Introducción

El método de secuenciación por dideoxinucleótido, mejor conocido como el

método Sanger se basa en el proceso biológico de la replicación del DNA. El
método de secuenciación ideado por Sanger está basado en el empleo de
dideoxinucleótidos que carecen de uno de los grupos hidroxilo, de manera que
cuando uno de estos nucleótidos se incorpora a una cadena de DNA en
crecimiento, está cadena no va a poder continuar elongándose. Esto es así ya
que la DNA polimerasa necesita un terminal 3’ OH para añadir el siguiente
nucleótido y el dideoxinucleótido incorporado carece de este grupo hidroxilo. El
método comienza una vez se aísla y se clona el DNA que se desea secuenciar.
Este DNA se desnaturaliza y se emplea una sola hélice en la secuenciación. En la
secuenciación se utiliza un cebador o “primer” que se encarga de suministrar el
terminal 3’OH que necesita la DNA polimerasa. Se preparan cuatro tubos de
reacción, cada uno con el DNA molde de hélice sencilla que se desea secuenciar,
con DNA polimerasa, con el “primer” y con los cuatro nucleótidos trifosfatados.

A cada tubo se le añade una pequeña proporción de un dideoxinucleótido

trifosfato; un tubo con ddATP, otro con ddTTP, el tercero con ddGTP y el cuarto
con ddCTP. En cada uno de estos tubos se producen cadenas de DNA de distintas
longitudes, terminando todas en el lugar en el que se incorporó el
dideoxinucleótido correspondiente añadido al tubo. Los productos de las 4
reacciones, cada una conteniendo una pequeña cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleótidos, son cargados en el gel y sometidos a electroforesis. En este
experimento se realizo una simulación de este método con el propósito de
conocer los procesos básicos de la replicación del DNA y de familiarizarnos con los
procedimientos utilizados para parea la misma.
 Materiales y Métodos

Para esta simulación se dividieron los estudiantes en cuatro grupos. A cada

grupo le toco una reacción distinta; rojo ATP, amarillo GTP, negro CTP, blanco TTP.
Por grupo se repartieron 25 cuentas rojas, 25 cuentas blancas, 25 cuentas negras
y 25 cuentas amarillas, 8 cuentas marcadas con sus respectiva reacción y un
vaso rotulado con el nombre de la reacción. Cada una de estas representa los
nucleótidos del DNA, mientras que las cuentas marcadas representan los
nucleótidos dideoxi. En el vaso rotulado se añadieron las 25 cuentas más las 8
cuentas marcadas. Se comenzó a extraer con la mano y sin mirar una cuenta a la
vez. Si la cuenta que se tomó es complementaria a la base luego del “primer”
presente en el DNA molde ésta se escribe inmediatamente después del “primer”.

Luego de anotar la base correspondiente, la cuenta se devolvió al envase de

reacción. Si la cuenta que se tomó del envase de reacción no es complementaria
a la base presente en el DNA molde, ésta fue devuelta al mismo y se continuó
extrayendo cuentas del envase hasta que se obtuvo una complementaria. Esto
simula el proceso por el cual ocurre la complementariedad de bases al azar. Se
continúo haciendo esto hasta que se sacara una de las cuentas marcadas.
Cuando esto ocurrió la síntesis de la cadena naciente de DNA se detiene. Esta
cuenta representa un dideoxinucleótido. Una vez terminada la síntesis se reinicio
el proceso de secuenciación repitiendo los pasos anteriores hasta que se
obtuvieron al menos 8 segmentos variados que terminen en cada uno de los
dideoxinucleótidos correspondientes. Una vez terminadas las 8 secuencias de
DNA se procedió a leer la electroforesis de cada grupo y se determinó la
secuencia de la cadena de DNA bajo estudio.
Interpretación de los Resultados

1. ¿En la simulación llevada a cabo, qué rol juega su mano?

a. La mano juega el rol de endonucleasa, la cual se encarga de formar el

enlace entre las bases nitrogenadas.

2. ¿Cuál es la función del primer?

a. La función del primer consiste en proveer un terminal OH 3’ a la DNA

polimerasa. Esto es así porque el DNA polimerasa no puede replicar el
DNA si no tiene un terminal OH 3’ al que añadir nucleótidos.

3. ¿Qué proceso biológico es representado por la devolución de las

cuentas no complementarias a la mezcla de reacción (paso 8 del
procedimiento)?

a. El sacar con la mano las cuentas y devolver las cuentas no

complementarias a la mezcla de reacción simula lo que sucedería en el
apareamiento al azar que ocurriría de forma natural en la replicación
de DNA.

4. Determina la secuencia del DNA sintetizado en la figura 5

a. La secuencia del DNA sintetizado en la figura 5 es:

3’ T G C G G G C T T A T C G G G T C T A A 5’

5. ¿Cuál es la secuencia que le da la lectura que aparece en la tabla 2?

a. La secuencia que da la lectura que aparece en la tabla 2 es:

 3’ G G A C G A C T T A T G C A C A T C T G G C A 5’

6. ¿Cuál es la secuencia del DNA molde que se utilizó?

a. La secuencia del DNA molde utilizado es:

3’CTGCTGACGAACGTACTGTGAAGGCACTCATTTAATGGCTACGC 5’

Referencias

• Manual de Laboratorio Genética 2006. Baerga-Santini, Carmen; Cintrón

Isabel; Dávila, Iván. pp. 216-225.

• Conceptos de Genética 5ta Edición 1999. Klug, William.; Cummings,

Michael. pp. 474- 475.
 Universidad de Puerto Rico en Humacao

Facultad de Ciencias Naturales

Departamento de Biología

SIMULACIÓN DEL MÉTODO DE SECUENCIACIÓN DE

SANGER
Sharon M. Boschetti-Medina

801-01-0907

BIOL 3305 Secc. 002

Prof. Baerga