Oncologie (2006) 8 : 267268 Springer 2006 DOI 10.

1007/s10269-006-0370-x

19e Journee du Centre Rene-Huguenin

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Le tissu microarray outil de recherche et / ou de routine dans le cadre des cancers du sein
J. Jacquemier 1,2,5, E. Charafe-Jauffret 1,2,5, C. Ginestier 1, J. Geneix 1, G. Houvenaeghel 3, P. Viens 4, D. Birnbaum 1, F. Bertucci 1,4,5
Departement doncologie moleculaire, institut Paoli-Calmettes, 232, boulevard Sainte-Marguerite, 13009 Marseille, France 2 Departement de biopathologie, institut Paoli-Calmettes 232, boulevard Sainte-Marguerite, 13009 Marseille, France 3 Departement de chirurgie, institut Paoli-Calmettes 232, boulevard Sainte-Marguerite, 13009 Marseille, France 4 Departement doncologie medicale et investigation clinique, institut Paoli-Calmettes, Marseille, France 5 UMR599 Inserm, Marseille Cancer Institute, Marseille, France Correspondance : e-mail : jacquemierj@marseille.fnclcc.fr
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Les differents niveaux de risque metastatique des cancers du sein, sont encore aujourdhui etablis sur des facteurs pronostiques tre s ` classiques comme la taille tumorale, lenvahissement ganglionnaire, les emboles peritumoraux, le grade histopronostique, les re cepteurs hormonaux. Bien que cette determi nation soit deja multifactorielle elle ` reste imparfaite. Pour augmenter la fiabilite de la determination du profil evolutif individuel, il faut se rappro cher le plus possible de la biologie tumorale specifique. Cest ce que tendent a determiner les profils ` dexpression en micro-arrays ou profiling, en etablissant des signa tures pronostiques voire de reponse therapeutique. Ce systeme ` a haut debit est en voie dexpansion, ` il ne prend cependant pas en compte les aspects topographiques, puisquil sagit dune extraction globale de zone tumorale qui peut comporter du tissu normal ou des foyers de carcinome in situ. Enfin cette methode est dependante de la con gelation et ne sapplique pas aux petites lesions. Toutes ces raisons ont conduit les pathologistes a deve` lopper leur propre systeme a haut ` ` debit que constitue le tissu-array ou TMA. Repondant a un veritable ` besoin de validation des profils dexpression au niveau proteique sur un grand nombre dechantillons, la technique du TMA sest imposee comme la technique de transfert de reference. Veritable outil dinterface entre le pathologiste et le biologiste

moleculaire, le TMA permet une validation rapide sur de grandes series de nouveaux facteurs pronos tiques ou la recherche de cibles therapeutiques. Lidee de mettre plu sieurs echantillons sur le meme bloc de paraffine nest pas nouvelle puisquen 1986 Battifora publiait le multitumor (sausage) tissue block , mais elle sest considera blement amelioree depuis par le developpement de ces systemes ` darrays. Les equipes de O.P. Kallio nemi a Bethesda et G. Sauter a Bale, ` ` la technique du TMA ont largement contribue a son rayonnement un ` peu partout et notamment en France [5,6]. Brievement, pour construire un ` TMA, des carottes de tissus inclus en paraffine sont selectionnees a partir ` de coupes colorees correspondan tes. Les carottes pouvant mesurer de 0,6 a 4 mm de diametre, sont ensuite ` ` incluses de maniere orthonormee ` selon un plan preetabli dans un bloc receveur. Lappareil permettant cette operation est appele tissue arrayeur . Ilutilise deux aiguilles de calibre different : une destinee a ` forer le trou receveur, une a biopsier ` le tissu donneur. Selon le diametre ` des carottes, jusqua 1000 cas peu` vent theoriquement etre deposes pour un seul bloc de paraffine. Les coupes de TMA peuvent etre utili se es pour lanalyse in situ des amplifications par technique FISH, mais plus accessoirement pour lexpression en hybridation in situ. La mise en evidence des niveaux

dexpression proteique par immu nohistochimie reste cependant son territoire dutilisation le plus facile que cela soit en fluorescence mais surtout en microscopie optique. Des techniques danalyse automatiques se sont developpees, en fluorescence ou en IHC conventionnelle. Differents systemes existent, ` qui ont en commun la confection dune grille adaptee sur le TMA permettant de retrouver chaque image en fonction de ses coordonnees. Le systeme que nous avons ` acquis dans notre laboratoire est la station inte gre e Spot Browser (Alphelys, 78370 Plaisir). Cepen dant, les fichiers danalyse de TMA deviennent de plus en plus lourds, et lintegration de nouveaux outils statistiques et dinte gration aux bases de donnees sont devenus necessaires. Ces nouveaux syste ` mes plus performants sont enfin sur le marche , ils inte grent mieux ` lanalyse dimage et les bases de donnees patients. Les analyses sta tistiques utilisent ensuite les metho dologies des puces, Clustering hierarchique ou supervise...

TMA outil de recherche

Une des applications possibles du TMA est de permettre de valider sur de plus grandes series les donnees etablies par les puces en micro arrays. La confrontation des deux methodes suggere une importante ` complementarite.

C O M P TE S - R E N D U S

268 Dans la recherche de nouveaux marqueurs comme dans la validation pronostique de marqueurs connus, le TMA vient souvent valider au niveau proteique, une etape de criblage des profils dexpression par ADN microarrays. Cette comple mentarite des deux techniques a ete largement utilisee dans letude de nombreux organes comme la prostate, le rein les cancers colorectaux, thyrodiens, les lymphomes, et le cancer du sein. Dans le cancer du sein, notre equipe a ete une des premieres a ` ` tester la correlation entre ADNc arrays et TMA sur une serie de 15 genes testes sur 55 tumeurs mam` maires [5]. Un tiers des molecules teste es pre sentaient une bonne correlation entre les deux methodes. En revanche, la valeur pronostique de certaines mole cules comme lapomucine MUC1 napparaissait que sur les resultats du TMA, met tant en exergue la necessite dune approche topographique comple mentaire et multimethodologique des parametres testes. ` Quoi quil en soit, il parat de plus en plus evident que le TMA est en train de devenir une sorte dequi valent dADN microarrays pour effectuer un profil dexpression proteique des tumeurs. Le developpe ment conjoint de lanalyse dimage et doutils statistiques va dans ce sens. Cest notamment le cas pour les tumeurs mammaires. G. Callagy a ete le premier a utiliser les metho ` des de clustering sur le TMA pour classer une serie des 107 cancers du sein et de 13 marqueurs. Deux clusters principaux se sont degages en fonction de la positivite ou non ` des recepteurs hormonaux. A partir de ces deux clusters principaux lexpression des cytoke ratines comme les CK 8 / 18 et 5 / 6, CK14... permet de retrouver les sous types precedemment decrits par Perou et Sorlie : basal, HER2, luminal A, luminal B, normal [7]. Cette meme methode dappro che nous a permis e galement detablir une signature pronostique plus large, impliquant 21 proteines [8]. Les patientes conside re es comme de bon pronostic ont une survie globale a cinq ans de 90 ` contre 61 % pour le mauvais pronostic. Cette signature opposee aux parametres cliniques classiques, en ` analyse multivariee, est le para metre predictif le plus fort (RR 2,96 ` p < 0,0001). Nous avons pu ensuite etablir selon les memes methodo logies une signature pour les cancers inflammatoires [2,3,9], et pour les carcinomes medullaires. archive en paraffine pour contribuer a letablissement de signatures cor` respondant a des profils pronosti` ques ou de reponse therapeutique. Ensuite le TMA sera utilise au quoti dien pour maintenir le meilleur niveau possible de reproductibilite de ces nouveaux marqueurs. Le TMA realise par consequent un outil exemplaire du transfert de la recherche a la routine ou pratique ` quotidienne.

ONCOLOG IE

References TMA outil quotidien de controle qualite

En pratique quotidienne le TMA est devenu un outil indispensable au maintien de la qualite en immuno histochimie. Les nouvelles cibles (CKIT, CD20, ERBB2, EGFR1, RE, RP) demandent, pour leur application et pour lefficacite des reponses therapeutiques une fiabilite cons tante. Dans ce sens la confection de TMA dedie integrant les diffe rents cas de figure controles en biologie moleculaire ou en FISH devient fondamentale. Le TMA devient alors un temoin externe du bon fonctionnement de chaque technique. Les variations observees peuvent fournir une aide conside rable a la recherche des parametres ` ` defaillants. Le TMA est maintenant utilise en routine par les associa tions pour le controle de qualite permettant de confier a chacun des ` participants un panel plus large, et plus homogene. Des controles de ` qualite sur la mise en evidence dERBB2 ou des recepteurs hormo naux ont ete largement effectues en ce sens.
1. Bertucci F, Tarpin C, Charafe-Jauffret E, et al. (2004) Multivariate analysis of survival in inflammatory breast cancer: impact of intensity of chemotherapy in multimodality treatment. Bone Marrow Transplant 33: 913-20 2. Bertucci F, Finetti P, Rougemont J, et al. (2004) Gene expression profiling for molecular characterization of inflammatory breast cancer and prediction of response to chemotherapy. Cancer Res 64: 8558-65 3. Bertucci F, Tarpin C, Charafe-Jauffret E, et al. (2004) Multivariate analysis of survival in inflammatory breast cancer: impact of intensity of chemotherapy in multimodality treatment. Bone Marrow Transplant 33: 913-20 4. Bertucci F, Finetti P, Rougemont J, et al. (2005) Gene expression profiling identifies molecular subtypes of inflammatory breast cancer. Cancer Res 65: 2170-8 5. Ginestier C, Charafe-Jauffret E, Bertucci F, et al. (2002) Distinct and complementary information provided by use of tissue and DNA microarrays in the study of breast tumor markers. Am J Pathol 161: 1223 6. Jacquemier J, Ginestier C, CharafeJauffret E, et al. (2003) [Small but high throughput: how tissue-microarrays became a favorite tool for pathologists and scientists]. Ann. Pathol. 23: 623 7. Birnbaum D, Bertucci F, Ginestier C, et al. (2004) Basal and luminal breast cancers: basic or luminous? (review). Int J Oncol 25: 249-58 8. Jacquemier J, Ginestier C, Rougemont J, et al. (2005) Protein expression profiling identifies subclasses of breast cancer and predicts prognosis. Cancer Res 65: 767-79 9. Charafe-Jauffret E, Tarpin C, Ginestier C, et al. (2003) Inflammatory breast carcinoma: towards molecular characterization? Ann Pathol 23: 564-9.

Conclusion
Le TMA est un outil de recherche a ` haut debit developpe dans le cadre des laboratoires de pathologie. Il permet dutiliser le mate riel