Tincin estructural. Prct.

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nIntroduccin. Algunos colorantes son especficos a nivel molecular, esta es la razn por la que se han diseado nuevos mtodos de tincin que son ms especficos y selectivos, estos ayudan a visualizar organelos, protenas y otras macromolculas celulares, se les denominan tincin estructural. La tincin se puede llevar a cabo mediante reacciones qumicas que pueden ser inespecficas como la tincin de nucleoprotenas cidas por colorantes alcalinos. Actualmente la mayor parte de las tcnicas de tincin son de reaccin qumica y adsorcin. En esta prctica realizaremos la tincin estructural de nuestros cultivos bacterianos en donde evidenciaremos la presencia de cpsulas, esporas, y flagelos mediante la tincin de Maneval modificada, tincin con tinta china y la tcnica de esporas por la tcnica de Writz. Presentaremos una breve explicacin de las estructuras que buscamos distinguir en las tinciones: Cpsula: es la capa rgida con borde definido formada por una serie de polmeros orgnicos que en las bacterias se deposita en el exterior de su pared celular. Generalmente contiene glicoprotenas y un gran nmero de polisacridos diferentes, incluyendo polialcoholes y aminoazcares.

La cpsula es una capa rgida organizada en matriz impermeable que excluye colorantes como la tinta china, se observa como un reflejo de luz teniendo un color lucido. Espora: Es una clula reproductora que transporta materiales a las setas, generalmente haploide y unicelular. La reproduccin por esporas permite al mismo tiempo la dispersin y la supervivencia por largo tiempo (dormancia) en condiciones adversas (sequedad, falta de nutrientes, etc). El microorganismo se libera de la espora cuando encuentra un ambiente hmedo y nutritivo en donde pueda desarrollarse. Flagelo: Es una estructura filamentosa que sirve para impulsar la clula bacteriana. Los flagelos estn compuestos por cerca de 20 protenas, con aproximadamente otras 30 protenas para su regulacin y coordinacin. Estructura Flagelos Esporas Tincin Mtodo de Maneval modificado. Mtodo de Wirtz-Conklin.

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Cpsula Mtodo de la tinta china.

Adems es importante mencionar que las tincin de cpsulas tiene una importancia debido a que nos ayuda a determinar la virulencia de un microorganismo. La tinta china tiene unas partculas muy grandes que no entran al interior de la bacteria. Primero aplicamos el colorante primario (Fucsina) que tie las bacterias capsuladas de rojo y despus aplicamos la tinta china. Tincin de flagelos: La tincin de flagelos es difcil debido a que los flagelos se retraen con mucha facilidad y se adhieren a la pared celular. En este caso no observaremos los flagelos pero sabremos de su existencia ya que al teir las clulas podremos ver su movilidad y esto es una evidencia de los flagelos. Tincin de esporas: Para la tincin de esporas ocuparemos hacer un frotis y fijarlo, despus de esto, cubrirlo con verde de Malaquita. Se calienta de 8-10 minutos evitando que se seque el colorante, se lava, se cubre con Fucsina y al lavarlo est listo para observarse en el microscopio.

Resultados y observaciones. Despus de realizar todas la tcnicas de tincin descritas en el manual obtuvimos los siguientes frotis: Bacteria Escherichia coli. Tipo de tincin Tincin con tinta china. Frotis:

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Klebsiella pneumoniae Mtodo maneval modificado.

Klebsiella pneumoniae

Tcnica Wirtz

de

Proteus ox

Observacin al fresco con gota pendiente.

En esta prctica pudimos observar por medio de la tcnica de tincin con tinta china ,la formacin de capsulas a partir de una muestra de Escherichia coli, de un cultivo que se realizo al empezar la practicas de laboratorio de microbiologa, las capsulas teidas se observan como estructuras de color negro que recubren a la estructura bacteriana. En la tincin Mtodo maneval modificado, utilizamos klebsiella pneumoniae, la cual presento tincin de capsula bacteriana que presentaba al observase por el microscopio un punto amarillo en el interior y la capsula resaltaba alrededor de este. En el frotis generado por la tincin de Witz se observaron de manera sorprendente, las capsulas bacterianas de klebsiella pneumoniae, eran de un color rosado azulado, violceo, que se encontraban, al alrededor de la estructura bacteriana, en el caso de la observacin en fresco de la bacteria Proteus ox ,pudimos observar su movimiento provocado por sus flagelos de una manera ntida y clara.
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Conclusin: En esta practica pudimos reafirmar los conocimientos aprendidos en clase, debido a que la capsulas son estructuras superficiales que presentan muchas bacterias en sus ambientes naturales ,compuesta principalmente de calcio o peptidoglucanos, estas estructuras pueden ser flexibles ,adems de que proporciona proteccin contra situaciones de estrs como sequedad, radiacin, agentes qumicos entre otros. La observacin a microscopa ptica en fresco es difcil, ya el ndice de refraccin de las bacterias es similar al del medio y solo se notan como siluetas movindose a travs del medio. Por lo tanto se utilizan tcnicas especializadas como las utilizadas en esta practica este tipo de tincin son muy laboriosas y delicadas, debido a que si excedes o no colocas la cantidad de colorante necesario para el frotis ,la tincin no dar la nitidez necesaria o formara precipitados en las estructuras bacteriana, lo cual no dejara hacer una observacin clara de la estructuras bacterianas que estamos buscando.

Preguntas. 1.- Qu tcnicas realiz en esta prctica? -Tincin con el mtodo de Maneval modificado, tincin con tinta china, observacin al fresco en gota pendiente, tincin de esporas por tcnica de Writ. 2.- Reporte los resultados obtenidos en las pruebas realizadas (con imgenes de de los frotis). Descritos en el apartado de Resultados y observaciones. 3.- Explique el por qu del cuidado que se debe de tener para realizar esta prctica. El principal cuidado es el de la esterilizacin completa por la posible contaminacin de los cultivos y sobretodo porque en esta prctica trabajamos con bacterias y el microorganismo de Proteus es patgeno por lo que se debe trabajar con mucho cuidado respecto a la tincin de ese microorganismo ya que puede causar daos a la salud. Adems el inters de observar estos microorganismos es que tengan libertad de movimiento por lo que la observacin debe de ser en fresco de la gota pendiente, no debe tener contacto con el portaobjetos para observar el movimiento. Fuentes de informacin. Brock, M (2009). Biologia de los microorganismos. Editorial Pearson.12a edicin. .

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm

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Apuntes de la materia de Biologa. Profesora Mara del Carmen Surez Camacho. dieumsnh.qfb.umich.mx/patologIa_pract/pagina_nueva_1.htm http://www.biblioteca.upibi.ipn.mx/Archivos/Material%20Didactico/Microbiolog%C3%AD a%20ambiental/II.TecMic-Preparaciones.pdf http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/04capsula.htm