tcnicas de contaje celular

Tcnicas de estudio de lneas celulares TCNICAS DE CONTAJE CELULAR

Una suspensin celular se caracteriza por presentar un nmero de partculas microscpicas dispersas en un fluido. Habitualmente ser necesario determinar tanto la densidad de las clulas en la suspensin como el porcentaje de stas que son viables. Para determinar la densidad de las clulas se emplean diferentes tcnicas, desde la relativamente simple cmara de contaje celular de la que existen numerosas variantes, entre ellas la que empleamos (cmara de Neubauer), hasta equipos automticos de contaje celular como el "Cell Coulter" de la empresa Beckman-Coulter.

El principio del contador celular se basa en la medida de los cambios en la resistencia elctrica que se producen cuando una partcula no conductora en suspensin en un electrolito atraviesa un pequeo orificio. Como se puede ver en el esquema, una pequea abertura entre los electrodos es la zona sensible a travs de la que pasan las partculas que se encuentran en suspensin. Cuando una partcula atraviesa el orificio desplaza su propio volumen de electrolito. El volumen desplazado es medido como un pulso de voltaje. La altura de cada pulso es proporcional al volumen de la partcula. controlando la cantidad de la suspensin que circula a travs del orificio es posible contar y medir el tamao de las partculas. Es posible contar y medir varios miles de partculas por segundo, independientemente de su forma, color y densidad.

En la unidad de Citometra de flujo y Microscopia Confocal de los Servicios Cientfico-Tcnicos de la Universidad de Barcelona se dispone de contadores celulares. Sin embargo, es posible determinar la densidad celular empleando mtodos ms sencillos. Nos basta con una cmara de contaje celular, por ej. la cmara de Neubauer, y un microscopio. Una cmara de contaje celular es un dispositivo en el que se coloca una muestra de la suspensin a medir. El dispositivo presenta unas seales que determinan un volumen conocido (x microlitros). Al contar bajo el microscopio el nmero de partculas presentes en ese volumen se puede determinar la densidad de partculas en la suspensin de origen. La cmara de Neubauer es una cmara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresin en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrcula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separacin entre dos lineas consecutivas de 0.25 mm. As pues el rea sombreada y marcada L corresponde a 1 milimetro cuadrado. La depresin central del cubreobjetos est hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos ste dista de la superficie marcada 0.1 milmetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milmetro cbico, es decir 0.1 microlitro.

Si contamos las cuatro reas sombreada (L) observando un total de x clulas entre las cuatro reas, la concentracin en la suspensin celular ser : concentracin en la suspensin (clulas / mL) = 10000 (x/4) En la imagen puedes observar el aspecto de una de las regiones marcadas como L y que en el microscopio se ven como una cuadrcula de 16 pequeos cuadrados de 0.25 milmetros de lado. Esta imagen ha sido

http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/contajecelular.htm[08/09/2009 8:34:57]

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tomada empleando un microscopio invertido de contraste de fases.

Existen numerosos modelos de cmaras de contaje celular adaptadas a su uso en microscopa. En la imagen puedes observar una cmara de Neubauer doble, como las que usas en el laboratorio de prcticas.

Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes mtodos. El ms comn es el de tincin con azul tripn. El azul tripn es un coloide que se introduce en el interior de las clulas que presentan roturas en la membrana. As pues las clulas que aparecen en la imagen, claramente de color azul, son consideradas no viables. Asimilar clulas blancas, por exclusin, a clulas viables es un error pues por este mtodo se sobrevalora la viabilidad de las clulas en la suspensin, determinando como inviables slo aquellas con la membrana rota. Existen otros mtodos de determinacin de la viabilidad celular como el ms preciso de la tincin con ioduro de propidio En la red dispones de descripciones detalladas sobre como utilizar un hemocitmetro, como la propuesta por P.J. Hansen, o la detallada descripcin que aporta Beckton-Dickinson, y los problemas de clculo de parmetros celulares que plantea empleando datos obtenidos a partir de un hemocitmetro, y otros protocolos para el contaje de clulas (en protocol-online) - arriba Material docente diseado y elaborado por Manuel Reina. ltima actualizacin : 20/10/2003 10:25 . Comentarios : mreina@ub.edu

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