I P N

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniera Campus Guanajuato

Ingeniera en Biotecnologa Grupo 3BM1

Laboratorio de Mtodos Cuantitativos

Reporte*Prctica*#10
SEPARACIN DE LOS PIGMENTOS DE LA HOJA DE ESPINACA MEDIANTE CROMATOGRAFA EN CAPA FINA Y COLUMNA 11/11/2011

INTEGRANTES*DEL*EQUIPO:

!"Amparo!Baltazar!Lpez"2011660162 "Misael!Horacio!Silva!Juarez"2011660220 "Soto!Martnez!Erick!No"!2011660270

! Objetivo. Introducir*al*alumno*al*estudio*de*la*tcnica*de*separacin*analtica*de*cromatogra5a*en*capa* 5ina* (CCF).* Aprendiendo* los* fundamentos* de* sta,* los* factores* que* en* ella* intervienen* y* su* aplicacin* en* la* puri5icacin*e* identi5icacin* de* sustancias.* Aplicar* los* conceptos* de* la* CCF* para*determinar*los*valores*de*RF*para*varias*sustancias*correlacionando*este*concepto*con*la* seleccin*adecuada*del*eluyente. ! Marco.Terico. Las*plantas*verdes*y*algunos*microorganismos*que*abundan*en*la*super5icie*terrestre*llevan*a* cabo* un*proceso* llamado* fotosntesis,* por* el* cual,* mediante* la*energa* solar,* transforman*el* bixido* de* carbono* en* carbohidratos* como* la* glucosa* y* su* polmero* el* almidn,* que* son* compuestos* con* alto* contenido* en* energa* qumica* y,* por* ello,* estos* seres* vivos* son* productores*primarios*de*los*ecosistemas.*La*glucosa*formada*es*utilizada*por*ellos*mismos*y* por*otros* seres*vivos*durante*el*proceso*de*respiracin,* en*el* cual* se*oxida*hasta*CO2* y*H2O,* obteniendo*as*la*energa*necesaria*para*llevar*a*cabo*sus*diversas*funciones.*(Rise,'1994) Para* atrapar* la* energa* solar* e* iniciar* el* proceso* de* transformacin* de* energa* luminosa* a* energa* qumica,* las* plantas* superiores* contienen* en* sus* clulas* un* organelo* llamado* cloroplasto,*en*donde*se*encuentran*los*llamados*centros*de*reaccin,*formados*por*protenas* y* diversos* pigmentos,* en* especial* las* cloro5ilas.* Las* cloro5ilas* a" y* b" se* encuentran* en* las* plantas* y*las* bacteriocloro5ilas* a"o*b"se*encuentran*en*las*bacterias*fotosintticas.*Adems*de* estas* molculas,* los* organismos* fotosintticos* tienen* otros* pigmentos* con* capacidad* para* absorber* luz.* Los* pigmentos* accesorios* incluyen* por* ejemplo* a* los* carotenos,* xanto5ilas,* antocianinas*y*otras*molculas*con*colores* caractersticos,*estas* sustancias*son*coloridas*por* el*nmero*elevado*de*dobles*ligaduras*conjugadas*que*poseen,*lo*que*permite*que*las*excite*la* radiacin*con*longitud*de*onda*en*la*regin*del*visible.* La*cloro5ila*absorbe*bien*en*la*regin* del* rojo* y* el* azul* y* muy* poco* en* la* zona* del* verde.* Las* plantas* que*contienen*cloro5ila* son* verdes*porque*la*luz*verde*se*re5leja,*no*se*absorbe.**(Consden, 1995) Estos* pigmentos* no* son* solubles* en* agua,* pero* pueden* extraerse* con* solventes* orgnicos* cuando* las* clulas* que*los* contienen*se*rompen.*Los*extractos*tienen,* adems* de*pigmentos,* grasas* y* algunos* otros* compuestos* incoloros.* Entre*los* tipos* de*pigmentos* ms*solubles* en* solventes* orgnicos,* se* encuentran* las* cloro5ilas* (azulNverde)*y* los* carotenoides* (amarilloN naranja).* Algunos* colores* rosas* y* rojos* en* las* plantas* (por* ejemplo* en* el* betabel,* la* col* morada,*la*jamaica*y*en*las*5lores)*se*deben*a*xantocianinas,*las*cuales*si*son*solubles*en*agua* y*no*se*extraen*con*solventes*orgnicos*y*pueden*ser*identi5icas*por*tcnicas*cromatogr5icas.* (Wilcox,'1995) La*IUPAC*de5ine*a*la*cromatogra5a,*como*un*mtodo*5sico*de*separacin*mediante*el*cual*los* componentes* de*una*mezcla*se*separan*por*distribucin* entre*dos* fases:*una* estaN* cionaria*

(FE)* y* otra* mvil* (FM).* El* proceso* de* separacin* de* cada* sustancia* es* el* resultado* de* un* equilibrio*entre*dos*conjuntos*de*fuerzas*contrapuestas:*las*de*propulsin,*promovidas*por*el* 5lujo* de* la* fase* mvil* y* las* fuerzas* de* retencin,* originadas* por* la*fase* estacionaria.De*este* modo,* cada* sustancia* migra* de* forma* diferencial,* conforme* a* sus* propias* caractersticas* 5sicas*y*al*tipo*de*fuerzas*intermoleculares*que*pueda*establecer*con*ambas*fases. (IUPAC.'Pure'Appl.'Chem.'1993) Fase.estacionaria* es* la*sustancia*que*est*5ija*en*una*posicin*y* puede*ser*empaquetada*en* una*columna,*extendida*en*una*capa,*distribuida*como*una*pelcula,*etc. Fase. mvil* es* la* fase* que* se* mueve* en* una* direccin* de5inida,* de* forma* que* la* muestra* interacciona* con* la* fase* estacionaria* y* se* separa.* Puede* ser* un* lquido,* un* gas* o* un* 5luido* supercrtico.* La* fase* mvil* consiste* en* la* muestra* que* est* siendo* separada/analizada* y* el* disolvente,*que*se*mueven*por*el*interior*de*la*columna.* Los*componentes*de*la*mezcla*interaccionan*en*distinta*forma*con*la*fase*estacionaria,* por*lo* cual,* los* componentes* atraviesan* la* fase* estacionaria* a* distintas* velocidades* y* se* van* separando Las* distintas* tcnicas* cromatogra5cas* se*pueden* dividir* segn*cmo* est* dispuesta* la* fase. estacionaria:
Cromatogra9a.plana.*La*fase*estacionaria*se*sita*sobre*una*placa*plana*o*sobre*un*papel.*

Las*principales*tcnicas*son: Cromatogra5a*en*papel Cromatogra5a*en*capa*5ina Cromatogra9a.en.columna.*La*fase*estacionaria*se*sita*dentro*de*una*columna.*Segn*el* 5luido*empleado*como*fase*mvil*se*distinguen: Cromatogra5a*de*lquidos Cromatogra5a*de*gases

Cromatogra5a*de*5luidos*supercrticos.(Harris, 2007)

La* cromatogra5a* en* una* columna* de* medio* adsorbente* proporciona* un* medio* para* la* separacin*y*aislamiento*de*los*componentes*de*una*mezcla.*La*muestra*se*aplica*en*la*parte* superior* de* la* columna* y* se* deja* pasar* solvente* a* travs* del* adsorbente.* Este* proceso* desarrolla* el* cromatograma* en* bandas* que* contienen* los* compuestos* individuales;* estas* bandas* pueden* ser* eludas* (arrastradas)* en* secuencia* por* adicin* de* ms* solvente* y* recolectadas*en*fracciones*separadas.* La*columna*se*prepara*y*desarrolla*usando*el*solvente* menos*polar*que*disuelva*a*la*muestra*y*que*permita*el*movimiento*de*los*compuestos*a*una* velocidad* prctica.* Generalmente* es* necesario* ir* cambiando* a* solventes* ms* polares* para* efectuar*la*elusin*de*los*compuestos,*dependiendo*de*los*grupos*funcionales*que*tengan*los* componentes*de*la*mezcla.*(Smith, 1990)

Laboratorio de Qumica Orgnica Aplicada.

Prctica 2. Cromatografa en columna.

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polar que disuelva a la muestra y que permita el movimiento de los compuestos a una velocidad prctica. Generalmente es necesario ir cambiando a solventesResultados efectuar la elusin de los compuestos, ms polares para dependiendo de los grupos funcionales que tengan los componentes de la mezcla. La facilidad de ser eludo msSe* realizo* una* cromatogra5a* polaridad de los grupos funcionales, como se muestra en la Tabla 2.con* la* rpidamente, depender de la menor en* capa* 5ina* y* columna,* utilizando* varios* solventes* El cambio de solventes debe efectuarse gradualmente, mediante mezclas de los solventes (5 a 10% del 5inalidad*de*identi5icar*los*distintos*pigmentos*que*componen*la*planta*de*espinaca*(Spinacia solvente siguiente en polaridad), para evitar que se alteren las zonas que ya han sido desarrolladas oleracea). (separadas). una experiencia.qxd 12/12/2007 10:11 Pgina 48 Las sustancias demasiado polares, como azcares o aminocidos, no pueden separarse de sus mezclas por El* principal* factor* para* controlar* el* movimiento* de* los* diferentes* compuestos* en* un* cromatografa en columna, ya que con los adsorbentes anteriormente mencionados no pueden utilizarse agua cromatograma*es*la*polaridad*del*solvente.* *Entre*ms*polar*sea*un*solvente,*ms*rpido*es*el* o cido actico porque, con estos solventes demasiado polares, el equilibrio componentes-adsorbente se desplaza hacia el de solvente-adsorbente y de ah al de componentes-solvente y, de esta manera, todos los movimiento*de*los*compuestos*y*menos*efectiva*la*separacin. componentes de la mezcla se eluyen simultneamente.

Anales VELOCIDAD RSEQ menos polar

Si bien se han descrito mlti la extraccin directa con ace polaridad, escasa selectivid Tabla 2. Serie eluotrpica de disolventes ordenados de acuerdo a su Tabla%1%Orden%de%polaridad%de%los%grupos%funcionales% Tabla 2. Velocidades relativas de elucin para diferentes grupos funcionales lizacin.[22] El proceso de polaridad relativa creciente, segn Skoog et. al.[7] y Miller.[10] de%algunos%solventes%utilizados ambiente fresco, con luz ten tra que se En la prctica, los pasos de desarrollo y elusin frecuentemente son distinguibles, ya que la banda con el disolvente, para n ndice de Disolvente mueva ms rpido puede empezar a emerger de la columna antes de que se P puestos polaridad complete la separacin de las de degradacin bandas que se mueven ms lentamente. carotenoides son bastante e Pentano 0,0 ter de petrleo Frecuentemente, los compuestos a separar en la mezcla son incoloros por lo que no pueden verse daciones e isomerizaciones las bandas. 0,01 matografa, En este caso se recolectan fracciones de volumen pequeo. se evapora 0,04 el solvente y los residuos se comparan [2] las clorofilas Ciclohexano por cromatografa en placa delgada para determinar cules fracciones tienen igual composicin y el calor, los cidos y por ac pueden ser Hexano 0,1 reunidas. propio tejido vegetal. En m Tetracloruro de carbono 1,6 Tolueno forman fcilmente en feof 2,4 La columna se prepara en un tubo de vidrio que, en uno de sus extremos, lleva una llave de paso (puede Benceno 2,7 pardo oliva utilizarse una bureta). El adsorbente se sostiene en un disco de vidrio poroso o un tapn de algodn o lana de en las cuales se Cloruro de metileno partculas finas. 3,1relacin usual de dimetro de la hidrgeno.[2,5,18 vidrio cubierto con una capa de arena para retener La tomos de columna a altura del adsorbenten-propanol es aproximadamente de 1 a 10 y debe haber suficiente espacio adicional en la 4,0 puestos durante el desarrol columna para permitir que hayaTetrahidrofurano adsorbente. Si el tubo tiene un dimetro de 1 cm o mayor, solvente arriba del 4,0 suele ser se llena parcialmente con el solvente que se vaya a usar para disolver la muestra. Se aade el adsorbente, ya objeto de confus Cloroformo 4,1 cromatograma y no son re sea seco, dejndolo caer como un chorro muy fino, o bien, suspendindolo en un vaso de precipitados con el tanol 4,3 mismo solvente y aadiendo la suspensin a la columna. Mientras se aade el adsorbente, debe mantenerse Son compuestos d mentario. Acetato de etilo 4,4 entreabierta la llave de la columna para que el solvente siga fluyendo lentamente. Si la columna tiene un damentalmente durante la c dimetro menor a 1 cm (comoDioxano en tcnicas de microescala, 4,8las que se puede usar una pipeta las usadas en mentos,[18] y en el caso de Acetona 5,1 cialmente en el transcurso Metanol 5,1 Agua al disgregar la muestra, lo 10,2 Departamento de Ingeniera y Ciencias Qumicas. Universidad Iberoamericana. catalizan su formacin. Po Tabla%2%ndice%de%polaridad%de%algunos%disolventes% procedimiento de extracci utilizados%en%cromatografa%por%capa%na%y%columna Algunas consideraciones experimentales disgregue en presencia MgCO3[22] o MgSO4,[23] l Aunque la cromatografa sobre papel es una tcnica mente a la molcula de clo extremadamente sencilla, es frecuente observar en la biblio- po, el agua presente en las

GRUPO FUNCIONAL alcanos halogenuros de alquilo polaridades y fuerzas eluyentes,[7] pero que no tienen que ver alquenos dienos con la polaridad en trminos de momento dipolar. As, es hidrocarburos utilizausual presentarles a los alumnos los disolventes ms aromticos halogenuros aromticos dos en CP, ordenados conforme a su polaridad relativa, meteres diante la denominada serie eluotrpica (Tabla 2).[7,10] En esta steres cetonas serie, por ejemplo, el tetracloruro de carbono es ms polar que aldehdos el hexano en trminos cromatogrficos, aunque ninguno de aminas los dos posea un momento dipolar. Los disolventes utilizados alcoholes en cromatografa como fase mvil, usualmente son denomifenoles nados como eluyentes, trmino mediante cidos carboxlicos a el cual se referir ms polar partir de esta seccin. ms lento cidos sulfnicos ellos, a

RAPIDEZ DE ELUSIN ms rpido

tores, del estado nutricion medioambientales y de su h utilizacin de la espinaca (S formado en una costumbre, se trata de un alimento de co y color verde muy intenso.

Extraccin de los pigment

La*identi5icacin*de*los*pigmentos*a*partir*del*cromatograma,* suele*llevarse*a*cabo*mediante* el*parmetro*Rf,*factor*de*retardo*o*de*retencin,*que*representa*la*relacin*entre*la*distancia* recorrida*por*cada*pigmento*y*la*del*eluyente.

Rf =

distancia recorrida por el pigmento distancia recorrida por el eluyente

El*valor*del*Rf*oscila*entre*0*y*1,*los*pigmentos*ms*polares*como*las*cloro5ilas*tendrn*un* factor*de*retardo*menor*que*los*carotenos*que*son*menos*polares. De*la*cromatogra5a*con*papel*5iltro*y*en*capa*5ina*se*calcularon*estos*valores*y*se*obtuvieron* los*siguientes*resultados*(Tabla"3"y"4).

Tabla%3%Valores%de%Rf%obtenidos%de%la%cromatografa%con%papel%ltro.
Mezcla.solvente. Distancia(recorrida( Color( por(el(solvente((en( cm. 4.4 3.9 4.3 4.3 4.4 4.8 4.4 4.8 4.4 4.9 amarillo verde verde verde verde verde verde verde verde verde Distancia( Rf recorrida(por(el( compuesto((en( cm. 3.5 0.7954 3.2 0.8205 3.7 0.8604 3.5 0.8139 4 0.9090 4.5 0.9375 4 0.9090 4.5 0.9375 4.2 0.9545 4.5 0.9183

Hexano EtanolCacetona. Etanol HexanoCcloroformo Cloroformo Acetona EtanolCcloroformo HexanoCacetona AcetonaCcloroformo. Hexano.Cetanol

Tabla%4%Valores%de%Rf%obtenidos%de%la%cromatografa%con%capa%na.

Mezcla.solvente. Distancia(recorrida( Color( por(el(solvente((en( cm. Hexano 3.5 amarillo Etanol 2.8 amarillo verde

Distancia(recorrida( Rf por(el(compuesto(( en(cm. 1 0.2857 1.9 2.05 0.6785 0.7321

Para* la* cromatogra5a* en* papel* 5iltro* se* utilizaron* diferentes* mezclas* de* solventes* que* fungieron*como*la*fase*movil*para*desplazar*el*pigmento,*impregnando*el*papel*que*es*la*fase* estacionaria.

Fotografa%1 %Resultados%de%la%cromatografa%de%la%hoja%de%espinaca%en%papel%ltro. Tabla%5%Observaciones%de%los%resultados%de%la%cromatografa%de%la%hoja%de%espina%con%papel%ltro% utilizando%distintos%solventes. Mezcla solvente

Hexano** EtanolCacetona. Etanol**

Observaciones Se observan hasta tres tonalidades y una separacin completamente uniforme. Se observan solo dos tonalidades verde y amarillo donde predomina el verde. Se observan hasta tres tonalidades y una separacin uniforme con concentracin mayor de pigmento en la distancia media del papel. Se observan hasta dos tonalidades concentradas en la parte superior del papel filtro Se observan dos tonalidades Se observa solo una tonalidad la verde, la muestra es confusa y poca clara. Una tonalidad, muestra confusa. Se observan dos tonalidades, la muestra es un poco confusa y la separacin no es uniforme. Se observan dos tonalidades distribuidas en la parte central del papel. Se observan dos tonalidades concentradas solo en la parte superior del papel.

HexanoCcloroformo Cloroformo Acetona EtanolCcloroformo HexanoCacetona AcetonaCcloroformo. Hexano.Cetanol

**Mejores muestras

Resultados Cromatografa En Columna De* la* cromatogra5a* de* capa* 5ina* se* seleccionaron* las* mezclas* de*disolventes* en* las* que* se* observ*una*mejor*separacin. Las*mezclas*en*las*que*se*observ*una*mejor*separacin*fueron*el*Etanol*(C2H6O)*y*el*Hexano* (C6H14). Disolvente.1.Etanol. Se* realizo* una* cromatogra5a* en* columna* utilizando* como* fase* estacionaria* silica* gel,* se* hidrato* con* etanol* y* se* dejo* correr* la* cromatogra5a* con* el* disolvente* con* los* mejores* resultados.* Una* vez* que* el* disolvente* descendi* por* toda* la* columna* se* observaron* los* primeros* resultados*que*muestran*la*separacin*de*los*pigmentos*fotosintticos*que*son*la*cloro5ila*a*y* la*cloro5ila*b*y*los*pigmento*carotenoides. La*muestra*se*aplica*en*la*parte*superior*de*la*columna*y*se*deja*pasar*el*solvente*a*travs*del* adsorbente.

Imagen%1

Imagen%2 Fotografa%2:%Cromatografa%en%columa%de% la%hoja%de%espinaca%(Spinacia%oleracea)" Fase%Estacionaria:%Silica%Gel Fase%Mvil:%Etanol

Imagen%3 Imagen%1,2,3:%Valores%de%intensidad%del%modelo% RGB%(Red,%Green,%Blue)%para%identicar% tonalidades%de%una%cromatografa%en%columna% utilizando%como%solvente%Etano

Disolvente 2 Hexano Se*repiti*el*procedimiento*con*un*solvente*menos*polar,*el*hexano*y*se*obtuvieron*los* siguientes*resultados

Imagen%4

Imagen%5

Imagen%6

Imagen%7 Fotografa%3:%Cromatografa%en%columa%de% la%hoja%de%espinaca%(Spinacia%oleracea)" Fase%Estacionaria:%Silica%Gel Fase%Mvil:%Hexano

Imagen%8

sentan 90 COOCH3 R El d CH CH2 CH3 CH2COOCH2 la fas 72 CH3 CH3 CH3 REDCH3 propu N N GREEN FiguraH3CEstructura de las clorofilas a y b. La diferencia entre ambas contri 2. CH2CH3 54 Mg BLUE radica en el sustituyente (R) del carbono C-3. La= -CH3 Clorofila a: R polaridad de la suces CH3 H3C molcula est dada por el ncleo tetrapirrlico mientras que su natu- slo e N N 36 Clorofila b: R = -CHO H raleza hidrofbica, est originada por la presencia de la larga cadena hexan H de fitol. 18 CH2 rar pu O COOCH Los carotenos son3 hidrocarburos que contienen nicamente La ad 0 CH3 CH 3cm 2.2cm 1.8cm2COOCH2 son solubles en disolventes no polares, como 1.5cm 0.5cm hidrgeno y carbono, CH3 CH3 CH3 CH3 poseen coloraciones que van desde el amarillo hasta el posib Distancia recorrida por Figura 2. Estructura de las clorofilas a b. -caroteno y el anaranjado y los ms abundantes sonyel La diferencia entre- ambas en radica en el xantfilas en cambio, son derivados oxigenados dad caroteno. Las sustituyente (R) del carbono C-3. La polaridad de la d Se realiz un modelo con las molcula est dada porobtenidas de la cromatografa y seque su natu- p diferentes tonalidades el ncleo tetrapirrlico de los en la muestra de acuerdo a la bibliografa1.mientras gene- ella, identic los pigmentos presentes anteriores, solubles en alcohol, con coloraciones eluye raleza hidrofbica, est ms abundantes son la lutena larga ralmente amarillas y las originada por la presencia de la y vio-cadena adem de fitol. laxantina. (Figura 3).[2,17] el pr
CH2 O

turas N no H3C seNtraduce CH2CH3 solo en cambios de coloracin, un verde azulatipo do para la Mg clorofila a y Clorofila a: R = -CH3 para la b, sino v verde amarillento CH3 H3C como N N adems, en una mayor polaridad de esta ltima con respecto a Clorofila b: R = -CHO H queda H la primera.[17,18] Modelo RGB de Columa de cromatografa de espinaca solvente hexano

% de Intensidad

3cm

2 cm a

carotenos son hidrocarburos que contienen nicamente Difer hidrgeno y carbono, son solubles en disolventes no polares, Imagen%4 poseen coloraciones que van desde el amarillo hasta el anaranjado y los ms abundantes son el -caroteno y el Los p matog caroteno. Las xantfilas en cambio, son derivados oxigenados Clorola a requie de los anteriores, solubles en alcohol, con coloraciones genelares e Imagen%5 ralmente amarillas y las ms abundantes son la lutena y viose des laxantina. (Figura 3).[2,17] va a c
Clorola b

Los Carotenos

Figura Imagen%6 3. Principales carotenos y xantfilas presentes en los pigmentos fotosintticos de las plantas superiores.
1 cm

Debido a las diferentes solubilidades que presentan estos pigmentos en los disolventes orgnicos, es muy usual que en los guiones de prcticas y en algunos textos se tome como Xantolas parmetro esa diferencia para explicar su separacin mediante Imagen%7 cromatografa sobre papel, lo cual es un error.[16] En efecto, esta idea, asociada a la concepcin de un proceso de sepa-

liza ta a las fase m trmi mome siemp tancia matog diante (para croma

0 cm

An. Qum. 2007, 103(4), 45 51 y xantfilas presentes en los pigmen- 20 www.rseq.org Figura 3. Principales carotenos Imagen%9 tos Modelo%grco%obtenido%con%los%pigmentos% fotosintticos de las plantas superiores. reales%de%la%cromatografa%en%columna%de%la% Debido a las diferentes solubilidades que presentan estos hoja%de%espinaca.

pigmentos en los disolventes orgnicos, es muy usual que en los guiones de prcticas y en algunos textos se tome como

Anlisis de Resultados El*factor*de*retencin*o*Rf*es*una*medida*resultante*del**cociente*del*recorrido*de*la*sustancia* por*el*disolvente* o* bien*la*distancia* *medida*desde*el* *origen*o* el*punto*donde* se*coloc* el* pigmento*muestra*hasta*el*borde*5inal*del*espectro*de*color*que*fue*arrastrado*por*el*solvente* dividida*por*la*distancia*que*se*midi*desde*el*origen*hasta*donde*llega*la*marca*de*la*mezcla* solvente* este*factor*es*adimensional,* esta*sujeto*a* * condiciones* invariantes*y*espec5icas* del* trabajo*realizado* en*el* laboratorio* puede*ser* utilizado* para* identi5icar* a*una*sustancia,*pero* est* condicionado* por* mltiples* factores* como* la* temperatura,* caractersticas* del* papel,* cantidad* de* muestra* aplicada,* dimensin* y* saturacin* de* la* cubeta,* volumen,* volatilidad* y* composicin*del*eluyente,*etc.*(Abbot,'1973) La*a5inidad*del* solvente*con*el*pigmento*se* **ve*denotada*por*el* valor*de*Rf**en*el* caso* *de*la* prctica* los* valores* de* Rf* en*su* mayora* fueron*mayores* *a*0.5*por* lo* que*se*deduce*que*la* mayora* de* los* solventes* tenan* una* a5inidad* considerable* con* el* pigmento,* sin* embargo* algunos* no* presentaban*una*diferencia* notoria*en* la* coloracin* que* hiciera* distincin* entre* los* *distintos*tipos* de*carotenos* y*cloro5ilas*en*comparacin*a*la*(Fotogra3a)" que*muestra*el* color* y* su* respectivo* componente,* por* ello* mediante*la* observacin* * se* determin* que*los* disolventes* que* presentaban* mayor* separacin* de* los* componentes* eran* el* hexano* y* el* etanol*,*en*el*caso*del*hexano**claramente*se*vio*una*separacin*en*dos*tonalidades* *de*verdes* y* amarillo*por*lo* que*haciendo* el* * clculo* de* * Rf* en*la* muestra*con* disolvente* hexano* * *los* carotenos* y* cloro5ilas*polares*resultaron*menos* a5ines* * al* solvente* con*un*Rf* de*0.2857* * as* mismo* *en*la*muestra*con*etanol* *con*un*Rf*de*0.6785**de*acuerdo*a*los*datos* *mostrados* **en* la*tabla*4*.*(Hardegger',1965) La*separacin*de*los*pigmentos*fotosintticos*mediante*cromatogra5a*sobre*papel*transcurre* fundamentalmente,* a* travs* de* un*mecanismo* de* adsorcin* 5sica,* dnde*se*establecen*una* serie*de*equilibrios*de*adsorcinNdesorcin*que*dependen*de*la*polaridad*de*cada*pigmento*y* del*tipo*de*fuerzas*intermoleculares*que*puedan*establecer*con*los*grupos*hidrxilos*libres*de* la*celulosa*del*papel*y*con*la*estructura*del*disolvente*de*la*fase*mvil.*As,* la*cloroFila'b,*ms* polar*que*la*a,*se*adsorbe*ms*intensamente*y*presenta,*en*consecuencia,*un*factor*de*retardo* (Rf)*menor.* Los* carotenos*en*cambio,* son*hidrocarburos,* y* aunque*la*deslocalizacin*de*los* electrones* * de* sus* estructuras* le* otorgan* una* mayor* dominancia* de* interacciones* intermoleculares* de*Van*der*Waals,*no* son*lo* su5icientemente*fuertes*como* para*interactuar* con*la*estructura*del*papel,*por*lo*que*quedan*disueltos*en*la*fase*mvil*y*arrastrados*por*ella,* presentando*en*consecuencia,*un*factor*de*retardo*mayor..(Wilcox,'1995) Los*procesos*de*separacin*llevados*a*cabo*mediante*cromatogra5a*lquida*en*general,**y* sobre*papel*en*particular,*requieren*de*un*adecuado*equilibrio*de*fuerzas*intermoleculares* entre*soluto,*fase*mvil*y*fase*estacionaria.

Conclusiones Debido*a*las*propiedades*termodinmicas*como*el*Calor*Latente*de*Vaporizacin*del*etanol* (854KJ/Kg)2,*es*recomendable*mantenerlo*tapado*para*asegurar*una*concentracin*adecuada* y*que*no*afecte*los*resultados*de*la*cromatogra5a. La*eleccin*del*tipo*de*papel*es*importante*puesto*que*del*grosor*y*de*la*porosidad*del*papel* depender*la*velocidad*de*desarrollo*y*la*resolucin. De*acuerdo*con*los* resultados* *obtenidos*de* la*prctica*(Fotogra3a"3)* se* comprueba*que*un* solvente* menos* polar* es* mejor* a* la* hora*de* separar* los* pigmentos* de* una* muestra* en* una* cromatogra5a*por*capa*5ina*y*columna*debido*a*que*la*velocidad*del*eluyente*es*menor.

!Cuestionario.
1. En que se fundamenta la cromatografa. Es un mtodo analtico de separacin de componentes, los cuales se distribuyen entre dos fases: una fase estacionaria y una fase mvil en una direccin definida. La fase estacionaria suele estar en una columna, o bien, en otras formas como lo son las fases planas (hoja de papel). La fase mvil normalmente es de dos tipos, de las cuales se derivan los principales tipos de cromatografa: donde la fase mvil es un gas (cromatografa de gases), o cuando la fase mvil es un lquido (cromatografa de lquidos). (Christian,2009) 2. Como se define Rf. El*coe.iciente*obtenido*entre*la*distancia*recorrida*por*el*compuesto*entre*la*distancia*recorrida*por*el* disolvente*en*la*fase*estacionaria*se*le*conoce*como*factor*de*particin*(rf). Rf*es*el*registro,**esta*es*una**relacin**de*distancias,**y*se*de.ine**como:

Rf =

distancia recorrida por el pigmento distancia recorrida por el eluyente

El*valor**de*Rf*depender*de*las**condiciones**en*las**cuales**se*llevar*a*cabo*la*corrida*de* *la*muestra* como*tipo*de* adsorbente,* eluyente,* adems*de* *las* *condiciones* *de*la* placa,*temperatura,*vapor* *de* saturacin,*etc.*

3. Cules son las principales diferencias entre la cromatografa en capa fina y la cromatografa en columna?. En la cromatografa en columna, el analito y el eluyente se aplican a la parte superior de una columna abierta alimentada por gravedad que contiene fase estacionaria. sta tcnica se utiliza en qumica y bioqumica en los cuales deben aislarse cantidades relativamente grandes (miligramos o gramos) de material. En la cromatografa de capa fina, normalmente se utilizan distintos solventes y fases estacionarias con objeto de encontrar las mejores condiciones de operacin. En este tipo de cromatografa, se aplica una pequea gota de la solucin cerca del borde inferior de una placa de vidrio o plstico recubierta con una capa delgada de fase estacionaria. Cuando la placa se coloca en un depsito somero de solvente dentro de una cmara cerrada, el solvente sube lentamente por la placa, y durante el ascenso se realiza la separacin cromatogrfica. Cuando el solvente se acerca al extremo superior de la placa, sta se extrae del solvente y se deja secar. Es decir, la mayor diferencia entre ambos mtodos es que en la primera el solvente y el analito se desplazan por la fase estacionaria por efecto de la gravedad o bombeo, mientras que en la segunda, el solvente y analito suben a travs de la fase estacionaria. (Harris, 2007) 4. Qu factores influyen en la separacin cromatogrfica en capa fina? a) Temperatura: a menor temperatura las estacionaria. b) La cromatografa debe llevarse a cabo en un rea sin corrientes de aire. c) Limpieza de las placas. Muchas placas estn contaminadas con grasa o agentes plastificantes o adhesivos. Para el trabajo a pequea escala, stas deben limpiarse corriendo primero una mezcla de cloroformo y metanol y despus dejar secar completamente antes de aplicar la muestra. d) Pureza de los disolventes
ABBOT D., Intro. a la Cromatografia, 3. Ed.

sustancias

se adsorben ms

en la fase

5. Una serie de colorantes son separados por cromatografa en capa fina. Calcular los valores de Rf de cada colorante de acuerdo a la siguiente tabla. Colorantes Eluyente Rojo de metilo Rojo Congo Distancia Recorrida (mm) 66.0 56.0 0.5

6. Qu significa que una sustancia tenga: a) Rf < 0.5 b) Rf = 0.5 c) Rf > 0.5 a) La muestra tiene mayor afinidad por la fase estacionaria. b) Es el ndice de retencin ideal. c) La muestra tiene mayor afinidad por la fase mvil.

Bibliografa

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