Biorremediacin estimulada por efluentes cloacales tratados de suelos contaminados con hidrocarburos.

Autor: Leandro Pellini.

Directora de Tesis: Lic. Mara Eugenia Parolo. Co - Directora de Tesis: Bioq. Irene E. Zajonskovsky. Tutor: Ing. Juan D. Vasallo

Escuela Superior de Salud y Ambiente Universidad Nacional del Comahue Lugar de Trabajo: Laboratorios de la Escuela Superior de Salud y Ambiente Departamento de Qumica de la Facultad de Ingeniera. Universidad Nacional del Comahue. 2006

Agradecimientos
Mara Eugenia Parolo, Irene E. Zajonskovsky: Directoras del alumno en el presente trabajo. Lelia McKormack: Coordinadora de los laboratorios N 1 y N 2 de la Escuela Superior de Salud y Ambiente, por su invaluable colaboracin. Gabriela Paladino: Compaera de laboratorio a lo largo de todo el trabajo. Juan D. Vasallo: Tutor del alumno durante la presente investigacin. A la Universidad Nacional del Comahue: Porque me permiti cambiar mi realidad.

Resumen / Abstract Introduccin

1.1. Propiedades y Composicin del Suelo 1.2. Hidrocarburos 1.3. Productos Derivados del Petrleo 1.4. Efecto de los Hidrocarburos en los Seres Vivos 1.5. Actividad Hidrocarburfera en la Regin 1.6. Contaminacin del Suelo 1.7. Remediacin de Suelos Contaminados con Hidrocarburos 1.8. Tcnicas de Remediacin 1.9. Mtodos Analticos para la Determinacin de Hidrocarburos Objetivos Fundamentacin - Hiptesis Materiales y Mtodos 1.10. Caractersticas del rea 1.11. Obtencin del Suelo y Pretratamiento 1.12. Enmienda del Suelo Correspondiente al Tratamiento EST 1.13. Fortificacin del Suelo con Hidrocarburos 1.14. Diseo Experimental

1.15. Determinacin de Microorganismos Mesfilos Hetertrofos Totales Resultados y Discusin 1.16. Anlisis Fsico-Qumico del Suelo Estudiado. 1.17. Niveles de Hidrocarburos Totales de Petrleo en el Suelo Seleccionado para el Estudio. 1.18. Caractersticas Qumicas y Microbiolgicas del Efluente Utilizado. 1.19. Niveles de Hidrocarburos Totales de Petrleo en los Tratamientos EFL y EST. 1.20. Bacterias Hetertrofas Totales en los Tratamientos EST y EFL Conclusiones Bibliografa Anexos 1.21. Normativa Internacional Aplicable 1.22. Normativa Provincial Relacionada 1.23. Tabla de McCrady para Tres Replicas por Dilucin 1.24. Anlisis Estadstico

RESUMEN
El suelo es un sistema complejo que se forma en la superficie del terreno, inicialmente por la alteracin fsica y qumica de las rocas y luego tambin por la influencia de los seres vivos, desarrollando una estructura en niveles superpuestos, el perfil, y una composicin qumica y biolgica definidas. Se lo considera contaminado o en proceso de contaminacin, cuando sus componentes qumicos y biolgicos estn agredidos por sustancias ajenas a l, incompatibles con su estado de equilibrio. Aos atrs, las malas prcticas empleadas en la explotacin de hidrocarburos y la ausencia de un marco legal apropiado, afectaron la calidad del suelo. En la actualidad la principal causa de contaminacin del suelo con estas sustancias, se debe principalmente a situaciones imponderables. Estas circunstancias, originan la necesidad de recomponer el suelo contaminado siendo la biorremediacin, una de las tcnicas ms empleadas para su restitucin. El objetivo del presente trabajo es comparar dos tratamientos de biorremediacin, el primero es un tratamiento a travs de tcnicas reconocidas o tradicionales, y en el segundo tratamiento, la humedad y los nutrientes inorgnicos son aportados por efluentes cloacales tratados. Segn los resultados obtenidos, se puede concluir que un tratamiento de biorremediacin en el cual se aportan los nutrientes inorgnicos a travs de efluentes cloacales tratados, no es ms eficiente que un tratamiento de biorremediacin fertilizado con productos comerciales y humedecido con agua pura

ABSTRACT
The soil is a complex system formed on the surface of the land, initially by the physic and chemic alterations of de rocks and by the influence of live beings, developing a structure of superposed layers. Its considered contaminated or in contamination

process, when its biological and chemical components are attacked by substances detached from it, which are incompatible with it balance status. Years ago, bad practices employed in the hydrocarbon exploitation and the absence of an appropriate legal matrix, damaged soil quality. Today the first source of soil contamination by these substances is mainly because of imponderable situations. Those circumstances originate the necessity to recompose the contaminated soil, being bioremediation one of the most employed techniques for its restitution. The aim of the present work is to compare two bioremediation treatments, one of those is a treatment through the recognized or traditional techniques, and in the second treatment the moisture and the inorganic nutrients are incorporated by refined sewage effluents. Depending on the obtained results, those allows to conclude that a bioremediation treatment in that inorganic nutrients are incorporated by refined sewage effluents, is not more efficient that a bioremediation treatment fertilized by commercial products and moistured with fresh water

1.1. Propiedades y Composicin del Suelo

El suelo est constituido por tres fases: la fase slida, compuesta a su vez por la fraccin mineral y la orgnica; la fase lquida; y la gaseosa; que ocupa el espacio que la fase lquida deja libre en la porosidad presente en el suelo. Como consecuencia de estas tres fases, el suelo presenta determinadas propiedades que dependen de su composicin. La fase lquida constituye el medio ideal que facilita la reaccin entre las tres fases, pero tambin se producen reacciones dentro de cada una de ellas. En un promedio general la materia orgnica constituye un 5% del suelo, el agua 25% mientras que la fraccin mineral est representada en un porcentaje del 45%. Los minerales constituyen la base del armazn slido que soporta el suelo. Cuantitativamente en un suelo normal la fraccin mineral representa de un 45 a un 49% del volumen del mismo, pero dentro de la fase slida constituyen, para un suelo representativo, del orden del 90 al 99% (el 1-10% restante corresponde a la materia orgnica). La fase slida, muy heterognea, representa la fase ms estable del suelo y la ms ampliamente estudiada. La fase lquida se caracteriza por su variabilidad en el espacio y el tiempo, tanto a nivel cualitativo como cuantitativo, esta variabilidad est condicionada por las propiedades especficas de esa fase lquida, por las caractersticas de los espacios en que se encuentra y por las propiedades del suelo que la sustenta. Esta fase lquida del suelo es

fundamentalmente una solucin acuosa, y por ello, y al contener sustancias en solucin, se le llama solucin del suelo. Las soluciones del suelo proceden de la alteracin de los minerales y de la materia orgnica. El agua ejerce importantes acciones, tanto para la formacin del suelo (interviene decisivamente en la meteorizacin fsica y qumica, y translocacin de sustancias) como para su fertilidad. La fase lquida circula a travs del espacio poroso, quedando retenida en los huecos del suelo; est en constante competencia con la fase gaseosa. Los cambios climticos estacionales, y concretamente las precipitaciones atmosfricas, hacen variar los porcentajes de cada fase en cada momento. El agua que se mueve por la fuerza de gravedad se denomina agua libre o agua gravitacional, y se encuentra en los poros ms grandes del suelo, que frecuentemente estn llenos de aire. Parte del agua se retiene contra la fuerza gravitacional como resultado de la atraccin entre el agua y los otros constituyentes. No toda el agua del suelo es aprovechable biolgicamente y slo una parte de esta pocin retenida en contra de la atraccin gravitacional puede ser usada por los sistemas vivientes. La fase gaseosa es una mezcla de gases que ocupa los espacios que la fase lquida deja libres en la porosidad del suelo. Debido a sus caractersticas intrnsecas como fluido, la fase gaseosa presenta una marcada similitud con la fase lquida, sobre todo en lo que se refiere a su dinmica, aunque tiene algunas diferencias con respecto a esta. La atmsfera del suelo est condicionada por la dinmica de los procesos biolgicos que se producen en relacin a ella, y que estn determinados por el consumo de oxgeno y por la produccin de CO2 que realizan los microorganismos y las plantas durante sus procesos de oxidacin (Campbell, 1987). En cuanto a la textura el suelo est constituido por partculas de muy diferente tamao. El trmino textura se usa para representar la composicin granulomtrica del suelo. Conocer esta granulometra es esencial para cualquier estudio. Para clasificar la textura del suelo, bsicamente todas aceptan los trminos de grava, arena, limo y arcilla, hay diferencia en los valores de los lmites establecidos para definir cada clase. Cada trmino textural se corresponde con una determinada composicin cuantitativa de arena, limo y arcilla (Figura N 1). En los trminos de textura se prescinde de los contenidos en gravas; se refieren a la fraccin del suelo que se estudia en el laboratorio de anlisis de suelos y que se conoce como tierra fina.

Figura N 1: Tringulo de textura a partir del cual se obtienen los nombres de las clases de textura.
Las partculas no estn sueltas sino que forman agregados, siendo por lo tanto necesario destruir la agregacin para separar las partculas individuales, por ello antes de proceder a la extraccin de las diferentes fracciones hay una fase previa de preparacin de la muestra. En esta fase previa existen diversos mtodos para separar a las partculas del suelo. Algunos son mtodos fsicos (trituracin suave, agitacin lenta, agitacin rpida, ultrasonidos, lavado y coccin) y otras son tcnicas qumicas (oxidacin de la materia orgnica con agua oxigenada, ataque cido de los carbonatos y compuestos de Fe con ClH, dispersin de las arcillas con hexametafosfato sdico o amonaco). Como los agentes agregantes pueden ser muy distintos, normalmente no sirve uno solo de estos mtodos sino que se monta una cadena de tratamientos. La extraccin final de las fracciones se realiza por tamizado para las arenas, mientras que la sedimentacin en fase acuosa es el mtodo normal de separacin de los limos y de las arcillas. Si se necesita subfraccionar la fraccin de arcilla se ha de recurrir a la centrifugacin. El pH influye en las propiedades fsicas y qumicas del suelo. Entre otros aspectos, el pH del suelo influye en el nivel de toxicidad de algunos elementos como, por ejemplo, aluminio y manganeso. Tambin influye decisivamente en procesos microbiolgicos de tanta trascendencia como son la mineralizacin y humificacin de los restos vegetales

incorporados, y en la dinmica y transformaciones de numerosos nutrientes (por ej. nitrgeno), ejerciendo una poderosa influencia sobre la fertilidad del suelo. En los suelos, los iones H+ estn en la solucin como tambin en el complejo de intercambio, o sea hay dos tipos de acidez, activa o real (en solucin) y de intercambio o reserva (para los adsorbidos); ambas estn en equilibrio dinmico. Si se eliminan protones de la solucin se liberan otros tantos protones adsorbidos. Como consecuencia el suelo muestra una fuerte resistencia a cualquier modificacin de su pH, est fuertemente tamponado. (Alexander, 1994)

1.2. Hidrocarburos
El petrleo crudo contiene una gran variedad de elementos combinados de diferentes formas. Los principales constituyentes son carbono e hidrgeno que en forma combinada componen los hidrocarburos. Adems estn presentes otros compuestos orgnicos que contienen azufre, oxgeno y nitrgeno y constituyentes metlicos en concentraciones relativamente bajas. Es imposible identificar todos los componentes, por ello los compuestos del petrleo son caracterizados en trminos de rangos segn el punto de ebullicin y nmero aproximado de carbonos. A pesar de la complejidad de este grupo de compuestos se los puede clasificar en dos grandes grupos: los hidrocarburos y los compuestos que no entran en dicha categora (TPH CRITERIA WORKING GROUP TPHCWG-; 1998). Los hidrocarburos se clasifican en: hidrocarburos saturados, insaturados y aromticos. a.-Hidrocarburos saturados: son la clase principal presente en el petrleo. Estn compuestos por enlaces simples C-C, con los dems enlaces restantes saturados con tomos de H. Las molculas pueden encontrarse en distintas configuraciones. Alcanos e isoalcanos: responden a la siguiente frmula:

Contienen solamente enlaces simples entre los tomos de carbono. Pueden ser de cadena lineal o ramificados (el prefijo n corresponde a los alcanos con configuracin estructural de cadena lineal). La industria del petrleo se refiere a ellos como parafinas e isoparafinas, respectivamente. Ejemplos:

Cicloalcanos: son compuestos cclicos con la siguiente frmula general:

Estos compuestos son hidrocarburos saturados donde los carbonos forman estructuras cclicas. La industria del petrleo se refiere a ellos como naftenos o cicloparafinas. Ejemplos:

b.- Hidrocarburos no saturados (o insaturados): esta clase de compuestos tiene al menos dos tomos de carbono en la molcula unidos por un doble o triple enlace (doble para alquenos y triple para alquinos). Estos compuestos no se encuentran en el petrleo crudo, y son producidos principalmente en los procesos de craqueo en la produccin de molculas pequeas a partir de las ms grandes. Se forman estos enlaces mltiples cuando no hay suficiente hidrgeno para saturar la molcula. Alquenos/olefinas: pueden ser lineales, ramificados o cclicos y su frmula general es:

Estos compuestos tienen uno o ms enlaces dobles entre los tomos de carbono. A los alquenos que contienen dos dobles enlaces se los denomina dienos y cuando los dos dobles enlaces estn separados por un enlace simple, se los llama dienos conjugados.

Ejemplos:

Alquinos/acetilenos: pueden ser lineales o ramificados y responden a la siguiente frmula general:

Ejemplos:

c.- Hidrocarburos Aromticos: son una clase especial de hidrocarburos no saturados. Tienen como base la estructura de anillo de benceno. Este anillo contiene seis carbonos. Cada carbono est unido a un hidrgeno. La molcula es plana y simtrica con nubes de electrones por debajo y sobre el plano de la molcula. Los enlaces C-C son enlaces de resonancia, en los cuales los electrones son compartidos entre varios tomos de carbono. Los electrones se encuentran deslocalizados (participando en varios enlaces); esto le otorga estabilidad qumica a la molcula. Las nubes de electrones que rodea a las molculas de los anillos pueden deformarse por la carga de las molculas adyacentes. Esto produce sitios de carga positiva y negativa dentro de la molcula, lo cual le otorga a la misma una moderada polaridad. Esta polaridad determina la interaccin de las molculas entre ellas y con el agua. Generalmente, a medida que la polaridad aumenta, se incrementa el punto de ebullicin y la solubilidad en agua. Los compuestos monoaromticos poseen un anillo de benceno, pudiendo estar uno o ms hidrgenos sustituido por grupos alquilo. Los diaromticos tienen como base dos anillos bencnicos fusionados. Aquellos que tienen como base ms de dos anillos fusionados son los hidrocarburos aromticos policclicos (HAPs). Todos los tipos de petrleo crudo y casi todos los productos derivados contienen hidrocarburos aromticos. Los compuestos aromticos son contaminantes comunes en sitios afectados por productos de petrleo. Los monoaromticos, como benceno, tolueno, y xileno (BTEX) tienen una solubilidad en agua significativa y son mviles en el ambiente. Muchos HAPs que se

encuentran en petrleo crudo y sus productos pueden ser contaminantes persistentes, particularmente en suelo y sedimentos. Ejemplos:

Dentro de cada familia y sub-familia de hidrocarburos, hay series homlogas. A cada miembro de la serie se lo llama homlogo y difiere del miembro adyacente en la serie por una unidad que se repite, como por ejemplo el grupo metileno (CH2). Dentro de cada serie las propiedades fsicas de los compuestos varan con el nmero de tomos de carbono. Por ejemplo, hay un incremento de aproximadamente 20C en el punto de ebullicin por cada tomo que se suma en una cadena de los alcanos lineales. Generalmente, la persistencia de los hidrocarburos en el ambiente se incrementa con el aumento del punto de ebullicin. Otra caracterstica de los hidrocarburos es que tienen una gran cantidad de ismeros. Los ismeros son compuestos que tienen la misma frmula elemental pero tienen configuraciones estructurales diferentes. Hay distintos tipos de ismeros. En general, a medida que el nmero de carbonos aumenta, se incrementa significativamente el nmero de ismeros posibles. Por ejemplo, un alcano con seis tomos de carbono tiene cinco posibles ismeros, mientras que unos de diez carbonos posee setenta y cinco (TPHCWG; 1998). Otros Compuestos: el petrleo crudo contiene cantidades significativas de compuestos que no entran dentro de la categora de hidrocarburos, especialmente los que contienen oxgeno, azufre y nitrgeno. Dentro de estos compuestos los que predominan son los aromticos heterocclicos con azufre. Estn presentes tambin, en menor cantidad compuestos organometlicos y sales inorgnicas. Se encuentran principalmente concentrados en las fracciones de destilacin ms pesadas y los residuos provenientes de la refinacin. Se los llama tambin asfaltenos y resinas (TPHCWG; 1998). Ejemplos:

1.3. Productos Derivados del Petrleo

Los productos del petrleo son tanto fracciones de destilacin del crudo o mezclas de fracciones luego de un proceso de refinacin. Los productos son utilizados para fines industriales o militares o en gran escala en numerosos productos de consumo. Algunos de los productos son: gasolinas, naftas, solventes, naftas de aviacin, kerosene, combustible diesel, fuel oil, aceites lubricantes (TPHCWG; 1998). Debido a que puede resultar extremadamente difcil identificar todos los componentes del petrleo, tanto el petrleo como sus derivados pueden ser caracterizados en trminos de rangos segn el punto de ebullicin y el nmero aproximado de carbonos. La tabla I muestra los puntos de ebullicin y rangos de nmero de carbonos para seis fracciones del petrleo crudo. Tabla N 1: Rangos de punto de ebullicin para las distintas fracciones del petrleo (McMILLEN et al.; 2001).

Fraccin Gasolina
El aceite lubricante tanto para uso en automviles e industrias, est compuesto en general (excepto en aceites sintticos) por una base orgnica y aditivos, estos ltimos utilizados para aumentar su rendimiento, eficiencia y vida til. La composicin de la base orgnica est formada de cientos de miles de compuestos orgnicos, siendo la gran mayora compuestos aromticos polinucleares (PNA). Algunos de estos PNA (principalmente estructuras de 4, 5 y 6 anillos) son considerados cancergenos como el benzopireno, sin embargo, existen otros combustibles cuyas concentraciones de PNA son superiores, por lo que los PNA tanto en aceite lubricante virgen como usado no son la mayor fuente de preocupacin. Los aditivos

Nafta

Kerosene

Diesel y fuel oil

de la base orgnica del aceite que pueden llegar a constituir hasta un 30 % en volumen del total de aceite virgen, tpicamente contienen constituyentes inorgnicos como azufre, nitrgeno, compuestos halogenados y trazas de metales (Ruz, E., 1991). Las bases lubricantes minerales son refinadas del crudo del petrleo, sus caractersticas estn determinada por la fuente de crudo y el proceso especifico de refinacin usado por el fabricante. Existen dos tipos principales de crudos de petrleo: crudo parafnico y crudo naftnico. El crudo parafnico es el ms usado para la fabricacin de aceites lubricantes, su alta composicin en componentes parafnicos hace que su ndice de viscosidad sea ms elevado que el de el crudo naftnico (Pit & Quarry. 2000). Los aceites lubricantes para motores a gasolina se pueden clasificar de acuerdo a dos criterios generales: segn su viscosidad (SAE) y segn requerimientos industriales (API). La sociedad de ingenieros automotores SAE ha generado una clasificacin que depende exclusivamente del grado de viscosidad del lubricante. En aceites para motor existen los monogrados que van del 0W hasta el 60 y en los multigrados desde el 5W 50 hasta el 20W 50. El instituto Americano del Petrleo (API) clasifica los aceites para motor de acuerdo a sus caractersticas y a las condiciones exigidas por los lubricantes de automviles. La designacin para aceites segn API ha variado desde SA hasta SG que es el recomendado en la actualidad.is fsico-qumico.

1.3.1. Biodegradabilidad de los Componentes del Petrleo

El petrleo crudo, as como sus fracciones, son mezclas complejas de hidrocarburos y las caractersticas estructurales de cada grupo de compuestos, determinarn la velocidad y viabilidad de la degradacin. Es necesario distinguir entre degradacin y mineralizacin; frecuentemente un compuesto con una estructura qumica compleja, ser degradado en sucesivas fases, y con la participacin de diversos grupos de microorganismos y de enzimas, pero una porcin de la molcula puede resultar recalcitrante (resistente a la biodegradacin), por lo cual puede no alcanzarse la mineralizacin. Usualmente la fraccin ms liviana de los hidrocarburos es ms rpidamente degradada que la fraccin ms pesada, siendo en general mineralizada, es decir, completamente convertida en dixido de carbono (CO2) y agua. El factor limitante para que lo propio ocurra con las fracciones ms pesadas, suele ser el escaso grado de solubilizacin del compuesto y su lenta liberacin desde los poros del suelo.

En lneas generales, las transformaciones aerobias hacen que el producto de la metabolizacin sea un compuesto menos voltil, ms soluble y ms degradable que el original. Una excepcin pueden ser los hidrocarburos poliaromticos, los cuales pueden degradarse a productos ms voltiles, como resultado de la ruptura del anillo aromtico y formacin de compuestos de bajo peso molecular (Eweis et al., 1998). Los alcanos lineales son los hidrocarburos del petrleo ms biodegradables debido a la simplicidad de su estructura molecular. Sin embargo, altas concentraciones de alcanos con nmero de carbonos entre 5 y 10, inhiben la biodegradacin, ya que como solventes lisan la membrana lipdica del microorganismo. Los alcanos de C20 a C40 tienen, en general, muy baja solubilidad en agua, lo cual interfiere en la degradacin biolgica. Una ramificacin muy extensa compleja del alcano, tambin puede significar una dificultad para su metabolizacin microbiana. Por ejemplo, el alcano lineal n-octano es degradado ms fcilmente que el 3-etil hexano, aunque ambos tienen la misma frmula emprica: C8H18 (Gibson, 1984). En general, la degradacin de alcanos origina productos muy oxidados, los cuales son menos voltiles que sus compuestos parentales (Eweis et al., 1999). Los Cicloalcanos son menos biodegradables que sus ismeros de cadena lineal, pero ms biodegradables que los Hidrocarburos Aromticos Policclicos (HAPs) por ser, estos ltimos, muy estables qumicamente. La susceptibilidad a la degradacin de los Cicloalcanos tiende a decrecer con el incremento del nmero de anillos en su estructura, como es el caso de los HAPs. La biodegradabilidad de los compuestos aromticos disminuye con el incremento del nmero de anillos y del nmero de sustituyentes alquilos. Los compuestos monoaromticos, como los BTEX, son degradados con mayor facilidad que los compuestos que contienen ms de un anillo en su estructura (Altamirano, 2000). En los HAPs, el aumento del peso molecular y del nmero de anillos, produce una disminucin en la solubilidad y volatilidad e incrementa la capacidad de adsorcin a las partculas slidas del suelo, dificultando el acceso de los microorganismos degradadores (Brubaker, 1991). No obstante, las enzimas requeridas para la degradacin de los HAPs, pueden ser inducidas por la presencia de compuestos aromticos de bajo peso molecular, como el naftaleno el antraceno (Atlas, 1991). Los asfaltos y muchas resinas son compuestos por largas cadenas de hidrocarburos, nitrgeno, azufre y tomos de oxgeno ligados a aromticos policclicos, los cuales incluyen, a su vez, elementos tales como nquel y vanadio. Debido a su insolubilidad y a la presencia de grupos funcionales y extensivas estructuras de anillos, que los protegen de los ataques microbianos, estos grupos de compuestos tienden a ser muy recalcitrantes (Atlas, 1991). Pese a ello, algunos estudios han publicado la eliminacin de asfaltos por cometabolismo, en presencia de n-alcanos de C12 a C18 (Leahy & Colwell, 1990).

Generalizando, entre los factores estructurales que dificultan la biodegradacin de los compuestos, se encuentran: la presencia de grupos amino, metoxi, sulfonatos y nitro; la halogenacin extensiva; pesos moleculares muy altos cadenas de longitud larga; bencenos sustituidos en la posicin meta; enlaces ter y cadenas muy ramificadas de carbonos. Los factores sealados, determinan la siguiente secuencia de biodegradacin, en orden decreciente: n-alcanos, alcanos de cadena ramificada, alquenos ramificados, compuestos nalquil aromticos de bajo peso molecular, monoaromticos, alcanos cclicos, aromticos polinucleares y asfaltenos.

1.3.2. Concentracin y Toxicidad del Contaminante

Dos parmetros primordiales que afectan significativamente la tasa de biodegradacin de un contaminante son su concentracin y toxicidad. Concentraciones menores a la concentracin lmite, es decir aquella concentracin mnima suficiente como para soportar el crecimiento mantenimiento de la poblacin microbiana degradadora, pueden detener el proceso y el contaminante podra persistir en el ambiente por aos. Una explicacin de este fenmeno es que, a muy bajas concentraciones, los compuestos no generan suficiente energa para el crecimiento de los microorganismos, no inducen el sistema enzimtico necesario para su metabolismo, si se encuentran presentes otros sustratos ms fcilmente biodegradables. Por otro lado, una alta concentracin del contaminante puede resultar txica para la microflora autctona del suelo, generando una disminucin supresin en la actividad de degradacin y/ muerte de la comunidad (Alexander, 1981, 1994). Diversos autores acuerdan en que concentraciones de hidrocarburos superiores al 10 %, pueden ser inhibitorias para el proceso de biodegradacin (Ferrari et al., 1994; Atlas & Bartha, 1992; Leahy & Colwell, 1990). Por ello, previamente a aplicar un tratamiento de biorremediacin, es necesario establecer la concentracin apropiada del contaminante en cuestin, para que este factor no signifique una razn de fracaso. Una posibilidad para reducir la concentracin es agregar suelo no contaminado en el sitio a remediar, logrando, de este modo, un efecto de dilucin del residuo. La toxicidad constituye otro factor clave en la biorremediacin. Si la mezcla contaminante no es txica por s misma para los microorganismos degradadores, algunos de sus componentes pueden serlo, retardando la biodegradacin de otros contaminantes fracciones presentes (Volke Seplveda, 2002). Algunos autores afirman que la toxicidad aparece debido a la presencia de alcoholes y solventes clorados, no considerando txicos a los hidrocarburos del petrleo en s mismos, cuando stos componen el nico contaminante presente y en la concentracin adecuada (Norris et al., 1994). Sin embargo, es frecuente la presencia de metales pesados acompaando a los residuos del petrleo, como Pb, As, Cd, Ba, Hg, Zn, Cu, Ni, V y Se entre otros, de probado efecto ecotxico.

1.3.3. Comportamiento de los Hidrocarburos en el Suelo

El petrleo crudo y los productos del petrleo liberados al ambiente sufren con el tiempo procesos de intemperizacin. Estos procesos incluyen, entre otros, volatilizacin, transferencia a la fase acuosa, oxidacin qumica y degradacin microbiolgica. La velocidad de transformacin depende principalmente de las condiciones ambientales. Por ejemplo, la gasolina, un producto voltil se evaporar rpidamente en un derrame superficial, mientras que el mismo producto liberado bajo una capa de arcilla cubierta con asfalto tender a evaporarse con lentitud (el proceso de intemperizacin no ser detectado por aos). Adems, cada proceso de intemperizacin afecta a las familias de hidrocarburos de manera diferente. Por ejemplo, los aromticos tienden a ser ms solubles en agua que los alifticos, mientras que estos ltimos tienden a ser ms voltiles. Dentro de los compuestos aromticos, los BTEX (benceno, tolueno, etilbenceno y xileno) tienen una solubilidad en agua bastante significativa. Los cuerpos de agua contaminados por petrleo suelen estar enriquecidos por estos compuestos en relacin con las otras fracciones de petrleo. Otros hidrocarburos relativamente insolubles en agua pueden transferirse al agua a travs de la adsorcin a partculas suspendidas en la fase acuosa o como aglomeraciones de gotas muy pequeas (microemulsin) (TPHCWG; 1998). En el caso del suelo estos procesos pueden tener una variedad de escenarios potenciales. Por difusin, lentamente, los hidrocarburos pueden redistribuirse desde la superficie del suelo hacia el interior del mismo. Tambin pueden unirse a las partculas del suelo, modificndose su disponibilidad y movilidad (Beck, 1997). Cuando los hidrocarburos entran en el suelo, se produce una separacin natural de los distintos constituyentes, debido a la exposicin de la fase no acuosa a las fases slida, gaseosa y acuosa del suelo. Los compuestos de alto peso molecular tienen, en general, menor movilidad y permanecen cerca de la fuente, mientras que los ms livianos migran hacia porciones ms profundas del perfil debido a su mayor solubilidad en agua. A medida que la cantidad de hidrocarburos disminuye, ya sea por disolucin u otro mecanismo de remocin, la fraccin del espacio poroso ocupada por los mismos disminuye. Los conductos de comunicacin entre los poros se tornan ms pequeos y tortuosos, reduciendo la capacidad de la fase orgnica de desplazarse. Cuando ya no existe suficiente volumen para que continu la migracin, la fase no acuosa en el suelo es denominada saturacin residual (API, 2003). Parte de la fraccin aromtica de un derrame de petrleo puede particionarse en el agua que est en contacto con la contaminacin. Los procesos de volatilizacin, tambin actan simultneamente en la remocin de aromticos voltiles como el benceno y tolueno, adems de los alcanos de bajo nmero de carbonos. Comnmente, la fraccin soluble en agua se difunde del punto de origen del derrame, al estar en contacto con agua, utilizando cualquier medio que se lo permita (TPHCWG; 1998).

1.4. Efecto de los Hidrocarburos en los Seres Vivos

1.4.1. En los Microorganismos

Dada la naturaleza hidrofbica del rea entre las monocapas de la membrana citoplasmtica, y en bacterias gram-negativas, de la capa exterior, no es extrao que las molculas lipoflicas como los hidrocarburos se incorporen en ellas. Los hidrocarburos tienden a alojarse en el rea hidrofbica entre las monocapas de la membrana en las cadenas acilo de los fosfolpidos, su incorporacin est relacionada con el coeficiente de particin octanol-agua del compuesto lipoflico. La insercin de los hidrocarburos en la membrana altera la estructura de la misma, ocasionando cambios en su fluidez y en la conformacin de las protenas de membrana. Esto provoca la disrupcin de la membrana y de las funciones de transduccin de energa. La bacteria puede formar biofilms en respuesta al estrs, es decir, alterar la hidrofobicidad de su superficie celular para regular esta incorporacin. De la misma forma, pueden ser utilizados mecanismos de reparacin con gasto de energa para compensar las prdidas en la integridad de la membrana a causa de la intrusin de los compuestos lipoflicos (Van Hamme et al, 2003).

1.4.2. En las Plantas

En los primeros abordajes, se haca una distincin entre los efectos agudos y crnicos, y entre los efectos biofsicos y bioqumicos. Los hidrocarburos del petrleo pueden producir un efecto directo sobre las plantas al disolver los tejidos. La disminucin en el crecimiento se atribuy a la sofocacin de las plantas causada por el desplazamiento del aire de los poros por los hidrocarburos o por la falta de oxgeno debido al aumento de la actividad microbiana. Adems, durante la descomposicin microbiana, pueden encontrarse compuestos con azufre y manganeso en cantidades que resulten txicas. En estudios realizados tambin se detect dao a membranas celulares, reduccin en la transpiracin y aumento en la respiracin. La gravedad de los efectos detectados dependen tanto de los constituyentes y cantidad de producto, de las condiciones ambientales y de las especies de plantas. Ha habido una diferenciacin, adems, entre los efectos agudos y rpidos causados por aceites livianos y los efectos crnicos y lentos resultantes de los aceites pesados. Un grupo a tener en cuenta al analizar la toxicidad de los hidrocarburos del petrleo es el de los hidrocarburos aromticos policclicos (HAPs). Las plantas pueden acumular este grupo de compuestos. Tambin este proceso ocurre en sedimentos y plantas acuticas y por lo tanto puede impactar en especies herbvoras de peces y vida silvestre en general. Algunas plantas pueden catabolizar benzo(a)pireno. Esto es un factor importante a tener en cuenta, ya que cuando los HAPs son degradados metablicamente se transforman en compuestos an ms txicos, carcingenos y mutagnicos. Las transformaciones metablicas hacia compuestos ms peligrosos tambin pueden ocurrir a travs de la degradacin microbiana en el suelo o sedimentos (Irwin, 1997). A una concentracin igual o menor al 1% (p/p) de hidrocarburos, se espera que la reduccin en la produccin de las plantas sea muy baja o nula. Adems, cuando esta concentracin es de 1 a 5% de hidrocarburos en suelo, el sitio puede recuperarse naturalmente en un

transcurso de tiempo menor a un ao (Deuel, 1991). Esta recuperacin es el resultado de la asimilacin de hidrocarburos en el suelo, que es una combinacin de biodegradacin, prdida por evaporacin, y la unin de los hidrocarburos a la materia orgnica del suelo. Se descubri que la fitodisponibilidad de mezclas complejas de hidrocarburos que tienen bajo coeficiente de reparto octanol-agua (Kow) es muy baja, an cuando el contenido de HTP es tan alto como 1%. La fitotoxicidad result ser mayor para los hidrocarburos de bajo peso molecular y aromticos. Segn lo expuesto, se ha demostrado que el valor gua propuesto por el Instituto Americano de Petrleo (1% HTP) tiene la finalidad de proteger la vida vegetal, el agua subterrnea y adems puede lograrse a travs del mtodo de biorremediacin. A pesar de ello an se requieren valores gua para ciertas mezclas de hidrocarburos, que estn basados en el riesgo para la salud humana. Los componentes especficos del petrleo crudo deben ser identificados y su riesgo potencial evaluado para aquellos sitios donde se deba tener en cuenta la exposicin humana (Mc Millen et al., 2001).

1.4.3. En Vertebrados
Los daos biolgicos sobre los organismos vivos dependen de varios factores que pueden actuar juntos o por separado, como por ejemplo: el tipo de hidrocarburos al que estn expuestos, en especial al contenido de compuestos aromticos, a la concentracin y tiempo de exposicin, el grado de intemperismo de los hidrocarburos, la forma en que se encuentre (emulsin, disperso, absorbido en materia orgnica) y por ltimo a la especie expuesta. Es de destacar que, a parte de los diferentes hidrocarburos, el petrleo contiene otros componentes como sulfuro, oxgeno, nitrgeno y diversos metales pesados, y que todos ellos, de una manera u otra, afectan negativamente a los animales. Pueden observarse efectos ms o menos comunes en las distintas vas de ingreso al organismo de los animales. a. Por Va Inhalatoria

A nivel local se produce una irritacin del epitelio respiratorio, y una inhalacin severa de las emanaciones txicas puede producir graves problemas como inflamacin, congestin y hemorragias pulmonares. Si estos compuestos voltiles llegan a ser absorbidos (por ejemplo por causa de lesiones en el interior del pulmn), se producirn lesiones sistmicas a nivel heptico, renal y del sistema nervioso central (Farr, 2002).
b. Por Va Gastro Intestinal

La entrada por va oral de petrleo produce irritacin y una posterior destruccin de los epitelios esofgicos, gstrico e intestinal. Estos efectos producen a su vez una alteracin en la motilidad gastrointestinal y los consecuentes sndromes de mal

digestin y mala absorcin. Otras consecuencias ms graves son las gastroenteritis y gastroenteritis hemorrgicas (Farr, 2002).
c. Por Contacto con la Piel y las Mucosas Es importante considerar, el efecto en la fauna marina, ya que los sucesos ms importantes de contaminacin por contacto con la piel y mucosas se presentan en este grupo. La impregnacin externa con petrleo produce una accin lesiva directa sobre la piel de los delfines, las focas y las tortugas marinas, pero es especialmente negativo en las focas, ya que el mecanismo termorregulador de estos animales marinos no depende nicamente de la capa de grasa sino, en una parte importante, de la presencia del pelo. Los efectos de esta alteracin de los mecanismos de regulacin trmica, pueden producirse en dos sentidos opuestos: puede instaurarse una hipotermia (por la imposibilidad de retener el calor corporal) o bien, una hipertermia (por la imposibilidad de eliminarlo).

Los efectos del contacto directo del petrleo con las mucosas producirn una irritacin de stas, siendo las afectaciones ms graves a nivel ocular. Las lesiones oculares van desde la simple irritacin hasta las graves lceras corneales, pasando por los diferentes grados y tipos de conjuntivitis y el blefaroespasmo (Farr, 2002).
La respuesta biolgica se puede clasificar en: efectos txicos letales cuando los hidrocarburos interfieren en procesos celulares produciendo la muerte, efectos subletales cuando los hidrocarburos alteran el comportamiento y las actividades fisiolgicas pero no provocan la muerte. Su ingestin puede producir la carcinognesis en el individuo. Otros efectos se relacionan con la interferencia en la bsqueda de alimentos, o en el escape de predadores (Farr, 2002). 1.4.3.1. En el ser Humano La exposicin a HTP proviene de muy diversas fuentes, incluyendo qumicos utilizados en el hogar y el trabajo, en estaciones de servicio, algunos plaguicidas, etc. Una pequea cantidad de los HTP ms livianos se encuentran en el aire. Una gran parte de las exposiciones proviene de las ocupaciones que involucran la manipulacin de productos de petrleo. La exposicin puede provenir tambin a travs del consumo de agua de acuferos subterrneos contaminados, de derrames o prdidas donde puede entrar en contacto directo con los productos o inhalarlos. Los nios pueden estar expuestos al jugar en terrenos contaminados. Los HTP pueden entrar y salir del cuerpo cuando se los inspira con el aire; cuando se los ingiere con los alimentos, el agua o cuando se los toca. La mayora de los componentes de este grupo entran en el torrente sanguneo rpidamente cuando se los inhala en forma de vapor o cuando se los ingiere. Algunos componentes son ampliamente distribuidos por la sangre y rpidamente transformados a compuestos qumicos menos peligrosos. Otros pueden ser transformados en qumicos ms dainos. Otros compuestos son transportados

muy lentamente a travs del cuerpo y no son transformados en otros. Cuando la va de exposicin es la drmica, los compuestos son absorbidos mucho ms lentamente que cuando son inhalados o ingeridos. La mayora de los HTP abandonan el cuerpo a travs de la orina o con el aire exhalado. Los efectos en la salud por la exposicin a los HTP dependen de muchos factores. Estos incluyen el tipo de compuesto qumico, la cantidad y la duracin de la exposicin. Se conoce muy poco sobre la toxicidad de algunos compuestos que integran este grupo. Los constituyentes de diferentes fracciones de HTP afectan a la salud de manera distinta. Algunos, especialmente los de bajo peso molecular, como el benceno, tolueno y xileno, pueden afectar al sistema nervioso central. Si la exposicin es suficientemente alta, pueden ocasionar la muerte. La inhalacin de tolueno a concentraciones mayores a 100 ppm por varias horas puede causar fatiga, dolor de cabeza, nuseas y adormecimiento. Cuando la exposicin cesa, los sntomas desaparecen. Sin embargo, si la exposicin se extiende por un largo tiempo, puede ocurrir dao permanente al sistema nervioso central. El n-hexano, puede afectar el sistema nervioso central (SNC) de una forma diferente, causando un desorden nervioso llamado neuropata perifrica caracterizada por el entumecimiento de las extremidades y en casos graves, parlisis. Esto ha ocurrido a trabajadores expuestos a una concentracin de 500 a 2000 ppm de n-hexano en el aire. La ingestin de algunos productos como gasolina y kerosene causa irritacin de garganta y estmago, depresin del sistema nervioso central, dificultad para respirar y neumona. Los compuestos de ciertas fracciones pueden tambin afectar a la sangre, el sistema inmune, hgado, riones, pulmones y el desarrollo embrionario, algunos compuestos son irritantes de la piel y las mucosas, otros, como ciertos aceites minerales no son txicos y son utilizados en alimentos. Se ha demostrado que el benceno es responsable de causar cncer (leucemia) en los seres humanos. La Agencia Internacional de Investigacin del Cncer (IARC) ha determinado que el benceno es carcinognico para humanos (grupo 1). Adems la gasolina y benzo(a)pireno son considerados como probables carcinognicos para humanos (IARC gupos 2B y 2A, respectivamente) (ATSDR, 1999).

Los principales peligros provenientes de elevadas concentraciones de hidrocarburos totales de petrleo en general estn relacionados a los HAPs encontrados en la contaminacin de petrleo, principalmente por sus efectos carcingenos. Aunque los HAPs son generalmente ms peligrosos que los alcanos, stos tambin tienen efectos biolgicos. Los alcanos presentes en las gasolinas son depresores del SNC. De hecho, la gasolina en el pasado fue evaluada como agente anestsico. Sin embargo, muertes repentinas, posiblemente como resultado de ritmo cardaco irregular, han sido atribuidas a los vapores de hidrocarburos inhalables, como los presentes en las gasolinas (Irwin, 1997). Es fundamental tener en cuenta los procesos de intemperizacin, ya que estos cambian la composicin de los productos y puede afectar los resultados, la capacidad para biorremediar y la toxicidad del producto liberado al ambiente. Como resultado de este proceso, y en relacin a la evaluacin de riesgo de sitios

contaminados, los materiales que han sufrido intemperizacin, en general presentan menor riesgo para la salud humana y el medio ambiente respecto de los mismos materiales provenientes de un derrame ms reciente (Beck, 1997).

1.5. Actividad Hidrocarburfera en la Regin

La primera perforacin con el objeto de obtener hidrocarburos, se realiz en 1918 en Plaza Huincul, desde entonces y hasta 1992 aproximadamente, la exploracin y explotacin se realizaba sin considerar el ambiente o los superficiarios. A partir de 1992 comenzaron profundos cambios en la actividad hidrocarburfera de nuestro pas respecto al manejo de los hidrocarburos y el cuidado ambiental. Estos cambios se producen a causa de la transformacin empresaria, la privatizacin de Y.P.F. S.E. (ley 24.145), y la generacin de reglamentaciones que principian la matriz legal actual a nivel nacional y provincial. En la provincia de Neuqun, durante estos ltimos aos, se ha logrado una lenta y progresiva modificacin de las prcticas que involucraban la exploracin y explotacin, hacia otras que producen un menor impacto en el medio, a travs de la promulgacin de legislacin y el seguimiento por parte de la Autoridad de Aplicacin (Ley Provincial 1875, Modificada por Ley 2267 (T.O.)). La actividad petrolera en la provincia de Neuqun tiene un significado estratgico de primera magnitud, que se manifiesta por los niveles de contribucin a la economa de la provincia. Se sabe que la industria del petrleo presenta ciertos riesgos inherentes a su actividad. La contaminacin del aire, agua y suelo con hidrocarburos es uno de los impactos potenciales asociados a dicha actividad. Entre algunas de las prcticas ms nocivas para el medio ambiente se puede observar: picadas ssmicas, derrames de hidrocarburos en suelo y agua, lneas de conduccin areas, locaciones de pozos cortando los frentes de barda, piletas de lodos sin impermeabilizar, agua de purga vertida al campo o al ro, contaminacin de napas freticas, etc. Entre las posibles causas de derrames en suelo se encuentran: roturas de lneas de conduccin (pinchaduras, fractura completa o parcial, actos de sabotaje), pozos fuera de control, prdida en los tanques de almacenamiento, derrame en bateras y cargaderos, etc. En este contexto, los derrames de hidrocarburos se presentan como los problemas ms importantes que las empresas petroleras tienen que combatir con planes de prevencin y contingencia adecuados. As como la legislacin provincial data de poco tiempo atrs, la concientizacin en la comunidad con respecto a los problemas ambientales se encuentra en una etapa incipiente de evolucin, pero que lentamente se fortalece. No slo se logra un control sobre la actividad hidrocarburfera a travs de las normas oficiales, sino que existen otras reas de control como son los organismos nacionales e internacionales no gubernamentales, los organismos de certificacin de normas internacionales y las comunidades que se organizan y reclaman una mejor calidad de vida.

1.6. Contaminacin del Suelo

Tradicionalmente, el impacto en suelos por hidrocarburos en sitios de exploracin y explotacin ha sido tratado tomando como base el contenido total de hidrocarburos de petrleo (HTP). El uso de concentraciones de HTP es comnmente utilizado para establecer niveles objetivos de limpieza para suelo y agua. En Estados Unidos, aproximadamente el 75% de los estados utilizan criterios de limpieza basados en HTP. Se ha confirmado que la migracin de hidrocarburos no es un problema a bajas concentraciones en el suelo. Segn Raymond (1976) agregando 2% de petrleo en los 15cm superficiales del suelo, el 99% permanece en los 20cm superiores luego de un ao. En base a este y otros estudios disponibles, la concentracin de 1% HTP parece justificarse adems por ser protectiva de las fuentes de agua subterrnea El grupo de compuestos que se agrupa bajo el trmino HTP, se lo denomina tambin aceites minerales, hidrocarburos de petrleo, hidrocarburos extrables y aceites y grasas. En algunas jurisdicciones provinciales se toma como valor objetivo (a alcanzar luego de una remediacin) una concentracin de Hidrocarburos Totales de Petrleo del 1% p/p (10.000mg HTP /Kg de suelo), que coincide con el nivel de referencia desarrollado y propuesto por el Instituto Americano del Petrleo (API). Este valor est por debajo del nivel mnimo requerido para la movilidad de los hidrocarburos (o por debajo de la saturacin residual). Por lo tanto este valor gua previene el movimiento de los hidrocarburos hacia el agua subterrnea. El valor gua de 1% HTP parece ser confirmado por las investigaciones sobre biodegradacin. Los niveles de limpieza menores a 1%, si bien son posibles de lograr en determinadas situaciones, son difciles de lograr en sitios que contienen hidrocarburos de petrleo intemperizados.

1.7. Remediacin de Suelos Contaminados con Hidrocarburos

Debido a los problemas de contaminacin mencionados, principalmente en zonas hidrocarburferas, se ha dado considerable importancia al desarrollo de tecnologas para la recuperacin de suelos contaminados con el fin de reutilizarlos. De acuerdo a Sellers (1999) cualquier tecnologa de remediacin debe cumplir alguno de los siguientes objetivos: - Separar los contaminantes del suelo, agua algn otro medio afectado; - Aislar inmovilizar dichos contaminantes - Destruirlos.

Por su parte, la Agencia de Proteccin Ambiental de los Estados Unidos (US EPA), recomienda el uso de tcnicas de remediacin de suelos que impliquen, en forma significativa y permanente, una reduccin del volumen, toxicidad y movilidad de las sustancias peligrosas y contaminantes y define el trmino tecnologa de tratamiento como cualquier operacin unitaria, serie de operaciones unitarias, que altera la composicin de una sustancia peligrosa o contaminante a travs de acciones qumicas, fsicas o biolgicas, de manera que reduzcan la toxicidad, movilidad volumen del material contaminado ( US EPA, 2001). Obviamente las tcnicas de destruccin del contaminante o de transformacin en un producto inocuo o de menor toxicidad, son las preferidas en el momento de enfrentar un problema de remediacin, mientras que la aplicacin de cualquiera de las restantes representan un problema para el futuro. El uso de una tecnologa en particular depende, adems de los factores mencionados, de su disponibilidad, fiabilidad (demostrada o proyectada), estado de desarrollo (laboratorio, escala piloto o gran escala) y de su costo. De hecho, en la seleccin de la metodologa a implementar en un sitio a tratar, es necesario disponer de la siguiente informacin (Volke Seplveda & Velasco Trejo, 2002): - Ubicacin geogrfica y uso del suelo afectado. - Tipo de instalacin que dio origen a la contaminacin. - Magnitud y distribucin del contaminante. - Formas de acceso al sitio, ubicacin de poblaciones cercanas y cuerpos de agua. - Tipo de vegetacin, clima y topografa del sitio. - Caractersticas ecolgicas (ecosistemas involucrados). - Caractersticas hidrogeolgicas (formaciones geolgicas, ciclo hidrolgico y flujo de cuerpos de agua).

1.8. Tcnicas de Remediacin

Para enfrentar la recuperacin de los ambientes contaminados por la incorporacin de residuos txicos, particularmente en suelos y aguas, tanto superficiales cmo subterrneas, existen diversas tecnologas, cada una de ellas con sus ventajas y desventajas.

Las tecnologas de remediacin pueden agruparse de diferentes maneras, en base a los siguientes principios: (I) lugar en que se realiza el proceso de remediacin, (II) estrategia de remediacin, y (III) tipo de tratamiento (Van Deuren et al., 1997; US EPA, 2001). (I) - De acuerdo al lugar donde se realiza el tratamiento de remediacin: In situ: el tratamiento se realiza en el mismo sitio en donde se encuentra la contaminacin. Ex situ: en este caso se requiere realizar una excavacin, dragado cualquier otro proceso, para remover el suelo contaminado antes de su tratamiento, que puede realizarse en el mismo sitio (on site) o fuera de l (off site). (II) - Estrategia de remediacin: pueden usarse separadas o combinadas: Destruccin modificacin de los contaminantes: Este tipo de tecnologas busca alterar la estructura qumica del contaminante. Extraccin separacin: Los contaminantes se extraen y/o separan del medio contaminado, en base a sus propiedades fsicas qumicas (volatilizacin, solubilidad, carga elctrica, etc.). Aislamiento inmovilizacin: en este caso se trata de estabilizar o solidificar los contaminantes por mtodos fsicos o qumicos. (III) - Por otra parte, el principio de remediacin funcionamiento determina tres tipos distintos de tratamientos: Tratamientos trmicos: Por medio de la accin del calor se logra la volatilizacin (separacin), quema, descomposicin fusin (inmovilizacin) de los contaminantes en un suelo. Tratamientos fisicoqumicos: en base a las propiedades fsicas y/ qumicas de los contaminantes del medio contaminado, se separa destruye, el contaminante. Tratamientos biolgicos (Biorremediacin): Esta metodologa utiliza el metabolismo de organismos vivos (plantas, hongos, bacterias) para degradar transformar los contaminantes a productos metablicos inocuos de menor toxicidad.

1.8.1. Tecnologas de Remediacin Trmica

La mayora de estos mtodos pueden aplicarse in situ y ex situ. Producen vapores, residuos slidos (cenizas) y, en ocasiones, residuos lquidos que deben ser tratados.

Si bien poseen la ventaja de ser procesos rpidos, tienen el inconveniente de ser los ms costosos y en algunos casos destruyen el suelo. Las tecnologas trmicas ms importantes son: Incineracin, Vitrificacin, Pirlisis y Desorcin Trmica (Volke Seplveda & Velasco Trejo, 2002): Incineracin: Se utilizan altas temperaturas de operacin, que van desde los 870 a los 1200 C, para lograr volatilizar y quemar compuestos orgnicos y halogenados, en presencia de oxgeno. Puede llevarse a cabo in situ o ex situ. Vitrificacin: Como en el caso anterior, este proceso puede llevarse a cabo in situ o ex situ, y se realiza mediante una corriente elctrica que funde los suelos contaminados, con temperaturas que van de 1600 a 2000 C. Estabiliza la mayora de los contaminantes inorgnicos y destruye los orgnicos. Con esta tecnologa se produce un material cristalino qumicamente estable que no produce lixiviados, en el cual quedan incorporados los compuestos inorgnicos. Durante el proceso, las altas temperaturas provocan la destruccin o remocin de los materiales orgnicos (US EPA 2001). Pirlisis: Mediante este mtodo se produce la descomposicin qumica de materiales orgnicos inducida por calor en ausencia de oxgeno. Se realiza a presin y a temperaturas de operacin mayores a 430 C, en hornos y equipos similares a los utilizados para la incineracin, pero se deben operar a temperaturas menores y en ausencia de aire. Desorcin Trmica (DT): La DT consiste en calentar el suelo contaminado por compuestos orgnicos hasta temperaturas entre 90 y 540 C, con el fin de vaporizarlos y por consiguiente separarlos de ste. Los contaminantes liberados son dirigidos hasta un sistema de tratamiento de gases, con el uso de un acarreador de gases o un sistema de vaco. Es un proceso de separacin fsica no destructivo.

1.8.2. Tecnologas de Remediacin Fisicoqumicas

La mayora de estas tecnologas se aplican in situ y se basan en el aprovechamiento de las propiedades fsicas y/o qumicas de los contaminantes del material contaminado, para destruir, separar contener la contaminacin. Entre ellas se encuentran: Extraccin por Solventes:

Como su nombre lo indica, se disuelven los contaminantes utilizando solventes orgnicos y as removerlos del suelo, a travs de la circulacin del solvente. El lquido que resulta del lavado de suelo y de la extraccin por solventes, requiere de un tratamiento posterior para remover destruir los contaminantes (Sellers, 1999; US EPA, 2001). Extraccin de Vapores (EV): Esta tecnologa, tambin conocida como ventilacin del suelo, vaporizacin y volatilizacin, es una metodologa en la que se aplica vaco para inducir un flujo controlado y continuo de aire, removiendo as contaminantes voltiles y semivoltiles del suelo. (Riser-Roberts 1998). Inundacin del Suelo: Se aplican al suelo o se inyectan en cuerpos de agua cercanos, para aumentar el nivel en la zona contaminada, grandes cantidades de agua para favorecer el paso de los contaminantes hacia el cuerpo de agua. sta es extrada y tratada en forma separada. Este tratamiento puede llevarse a cabo con la incorporacin de algn aditivo. Lavado de Suelos: Los contaminantes son removidos mediante la circulacin de soluciones acuosas. El suelo es realmente lavado y de esta manera se reduce el volumen del material contaminado, ya que las partculas finas con el contaminante sorbido en ellas son extradas, quedando retenidas en la solucin acuosa. Remediacin Electrocintica (RE): Esta tecnologa est en desarrollo. Aprovecha las propiedades conductivas del suelo, cuyo objetivo es separar y extraer contaminantes orgnicos e inorgnicos (metales) de suelos, lodos y sedimentos, con el uso de un campo elctrico que permite remover las especies cargadas (iones). Implica la aplicacin de una corriente directa de baja intensidad entre un electrodo positivo y uno negativo (US EPA, 2001). Solidificacin/Estabilizacin (S/E): Es una tcnica en el que el suelo contaminado es mezclado con aditivos para inmovilizar los contaminantes, con el objeto de disminuir eliminar la lixiviacin. La solidificacin se refiere a las tcnicas que encapsulan (atrapan fsicamente) al contaminante formando un material slido. La estabilizacin limita la solubilidad o movilidad del contaminante, generalmente por la adicin de materiales, como cemento Portland, cal o polmeros, que aseguren que los

constituyentes peligrosos se mantengan en su forma menos mvil o txica. La S/E puede realizarse tanto in situ como ex situ. Los mtodos mencionados tiene la ventaja de necesitar equipos accesibles y pueden utilizarse para un amplio rango de contaminantes, tanto orgnicos como inorgnicos, pero tienen el incoveniente de que generan residuos que a su vez necesitan tratamiento y disposicin final lo que encarece el proceso. Adems los solventes utilizados pueden aumentar la movilidad del contaminante

1.8.3. Tecnologas de Remediacin Biolgicas (Biorremediacin)

Cmo ya se mencion la biorremediacin involucra tratamientos que utilizan organismos vivos (plantas, hongos, bacterias, etc.) para degradar transformar, compuestos orgnicos txicos, a productos metablicos inocuos de menor toxicidad (Van Deuren et al., 1997). En esta tecnologa se pueden emplear organismos autctonos, propios del sitio contaminado exgenos, de otros sitios, tambin puede realizarse in situ o ex situ y en condiciones aerobias (en presencia de oxgeno) anaerobias (sin oxgeno). La degradacin de contaminantes orgnicos, por parte de los microorganismos, constituye un proceso que se produce en forma natural en el ambiente y que depende de las actividades catablicas de stos, los cuales utilizan los contaminantes como fuente de carbono y energa para su subsistencia. Sin embargo dicho proceso se encuentra, la mayora de las veces, limitado por factores qumicos, fsicos y medioambientales (Eweis et al., 1999; Volke Seplveda, 2002). El grado de biodegradacin depende principalmente de la toxicidad y de la concentracin inicial del contaminante, su biodegradabilidad, las propiedades del suelo contaminado y el sistema de tratamiento que se seleccione. La eficacia de las medidas biocorrectivas es limitada en lugares con una alta concentracin de metales, compuestos orgnicos altamente clorados o sales inorgnicas, por ser, stos compuestos, txicos para los microorganismos si se encuentran en grandes cantidades. An cuando no todos los compuestos orgnicos son susceptibles a la biodegradacin, los procesos de biorremediacin se han utilizado con xito para el tratamiento de suelos, lodos y sedimentos contaminados con hidrocarburos del petrleo (HTPs); solventes (Benceno y Tolueno); explosivos (TNT), clorofenoles (Pentaclorofenol-PCP); plaguicidas (cido 2,4Diclorofenoactico: 2,4-D); conservadores de madera (creosota) e Hidrocarburos Aromticos Policclicos (HAPs), entre otros. (Van Deuren et al., 1997; Semple et al., 2001). Asimismo, la biorremediacin de suelos ha demostrado ser una tecnologa eficaz para el tratamiento de la contaminacin por petrleo, debido a que gran parte de los componentes del crudo y sus productos refinados son biodegradables (Van Hamme et al., 2003).

En la biorremediacin realizada in situ, se debe proporcionar a los microorganismos las condiciones ambientales ptimas para que desarrollen a partir del contaminante. Una de las maneras de lograr esto es con el bioventeo (aporte de aire y oxgeno), bioestimulacin (aporte de nutrientes), bioaumentacin (aporte de microorganismos) adems del control de humedad temperatura y pH (US EPA, 2001). Los procesos ex situ incluyen: procesos de biodegradacin en fase de lodos (biorreactores), donde el suelo contaminado es mezclado con agua, microorganismos y nutrientes, y procesos de biodegradacin en fase slida, en el que el suelo se coloca en una celda de tratamiento (composteo) sobre membranas impermeables (biolabranza Landfarming), con el agregado de agua y nutrientes (US EPA, 2001). Otra tecnologa de biorremediacin y que cada vez tiene mayor importancia es la Fitorremediacin, que es un proceso que utiliza plantas superiores para remover, transferir, estabilizar, concentrar y/o destruir contaminantes (orgnicos e inorgnicos) en suelos, lodos y sedimentos, y puede aplicarse tanto en forma in situ como ex situ (Hutchinson, 2001). En general, el trmino biorremediacin, es utilizado para designar los tratamientos que utilizan organismos microscpicos (principalmente bacterias y hongos), en la recuperacin de ambientes contaminados. En la actualidad, esta metodologa es de uso preferencial debido a que presenta ventajas tales como bajo costo, fcil implementacin, efectividad en la remocin de contaminantes (los cuales pueden ser eliminados o transformados en productos inocuos), casi no se necesita tratamiento posterior y, lo que es muy importante, es mnimo el impacto en el ecosistema involucrado. No obstante, en el momento de pensar en la aplicacin de este tipo de tratamientos se deben tener en cuenta una serie de factores que pueden constituirse en desventajas, tales como: El tiempo requerido para completar la degradacin es mayor que en los tratamientos fsico qumicos. El contaminante debe ser biodegradable. No siempre se puede predecir la efectividad. El xito del proceso depende de la destreza para mantener las condiciones ptimas para el crecimiento microbiano. Se debe verificar que el contaminante no sea txico para los microorganismos y que el suelo sea apto para los mismos.

1.8.3.1. El proceso de Biorremediacin Numerosos microorganismos indgenas autctonos, presentes en el suelo y el agua subterrnea, poseen la capacidad metablica de transformar diversos compuestos orgnicos txicos, y en particular hidrocarburos, vertidos al ambiente. En los ambientes contaminados existen en abundancia especies con stas capacidades metablicas especficas, debido a la adaptacin de la microflora presente al contaminante (Marchal et al., 2003). El trmino "biodegradacin" puede referirse a la completa mineralizacin de los contaminantes orgnicos, obteniendo como producto final Dixido de Carbono (CO2), agua, compuestos inorgnicos y componentes celulares, a la transformacin parcial de contaminantes orgnicos en otros compuestos de menor, igual, mayor toxicidad para el ecosistema involucrado, as como con menor mayor movilidad en el ambiente (US E.P.A, 1994). En ambos procesos los microorganismos se desarrollan sobre la sustancia contaminante, obteniendo carbono y energa para su crecimiento y reproduccin. La biodegradacin es fundamentalmente un proceso metablico de transferencia de electrones. La energa necesaria para el crecimiento microbiano se obtiene durante el proceso de oxidacin de materiales reducidos, donde las enzimas microbianas catalizan la transferencia de los electrones. Cuando la materia orgnica es utilizada como fuente de energa (dador de electrones) y un compuesto exgeno (extracelular) es utilizado como aceptor terminal de electrones, el proceso metablico es denominado respiracin microbiana. Si el oxgeno (O2) es utilizado como aceptor de electrones, se produce respiracin aerobia; cuando se utiliza otro aceptor de electrones (por ejemplo, Fe3+, NO2-, NO-3 SO4 2- ), el proceso de respiracin se producir en forma anaerobia. Entonces, la biodegradacin de los contaminantes orgnicos puede darse en forma aerobia en forma anaerobia, y el compuesto orgnico a degradar acta como dador de electrones substrato orgnico. La respiracin degradacin aerobia soporta un rango ms amplio de reacciones, en las que el oxgeno molecular (O2) es incorporado en las molculas por enzimas oxigenasas y es llevada a cabo por microorganismos aerobios estrictos. La respiracin degradacin anaerobia es realizada por microorganismos anaerobios estrictos (no sobreviven en presencia de oxgeno) y anaerobios facultativos (microorganismos capaces de crecer tanto en presencia como en ausencia de oxgeno). El oxgeno es, generalmente, el mejor aceptor de electrones, es decir, el que produce la mayor energa libre en una reaccin completa. En consecuencia, para un mismo substrato orgnico, los microorganismos que emplean el oxgeno como agente oxidante pueden generar mayor energa que aquellos que emplean nitratos, sulfatos otros aceptores de

electrones alternativos, logrando de esta forma crecer a mayor velocidad, lo que implica un mayor consumo del sustrato. Por lo tanto la biodegradacin aerobia es tpicamente ms eficiente que la biodegradacin de contaminantes orgnicos en forma anaerobia (Eweis et al, 1999; US EPA, 1996, 1994). El proceso de biodegradacin aerobia puede esquematizarse de la siguiente manera: Substrato orgnico + O2 = biomasa + CO2 + H2O + compuestos inorgnicos As, el substrato orgnico es oxidado (adicin de oxgeno), y el O2 molecular es reducido (adicin de electrones e hidrgeno) a agua (H2O). En este caso, el substrato orgnico sirve como fuente de energa (electrones) y como fuente de carbono para la biosntesis de componentes celulares (biomasa). Estrategias involucradas en la biodegradacin: Cohortes microbianos y Cometabolismo La biodegradacin de componentes orgnicos es catalizada por enzimas producidas por los microorganismos. Las enzimas son generalmente especficas para cada sustancia a degradar, es por ello, que para una mezcla compleja de compuestos, como son el petrleo sus derivados, ser necesaria una gran variedad de enzimas para biodegradar totalmente los componentes orgnicos. De esta forma, la biodegradacin de un compuesto es tpicamente un proceso gradual, que implica la participacin de varias especies de microorganismos, generalmente organizados en asociaciones, consorcios cohortes microbianos (US EPA, 1994). La cooperacin asociacin entre especies y el cometabolismo, son los principales mecanismos que explican la demostrada eficiencia de la microflora presente en ambientes poludos, para la eliminacin de los contaminantes (Marchal et al., 2003). Una asociacin consiste en varias poblaciones microbianas viviendo en estrecha proximidad e interactuando entre s. La asociacin implica, generalmente, una interaccin positiva, donde un grupo de microorganismos se beneficia de las acciones del otro, y de esta forma varias especies estn involucradas en cada etapa de la mineralizacin conversin de un compuesto. Las especies que mejor se adapten a un ambiente en particular, determinado principalmente por la presencia de una fuente de carbono y energa utilizable, las condiciones de humedad, temperatura y pH, son las que predominarn (Eweis et al., 1999). El proceso denominado cometabolismo cooxidacin consiste en la transformacin de aquellos compuestos orgnicos, que no pueden ser utilizados como fuente de carbono energa por los microorganismos, pero pueden ser potencialmente degradados por enzimas generadas por los mismos, para metabolizar otras sustancias. Estos compuestos, de los cuales s pueden obtener energa nutrientes para su subsistencia, se denominan cosustratos (Atlas, 1997; US EPA, 1994).

El uso del trmino cometabolismo se encuentra en discusin en el mbito cientfico, ya que algunos autores utilizan este trmino slo si el cosustrato se encuentra presente durante la metabolizacin del compuesto secundario (aquel que no aporta nutrientes y energa para el crecimiento). Sin embargo, el trmino cometabolismo, ha sido el ms ampliamente empleado para describir el proceso donde un compuesto es transformado fortuitamente, sin ser utilizado como sustrato para el crecimiento como fuente de energa. Generalmente, los productos del cometabolismo son metabolitos subproductos parcialmente oxidados transformados, que pueden ser utilizados por otros microorganismos y de esta forma continuar hasta la degradacin completa del compuesto contaminante. El cometabolismo puede suponer un requisito previo a la mineralizacin de muchos compuestos recalcitrantes, tales como los Hidrocarburos Aromticos Policclicos (PAHs) (Atlas, 1997; US E.P.A, 1994). 1.8.3.2. Factores que inciden en la biorremediacin de suelos contaminados Los factores que afectan al rendimiento de la biorrecuperacin pueden clasificarse en tres grandes grupos: Medioambientales, Fisicoqumicos y Biolgicos (propiedades del contaminante y caractersticas del suelo). Estos factores pueden ser modificados, en algn grado, por el hombre, con el objeto de acelerar y/ reformar estos procesos naturales, optimizndolos para conseguir mejores resultados en el menor tiempo posible.

Factores Medioambientales:
Los factores medioambientales son aquellos que afectan directamente el crecimiento y actividad de los organismos que llevan a cabo la biodegradacin. Dichos factores determinan la efectividad y velocidad de la degradacin, y pueden limitar el crecimiento microbiano y la disponibilidad de los contaminantes en el suelo (Volke Seplveda, 2002). Entre stos, los que revisten mayor importancia en el proceso de biodegradacin son:

o Temperatura o pH del suelo o Humedad del suelo o Disponibilidad de oxigeno o Disponibilidad de nutrientes.

Temperatura:
La temperatura del suelo afecta considerablemente la actividad microbiana y las tasas de biodegradacin. La mayora de las especies bacterianas presentes en los suelos son clasificadas como mesfilas, las cuales se desarrollan entre 15 C y 45 C, teniendo un intervalo de crecimiento ptimo entre 25 C y 35 C (Madigan et al., 1999).Por regla general, se considera que aproximadamente por cada 10 C de incremento en la temperatura, la tasa de biotransformacin se duplica (Eweis et al., 1999; Van Deuren et al., 1997). Ello se atribuye a un aumento en la solubilidad del contaminante y a una disminucin de los compuestos adsorbidos en la matriz del suelo, conforme aumenta la temperatura. De esta forma, se maximiza la biodisponibilidad del compuesto contaminante, resultando en un crecimiento en la tasa de biodegradacin. Regularmente, a temperaturas mayores a 40C decrece la biotransformacin, debido a la desnaturalizacin de las protenas y enzimas microbianas; a temperaturas aproximadas a 0 C, se detiene esencialmente la biodegradacin (Sims et al., 1990). Es necesario considerar que el clima de la regin norpatagnica presenta temperaturas promedio menores a las reportadas como ptimas, durante perodos de tiempo prolongados, por lo cual los tratamientos biolgicos realizados a campo pueden extenderse ms de lo esperado, debido a las fluctuaciones de la temperatura ambiente. pH del suelo: La presencia de contaminantes extremadamente cidos alcalinos, pueden llevar el pH del suelo a valores inhibitorios para el desarrollo microbiano. El crecimiento de muchos microorganismos, particularmente del suelo, es mximo a pH aproximadamente neutro, es decir en un intervalo de 6.5 a 8. Por lo tanto, condiciones altamente cidas alcalinas generalmente inhiben las funciones microbiolgicas. El pH del suelo afecta tambin la solubilidad del fsforo, un nutriente importante para los microorganismos, y el transporte de metales peligrosos en el suelo, los cuales se encuentran presentes en muchos contaminantes. La solubilidad del fsforo se maximiza a niveles de pH de 6.5 y el transporte de metales se minimiza a valores de pH superiores a 6 (Eweis et al., 1999). Humedad del suelo: El agua presente y el Potencial de Matriz del suelo revisten una gran importancia en el proceso de biorremediacin, ya que regulan la actividad microbiana. El agua es el mayor constituyente del protoplasma bacteriano, por lo tanto su suministro es esencial para el crecimiento y desarrollo de los microorganismos. En adicin, es el medio de transporte por el que los compuestos orgnicos y nutrientes se difunden al interior de la clula, y los productos metablicos emigran al exterior.

El Potencial de Matriz es la energa requerida para superar las fuerzas capilares y adsorbentes (originadas en la interfase slido - lquido) y extraer el agua de los poros del suelo. Segn sea menor mayor el contenido de agua, la energa destinada por los microorganismos para este proceso, ser mayor menor respectivamente (Eweis et al., 1999; US E.P.A, 1996). La presencia de agua determina muchas propiedades del suelo, afectando el estado de aireacin (difusin del oxgeno), la naturaleza y cantidad de materiales solubles, y el pH. La aireacin y humedad se encuentran estrechamente relacionadas ya que el espacio poroso del suelo no llenado por agua, es llenado por gas; un exceso de agua origina un suelo saturado, inhibiendo as el intercambio de gases y la difusin del oxgeno (la solubilidad del oxgeno en el agua es muy baja) a travs del perfil edfico. De esta forma, pueden generarse zonas de anaerobiosis y, como consecuencia, la eliminacin de especies bacterianas aerobias, principales responsables de la biodegradacin. Generalmente, la actividad microbiana, medida como tasa de biodegradacin, es ptima a niveles de humedad comprendidos entre el 60 y 80% de la capacidad de retencin de agua del suelo capacidad de campo[1] (US E.P.A, 1996). Disponibilidad de Oxgeno: El oxgeno (O2) puede constituir uno de los factores limitantes para el desarrollo del proceso de biodegradacin en suelos, sedimentos y acuferos. La presencia del oxgeno como aceptor terminal de electrones es esencial en el metabolismo microbiano aerbico. En particular, como ya se mencion anteriormente, los pasos iniciales en la biodegradacin de hidrocarburos, implican generalmente, la oxidacin del sustrato mediante oxigenacin (ganancia de oxgeno), lo cual supone una gran demanda de este elemento (Atlas, 1997). Las concentracin de oxgeno en el suelo, puede ser aumentada labrando, drenando y/ volteando el suelo no saturado, para incorporar el oxgeno atmosfrico en el sistema (Kincannon, 1972). En prcticas de biotratamiento realizadas en forma ex situ (compostaje, biopilas, predios de tratamiento), y en sistemas de tratamiento in situ, el oxgeno puede ser incorporado mediante dichos procedimientos. El uso de sistemas de bioventeo, donde el aire es forzado a ingresar en el suelo, llevando el oxgeno a los microorganismos, constituye otra opcin pero a un mayor costo (US E.P.A, 1996). Disponibilidad de Nutrientes: El metabolismo microbiano est orientado hacia la reproduccin de los organismos. Ello requiere que los componentes qumicos de la clula se encuentren disponibles para la asimilacin y sntesis del nuevo material celular. Los nutrientes necesarios son asimilados

slo si se encuentran en determinados estados elementales, es por ello que la cantidad y el estado de los mismos, es muy importante en el diseo y operacin de los tratamientos biolgicos de suelos y aguas contaminados. El carbono, el nitrgeno y el fsforo son los nutrientes de mayor importancia. stos pueden limitar la velocidad de degradacin microbiana, si no se encuentran en concentraciones suficientes y en un estado asimilable por los microorganismos. (US EPA, 1994; Atlas, 1997). Los contaminantes orgnicos biodegradables proveen una fuente de carbono. El Carbono total es medido como Carbono Orgnico Total (TOC: En Ingls: Total Organic Carbon), y sta es una medida del sustrato disponible para el crecimiento microbiano. Todos los compuestos orgnicos presentes en el suelo estn incluidos en el TOC. El nitrgeno puede ser asimilado por la flora microbiana en forma de nitrgeno orgnico, amonaco (NH3), nitritos (NO2) y nitratos (NO3), y el fsforo en su forma soluble reactiva (o-PO4). Numerosos estudios y experiencias han demostrado la importancia de la presencia de stos nutrientes en los procesos de biodegradacin de derrames de petrleo (Atlas & Bartha, 1972; Bartha & Atlas, 1973; Leahy & Colwell, 1990). Se considera que una relacin C:N:P (Carbono/ Nitrgeno/ Fsforo) = 100:10:1 es ptima para el proceso de biodegradacin de contaminantes orgnicos (US EPA, 1994), siempre que los nutrientes se encuentren en forma disponible para su asimilacin. Los suelos de la Patagonia presentan naturalmente un marcado dficit de nitrgeno y de fsforo, y las comunidades bacterianas presentes en estos sitios se encuentran altamente adaptadas a estas condiciones ambientales. La incorporacin de nutrientes en altas concentraciones puede provocar un efecto adverso al deseado, provocando una fase de latencia retardo en el crecimiento microbiano. Se han realizado trabajos en suelos patagnicos contaminados por hidrocarburos del petrleo (Luque et al., 1996; Pucci et al., 2003), con el objeto de determinar la cantidad ptima de nutrientes para la biorremediacin, llegando a la conclusin de que una relacin C:N:P = 100:1:0.1, sera efectiva en este tipo de suelos. Otros nutrientes como el potasio, el calcio, el magnesio y el azufre, se encuentran habitualmente disponibles en forma natural en la mayora de los suelos. Sin embargo, altas concentraciones de calcio y de magnesio pueden precipitar los fosfatos, y reducir la cantidad disponible para el metabolismo microbiano. En la Tabla III se sintetizan los parmetros ambientales crticos para la actividad microbiana en el suelo: Factores Fisicoqumicos:

Entre los factores fisicoqumicos se incluyen aquellas propiedades tanto del suelo como del contaminante, que pueden afectar la biodegradacin. El xito de la biorrecuperacin de un contaminante orgnico en el suelo, depende de que ste sea biodegradable, es decir que la flora microbiana presente posea las rutas metablicas adecuadas, y de que se encuentre biodisponible accesible al organismo. Los factores fisicoqumicos que determinan la biodegradabilidad del contaminante y su biodisponibilidad, pueden ser divididos en dos grandes grupos: Factores relativos al sustrato Factores relativos al suelo Factores relativos al sustrato: La composicin y estructura qumica del contaminante (tipo de compuesto, elementos qumicos constituyentes, grado de ramificacin, grado de insaturacin, naturaleza y efecto de los sustituyentes, peso molecular, etc.), la concentracin y sus propiedades fsicas como: solubilidad, viscosidad, volatilidad y densidad, determinarn la interaccin del contaminante con el suelo y con la comunidad microbiana presente. En suelos contaminados por vertidos de productos del petrleo, la identificacin y evaluacin de las propiedades fsicas y qumicas del residuo es esencial para llevar a cabo la remediacin del sitio afectado. La biodegradabilidad de un compuesto depende de su solubilidad. En general, al aumentar la solubilidad de un contaminante, la disponibilidad para los microorganismos aumenta. Como ya se describi anteriormente, los microorganismos toman el carbono orgnico, los nutrientes inorgnicos y los aceptores de electrones necesarios para el crecimiento, de la fase lquida, as, si el contaminante se encuentra en esta fase, ser incorporado con mayor facilidad en el metabolismo microbiano. No obstante, un microorganismo puede tener la capacidad de asimilar un compuesto poco soluble en agua, mediante el contacto directo con gotas del contaminante ms grandes que la clula, con gotas de ste suspendidas en la fase acuosa (Reddy et al., 1982; Singer & Finnerty, 1984).

Volatilidad:
La volatilizacin es el proceso en el cual un contaminante se difunde desde la fase slida liquida a la fase gaseosa. La velocidad de este proceso en el suelo es funcin de su concentracin, presin de vapor y solubilidad. La humedad, temperatura, porosidad y el contenido de materia orgnica y arcillas del suelo, tambin influirn en la volatilizacin del compuesto de lo contrario, en su retencin en las fases slida lquida del suelo (Eweis et al., 1999; Mc Millen et al., 2001).

Los hidrocarburos del petrleo ms livianos, como las gasolinas, tienden a ser mayormente removidos del suelo por volatilizacin y, en menor grado, por biodegradacin. Los productos medios del petrleo, como el kerosene y el gas oil, contienen menores porcentajes de constituyentes voltiles, por lo cual la remocin por biodegradacin de estas fracciones, puede suponerse ms significativa que por volatilizacin. En el caso de los componentes ms pesados no voltiles, como los aceites lubricantes, la biodegradacin es uno de los principales mecanismos de eliminacin de los mismos desde la matriz del suelo, siendo la volatilizacin insignificante en su sustraccin (Maila & Cloete, 2005).

Densidad:
La densidad de los hidrocarburos es expresada convencionalmente en Grados API (American Petroleum Institute). Los Grados API son una medida de la densidad especfica del hidrocarburo, medida a 60 F (15C). Como punto de referencia, el agua tiene 10 API. La composicin de los distintos tipos de crudo es reflejada en su valor de Grados API. A modo de ejemplo, los crudos pesados, de menos de 20 API, tienen mayores concentraciones de asfaltenos y resinas que aquellos crudos ms livianos, de densidades mayores a 20 API. Los Grados API de los productos de refinacin del crudo varan dependiendo del producto, partiendo de 15 para el Fuel Oil N 6 hasta 62 para las Gasolinas. Tomando la densidad especifica como medida, el petrleo crudo es menos denso que el agua, con una densidad entre 0.85 a 0.98. La migracin de un compuesto en un medio depende de su densidad y viscosidad. La densidad determina la tendencia de la fase inmiscible del contaminante, a flotar sumergirse en la superficie del suelo, y por consiguiente la zona donde ste quedar concentrado (Volke Seplveda, 2002).

Viscosidad:
Este parmetro es una medida de la resistencia interna de una sustancia a fluir. Los materiales altamente viscosos no fluyen rpidamente, mientras que los ms livianos y menos viscosos, como el agua, pueden fluir fcilmente, atrados por la gravedad. La viscosidad de un fluido tiende a decrecer conforme aumenta la temperatura a la que est expuesto. La viscosidad constituye una propiedad significativa del contaminante, ya que determina, en parte, su percolacin en el suelo.

Factores Relativos al Suelo:

Tamao de partcula. Los suelos se clasifican en funcin de su tamao de partcula, siendo sus tres principales componentes las arcillas (< 0.002 mm), los sedimentos (0.002 - 0.05

mm) y las arenas (0.05 - 2.0 mm). Es importante considerar esta propiedad, ya que la relacin rea/volumen de los diferentes tipos de partcula, tienen un impacto directo sobre las propiedades fsicas, qumicas y biolgicas del suelo, y por consiguiente en las tecnologas de remediacin. En general, los materiales no consolidados (arenas y gravas finas) son ms fciles de tratar (Van Deuren et al. 1997, Eweis et al. 1998). Heterogeneidad. Un suelo demasiado heterogneo puede impedir el uso de tecnologas in situ que dependan del flujo de un fluido. Pueden crearse canales indeseables de fluidos en las capas arenosas y arcillosas, dando como resultado tratamientos inconsistentes (Van Deuren et al. 1997). Densidad aparente. Es el peso del suelo por unidad de volumen, incluyendo agua y espacios. Es importante considerar que el suelo est compuesto por slidos y espacios llenos de agua y/o aire, y que su densidad depender de su humedad. Es til para realizar clculos para el transporte del material (Van Deuren et al. 1997). Permeabilidad. Se refiere a la facilidad o dificultad con la que un lquido puede fluir a travs de un medio permeable. La permeabilidad de un suelo es uno de los factores que controla la efectividad de tecnologas in situ (Sellers 1999). En general, una baja permeabilidad en el suelo disminuye la efectividad de la mayora de las tecnologas de remediacin. Factores Biolgicos: Para que una tcnica de biorremediacin opere eficientemente, deben cumplirse varias condiciones: El residuo debe ser susceptible de biodegradarse biolgicamente, y presentarse en una forma fsica que sea susceptible a los microorganismos. Deben estar disponibles los microorganismos apropiados. Las condiciones ambientales (como el pH, la temperatura y el nivel de oxgeno) deben ser las apropiadas. (Braid, 2001)

1.9. Mtodos Analticos para la Determinacin de Hidrocarburos

Debido a la diversidad de compuestos que forman el petrleo, generalmente no es prctico analizarlos a cada uno individualmente, siendo til medir la cantidad total de hidrocarburos que se encuentran en una muestra particular de suelo, agua o aire. A este grupo de compuestos que forman el petrleo se lo denomina hidrocarburos totales del petrleo (HTP o TPH).

Los HTP son definidos por el mtodo analtico que se utiliza para determinarlos. Las tcnicas convencionales cuantifican solamente aquellos hidrocarburos que son extrados de la muestra y debido a que la extraccin de hidrocarburos vara de una tcnica a otra, la misma muestra analizada por distintos mtodos, producirn distintos resultados (API, 2001). Existen diversas tcnicas analticas disponibles que miden concentraciones de HTP en el ambiente. Las tcnicas varan en la forma en que los hidrocarburos son extrados, purificados, y detectados, cada uno mide un subgrupo de derivados de hidrocarburos presentes en las muestras. La definicin de los HTP depende del mtodo analtico utilizado (TPHCWG; 1998).

Mtodo 418.1 U.S. E.P.A.: consiste en una extraccin con solvente seguido de un tratamiento en columna de slica gel y luego la cuantificacin por espectroscopia infrarroja.

Mtodo 413.1 para aceites y grasas: es un mtodo gravimtrico que consiste en una extraccin con solvente, evaporacin del solvente, y determinacin del peso.

Mtodo 8015M para Compuestos Orgnicos del Rango Diesel (DRO): es una extraccin con solvente seguida de una determinacin por cromatografa gaseosa (GC).

Mtodo 8015M para Compuestos Orgnicos del Rango de las Gasolinas (GRO): es una extraccin con solvente seguida de una determinacin por cromatografa gaseosa.

1.9.1. Anlisis Qumicos de Hidrocarburos Totales por Espectroscopia Infrarroja.

Se define Hidrocarburos Totales (HTP) analizados por espectroscopia IR, a cualquier hidrocarburo extractable por un solvente, el cual no es removido por la slica gel y que puede ser detectado por un espectrofotmetro de radiacin infrarroja. La principal ventaja del mtodo es que resulta simple, rpido y comparativamente econmico. Las desventajas son la menor especificidad, comparndolo con GC, y su incapacidad de proveer informacin en la identificacin de los hidrocarburos y su riesgo potencial. Cuando una molcula absorbe radiacin IR aumenta la frecuencia de vibracin de la misma. La espectroscopa infrarroja determina la energa absorbida por las molculas en esta regin del espectro electromagntico. Los distintos grupos funcionales y tipos de enlaces tienen distintas frecuencias e intensidades de absorcin. Los mtodos para la medicin de HTP miden la absorcin de los enlaces C-H. La mayora de los mtodos miden la absorcin a una nica frecuencia (generalmente 2930cm-1) que corresponde a los grupos alifticos CH2.

Otros mtodos usan ms de una frecuencia, por ejemplo 2960cm-1 para el grupo CH3 y de 3000 a 3100cm-1 para los enlaces C-H de los compuestos aromticos (Willard et al, 1991). La espectroscopa IR puede medir cualquier compuesto que contiene grupos alqulicos en su molcula. Cuando se utiliza esta nica frecuencia, se mide cadenas parafnicas, cicloalcanos, alquenos, aromticos sustituidos, hidrocarburos aromticos policclicos (HAPs) si tienen algn grupo alquilo, y molculas oxigenadas (teres, alcoholes). Los mtodos basados en una sola frecuencia no son adecuadas para la medicin de benceno o naftaleno porque no contienen grupos alquilos. La extraccin se realiza con un solvente adecuado que no contenga enlaces C-H. La tcnica que se utiliza para la extraccin es la recomendada en la norma 5520 E de los mtodos normalizados utilizados generalmente para lodos. La extraccin de hidrocarburos se obtiene utilizando CCl4 como solvente de extraccin. Posteriormente se trata la muestra con silicagel para adsorber los compuestos polares que puedan interferir con la determinacin de hidrocarburos totales de petrleo. De acuerdo al mtodo 418.1 de la Environmental Protection Agency la cuantificacin se lleva a cabo por espectroscopia infrarroja. El espectrofotmetro IR se utiliza para determinar la absorbancia de los extractos en la regin cercana a 2930 cm.-1. Estndares especficos para hidrocarburos totales de petrleo (HTP) se emplean para construir la curva de calibracin del equipo. Los estndares se preparan a partir de una solucin stock de hexadecano, isooctano y colorobenceno en proporciones definidas. Debido a que el mtodo de cuantificacin del analito es sensible a hidrocarburos que derivan de animales y vegetales as como a otros compuestos polares, es necesario eliminar tales interferentes, para preservar en el extracto los hidrocarburos petrognicos. Este procedimiento de purificacin del extracto, permite diferenciar las grasas y aceites de origen animal y vegetal, de los hidrocarburos totales de petrleo. La eliminacin de interferentes puede realizarse utilizando columnas con material adsorbente a travs de la cual se hace pasar el extracto o se puede adicionar al extracto una sustancia adsorbente en forma de pequeas partculas y luego removerla a travs del filtrado. Existe una variedad de tcnicas que utilizan entre otros: almina, slica gel, geles que funcionan por el principio de exclusin por tamao, cobre y mercurio (para la remocin de sulfuro). NOTAS:

[1]

La Capacidad de Campo es un trmino frecuentemente empleado, asociado a la humedad de un suelo, que describe la capacidad de un suelo para retener agua, una vez que ha cesado el drenaje interno debido a la fuerza de gravedad

OBJETIVOS

1.1. Objetivos Generales

Participar en las distintas etapas de un trabajo de investigacin: bsqueda bibliogrfica, diseo experimental, puesta a punto de tcnicas analticas, interpretacin de resultados y redaccin de tesis. Integrar las distintas disciplinas que conforman la Lic. en Saneamiento y Proteccin Ambiental.

1.2. Objetivos Especficos

Determinar los niveles de hidrocarburos totales en suelos contaminados artificialmente a lo largo de la experiencia. Estudiar el comportamiento de la microbiota conformada por bacterias hetertrofas totales a lo largo del tiempo. Determinar la factibilidad del uso del agua residual tratada para estimular los procesos de biodegradacin de hidrocarburos en suelos. Comparar dos tratamientos de Biorremediacin de suelos en los que se utiliza distintos mtodos de estimulacin del proceso.

FUNDAMENTACIN
La actividad hidrocarburfera ha producido y produce alteraciones en el suelo por la ocurrencia de derrames de petrleo y derivados, tanto en forma accidental como por malas prcticas operativas desarrolladas antiguamente. Como consecuencia de ello, se afectan las propiedades fsicas y fisicoqumicas del suelo producindose la degradacin del mismo. Las polticas ambientales actuales establecen un uso apropiado de los recursos naturales y marcan la tendencia a la proteccin y recuperacin de los ambientes degradados como resultado de la intervencin antrpica; con el fin de lograr la sustentabilidad de aquellas actividades econmicas donde el ambiente se vea comprometido. El desarrollo y aplicacin de tecnologas para la restauracin de ambientes degradados en el nivel internacional ha sido considerable, sin embargo en nuestro pas el avance cientfico en la temtica ambiental se encuentra en una etapa inicial. Una estrategia adecuada para

minimizar la contaminacin es la disminucin de la reactividad y peligrosidad del contaminante. Existen diversas tcnicas destinadas a la rehabilitacin de ambientes comprometidos, denominadas en su conjunto Tcnicas de Remediacin. Mediante el uso y aplicacin de estas tecnologas es posible la restauracin recuperacin, es decir el retorno a las condiciones previas a la contaminacin , al menos similares, de suelos y cuerpos de agua subterrneos y superficiales, para su posterior reutilizacin y aprovechamiento Es por ello que la investigacin para la optimizacin de mtodos de remediacin y su adaptacin a las condiciones locales, es de extrema importancia y constituye un aporte al progreso del conocimiento y la investigacin en el mbito nacional y regional.

HIPTESIS
Los microorganismos pueden degradar los hidrocarburos de suelos contaminados, utilizando los nutrientes inorgnicos aportados por las aguas residuales tratadas

Materiales y Mtodos 1.10. Caractersticas del rea

El rea se encuentra prxima a la barda que se ubica paralela al Ro Neuqun, presenta una superficie bastante quebrada, con pendientes cortas pero pronunciadas, es una de las pocas reas relativamente llanas que se pueden encontrar en el territorio. Presenta algunos cauces temporarios con gran concentracin de sales. Las precipitaciones caractersticas de la zona son de corta duracin pero torrenciales, en una sola lluvia puede completarse la media de precipitaciones esperada para ese mes del ao, la cada del agua de lluvia modifica el relieve con regularidad arrastrando el material erosionable de las bardas.

1.10.1.Caractersticas climticas
El aire que ingresa a la zona desde el Ocano Pacfico descarga toda su humedad al pasar por la Cordillera de los Andes. No llegan vientos desde el Ocano Atlntico. Durante el verano la regin presenta una temperatura media es de 25 C, mientras que en invierno la media puede variar entre 4 y 6 C. Tambin pueden presentarse algunas heladas. Las precipitaciones son escasas, no superan los 200 mm. anuales, las altas temperaturas y los vientos carentes de humedad evaporan el agua y contribuyen a la aridez de la regin (Prez, D. R: Navarro, M. C. 2005).

A pesar de su situacin dentro de un oasis es una regin bastante desrtica, tiene un clima estival netamente desrtico, es decir caluroso y seco, atenuado por la gran amplitud trmica que hace descender la temperatura por las noches. La diferencia entre la temperatura del mes ms caliente y la del ms fro se eleva a 17.5 C. Los vientos promedio son de 18 km/h en diciembre y de 9 km/h en julio. La temperatura media del mes de enero - el mes ms clido- se ubica en los 23.2 C y en el mes ms fro, julio, es de 5,7 C. La Tabla N 2 presenta los datos caractersticos el al regin en estudio.

1.10.2.Condiciones climticas del rea.

Condicin climtica Temperatura media anual Amplitud media anual Temperatura mxima anual Perodo libre de heladas (das) Lluvias (mm) Dficit hdrico anual Exceso anual de agua Clima Rgimen de humedad del suelo Rgimen de temperatura del suelo Vegetacin Medicin 14 C 16C 20-23C 150-180 130 500>=600 0 rido Ardico Trmico msico Estepa arbustiva

1.10.3.Caractersticas del Sitio Seleccionado

Para la realizacin de esta experiencia se trabaj con suelos provenientes de la provincia de Neuqun, representativos de la regin. Se seleccion este sitio porque se encuentra dentro de los lmites de la ciudad y en este lugar no se registraron derrames de petrleo o sus derivados, tampoco se ha desarrollado la actividad hidrocarburfera. A partir de estas observaciones es que se incrementan las posibilidades de obtener un suelo sin afectaciones, lo cual facilita la labor de contaminacin del suelo con la concentracin contaminante predeterminada.

1.10.4.Ubicacin
En la imagen satelital, se observa que el sitio donde se obtuvo el suelo se encuentra en la zona Norte de la Ciudad de Neuqun.

Ciudad de Cipolletti Ubicacin del sitio

Ciudad de Neuqun

Ro Neuqun

Ro Limay El lugar donde se extrajo el suelo para realizar la experiencia se ubica en el sector norte de la Ciudad de Neuqun.

Acceso a Barrio Rincn de Emilio

Sitio de obtencin del suelo Universidad Nacional del Comahue

Calle Leloir

Sitio de obtencin del suelo tomando como referencia la Universidad Nacional del Comahue. En imagen anexa la ampliacin del sitio, al Noroeste del acceso al Barrio Rincn de Emilio.

El suelo para realizar la experiencia, proviene de un sitio ubicado sobre las coordenadas del sistema Gauss Kruguer campo inchauspe X: 2581750, Y: 4691616 y Z: 270.

Sitio de donde se extrajo el suelo. No se registraron precipitaciones en los siete das precedentes a la extraccin del material por lo que el suelo se present relativamente seco.

1.11. Obtencin del Suelo y Pretratamiento

El suelo se extrajo de los 15 centmetros superficiales, utilizando una pala barreno para excavar y bolsas de polietileno de alto micronaje como recipiente para el transporte. El suelo en ese momento presentaba un aspecto suelto, con pocos agregados y de apariencia arenopedregosa. Se tomaron alrededor de 80 Kg de suelo, este lote fue homogenizado en el lugar por medio de volteos sucesivos sobre una membrana de polmero plstico. Una vez transportado al laboratorio, el suelo se dej secar al ambiente durante 48 horas. Posteriormente se homogeneiz utilizando un mortero de porcelana y se pas a travs de una malla metlica de 2mm (12 mesh). Este material que luego del proceso se torn en apariencia arenoso, como se muestra en la Figura N 5, se deposit en cuatro bateas plsticas.

Recipiente conteniendo el suelo pretratado en el laboratorio. Una porcin de aproximadamente 300 g de suelo se envi al Laboratorio de Servicios Agrarios y Forestales (LASAF) perteneciente al Ente Provincial de Agua y Saneamiento para su anlisis fisicoqumico. Se determin la textura de las muestras a travs del mtodo de Bouyocus. Para la medicin del pH se utiliz la tcnica de medicin potenciomtrica de pH en pasta y pH hidrlisis 1:2,5. Para la determinacin de la materia orgnica se utiliz el mtodo Walkley Black En la determinacin de la conductividad elctrica se utiliza un conductmetro sobre el extracto de saturacin, aunque tambin pueden utilizarse distintas diluciones de suelo en agua. El contenido de Fsforo se determin por medio del mtodo Olsen sobre la cantidad de fsforo extrada por una solucin de bicarbonato de sodio (extractante Olsen).

1.12. Enmienda del Suelo Correspondiente al Tratamiento EST

La incorporacin de nutrientes al suelo se llev a cabo respetando la relacin C/N/P 100:10:0,1 (Adams Shroeder, R.H. et al. 1999). Para lo cual se agreg Triple 15 (15% de N, 15% de P2 O5 y 15% de K2O) y NH4NO3.

Se incorpor las siguientes cantidades a 1500 g de suelo: Triple 15 450 mg. NH4NO3 720 mg.

1.13. Fortificacin del Suelo con Hidrocarburos

Se utiliz una solucin de fortificacin de aceite mineral monogrado para motores de vehculos, marca YPF, tipo SAE 30 normal, esta solucin se denomin solucin de fortificacin. El solvente utilizado fue fren. Para todas las experiencias se prepar una nica mezcla suelo- contaminante (el contaminante fue aceite de motor virgen) que se distribuy en los distintos recipientes. La solucin de fortificacin, se prepar, en una relacin de 500 mL de fren y 20 g de aceite contaminante por cada 1000 g de suelo, con el objeto de obtener una contaminacin inicial del 2%. Luego de agregada la solucin de fortificacin se homogeneiz el suelo por completo, mezclando a intervalos de 2 h. El suelo contaminado presentaba la textura arenosa original, aunque con una coloracin ms oscura, consistencia pastosa y sin olor apreciable. El fren se dej volatilizar durante 24 horas bajo campana, homogeneizando el suelo a intervalos regulares. Una vez finalizada sta operacin, el suelo fue dispuesto en los recipientes plsticos correspondientes donde se sometern a los distintos tratamientos.

Imagen del suelo luego de la contaminacin.

1.14. Diseo Experimental

Se realizaron dos tratamientos de biorremediacin, el primer tratamiento es un proceso de biorremediacin tradicional llamado en este trabajo EST, y el otro es un tratamiento de biorremediacin donde los nutrientes inorgnicos y la humedad son aportados por el efluente tratado de la Planta Depuradora de Lquidos Cloacales del Parque Industrial de la Ciudad de Neuqun, y fue denominado EFL. Los tratamientos se llevaron a cabo en recipientes plsticos, en cada uno de los cuales se coloc 1500 g de suelo para facilitar la homogeneizacin del mismo (Figura N 6 y N 7). El diseo experimental fue el siguiente: Cuatro recipientes correspondientes al tratamiento EST. Cuatro recipientes correspondientes al tratamiento EFL. Dos recipientes para los suelos control del tratamiento EST. Dos recipientes para los suelos control del tratamiento EFL. Estos recipientes fueron almacenados en estantes, a una temperatura de 20 C con una variacin de 1 C. Dos veces por semana se aire y mezcl todo el contenido de cada maceta con una esptula, y la reposicin del agua evaporada se realiz por adicin de 50 mL de agua dos a tres veces por semana, esto ltimo con el objeto de mantener la humedad del suelo cercana al 10% (Ercoli, E. et al., 2000).

Espacio fsico donde se almacenaron las macetas. El muestreo para el anlisis de hidrocarburos totales de petrleo y recuento de microorganismos hetertrofos totales se realiz a los 0, 15, 30, 60 y 90 das. Se realizaron recuentos estndar en placa de los lquidos cloacales utilizados. Reactivos y Materiales para la Determinacin de Hidrocarburos Totales en Suelos Para la realizacin del presente trabajo, se utilizaron los siguientes reactivos de laboratorio: Tetracloruro de carbono pro anlisis (Merck). Tetracloruro de carbono grado espectroscpico (Merck). Acetona pura (Dorwil). Silica Gel, 100-200mesh (Merck). Sulfato de Sodio anhidro (Baker). Mezcla de Referencia, en relacin 15:15:10 de n-hexadecano: isooctano: clorobenceno; respectivamente (Buck Scientific, Inc.). El Instrumental utilizado fue el siguiente: Balanza analtica (Figura N 10). Balanza granataria (Figura N 10). Espectrofotmetro IR Buck Scientific M500, de Haz Simple (Figura N 8).

Espectrofotmetro IR. Miscelneos Mortero de porcelana. Tamiz, 2mm. Material de vidrio de uso corriente en el laboratorio. Equipo para extraccin por Soxhlet. Manta calefactora para balones de 25 mL. Agitador magntico. Papel de filtro, banda negra, Whatman N 40, de 9 cm de dimetro. Estufa de secado (Figura N 9). Pipeta automtica. Dispenser para medios de cultivo. Vrtex. Autoclave.

Estufa para esterilizacin. Estufa para cultivo de bacterias.

Estufa de secado.

Balanza analtica y balanza granataria. Toma de Muestras de Suelo para Anlisis Qumicos

Se tom una muestra por cada maceta de la siguiente forma: primero se realiz la homogeneizacin de todo el contenido de la maceta empleando una esptula, luego se dividi la superficie del suelo dentro de las macetas, formando una cuadrcula de nueve cuadrantes, de estos cuales se tom una porcin de suelo de tres de ellos elegidos al azar, las porciones de suelo se mezclan para conformar una nica muestra.

M M Maceta

1 4 7

2 5 8

3 6 9

Se elige en forma aleatoria tres cuadrantes, de los cuales se toma una porcin de suelo, por ejemplo: cuadrantes 2, 5 y 9.

Recipiente para muestras m m Metodologa de muestreo para anlisis de HTPs. El procedimiento se repite para cada muestra a analizar. Preparacin de las Muestras para el Anlisis de Hidrocarburos Totales en Suelo A cada una de las muestras as obtenidas se las deposit en un erlenmeyer numerado, el cual fue tarado, posteriormente se agrega Na2SO4 anhidro con el objeto de capturar la humedad remanente en la muestra, la boca del erlenmeyer se cierra con un film de polietileno para evitar el intercambio de humedad entre la muestra y el ambiente. De esta forma, la muestra queda preparada y debe almacenarse durante 24 hs, tiempo suficiente para que el Na2SO4 retenga toda la humedad de la muestra. Extraccin de Hidrocarburos del Suelo El erlenmeyer conteniendo el suelo se pesa en balanza analtica para precisar su contenido por diferencia entre el peso del erlenmeyer vaco y el peso del erlenmeyer con el suelo. En el momento de la extraccin, el suelo contenido en el erlenmeyer se

trasvasa a un cartucho de papel para utilizar en el equipo de extraccin soxhlet. Aproximadamente 7 g. se tulizarn para la extraccin La extraccin se llev a cabo con CCL4 y realiz utilizando un equipo soxhlet por cada muestra, y mantas calefactoras con balones de 25 mL. Dentro del equipo de extraccin, el solvente recircula constantemente, evaporndose desde el baln inferior y condensndose en el refrigerante superior para gotear sobre la muestra en el cuerpo central del equipo de extraccin. Una vez que el solvente en el cuerpo central alcanza determinado nivel, la muestra se encuentra completamente en contacto con el solvente y un mecanismo sifn, drena el solvente desde el cuerpo central al baln en la parte inferior del equipo recomenzando el ciclo. Al completarse el tiempo de extraccin (4 hs.), se enfra y filtra la solucin, y se lleva a volumen en matraz de 25 mL.

Equipos de extraccin por soxhlet. Eliminacin de Interferencias Debido a que el mtodo de cuantificacin del analito es sensible a sustancias que derivan de animales o vegetales as como a otros compuestos polares, es necesario eliminar tales interferentes, con el objeto de preservar en el extracto los hidrocarburos petrognicos. Para lograr esto, se tratan 10 mL. del extracto obtenido con 3 g. de slicagel 100-200 mesh utilizando un erlenmeyer, se homogeneiz por medio de un agitador magntico durante 15 minutos, y posteriormente al extracto se lo filtr, empleando para ello papel

de filtro de tipo Whataman banda negra de 9 cm. de dimetro y embudos de vidrio. Los extractos obtenidos del filtrado, se cierran hermticamente y se almacenan refrigerados Construccin de la Curva de Calibracin Para cuantificar HTPs del suelo se prepararon soluciones estndar de hidrocarburos de concentracin conocida, utilizadas para construir luego la curva de calibracin. Las soluciones estndar fueron preparadas a partir de una solucin Stock obtenida de una mezcla de Referencia (Referece Oil), La misma est compuesta por una mezcla de 15:15:10 de n-hexadecano; isooctano y clorobenceno respectivamente. La solucin de referencia tiene un valor certificado de 99,95% de HTP. Posteriormente se registraron los valores de Absorbancia a 2939,7 cm-1 utilizando una celda de cuarzo de 1cm. En base a las soluciones concentraciones de las patrn preparadas y las absorbancias obtenidas de las mismas, se logra confeccionar la Tabla N 3. Valores de absorbancia de soluciones standard de hidrocarburos. Estndar 1 2 3 4 5 Concentracin (mg HC/ 100mL) 3,42 6,84 10,26 13,68 17,1 Absorbancia 0,1286 0,2047 0,3229 0,4121 0,4673

La correspondiente curva de calibracin se muestra en la Figura N 13. En esta curva de calibracin se exhibe en el eje de las ordenadas el valor de absorbancia obtenido, y en el eje de las abscisas el valor de concentracin de las soluciones estndar.

Curva de calibracin para HTPs. Limite de Deteccin El lmite de deteccin de la tcnica se define como la concentracin de analito que da una seal significativamente diferente a la seal de fondo blanco (Yb). Se especifica tambin como la concentracin de analito que produce una seal tres veces mayor que la desviacin estndar de la seal de fondo blanco, segn la siguiente ecuacin: Y - Yb = 3 Sb Donde: Y: Lmite de deteccin Yb: Seal del blanco (se estima utilizando el valor de la ordenada al origen de la recta expresada en (3.1)) Y Sb= S x/y = [ (yi - yi*)2 / n-2] Donde: yi : valor de absorbancia registrado para cada solucin estndar yi *: valor ajustado de yi, sobre la recta de tendencia calculada

El lmite de deteccin para esta tcnica fue determinado previamente (Brissio, 2005): x : 22,12 mg Hidrocarburo/ kg suelo seco Recuperacin del Mtodo La recuperacin del mtodo se realiza para conocer la eficiencia del mtodo de extraccin, este procedimiento influye en gran medida en la confiabilidad de los resultados. Consiste en contaminar un suelo blanco con un aceite (que en este caso se trata del mismo aceite utilizado a lo largo de todo el trabajo) a una concentracin conocida, y luego extraer el contaminante por el mtodo de extraccin seleccionado. La confiabilidad de los resultados obtenidos mediante la tcnica de extraccin por solvente, recomendada por el Mtodo 3540C de la US EPA, puede verse afectada por la prdida de analitos voltiles, lo cual constituye una limitacin reconocida de dicha tcnica. No obstante, se utiliz este procedimiento de extraccin en el presente trabajo, debido a que es altamente improbable encontrar compuestos orgnicos voltiles en el suelo analizado y a que el hidrocarburo para cuantificar es pesado. An as debe tenerse en cuenta que el mtodo puede no alcanzar el 100 % en la extraccin debido a diversas variables, por ello se calcula el porcentaje de recuperacin del mtodo. La recuperacin de la extraccin en Soxhlet, con CCl4 como solvente, de muestras de suelo contaminado de similares caractersticas a las analizadas, ha sido examinada en trabajos anteriores, obtenindose una recuperacin del 85.8 % (Brissio, 2005). Determinacin de Peso Seco del Suelo Una fraccin de 10 g de suelo se coloc en un crisol y se llev a estufa a una temperatura de 110 C hasta que el peso de la muestra se mantuvo constante. Las determinaciones se llevaron a cabo por triplicado. El porcentaje de humedad del suelo se calcul de la siguiente manera: % H = (pssa-psse)/pssax100. Donde: pssa: peso del suelo seco al aire. psse: peso del suelo seco a estufa.

1.15. Determinacin de Microorganismos Mesfilos Hetertrofos Totales

Se utiliz la tcnica del Nmero ms Probable (NMP) en medio lquido (Boonchan et al., 2000; Peressutti et al., 2003, Van Hamme et al., 2003), empleando un medio de cultivo completo (PTGY), cuya composicin se presenta en la Tabla N 4. Composicin del medio de cultivo. Componente Peptona Triptona Extracto de Levadura Glucosa MgSO4.7H2O CaCl2.2H2O Agua Destilada Peso 0.25 g. 0.25 g. 0.50 g. 0.50 g. 0.30 g. 0.0035 g. 1000 mL.

Fraccionamiento del Medio de Cultivo y del Lquido de Dilucin Luego de preparado, se fracciona el medio de cultivo en tubos de ensayo a razn de 5 mL por tubo, y se esteriliza en autoclave a 121 C y 1 atm de presin durante 15 minutos. El nmero de tubos conteniendo medio de cultivo, ser determinado por la cantidad de tubos a sembrar segn las diluciones calculadas para cada muestreo, siendo necesarios tres tubos por dilucin. Por otro lado se dispone una determinada cantidad de tubos de ensayo con 9 mL de agua destilada cada uno, para la realizacin de las correspondientes diluciones que la tcnica a efectuar indica. Estos tubos se esterilizan previamente en autoclave.

1.15.1.Toma de Muestras y Diluciones para Recuento Microbiolgico

Se toma una muestra de cada uno de los cuatro microcosmos, correspondientes a un mismo tratamiento, se recoge 1 g. en condiciones estriles, se conforma una muestra nica (pool) por tratamiento y se homogeneiza. De la misma forma se toman 5 g. en placa de petri para determinar el porcentaje de humedad del suelo. Las placas de petri conteniendo 5 g. de suelo se colocan en estufa a 110 C, hasta peso constante. El contenido de humedad del suelo se determina por la diferencia de peso, antes y despus de secarlo en estufa. El procedimiento se esquematiza en la Figura N 14.

Tratamiento EST Tubo de ensayo 9 mL. A.D.E. para dilucin 1 gr. Tubo de ensayo esterilizado Placa de Petri 5 gr. A estufa en placa de petri para determinar su peso seco A.D.E.: Agua Destilada Estril.

Macetas

Tratamiento EFL Tubo de ensayo 9 mL. A.D.E. para dilucin

1 gr. Tubo de ensayo esterilizado Paca de Petri 5 gr.

A estufa en placa de petri para determinar su peso seco Macetas A.D.E.: Agua Destilada Estril.

Toma de muestras para recuento microbiolgico. De dicha muestra nica se pesa 1 gramo y se introduce en un tubo de ensayo, conteniendo 9 mL del lquido de dilucin (agua destilada estril), el cual corresponde a un primer nivel de dilucin de 1:10 (10-1). Se agita en el vrtex. Se toma 1 mL del sobrenadante de sta primera dilucin, con una pipeta estril, y se lo coloca en un segundo tubo conteniendo 9 mL de agua destilada estril, el cual corresponde a la

segunda dilucin (10-2). As, se procede de la misma manera hasta alcanzar el ltimo nivel de dilucin establecido (10-10) (Figura N 15).

Muestra (en este caso slida)

Dilucin de la muestra 1 mL. 1 mL. 1 g.

1 mL.

A.D.E. 10 -1 10 -2 10 -3 10 - 9mL

Totalizando 10 tubos de ensayo desde la dilucin 10-1 a la dilucin 10-10

Dilucin de las muestras de suelo, para siembra de microorganismos. Siembra de las Muestras

Mesada para siembra de bacterias hetertrofas totales. Una vez que se dispone de todas las diluciones, se siembra una alcuota de 0,1 mL, por triplicado, de cada dilucin en los tubos con medio de cultivo previamente preparados (Figura N 17).

Siembra de las diluciones A.D.E 9 mL. 0,1 mL Diluciones

Medio de cultivo 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 - 10 -10

Totalizando 30 tubos de ensayo con medio de cultivo (tres por cada dilucin)

Siembra de medios de cultivo a partir de las diluciones. Este procedimiento se realiza para cada tratamiento.

1.15.2.Incubacin y Lectura
Los tubos son incubados durante 7 das a temperatura ambiente. Al octavo da se realiza la lectura de los mismos, tomndose como positivos a aquellos tubos que presentan turbidez debido al desarrollo microbiano. Luego se determina estadsticamente el nmero de bacterias por gramo de suelo seco (N bact.gr suelo-1), mediante la tabla de Mc Crady, para tres rplicas por dilucin (Ver en anexo).

1.15.3.Recuento de Microorganismos Viables

Con el objeto de estimar cual es la carga incorporada de bacterias vivas en el tratamiento EFL a travs del lquido cloacal tratado, se realiz un recuento de bacterias viables. Clula viable, se define como la que es capaz de dividirse y formar una progenie.

El mtodo preferido para este trabajo es el Recuento Estndar en Placa por la tcnica de agar volcado Pour Plate, en esta tcnica se realizan diluciones de la muestra en forma similar a la tcnica del Nmero ms Probable De cada dilucin se toman tres alcuotas de 1 mL. y se depositan cada una en una placa de petri estril, a continuacin se agrega a cada placa una cantidad de 11 o 12 mL. de agar fundido, el cual a sido enfriado a 45 C (Figura N 18) luego las placas se colocan en una mesa lisa y nivelada hasta que solidifica el agar, posteriormente se deben invertir las placas en incubar mantenindolas a temperatura ambiente por 48 hs. Es fundamental trabajar siempre en el rea de influencia del cono estril del mechero, tanto para la siembra como para el volcado del agar. Esta tcnica puede ser usada para determinar unidades formadoras de colonias por mililitro o por gramo de muestra.
Para diluciones 1 mL. Muestra (en este caso lquida) 11 o 12 mL. Agar fundido para recuento (45 C)

10 -1

10 -2

10 -3

10 -

1 mL.

Diluciones

A.D.E 9 mL. Placa de Petri Estril

Por cada dilucin se realizan tres placas de petri como la que se muestra.

Ejemplo de siembra de bacterias en placa de petri. La prctica comn, la que tiene el mayor significado estadstico, es la de contar solamente aquellas placas que tengan entre 30 y 300 colonias. Para obtener el nmero apropiado de colonias, usualmente se debe diluir la muestra a contar. Como rara vez se conoce la cuenta viable aproximada en un momento dado, suele ser necesario hacer ms de una dilucin

Resultados y Discusin

1.16. Anlisis Fsico-Qumico del Suelo Estudiado.

La tabla N 5 muestra las propiedades fisicoqumicas del suelo analizado. El suelo presenta una textura gruesa (arenosa). El pH en pasta es moderadamente alcalino. La conductividad elctrica medida en el extracto de saturacin indica suelo no salino. La relacin de adsorcin de sodio (RAS) indica suelo no sdico. En cuanto a la fertilidad est muy pobremente provisto en materia orgnica y nitrgeno, y medianamente provisto de fsforo. Anlisis fsico- qumico del suelo utilizado en el estudio.
Profundidad (cm.) Textura PH (pasta) PH (1:2,5) Conductividad (dS/M) Materia Orgnica () Carbono Orgnico () Nitrgeno () (Mox 0,05) Fsforo Olssen (ppm) Na+ Sales solubles (meq/l) (Ext. Saturacin) cationes Ca2+ 4,8 Mg2+ RAS 5,5 0-15 Arenosa 8,38 9,35 0,9 0,2 0,09 0,09 13,8 8,6

1.17. Niveles de Hidrocarburos Totales de Petrleo en el Suelo Seleccionado para el Estudio.

Previo al inicio de la experiencia se determin el contenido de HTPs del suelo seleccionado para el estudio, con el objeto de evaluar los valores base o de fondo correspondientes. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla N 6. Concentracin de hidrocarburos totales en los suelos blanco.

Anlisis estadstico para HTPs en suelo blanco. TPH Blancos

Muestras 3

Muestra
Media 102,7059 Mediana 99,04780 Mnimo 98,93680 Mximo 110,1332 Variancia 41,37630

(
Desvo Estndar 6,432441

Teniendo en cuenta los niveles propuestos por las Normas Holandesas, el suelo seleccionado para el estudio se puede considerar apto como blanco. La concentracin de HTPs presentes en el suelo seleccionado se encuentra en un orden significativamente menor a los niveles alcanzados en la contaminacin experimental, por cuanto estos valores base no interferirn en la evaluacin posterior.

1.18. Caractersticas Qumicas y Microbiolgicas del Efluente Utilizado.

En la Tabla N 8 se muestran los anlisis qumicos realizados a los efluentes cloacales tratados de la planta de tratamientos ubicada en la zona del Parque Industrial Neuqun durante el tiempo del presente estudio. Caracterizacin qumica del lquido cloacal de la Planta del Parque Industrial Neuqun.

Muesta 1 Muestra 2 Muestra 3

98 11 99

Fechas de Anlisis T0 T 30 T 60 T 90

N-NH3 (mg/L) 13 13 9 14

P total (mg/L) 1,2 1,1 2,8 4

En base a la cantidad de fsforo encontrado, en todos los casos, el agua analizada se considera como un medio hipereutrfico, al superar la concentracin de 0,1 mg/L (Orea, D. G. 1999).

La relacin DBO/DQO se presenta siempre por debajo de 0.5 lo que implica que la mayor parte de la materia orgnica presente en el agua no ser fcilmente utilizada como nutriente por los microorganismos.

En la Tabla N 9 se muestran los recuentos de microorganismos viables realizados a los efluentes cloacales tratados de la planta de tratamientos ubicada en la zona del Parque Industrial Neuqun durante el tiempo del presente estudio Recuento de microorganismos viables en el efluente a lo largo del tiempo.

Tratamiento de los Lquidos Cloacales.

La Planta Depuradora de Lquidos Cloacales del Parque Industrial, ubicada en la zona Este del Parque Industrial Neuqun, recibe los efluentes industriales y pluviales a travs de la red de drenajes. La red de drenajes industriales y pluviales, desembocan en una cmara colectora de efluentes. Un sistema de rejas retiene los slidos de mayor tamao arrastrados por las aguas a tratar, los que pueden eliminarse por medio de un peine mecnico.

Posterior a la cmara, los efluentes avanzan sobre canales desarenadotes hasta un pozo de bombas. Las bombas en el pozo operan en forma automtica por medio de un sensor de nivel que acciona las mismas evacuando el lquido crudo a un tanque ecualizador, el cual nivela el pH para que no llegue a los procesos biolgicos un pico cido o bsico. El tanque ecualizador permite adems retirar los slidos gruesos que pudieran pasar el sistema de rejas, la remocin se realiza por medio de un barredor de superficie. El lquido ecualizado pasa luego a un sedimentador tipo Imhof que cumple la funcin de sedimentador primario y digestor anaerobio de barros. Los barros estabilizados en esta unidad, son enviados posteriormente a piletas de secado.

Fecha 29/06/2005 14/07/2005 03/08/2005 21/09/2005

Res

104x1 151x1 75x 1 94x1

Una parte fundamental del proceso de depuracin de los efluentes es la aireacin del lquido en el reactor aerobio que se ubica luego del sedimentador Imhof, la aireacin tiene el objeto de facilitar el proceso de degradacin de la materia orgnica realizado por los microorganismos residentes en l. Despus de la etapa de oxigenacin, se deriva el lquido que lleva barros activados en suspensin, hacia el clarificador, donde la baja velocidad de flujo en esta unidad provoca la decantacin del los slidos suspendidos. El objetivo es promover una zona quieta, de velocidad de flujo baja, de modo que el barro se separe del lquido, y sedimente en el fondo donde es arrastrado por un barredor hacia la zona central, donde es retornado por medio de

bombas hacia el tanque de aireacin, manteniendo de este modo una edad de barro estable. Desde el clarificador y previo anlisis para verificar las composicin y aptitud del efluente para su disposicin final, el agua tratada pasa a canal de desage por el cual es transportada hasta las afueras de la planta y luego hasta su cuerpo de agua receptor (Medcalf, 1977). El proceso se esquematiza en la Figura N 19.

Esquema de la planta. Bacterias Hetertrofas Totales en Suelos no Contaminados En los dos suelos no contaminados, se observa al final del tratamiento un aumento en las poblaciones de microorganismos por un valor aproximado de un orden de magnitud. De estos dos result mayor el que corresponde al tratamiento EFL. Estos datos se observan en la tabla N 10. Recuento de microorganismos aerobios totales en los suelos no contaminados (microorganismos por gramo de suelo seco).

Se presume que el aumento del valor obtenido en el recuento de microorganismos para el tratamiento EST, es una consecuencia del agregado de nutrientes inorgnicos.

Muestra Suelo Bco. EST No Cont. EFL No Cont.

Tiempo T Cero T 90 T90

Resultad 7,65x10 1,57x10 5,85x10

Es posible de que el aumento en la poblacin microbiana del tratamiento de suelo no contaminado EFL radique en la incorporacin de microorganismos y materia orgnica a travs del efluente tratado.

1.19. Niveles de Hidrocarburos Totales de Petrleo en los Tratamientos EFL y EST.

Los valores obtenidos en la determinacin de HTPs para los dos tratamientos (EST y EFL) de biodegradacin a lo largo del tiempo, se muestran en las Tablas N 11 y 12 respectivamente. Concentracin de hidrocarburos totales de petrleo registrados en tratamiento EST.
Tiempo Muestra (Das) 0 I II III IV 15 I II III IV 30 I II III IV 60 I II III IV 90 I II III (mg HC/Kg. suelo seco) (mg HC/Kg. Suelo Seco) 22449,56 19458,155 17041,67 18707,64 19633,75 12458,53 12638,8 10333,93 10208,41 11919,385 11997,12 12563,72 10680,54 6796,77 5586,81 4587,79 5921,89 3420,65 4324,02 3948,23 3952,18 5723,31 11790,19 11409,92 HTPs Promedio HTPs

IV
25000

4115,81

mg HC/kg suelo seco

20000 15000 10000 5000 0 0 20 40 60 Tiem po (das) 80 100

Concentraciones promedio de HTP en el Tratamiento EST. Concentracin de hidrocarburos totales de petrleo registradas en tratamiento EFL.
Tiempo Muestra (das) 0 I II III IV 15 I II III IV 30 I II III IV 60 I II III IV mg HC/Kg. suelo seco) (mg HC/Kg. Suelo Seco) 22275,57 23055,14 23186,27 22267,28 16160,76 16823,65 15800,37 15964,22 10588,44 10220,37 11316,92 12437,16 12765,93 12458,73 11808,64 11133,46 12041,69 11140,72 16187,25 22696,07 HTPs ( Promedio HTPs

90

I II III IV

8805,28 9676,24 1075,1 9214,43

7192,76

25000

mg HC / kg suelo seco

20000 15000 10000 5000 0 0 20 40 60 80 100

Tiempo (das)

Concentraciones promedio de HTP en el Tratamiento EFL.

mg HC / kg suelo seco

25000 20000 15000 10000 5000 0 0 20 40 60 80 100

Tiempo (das)

Concentraciones promedio de HTPs obtenidas en los Tratamientos: EST y EFL. Con respecto a los niveles iniciales de hidrocarburos, en el tratamiento EFL son superiores a los incorporados en el momento de la contaminacin (2%), posiblemente debido a contenido de HTPs presentes en el agua tratada. En el perodo 30-60 das se observa en el tratamiento EST una disminucin de la concentracin de HTPs luego de los cuales los valores permanecen constantes para llegar a niveles menores de 0,5% al final del estudio (90 das). Para el tratamiento EFL se alcanzan niveles mayores que el EST (ver anexo). Humedad del Suelo

A lo largo de la experiencia se determin el porcentaje de humedad de las muestras. El mismo vari de un tratamiento a otro y a su vez en las distintas instancias de muestreo debido principalmente a que el riego se realiz homogenizndolo en forma manual. Adems deben considerarse las condiciones climticas diarias que pueden influir en la evaporacin del agua desde el suelo. Porcentaje de humedad hallado en los tratamientos.

Muestra EST T0 EFL EST T 15 EFL EST 1.20. Bacterias Hetertrofas Totales en los T 30 Tratamientos EST y EFL EFL EST T 60 EFL EST T 90 EFL
Donde: pssa: peso del suelo seco al aire. psse: peso del suelo seco a estufa.

Tiempo (das)

Ambos tratamientos presentan un significativo incremento en sus poblaciones durante los primeros 15 das de tratamiento. Los resultados se presentan en la Tabla N 23. Debido a que estos incrementos no se observaron en los suelos no contaminados, el crecimiento solo puede atribuirse a la utilizacin del hidrocarburo como nica fuente de carbono.

pssa 4,9024 5,0876 9,075 6,9631 6,4138 3,3809 4,9965 5,422 4,5425 4,8443

Recuento de bactrias hetertrofas totales

Log del nmero de bact. x gr de suelo seco

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 T cero

EST EFL

T 15

T 30

T 60

T 90

Crecimiento de la poblacin de bacterias hetertrofas totales en los tratamientos EST y EFL. El crecimiento de las poblaciones es similar en los dos tratamientos durante los primeros 30 das, de la misma forma se destaca que una de las curvas se ubica por encima de la otra. Esta particularidad en el tratamiento EFL, podra tener origen en la cantidad de microorganismos aportados a dicho tratamiento a travs del efluente cloacal. Alrededor de los 60 das de tratamiento, el nmero de microorganismos oscila en torno a ordenes de magnitud de 107 y 108, lo cual se considera comn para microorganismos en proceso de biodegradacin (Peressutti, 2003). Sobre el final de la experiencia las poblaciones comienzan a decrecer, este hecho podra ser consecuencia de las bajas concentraciones de hidrocarburos, ambos tratamientos se encuentran por debajo del 1% P/P transcurridos 90 das. (Ercoli, 2000).

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Disminucin de TPH y crecimiento microbiano a lo largo del tiempo. En la Figura N 24 se observa el comportamiento de hidrocarburos y microorganismos a lo largo de los 90 das que dur la experiencia. Durante los primeros 30 das de estudio se observa una disminucin de los niveles de hidrocarburos totales de petrleo y un aumento en los recuentos microbianos hasta llegar a niveles constantes a partir de los 60 das, tal como se indic anteriormente De la misma forma, los estudios estadsticos indican que el tratamiento EST se ajusta al modelo exponencial (ver anexo) mientras que el tratamiento EFL no sigue el mismo comportamiento.

Conclusiones
Ambos tratamientos alcanzan un nivel de hidrocarburos aceptable, segn lo dispuesto por el Instituto Americano del Petrleo. El tratamiento EST adems alcanza los valores mnimos dispuestos en la Holland List y en la Norma Mexicana NOM-138-SEMARNAT/SS-2003 para la fraccin media de hidrocarburos. Segn los resultados obtenidos, se puede concluir que el tratamiento EST es ms efectivo que el tratamiento EFL debido a los niveles de HTPs alcanzados al tiempo final (90 das), y por la velocidad de degradacin alcanzada. Es factible utilizar el agua residual tratada para estimular procesos de biodegradacin en suelo, sin embargo el uso de este tipo de aguas implica una menor eficiencia en el tratamiento.

Los tratamientos de biorremediacin de suelos contaminados artificialmente con hidrocarburos en un porcentaje del 2%, presentan variaciones de concentracin a lo largo de los primeros 90 das, suficientemente significativas como para ser cuantificadas por espectroscopia infrarroja. La microbiota nativa del suelo en un tratamiento de biorremediacin, aumenta sensiblemente al incorporar el hidrocarburo como nica fuente de carbono y realizar la bioestimulacin del tratamiento

Anexos
1.1. Normativa Internacional Aplicable 1.2. Normativa Provincial Relacionada 1.3. Tabla de McCrady para Tres Replicas por Dilucin 1.4.Anlisis Estadstico 1.4.1. Datos de HTPs Correspondientes a los Tratamientos de Biorremediacin 1.4.2. Anlisis de Regresin 1.4.3. Comparacin de medias de HTPs correspondiente a los 90 das (tiempo final)

1.1. Normativa Internacional Aplicable

En el caso de contaminacin de suelos por hidrocarburos, dado que no existe en la Legislacin Nacional y/o Provincial niveles gua de hidrocarburos totales de petrleo (TPH), se adopta como valor objetivo en trabajos de remediacin un valor final del 1% P/P (10.000 ppm), el que coincide con el nivel gua desarrollado y propuesto por el Instituto Americano del Petrleo (API), valor basado principalmente en dos criterios: el efecto de toxicidad para las plantas y la movilidad de los hidrocarburos hacia el agua subterrnea.

Dicho valor final se toma como referencia para reas de exploracin y explotacin hidrocarburfera; no obstante en reas de mayor sensibilidad ambiental, se podr adoptar un valor gua inferior a fin de lograr los niveles de calidad adecuados para la actividad que se desarrolla en el lugar. Para el caso de compuestos especficos, Complementariamente, como valor objetivo para este estudio se han utilizado los niveles gua difundidos en la informalmente denominada Holland List (Entidad Gubernamental de Medio Ambiente de los Pases Bajos Norma "Leidraad Bodermbescherming" -edicin 1994). Tambin se considera como referencia lo establecido en la Norma Oficial Mexicana NOM138-SEMARNAT/SS-2003, la cual establece Lmites Mximos de Hidrocarburos en Suelos y las especificaciones para su caracterizacin y remediacin. Los lmites mximos permisibles para fracciones de hidrocarburos en suelo establecidos en esta norma son los siguientes:

Tabla N 1: Valores de referencia considerados.

Norma Matriz Suelo Holland List (mg/kg base seca) 5.000 (saneamiento) Norma Mexicana NOM-138SEMARNAT/SS-2003 TPH (fraccin liviana) Suelo (Uso Industrial) TPH (fraccin media) (mg/kg base seca) TPH (fraccin pesada) Suelo API (mg/kg base seca) TPH (mineral oil) 10.000 6.000 5.000 500 TPH (mineral oil) 1.000 (inicio investigacin) Parmetro Valor de Referencia (ppm) 100 (concentracin base)

1.2. Normativa Provincial Relacionada

Ley Provincial 1875, Modificada por Ley 2267 (T.O.) Decreto Reglamentario 2656/99 La reforma de la Ley y se realiz en Diciembre de 1998 y la reglamentacin en Septiembre del ao 1999. Incorpora elementos nuevos que no se haban tenido en cuanta antes, como por ejemplo: Licencia ambiental Art. 24. Participacin ciudadana a travs de la Audiencia Pblica Art. 31.,

 El proponente Pblico Art. 24. Seguros Ambientales Art. 33. Registros Ambientales Art. 20. Rgimen de Sanciones Art. 28. El control y la fiscalizacin Ambiental, antes y durante la ejecucin de la obra Art. 32. Comit provincial de medio Ambiente Art. 27. Reglamentacin Decreto N 2656/99 Define claramente el procedimiento administrativo que lo Proponentes deben cumplir. Ley 1926 Actividad Hidrocarburfera. Esta Ley regula la actividad hidrocarburfera de la provincia y crea la Polica de Hidrocarburos. La autoridad de aplicacin es la Direccin Provincial de Hidrocarburos y Combustibles, y cuenta con Decreto Reglamentario 1147/96. Las funciones principales: Contralor operativo de toda la actividad dentro de la provincia (Pozos, bateras Plantas de tratamiento de Gas, de Crudo, de Agua, separadoras y de bombeo, transporte y almacenamiento, Refineras). Exigir las declaraciones juradas de la produccin de hidrocarburos lquidos o gaseosos. Controlar el buen uso del recurso hidrocarburfero, respecto a las tecnologas utilizadas, a efectos de proteger el medioambiente. Controlar los derrames de hidrocarburos. Liquidacin y pago de regalas. Ley N 1347 La provincia de Neuqun adhiere al rgimen de la Ley Nacional N 22.428 de uso y conservacin del suelo

1.3. Tabla de McCrady para Tres Replicas por Dilucin

Tabla de McCrady

Nmero Nmero de Caracterstico Microorganismos 000 0,0 001 0,3 010 0,3 011 0,6 1.4. Anlisis Estadstico 020 0,6 1.4.1. Datos de HTPs Correspondientes a los Tratamientos de Biorremediacin 100 0,4 101 0,7 102 1,1 110 0,7 111 1,1 120 1,1 121 1,5 130 1,6 200 0,9
Valores de HTPs para los tratamientos EST y EFL. TIEMPO 0,000 0,000 0,000 0,000 EST EFL LN EST 10,019 9,743 9,837 9,885 9,430 9,445 9,243 9,231 9,386 9,392 LN EFL 10,011 10,046 10,051 10,011 9,690 9,731 9,668 9,678 9,441 9,411 1 2 3 4 5 6 7 8 9 22449,56 17041,67 18707,64 19633,75 12458,53 12638,80 10333,93 10208,41 11919,39 11997,12 22275,57 23055,14 23186,27 22267,28 16160,76 16823,65 15800,37 15964,22 12588,44 12220,37 15,000 15,000 15,000 15,000 30,000 30,000 10

N Cara

11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

30,000 30,000 60,000 60,000 60,000 60,000 90,000 90,000 90,000 90,000

12563,72 10680,54 6796,770 5586,810 4587,790 5921,890 3420,650 4324,020 3948,230 4115,810

12816,92 12437,16 10107,93 10081,73 10503,64 10207,46 8805,280 9676,240 9512,100 9214,430

9,439 9,276 8,824 8,628 8,431 8,686 8,138 8,372 8,281 8,323

9,459 9,428 9,221 9,218 9,259 9,231 9,083 9,177 9,160 9,129

1.4.2. Anlisis de Regresin

TRATAMIENTO EST Anlisis de variancia; VD: LN EST Ho: b=0 (no hay dependencia entre el ln EST y el tiempo)
Suma de los cuadrados Regresin. Residual 6,170833 0,473493 Media de cuadrados 6,170833 0,026305

df

Nivel p

1 18

234,5863

0,000000

Total: 6,644326 Se rechaza Ho; la variabilidad de ln EST puede ser explicada por el tiempo. Resumen de regresin para la variable dependiente: LN EST R = 0,96371013 R = 0,92873722 Ajustado R = 0,92477817 F (1,18) = 234,59 p < 0,00000

Error de estimacin: 0,16219

Desvo estndar de Beta

BETA

Desvo estndar de B

t(18)

p-nivel

Intercepcin TIEMPO -,963710 ,062921

9,770914 -,017191

,056846 ,001122

171,8843 -15,3162

,000000 ,000000

Los datos ajustan al Modelo Exponencial EST= 17500.8 e 0.017 tiempo con un coeficiente de determinacin (R2) de 0.9248.

Valores observados contra valores anticipados para el tratamiento EST. ANLISIS DE LOS ERRORES CORRESPONDIENTES AL TRATAMIENTO EST

Valores residuales contra valores anticipados para el tratamiento EST.

Grfico de probabilidad normal de residuales

Valor normal esperado contra valores residuales para el tratamiento EST. Se observa normalidad, Homocedasticidad e Independencia de los errores. TRATAMIENTO EFL Ho: b=0 (no hay dependencia entre el ln EST y el tiempo)

Anlisis de Variancia; DV: LN EFL

Suma de los cuadrados Regresin. Residual 1,823838 0,285803 Media de cuadrados 1,823838 0,015878

df

Nivel p

1 18

114,8662

0,000000

Total 2,109641 Se rechaza Ho; la variabilidad de ln EST puede ser explicada por el tiempo. Resumen de regresin para la variable dependiente: LN_EFL R= 0,92979859 R= 0,86452541 Ajustado R= 0,85699905 F(1,18)=114,87 p<0,00000 Error de estimacin: 0,12601
Desvo estndar de Beta Desvo estndar de B 0,044165 0,000872

BETA

t(18)

p-level

Intercepcin TIEMPO -0,929799 0,086755

9,869671 0,009346

223,4741 -10,7176

0,000000 0,000000

Valores observados contra valores anticipados para el tratamiento EFL. Debido a la falta de independencia de los residuales y al coeficiente R2 obtenido, se concluye que el Tratamiento EFL no ajusta al Modelo Exponencial esperado. Anlisis de los errores correspondientes al tratamiento EFL

Valores residuales contra valores anticipados en el tratamiento EFL

Valores normales esperados contra valores residuales en el tratamiento EFL

1.4.3. Comparacin de medias de HTPs correspondiente a los 90 das (tiempo final)

1 Prueba F de Homocedasticidad: Ho= sEST 2 /sEFL 2 =1 F calculado= Sx 2/ Sy 2 = (386.25) 2 / (382.36) 2 = 1.020 F crtico (2,2, a=0.05)=19 No se rechaza la Hiptesis de Homocedasticidad. 2 Prueba t de comparacin de medias T-test para muestras dependientes Las diferencias marcadas son significativas para p < 0,05000
Desvo Estndar 386,2553 382,3597 4 5349,84 191,6041 -55,8426 3 0,000013 Diferencia del desvo estndar

Media

Diferencia

df

EST T FIN EFL T FIN

3952,178 9302,013

Las medias de HTPs correspondientes a los 90 das no son iguales