DETERMINAO ESPECTROFOTOMTRICA SIMULTNEA DE PARACETAMOL E IBUPROFENO EM FORMULAES FARMACUTICAS USANDO CALIBRAO MULTIVARIADA Camilla Benevides Freitas1,4, Marcelo Martins

de Sena 2,4, Lucas Camilo Silva3,4.

1 2

Bolsista PBIC/UEG Pesquisador 3 Voluntrio Iniciao Cientfica PVIC/UEG 4 Curso de Qumica Industrial, Unidade Universitria de Cincias Exatas e Tecnolgicas, UEG. RESUMO Este trabalho prope um mtodo alternativo para a determinao direta e simultnea de paracetamol e ibuprofeno em formulaes farmacuticas (comprimidos), baseado no uso conjunto de medidas de absoro no ultravioleta e calibrao multivariada. O mtodo quimiomtrico de calibrao usado foi o PLS (mnimos quadrados parciais, Partial Least Squares). O procedimento foi realizado em pH 10.5, nas faixas de concentrao de 3,00 a 15,00 g mL-1 (paracetamol) e de 2,40 a 12,00 g mL-1 (ibuprofeno). O modelo foi capaz de determinar paracetamol e ibuprofeno em misturas sintticas com raizes quadradas dos erros mdios quadrados de previso iguais a 0.12 g mL-1 e 0.17 g mL-1 , respectivamente. Figuras de mrito (sensibilidade, limite de deteco e preciso) foram tambm estimadas. Os resultados obtidos na determinao desses frmacos em duas formulaes farmacuticas comerciais esto de acordo com os valores especificados pelos fabricantes. Palavras-chave: calibrao multivariada; controle de qualidade; quimiometria.

Introduo Nos ltimos anos, a combinao entre mtodos quimiomtricos e tcnicas de espectroscopia molecular apresentou grandes contribuies para a qumica analtica, tornando possvel, por exemplo, a determinao de espcies sem resoluo de sinal analtico. Uma das aplicaes para a qual essa combinao demonstrou importncia foi a determinao direta de frmacos. Por outro lado, a maioria das metodologias oficiais para determinao de frmacos (USP, 2002) baseada em tcnicas cromatogrficas e determinaes univariadas. Apesar dessas metodologias estarem bem estabelecidas e serem reconhecidas pelos organismos reguladores, elas podem apresentar desvantagens em certas situaes, tais como custo e tempo de anlise relativamente altos. Em situaes nas quais a determinao de um analito dificultada ou impedida devido presena de interferentes, o uso de calibrao multivariada permite a modelagem desses interferentes junto com o analito de interesse. A idia central

consiste em substituir a separao fsica das espcies pela separao quimiomtrica de seus sinais. O mtodo de calibrao multivariada mais popular o dos mnimos quadrados parciais (PLS, Partial Least Squares, Brereton, 2000), usado na construo de modelos de regresso baseados em uma decomposio em variveis latentes, a qual relaciona um bloco de variveis independentes, x (espectros), com um bloco de variveis dependentes, y (concentraes ou outras propriedades). A estratgia que combina PLS e dados obtidos por espectrofotometria de absoro no ultravioleta (UV) tem permitido a determinao direta e simultnea de diversos princpios ativos em uma mesma formulao farmacutica (Sena et al., 2000, 2004; Ferraro et al., 2002). As vantagens potenciais desta estratgia so rapidez, reduo de uso de reagentes, baixo custo e simplificao no preparo da amostra. O paracetamol (PRC) e o ibuprofeno (IBF), esto entre os frmacos mais consumidos no mundo. O PRC (El-Obeid & Al-Badr, 1985) possui efeitos analgsico e antipirtico similares aos da aspirina, apresentando a vantagem de no irritar a mucosa gastro- intestinal. O IBF (Higgins et al., 1999) uma droga no-esteroidal anti- inflamatria que tambm possui efeitos analgsico e antipirtico. Algumas formulaes farmacuticas que combinam estes dois princpios ativos so usadas no tratamento de dores moderadas de origem reumtica. Os mtodos oficiais para a determinao das duas espcies so baseados em cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) com deteo no UV (USP, 2002). O fato de PRC e IBF apresentarem espectros de absoro sobrepostos no UV impede que sejam realizadas determinaes espectrofotomtricas diretas e simultneas. Da, o interesse deste trabalho em propor um mtodo direto, simples e de baixo custo para essa determinao, usando o PLS para construir um modelo de calibrao a partir dos espectros de um nmero relativamente reduzido (nove) de solues de misturas de padres. Um outro objetivo deste trabalho estimar figuras de mrito para o mtodo proposto, requisito para a sua validao analtica e a sua futura aceitao por organismos reguladores.

Materiais e Mtodos Duas solues estoque, PRC 1000,0 g mL-1 e IBF 800,0 g mL-1 , foram preparadas em metanol, por causa da baixa solubilidade do IBF em gua. Cinco solues intermedirias de cada analito foram preparadas por diluio em gua. Um espectrofotmetro UV/visvel de arranjo dispersivo Cary 50 foi usado na aquisio dos dados, os quais foram tratados no programa MATLABTM, verso 6.1 (The MathWorks, EUA), usando o pacote PLS Toolbox, verso 2.0 (Eigenvector Technologies, EUA). As solues do conjunto de calibrao foram preparadas de acordo com um planejamento experimental 32 (dois fatores e trs nveis), nas

faixas de 3,00 a 15,00 g mL-1 (PRC) e 2,40 a 12,00 g mL-1 (IBF). As misturas sintticas usadas como conjunto de validao foram preparadas de acordo com um planejamento similar ao anterior, nas faixas de 6,00 a 12,00 g mL-1 (PRC) e 4,80 a 9,60 g mL-1 (IBF). Trs pontos do conjunto de validao, os dois extremos (superior e inferior) e o central, foram determinados em triplicata, visando a estimativa da preciso mdia do mtodo. Desta forma, 24 solues foram preparadas diretamente na cubeta pela adio de 150,0 L da respectiva soluo intermediria de cada analito e 2700 L de uma soluo tampo de pH 10,5 (NH4 Cl/NH4 OH). Os espectros foram coletados na faixa de 220 a 320 nm. A ordem em que as solues foram analisadas foi sorteada, de modo a garantir a aleatoriedade das medidas. Uma soluo preparada da mesma maneira que as solues de trabalho, mas no contendo nenhum dos analitos, foi usada como branco. Espectros do branco foram medidos 15 vezes em seqncia, visando estimar o rudo instrumental para o clculo de figuras de mrito. Duas amostras de formulaes farmacuticas comerciais foram analisadas, as quais apresentaram a mesma composio, especificada pelos fabricantes: 300 mg de PRC e 200 mg de IBF. A amostra 1 tinha a seguinte composio de excipientes: estearato de magnsio, amido de milho, Explotab, gelatina em p, Microcel, talco e corante vermelho. A amostra 2 no especificou a composio de excipientes. Dez comprimidos de cada formulao foram pesados individualmente para se obter massas mdias representativas, finamente triturados e ento misturados. Massas correspondentes a exatamente 50,0% do valor mdio de um comprimido para cada amostra foram dissolvidas em 100 mL de metanol, com o auxlio de um banho ultrassnico. Na seqncia, f ram preparadas duas solues intermedirias pela o diluio de 10,00 mL da soluo de cada amostra em gua, em bales de 100,0 mL. Alquotas de 150,0 L de cada soluo intermediria foram misturadas diretamente na cubeta com 150,0 L de gua e 2700 L da soluo tampo de pH 10,5. Os espectros destas solues foram obtidos da maneira j descrita e as determinaes foram feitas em triplicatas.

Resultados e Discusso Espectros de absoro no UV de PRC e IBF Como pode ser observado na Figura 1, o espectro do PRC possui uma banda larga com absoro mxima em 252 nm, enquanto o IBF apresenta um mximo em 222 nm e uma banda de baixa intensidade de absoro entre 245 e 280 nm. Desta forma, a sobreposio espectral, principalmente em relao ao IBF, impede o uso de calibrao univariada em uma determinao direta e simultnea. Os valores de pKa encontrados na literatura (El-Obeid; Al-Badr, 1985; Higgins et al., 1999; Tam; Takacs-

Novak, 2001) para o PRC e o IBF esto prximos de 9,5 e de 4,4, respectivamente. A fo rma cida do PRC, predominante abaixo de pH 9,5, apresenta um mximo de absoro em 243 nm (espectro obtido experimentalmente em pH 7), aumentando a sobreposio espectral com o IBF. Por esse motivo, escolheu-se trabalhar em pH 10,5 usando tampo amnia, que no absorve significativamente na regio de interesse.

Figura 1. Espectros de absoro no UV do PRC e do IBF obtidos em pH 10,5. [PRC] = [IBF] = 12,00 g mL-1 Calibrao multivariada usando PLS - O melhor modelo PLS foi selecionado com trs variveis latentes atravs de um procedimento de validao cruzada (leave-one-out). Este modelo explicou 99,99% da varincia total do bloco X e 99,95% da varincia do bloco Y. Os valores de raiz quadrada dos erros mdios quadrados de previso (RMSEP, Root Mean Squares Error of Prediction) obtidos foram 0,12 g mL-1 para o PRC e 0,17 g mL-1 para o IBF, correspondendo a uma recuperao que variou entre 98,4 e 103,7 % para o PRC e entre 96,9 e 104,8 % para o IBF. Os resultados para a previso do IBF foram menos exatos do que os relativos ao PRC, o que pode ser explicado pelo fato de o espectro do primeiro ser mais fortemente sobreposto. Figuras de mrito - A validao pode ser acessada pela determinao de parmetros que so conhecidos como figuras de mrito, tais como sensibilidade, preciso e limite de deteco. Na estimativa de figuras de mrito em calibrao multivariada (Braga & Poppi, 2004) a parte do sinal que se relaciona unicamente ao analito de interesse mais importante que o sinal total e denominada sinal analtico lquido ou NAS (Net Analyte Signal). O NAS definido como a parte do sinal analtico que ortogonal ao sinal dos interferentes presentes na amostra (Lorber et al., 1997). A sensibilidade (SEN), a frao da variao do sinal associada ao acrscimo de uma unidade de concentrao, pode ser expressa pela seguinte equao: SEN = NAS (1)

A sensibilidade analtica (), normalmente no abordada em protocolos de validao, apresenta, de forma clara, a sensibilidade do mtodo em funo da unidade de concentrao

que utilizada. Em analogia com a calibrao univariada (Cuadros-Rodriguez et al., 1993), definida como a razo entre a SEN e o rudo instrumental (), de acordo com a Equao 2. O vetor contm o desvio padro do sinal analtico em cada comprimento de onda e, neste trabalho, foi estimado a partir de quinze replicatas do branco. = SEN / (2)

O limite de deteco (LD), a menor quantidade da espcie de interesse que pode ser detectada sob as condies experimentais estabelecidas, estimado atravs da seguinte equao: LD = 3 / NAS (3)

A preciso expressa o grau de concordncia entre os resultados de uma srie de medidas feitas para uma mesma amostra homognea, em condies determinadas. Neste trabalho, ela foi considerada no nvel de repetibilidade, a partir de nove determinaes (trs nveis de concentraes e trs replicatas) cobrindo a faixa til de previso do modelo (os dois nveis extremos mais o central). A exatido para mtodos mltivariados costuma ser expressa atravs de valores de RMSEP, os quais j foram apresetados na seo anterior. A Tabela 1 mostra as figuras de mrito estimadas para as determinaes do PRC e do IBF. Como o inverso da fornece a diferena de concentrao mnima que discernvel pelo mtodo analtico, independente da tcnica especfica empregada, pode-se estimar que o mtodo capaz de distinguir diferenas de concentrao de 0,01 g mL-1 de PRC e de 0,03 g mL-1 de IBF, na ausncia de erro experimental. As estimativas de sensibilidade analtica e de preciso mdia obtidas atestaram a eficincia do modelo. Tabela 1. Figuras de mrito na determinao simultnea de PRC e IBF usando o modelo PLS Figuras de mrito
SEN (mL g-1 ) LD (g mL-1 ) preciso mdia (g mL-1 )

PRC
0,24 92 0,03 0,14 33

IBF
0,09

0,09 0,19

Determinao de amostras comerciais - Duas formulaes farmacuticas disponveis no mercado brasileiro foram analisadas. Os resultados das previses so mostrados na Tabela 2. As diferenas em relao aos valores especificados pelos fabricantes variaram entre 3,8 e 8,4%. Estes resultados podem ser considerados em acordo com o especificado, levando-se em conta o limite de tolerncia de 10% estabelecido pela Farmacopia americana para este tipo de frmaco (USP, 2002).

Tabela 3. Determinao simultnea de PRC e IBF em duas formulaes farmacuticas Formulao Valor especificado (mg) mtodo proposto (mg)a PRC #1 #2
a

IBF 200 200

PRC

IBF

300 300

279,0 4,2 189,5 4,2 274,8 3,5 192,5 2,6

Valores mdios e desvios padro de trs determinaes.

Concluso A combinao de PLS e espectrofotometria no UV mostrou-se uma alternativa vivel e de relativo baixo custo para a determinao simultnea de PRC e IBF, fornecendo previses exatas e precisas para misturas sintticas e amostras de formulaes comerciais. Alm disso, a estimativa de figuras de mrito, tais como sensibilidade e limite de deteco, atestaram a eficincia do mtodo, o qual pode ser sugerido como uma possvel alternativa para o controle de qualidade destes frmacos neste tipo de formulao farmacutica. O mtodo poderia ainda ser automatizado em um sistema de injeo em fluxo, o que levaria a outras vantagens, tais como maior rapidez e diminuio dos erros devido menor manipulao das amostras.

Referncias - Braga, J. W. B.; Poppi, R. J. 2004. Quim. Nova 27: 1004. - Brereton, R. G. 2000. Analyst 125: 2125. - Cuadros-Rodriguez, L.; Garca -Campaa, A. M.; Jimenez-Linares, C.; Romn-Ceba, M. 1993. Anal. Lett. 26: 1243. - El-Obeid, H. A.; Al-Badr, A. A. 1985. In Analytical Profiles of Drug Substances 14, Florey, K., ed.; pp. 551. - Ferraro, M. C. F.; Castellano, P. M.; Kaufman, T. S. 2002. J. Pharm. Biomed. Anal. 30: 1121. - Higgins, J. D.; Gilmor, T. P.; Martelucci, S. A.; Bruce, R. D.; Brittain, H. G. 1999. In Analytical Profiles of Drug Substances and Excipients 28; Florey, K., ed.; pp. 282. - Lorber, A.; Faber, K.; Kowalski, B. R. 1997. Anal. Chem. 69: 1620. - Sena, M. M.; Fernandes, J. C. B.; Rover Jr, L.; Poppi, R. J.; Kubota, L. T. 2000. Anal. Chim. Acta 409: 159. - Sena, M. M.; Chaudhry, Z. F.; Collins, C. H.; Poppi, R. J. 2004. J. Pharm. Biomed. Anal. 36: 743. - Tam, K. Y.; Takacs-Novak, K. 2001. Anal. Chim. Acta 434: 157. - The United States Pharmacopoeia, 25a rev., 2002. U.S.P. Convention: Rockville.