida de alta presion. Cromatografas en papel y en capa fina La cromatografa en papel es una forma de cromatografa d4e particin combinada con cromatografa de adsorcion, en la cual la fase estacionaria es el agua absorbida y adsorbida que hay en el papel y el soporte es el mismo papel. La fase movil es una solucion que consiste en un disolvente o de una mezcla de varios liquidos que contiene agua. Sobre el papel se seca una gota de extracto de la muestra. Para evitar evaporacin se cuelga el papel dentro de una camara en forma tal que la mancha pueda ser irrigada con la fase movil, tanto hacia abajo por gravedad, hacia arriba u horizontalmente por capilaridad. Cuando la fase movil ha saturado el papel hasta una distancia predeterminada para lograr la separacion, se saca el papel de la camara y se desarrolla el cromatograma por aspersin de sustancias, que lo hagan visible. En el caso de sustancias coloridas, tales como colorantes para alimentos, la separcion puede ser evidente sin el uso de agentes reveladores. Las sustancias no polares tambin se pueden separar cubriendo el papel con compuestos no polares y utilizando disolventes polares como fase movil. La cromatografa de en papel es una tecnica barata, pero por lo general lenta, con limitaciones por el uso de agentes que se rocian, algunas de las cuales pueden destruir rapidamente el papel. Las manchas tienden a ser difusas. La cromatografa en capa fina de adsorbentes se ha mejorado (Stahl y Kaltenbach; 1961) usando sustancias pulverizadas que se adhieren al vidrio. Esto ha permitido usar otros soportes con diferntes propiedades, por ejemplo slice y kieselguhr. Se dispone de aparatos para recubrir placas de vidrio para la CCF*, pero ahora se estan usando ampliamente placas de vidrio prerecubiertas, pelculas plasticas rigidas y hojas delgadas de aluminio, existentes en el comercio. La CCF* es mas sensible, adaptable y rapida que la cromatografa en papel y las separaciones cromatograficas son ms eficientes y pueden ser semicuantitativas. Se pueden preparar o adquirir en el comercio

placas que no contengan materia orgnica y produciendo la visualizacion de las manchas por carbonizacin con acido sulfurico. Puede ser muy efectiva la visualizacion bajo luz UV despus de haber rociado la placa con un reactivo fluorescente, cuando los compuestos que se han separado destruyen o modifican la fluorescencia. La CCF es el mtodo mas barato y a menudo el mejor para aislar e identificar componentes menores de los alimentos. El componente separado puede ser raspado de la placa, extraido del material de sta y despus sometido a analisis por espectrometria o por cromatografa gas liquido. ** La CCF puede ser totalmente cuantitativa, como en la determinacin de acido erucico. Se cuenta con una revision reciente de la cromatografa en capa fina. Ms recientemente se ha aplicado la tecnologa usada en la preparacin del empaque con microparticulas para columna en la cromatografa liquida a alta presion a la CCF introduciendo la llamada Cromatografa en Capa Fina Alta Presion (HPTLC)* (CCFAP) . Se cuenta con placas prerrecubiertas para CCFAP quen presentan resolucion y sensibildad ms elevadas que las placas normales. Estas placas requieren cargas menores de la muestra y se pueden realizar ms pruebas por placa con menores corridas de desarrollo (30 a 60 mm) y los analisis son mas rapidos. La alta resolucion de los geles de slice con microparticulas que se usan, posibilitan la CCF cuantitativa directa. Ha aparecido una revision

INTRODUCCIN En esta prctica se pretenden identificar los componentes de una disolucin. Esta puede estar formada por tres compuestos, naftaleno, veratrol o acetanilida, siendo las cantidades de cada compuesto desconocidas para

nosotros siendo la mezcla completamente aleatoria. Para ello el mtodo a utilizar ser la cromatografa. Con este mtodo experimental podremos separar los componentes de una disolucin desconocida para luego compararlos con diferentes disoluciones patrn. La tcnica a utilizar no se corresponde de manera especfica con su nombre, puesto que no apreciaremos ninguna diferencia de color entre los diferentes componentes. El nombre de la tcnica deriva de los primeros ensayos en los que se separaron pigmentos de plantas como la clorofila, los cuales tienen colores definidos. Estos primeros pasos los dio el botnico ruso de origen italiano Mijail Tswett cuando separo diversos pigmentos de las plantas. La tcnica se basa en la velocidad de desplazamiento diferencial de los solutos al ser arrastrados por una fase mvil sobre una estacionaria que puede ser slida o liquida. Esta diferencia ser la que nos permita tanto identificar cuantos componentes tiene una disolucin como separarlos. FUNDAMENTO TERICO La cromatografa es la tcnica que separa una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al ser arrastrados por una fase mvil (liquida o gaseosa) a travs de un lecho cromatogrfico que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser slida o lquida. Hay que indicar que el nombre de la tcnica es incorrecto, ya que no consiste en escribir con colores. Este nombre proviene de la primera experiencia cromatogrfica realizada, la cual se utilizo para separar pigmentos coloreados de plantas. La cromatografa fue descubierta por el botnico ruso de origen italiano Mijail Tswett en 1903. Tswett separo los pigmentos de las plantas (clorofila) vertiendo extracto de hojas verde en ter de petrleo sobre una columna de carbonato de calcio en polvo en el interior de una probeta. No obstante, no existen datos sobre la utilizacin de esta tcnica hasta 1930 cuando khun y Lederer separaron tambin pigmentos de las plantas usando

como adsorbentes almina y carbonato de calcio. Fue a partir de ah cuando se inicio el verdadero desarrollo de la cromatografa. Para explicar el fenmeno cromatorgafico es necesario establecer dos tipos de fundamento, uno remoto y otro prximo Fundamento remoto: Este fundamento se encuentra en alguna o algunas propiedades fsicas o fsico qumicas de los analitos: solubilidad, adsorcin (tendencia a ser retenidos en slidos finamente divididos), volatilidad, tamao, carga, reactividad qumica o bioqumica, etc. La mezcla de sustancias a separar se coloca en una situacin experimental dinmica donde exhiben dos de estas propiedades, o bien una de ellas pero por duplicado tal como la solubilidad en dos lquidos diferentes como ocurre en cromatografa liquido liquido. Deben cumplirse las condiciones siguientes: - Los componentes de los sistemas empleados deben estar en intimo contacto entre si. - El equilibrio establecido entre esos componentes debe ser lo mas completo posible. Fundamento prximo: Se encuentra en el hecho de que es muy improbable que dos especies presenten cuantitativamente el mismo par de propiedades fsicas o fsico - qumicas frente a un sistema cromatogrfico dado. Por tanto, en estas diferencias, que pueden ser muy pequeas, se basa la separacin cromatogrfica. Si se transforma la idea del equilibrio esttico establecido entra las dos fases en un equilibrio dinmico, se tiene la realidad del fenmeno cromatogrfico. Como se ha indicado anteriormente, una de las fases, denominada fase mvil, fluye a travs de la otra, a la que se denomina fase estacionaria, que permanece inmvil, y que, al menos en una extensin esta en equilibrio con la fase mvil. Las propiedades de los componentes de una mezcla determinan so movilidad entre si y con respecto a la fase mvil. Se eligen las condiciones

experimentales y las fases cromatogrficas para que los componentes de la mezcla se muevan a distinta velocidad. La base de la separacin cromatogrfica ser, por tanto, la diferencia en la velocidad de migracin de los mismos. La cromatografa es probablemente la ms verstil de las tcnicas de separacin: es aplicable a cualquier mezcla soluble o voltil. De hecho las tcnicas de separacin y no suelen dividirse La en dos grandes de una grupos: tcnica cromatograficas cromatograficas. eleccin

cromatogrfica concreta depender de la naturaleza y cantidad de la muestra, del objetivo de la separacin y de las limitaciones del tiempo y equipo asequible Puede hacerse una primera distincin entra las tcnicas cromatogrficas atendiendo a la integracin continua o no del sistema de deteccin. As, la cromatografa no conlleva a un sistema de deteccin, mientras que cualquier cromatgrafo de lquidos o gases lleva incorporado dicho sistema siendo, por tanto, autnticos instrumentos. Clasificaciones: Para clasificar globalmente los procesos cromatogrficos es necesario atender a dos criterios bsicos: Fundamento del proceso cromatogrfico, lo que conduce a los tipos de cromatografas Forma de realizar el proceso cromatogrfico, es decir, lo que constituye las distintas tcnicas cromatogrficas Tipos de cromatografas: Si es un slido, cabe distinguir entre: Cromatografa de adsorcin: El slido adsorbe al componente que inicialmente estaba en fase mvil (liquida o gaseosa) (Fuerzas de Van der Waals)

Cromatografa de cambio inico: el slido es un cambiador de iones (fuerzas electrostticas) Cromatografa de exclusin (o de geles), el slido es un gel formado por polmeros no inicos porosos que retienen a las molculas de soluto segn su tamao. Cromatografa de afinidad: es un tipo especial de cromatografa de absorcin, utilizada especialmente en bioqumica, en la que un slido tiene enlazado un llamado ligando de afinidad que puede ser por ejemplo, un indicador enzimtico o un anticuerpo Si es un lquido que se encuentra soportado en un slido inerte, se trata de la Cromatografa de particin. El soluto se reparte entra la fase mvil (liquido o gas) y la fase estacionaria. Segn la naturaleza de la fase mvil, la tcnica cromatogrfica correspondiente recibe el nombre de dicha fase mvil: Si es un lquido, cromatografa liquida, cabe distinguir:

Cromatografa liquido-liquido (CLL) en la que ambas fases son liquidas y, por tanto, se trata de una cromatografa de particin.

Cromatografa liquido-slido (CLS) en la que la fase estacionaria es slida (adsorcin, cambio inica, exclusin, afinidad).

Si es un gas, cromatografa de gases, puede ser:

Cromatografa gas-liquido (CGL), que es una cromatografa de particin.

Cromatografa gas-slido (CGS), que es una cromatografa de adsorcin. Si es un fluido supercrtico, (fluido calentado a una temperatura superior

a la temperatura crtica, pero simultneamente comprimido a una presin

mayor que su presin critica), se trata de la cromatografa de fluidos supercrticos (CFS), que puede ser de particin o de adsorcin. Tcnicas cromatogrficas: Segn la forma de llevar a cabo la separacin cromatogrfica, es decir, segn el dispositivo utilizado para conseguir entre la fase mvil y la estacionaria, cabe distinguir dos tipos de tcnicas cromatograficas: en columna y plana. Cromatografa en columna: Se utiliza un tubo cilndrico, en cuyo interior se coloca la fase estacionaria y a su travs se hace pasar la fase mvil. El flujo de la fase mvil (liquido o gas) a travs de la estacionaria se consigue: 1)por presin, 2)por capilaridad, 3) por gravedad. Es de destacar que en la actualidad, aunque incorrectamente, el trmino de cromatografa en columna suele aplicarse a la cromatografa liquida para distinguirla de la cromatografa plana ya que, obviamente la cromatografa de gases solo puede realizarse en columna. Cromatografa plana: La fase estacionaria esta colocada en una superficie plana que en realidad es tridimensional, aunque una de sus dimensiones es muy reducida, por lo que puede considerarse bidimensional. Se divide en dos tipos generales:

Cromatografa en papel: en la que el papel acta como soporte de la fase estacionaria (cromatografa de particin).

Cromatografa en capa fina: en la que un slido acta como fase estacionaria (cromatografa de particin), se extiende en una capa delgada sobre una placa, generalmente de vidrio. El flujo de la fase mvil puede conseguirse de dos formas: 1) por

capilaridad (cromatografa horizontal y ascendente) y 2) por capilaridad y gravedad (cromatografa descendente). En la cromatografa plana queda excluido el uso de un gas como fase mvil, por lo que sta siempre es lquida.

Cromatografa plana: La cromatografa plana es un tipo de cromatografa liquida en la que la fase estacionaria esta extendida sobre la superficie de un plano y la fase mvil fluye a travs de ella. La fase mvil siempre es un lquido, mientras que la fase estacionaria puede ser un lquido soportado en un slido (cromatografa de particin) o un slido sorbente (cromatografa de adsorcin, cambio inico o exclusin). El flujo de la fase mvil se produce: Por capilaridad (cromatografa horizontal y ascendente) Por capilaridad y gravedad (cromatografa descendente) Esta clase de cromatografa es considerada la ms simple de todas las tcnicas cromatograficas. La diferencia principal con la cromatografa en columna es de tipo tcnico, es decir, difieren en la forma de soportar la fase estacionaria. En lo que se refiere al fenmeno en que se fundamenta la separacin, es el mismo para ambas tcnicas En la cromatografa plana, la disolucin de la muestra a separar se sita sobre el plano que contiene la fase estacionaria en forma de mancha, o a veces de banda, a corta distancia de uno de los extremos de dicho plano. Una vez seca la mancha o banda, el extremo del plano prximo a la misma se pone en contacto con la fase mvil, manteniendo todo el sistema cromatogrfico en una cmara cerrada. La separacin se produce por migracin diferencial de los componentes de la muestra en la direccin en que se mueve la fase mvil. Generalmente, a diferencia de la cromatografa en columna, en cromatografa plana el analito no abandona el lecho cromatogrfico, de forma que el proceso se detiene cuando la fase mvil ha alcanzado una determinada zona del plano. Cabe distinguir dos tipos de cromatografa plana: En papel (CP) y en capa fina (CCF).

La cromatografa en papel tuvo su mximo desarrollo en, os aos cincuenta pero en la actualidad se encuentra prcticamente eclipsada debido a la mayor rapidez, eficacia y versatilidad de la cromatografa en capa fina. Aproximadamente solo el 4% de las publicaciones sobre las distintas tcnicas cromatogrficas se dedican a la cromatografa en papel. En esta tcnica, la celulosa acta como soporte de la fase estacionaria que suele ser agua (cromatografa de particin). No obstante, tambin existen en el comercio papeles impregnados (v.i. como gel de slice o almina, con silicona para separaciones en fase invertida, con cambiadores ionicos) o tratadas qumicamente (v.i. grupos cambiadores incorporados al esqueleto polimrico de la celulosa), que amplan la aplicabilidad de esta tcnica. En cromatografa en capa fina, un slido, sorbente o soporte de la fase estacionaria, se extiende en forma de capa sobre el plano de una superficie rgida, normalmente una capa de vidrio o polietileno, de forma que la fase mvil fluye a travs del mismo. Dependiendo de las caractersticas del slido utilizado, la cromatografa ser de particin, adsorcin, cambio inico o exclusin. Hasta hace relativamente poco tiempo, la (CCF) era considerada una tcnica cualitativa simple y rpida, para separar mezclas no demasiado complejas, pero su aplicabilidad cuantitativa resultaba una pobre alternativa frente a otras tcnicas cromatogrficas como la CLAR. Sin embargo, actualmente, debido a los cambios introducidos en esta tcnica, en lo que se refiere a la calidad de los solventes, equipos para aplicar y la muestra y sistemas de deteccin, el inters por la CCF ha vuelto a renacer, siendo considerada una tcnica til para separar y determinar cualitativa y cuantitativamente mezclas complejas a nivel de trazas. Estos cambios han llevado a modificar el nombre de la tcnica, denominada cromatografa en capa fina de alta resolucin (CCFAR o HPTLC en la bibliografa inglesa), al igual que ocurri cuando se mejoro la capacidad de resolucin de la cromatografa liquida en columna, pasando a denominarla cromatografa liquida de alta resolucin (CLAR o HPLC)

http://html.rincondelvago.com/cromatografia_2.html

CROMATOGRAFA DE CAPA FINA Historia El botnico ruso Mikhail Tswett estableci las ventajas de la cromatografa y qu el primero en utilizar este trmino. Es recordado como el Padre de la Cromatografa. Ismailov y Scraiber utilizaron lminas de vidrio para colocar capas muy delgadas de almina y luego aplicaron extractos vegetales, dando as la primera forma de Cromatografa de Capa Fina. Egon Stahl (1956) di el nombre de Cromatografa de Capa Fina. Estandariz los procedimientos, equipos y adsorbentes dando un auge a la tcnica simple, a bajo costo y eficiente. Proceso de Adsorcin La muestra aplicada en la capa es adsorbida en la superficie del material por la accin de fuerzas electrostticas (fuerzas de Van der Waals, puentes de Hidrgeno, efectos inductivos, etc). Luego, cuando la capa es expuesta a un flujo por accin capilar, se inicia una competencia de enlaces entre los sitios activos del adsorbente y la sustancia con el solvente. Adsorbentes Los adsorbentes ms utilizados en la Cromatografa de Capa Fina son:

Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones) xido de Aluminio Almina (cida, neutra bsica)

Tierra Silcea Kieselguhr Celulosa (Nativa o micro-cristalina) Poliamidas

Estos adsorbentes deber tener las siguientes caractersticas:

Tamao de Partcula
o o o

Volumen de Poro Dimetro de Poro rea Superficial

Homogeneidad Pureza

Preparacin de la Placa Cromatogrfica Se usan como soporte del adsorbente lminas de: Vidrio, Plstico Metlicos (Ej.: Aluminio). Los tamaos de la placa para TLC convencional son: 20 cm. x 20 cm; 10 cm x 20 cm y 5 cm x 2 cm. Hay placas que contienen un indicador de Fluorescencia: F254 F366. El nmero que aparece como subndice nos indica la longitud de onda de excitacin del indicador utilizado. Aplicacin de la muestra La muestra se aplica en la placa segn el objetivo: Analtico Preparativa en:

Banda Punto Mancha

Desarrollo de la Placa Es un proceso mediante el cual son trasportados a travs de la fase estacionaria por la fase mvil. Eleccin del Solvente

Cmaras para Desarrollo Existen varios tipos de cmaras:

Normal Doble Compartimiento Sndwich Horizontal Vario KS U

Deteccin Visualizacin Si la muestra (mancha) no es coloreada se requiere de mtodos que nos permitan visualizar el(los) componente(s) presentes. Tambin se conoce este procedimiento como Revelado. Estos mtodos son:

Qumicos (por inmersin o rociado). Se obtienen derivados Fsicos (pticos). Generalmente se utiliza radiacin UV

coloreados o fluorescentes

Evaluacin de un Cromatograma de Capa Fina Anlisis Cualitativo

Medida de Rf Comparacin Visual de Color/Intensidad Propiedades UV/IR/MS/NMR

Anlisis Cuantitativo

Semi-cuantitativo
o

Comparacin visual del dimetro y la intensidad del

color de la mancha contra una serie de manchas patrones de concentracin conocida

Cuantitativo
o o

Indirecta Directa

Densitometra

Medida de Transmisin. Medida de luz Medida de Emisin. Medida de luz

transmitida a travs de la substancia.

reflejada desde la substancia

Espectrofotometra

Fluorescencia Fluorescencia con "quenching"

http://www.relaq.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/Thin.htm

CROMATOGRAFA EN CAPA FINA INTRODUCCIN Las tcnicas cromatogrficas se emplean para separar los componentes individuales de una mezcla y, en ciertos casos, para identificar un compuesto comparando su comportamiento cromatogrfico con el de sustancias conocidas empleadas como patrn. La base de la tcnica es que cuando un determinado soluto interacta con dos fases, una de ellas, habitualmente slida, llamada fase estacionaria, experimenta una serie de procesos (adsorcin en fase slida, solubilizacin en cada fase, arrastre por la fase mvil, etc.) que, en ltimo extremo, llevan a que el soluto se reparta entre ambas fases. En el equilibrio, la relacin entre las concentraciones del soluto entre ambas fases es constante, y se denomina coeficiente de reparto. Si en una mezcla, cada componente tiene un coeficiente de reparto diferente del de los otros, la separacin ser buena. Naturalmente, dicho coeficiente depende de la naturaleza de las fases, as como de las condiciones de la cromatografa.

Una de las tcnicas cromatogrficas ms sencillas es la que se realiza en capa fina, llamada as porque la fase estacionaria es una capa fina de un material poroso (gel de slice, almina, etc.) extendida para su manejo mecnico sobre un soporte inerte. La fase mvil es una mezcla de disolventes en diferentes proporciones, que emigra por la fase estacionaria debido, sobre todo, a la capilaridad. En su movimiento, arrastra ms o menos a los componentes de una mezcla en funcin de sus mayores o menores coeficientes de reparto. El coeficiente de reparto es poco empleado en la prctica. En su lugar, y relacionado con l, se emplea el denominado Rf, caracterstico de cada sustancia, definido como la relacin entre la distancia que recorre dicha sustancia y la que recorre la fase mvil. Las ms insolubles tendrn, en el disolvente empleado, un Rf prximo a cero, mientras las ms solubles se acercarn a uno. La cromatografa en capa fina se puede emplear para separar distintos grupos de biomolculas. En esta prctica, emplearemos aminocidos, pero podran emplearse los distintos fosfolpidos obtenidos de la yema de huevo de la prctica 2, o los azcares de la 1. Lgicamente, en cada caso cambiara la fase mvil empleada y los reactivos reveladores. Para aminocidos, la placa se revelar mediante la reaccin con ninhidrina, reaccin que se explica en la prctica 3.

MATERIAL. Placa fina de celulosa Cubeta para el revelado Pinzas de madera Regla de 20 cm Micropipeta de hasta 10 l Cubeta cromatogrfica Lpiz n 2 Secador de cabello

REACTIVOS. Muestras de aminocidos al 1% Ninhidrina (1mg/ml en acetona)

Fase mvil: n-butanol-acetona- actico-agua (35/35/20/10)

http://www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes/Practicas/Medicina/PracticasLaborat orio/Practica05.htm

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