FACULTAD DE MEDICINA UMANAY CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE ESTOMATOLOGIA

CURSO:

MICROBIOLOGIA

PROFESOR:

ELOY GAMBOA ALVARADO

TEMA:

MEDIO DE CULTIVO

INTEGRANTES:

LAGOS SERRANO ALFREDO

2011
INTRODUCCION Un medio de cultivo es un material alimenticio que se usa en el laboratorio para el desarrollo de los microorganismos. Una vez que ha sido preparado, un medio de cultivo puede ser inoculado (es decir, se le aaden organismos) y a continuacin incubado en condiciones que favorezcan el crecimiento microbiano. El crecimiento de los microorganismos es el cultivo. Un cultivo axnico o puro contiene un nico tipo de microorganismos. Los medios de cultivo deben contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y deben estar exentos de cualquier microorganismo contaminante. Los medios de cultivo contienen como mnimo: carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras. El agar es el principal agente solidificante utilizado en medios bacteriolgicos. Se disuelve completamente a 100C y se solidifica al enfriarse a 40C. De acuerdo a su consistencia, los medios de cultivo pueden clasificarse en: Lquidos: Se utilizan para el crecimiento de cultivos puros en lote. Se denominan caldos de cultivo y no tienen agar en su formulacin. Semislidos: Contienen 0.5% de agar en su formulacin. Se utilizan para estudiar la movilidad de las bacterias (presencia o ausencia de flagelo). Slidos: Contienen de 1.5 a 2% de agar en su formulacin. Estos medios inmovilizan a las clulas, permitindoles crecer y formar masas aisladas visibles llamadas colonias. Las colonias permiten al microbilogo reconocer la pureza del cultivo; las placas que contengan ms de un

tipo de colonia no provienen de un cultivo puro. Las placas de agar tambin se utilizan para la determinacin de clulas viables (recuento en placas).

OBJETIVOS:

1. Establecer los fundamentos tericos para la preparacin de medios de cultivo. 2. Aprender la clasificacin y uso de los medios de cultivo. 3. Preparar medios de cultivo y manejar adecuadamente la autoclave.

MEDIOS DE CULTIVO Es un medio lquido o en la superficie de un medio slido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van, desde azcares simples hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de caldo de carne. Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo slido donde las clulas que se multiplican no cambian de localizacin; tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por escisin binaria una colonia macroscpica compuesta por decenas de millones de clulas similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecer como cultivo puro de un solo tipo de bacteria. Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfolgicamente que es imposible diferenciarlas slo con el uso del microscopio; en este caso, para identificar cada tipo de bacteria, se estudian sus caractersticas bioqumicas sembrndolas en medios de cultivo especiales. As, algunos medios contienen un producto que inhibe el crecimiento de la mayora de las especies bacterianas, pero no la de un tipo que deseamos averiguar si est

presente. Otras veces el medio de cultivo contiene determinados azcares especiales que slo pueden utilizar algunas bacterias. En algunos medios se aaden indicadores de pH que cambian de color cuando uno de los nutrientes del medio es fermentado y se generan catabolitos cidos. Si las bacterias son capaces de producir fermentacin, generan gases que pueden ser apreciados cuando el cultivo se realiza en un tubo cerrado. Con otros medios de cultivo se identifica si las bacterias producen determinadas enzimas que digieren los nutrientes: as, algunas bacterias con enzimas hemolticas (capaces de romper los glbulos rojos) producen hemlisis y cambios apreciables macroscpicamente en las placas de agar-sangre. Los diferentes medios y tcnicas de cultivo son esenciales en el laboratorio de microbiologa de un hospital, pues sirven para identificar las bacterias causantes de las enfermedades infecciosas y los antibiticos a los que son sensibles esas bacterias.

CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo pueden clasificarse segn diferentes criterios, pero los ms importantes son aquellos que se basan en: a) Su consistencia b) Su utilizacin c) Su composicin d) Su origen

SEGN SU ESTADO FSICO (CONSISTENCIA). 1) Medios lquidos: Son los que se presentan en este estado, denominndose por esta razn caldos. El medio lquido ms utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtencin de una suspensin bacteriana de una determinada concentracin.

2) Medios slidos: Se preparan a partir de los medios lquidos, agregndoles un agente gelificante. Los ms utilizados son la gelatina y el agar. Gelatina: Es una protena animal obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de que es hidrolizada por muchas bacterias, y adems su uso est muy limitado porque su punto de fusin es bajo (lica a temperatura ambiente) razn por la que no puede utilizarse para cultivos a 37C, que es la tempera ptima de crecimiento para muchos microorganismos. Agar-agar:Es un polmero de azcares obtenido de algas marinas. Se trata de una molcula insoluble enagua pero soluble en agua caliente; una solucin al 1,5% p/v forma un gel firme entre 32 y 39C y nose funde por debajo de 85C. Funde a 90C y solidifica una vez fundido alrededor de los 45C. Tiene el inconveniente de que introduce compuestos orgnicos indefinidos que pueden falsear los resultados de las necesidades nutritivas de un microorganismo. Aunque el agar es una mezcla de polisacridos, Araki, en 1937, los dividi en dos grupos:- agarosa, con poco sulfato, libre de cido pirvico, y- agaropectina, con mucho sulfato y gran cantidad de cenizas. La proporcin de agarosa a agaropectina en el agar vara segn el alga de origen. El agar puede utilizarse para diferentes fines, aunque los ms importantes son: agar comercial para la industria alimenticia, agar bacteriolgico, agares purificados y agarosa, utilizada para electroforesis en gel. Aproximadamente la mitad de todo el agar que se produce, se utiliza en trabajo microbiolgico, por lo que es importante la ausencia de metales txicos.

3) Medios semislidos: Se preparan a partir de los medios lquidos, agregando a stos un agente solidificante en una proporcin menor que para preparar medios slidos. Uno de sus usos es la investigacin de la movilidad de las bacterias

SEGN SU UTILIZACIN. 1) Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes mnimos para que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio ms conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar comn, que

resulta de la adicin de agar al caldo nutritivo. Otros representantes de este grupo son el agar tripticase de soja, el agar Columbia, etc. 2) Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, adems de las sustancias nutritivas normales, incorporan una serie de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por adicin de sangre u otros productos biolgicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, etc.) que aportan dichos factores. En ocasiones es posible aadir suplementos artificiales a los medios para producir un enriquecimiento del mismo (p. ej. Polivitex, Isovitalex, etc)El gonococo, por ejemplo, necesita cistina y cistena para su crecimiento. Estas sustancias son aportadas por la sangre calentada adicionada al medio de cultivo (agar chocolate). 3) Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias contenidas en una poblacin polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una poblacin microbiana especfica. Un ejemplo de medio selectivo es el caldo selenito, que se utiliza para favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar el del resto de enterobacterias. 4) Medios inhibidores: Cuando las sustancias aadidas a un medio selectivo impiden totalmente el crecimiento de una poblacin microbiana, se denomina inhibidor. Los medios inhibidores podran considerarse como una variante ms restrictiva de los medios selectivos. Los medios inhibidores se consiguen habitualmente por adicin de sustancias antimicrobianas o de cualquier otra que inhiba completamente el desarrollo de una poblacin determinada. Un medio inhibidor es el MacConkey que permite el crecimiento de los grmenes Gram negativos e impide el crecimiento de los Gram positivos.

5) Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia caractersticas bioqumicas que ayuden a diferenciar gneros o especies. La adicin de un azcar fermentable o un

sustrato metabolizable se utilizan para este fin. El medio MacConkey es un medio diferencial porque permite distinguir los grmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. Tambin lo son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemlisis), el SS (que es doblemente diferencial), etc. 6) Medios de identificacin: Son los destinados a comprobar alguna cualidad especfica que puede servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios han de poseer los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de los microorganismos, el sustrato especfico que vaya a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado. El agar Kligler, el medio de Simmons y en general, cualquier medio al que se le haya aadido un elemento diferencial de un microorganismo, son medios utilizados en identificacin. Actualmente estn apareciendo en el mercado una gran cantidad de medios especficos de identificacin para ciertos microorganismos, con lo cual se consigue simultneamente abaratar el costo y reducir el tiempo de identificacin. Son ejemplos de esto ltimo los medios CPS ID3 o Uriline ID(Biomerieux), utilizados para identificar los grmenes urinarios ms importantes a partir de la placa de cultivo gracias a la utilizacin de sustratos cromognicos especficos. 7) Medios de multiplicacin: Sirven para obtener una gran cantidad de clulas a partir de un microorganismo ya aislado. Seemplean en la obtencin de vacunas, en la investigacin y en la industria. Los medios ms adecuados para la multiplicacin suelen ser lquidos. El caldo-infusin cerebro-corazn (BHI), es un ejemplo tpico de estos medios. 8) Medios de conservacin: Se utilizan para conservar una cepa que, por diversas razones nos interese mantener. Fundamentalmente se utilizan como controles de calidad de las pruebas y reactivos utilizados en elLaboratorio de Microbiologa. En el laboratorio se pueden conservar las cepas de tres formas: a) haciendo pases peridicos de placa a placa, b) mediante liofilizacin de una suspensin bacteriana, y c) congelando las cepas en leche descremada estril al 0,1%.

9) Medios de transporte: Se usan para el transporte de muestras clnicas que no pueden sembrarse inmediatamente. Suutilizacin debe hacerse introduciendo la torunda con la que se obtuvo la muestra en el interior delmedio (generalmente en un tubo). Son ejemplos tpicos de este grupo los medios de Stuart-Amies,Cary-Blair, etc. ATENDIENDO A SU COMPOSICIN. Segn las sustancias que entren a formar parte en su composicin, los medios de cultivo pueden ser clasificados en: 1) Medios complejos: Fueron los primeros utilizados, y los ms empleados se preparan a partir de tejidos animales, y ms raramente de vegetales. Su composicin no es exactamente definida, y por consiguiente no es rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en condiciones experimentales, donde la reproductibilidad no podr ser exacta. En la prctica corriente estos medios dan excelentes resultados y son los ms empleados. 2) Medios sintticos: Son aquellos que contienen en su composicin exclusivamente sustancias qumicas conocidas y disueltas en agua destilada en proporciones determinadas, resultando un medio de composicin perfectamente definida. 3) Medios semisintticos: El gran nmero de factores de crecimiento exigidos para ciertos grmenes hace que la fabricacin de un medio sinttico para estos grmenes sea imposible o demasiado cara. En este caso se aportan los factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgnico complejo (extracto de levadura, extracto de tejidos, etc.).Ciertos grmenes no crecen en ningn medio por muy enriquecido que est ste, hacindolo exclusivamente en clulas vivas con unas caractersticas determinadas. Ejemplos de este tipo son, aparte de los virus, las Chlamydias, Rickettsias, etc.

Segn su origen:

a) NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composicin qumica no se conoce exactamente. b) SINTTICOS: son los medios que contienen una composicin qumica definida cuali y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles.

c) SEMISINTTICOS son los sintticos a los que se les aaden factores de crecimiento bajo una forma de un extracto orgnico complejo, como por ejemplo extracto de levadura.

DESCRIPCIN Y UTILIZACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO MEDIOS DE CULTIVO COMUNES. Son los ms corrientemente utilizados, y aunque no vamos a enumerarlos todos, s son los ms conocidos en un laboratorio de Microbiologa. Agar nutritivo: Este medio es bastante bueno para el cultivo de grmenes que no presentan exigencias particulares. No es diferencial. Agar sangre: Es un medio enriquecido que se utiliza adems para la investigacin de los diversos tipos de hemlisis(, gamma ). Se utiliza para el crecimiento de estreptococos. Para la preparacin del agar sangre se puede utilizar el agar nutritivo enriquecido con cloruro sdico o un preparado enriquecido con otras sustancias como Columbia o el tripticase de soja. La adicin de sangre a un medio de cultivo no proporciona las sustancias que estn en el interior

de los hemates, pero s puede aadir factores inhibidores del crecimiento bacteriano presentes en el suero. Este es un inconveniente que puede solucionarse calentando la sangre para romper los eritrocitos y para que se destruyan las sustancias inhibidoras, que son termolbiles.La sangre utilizada como aditivo a estos medios suele ser sangre de carnero diluida al 5%, pero en algunas ocasiones es necesario utilizar sangre de otras especies (caballo, conejo, humana), pues facilitan las reacciones hemolticas o contienen determinados factores de enriquecimiento o no poseen sustancias inhibidoras del crecimiento de determinados grmenes. Agar chocolate: El agar chocolate se obtiene calentando la sangre antes de adicionarla al medio base. Por esta razn el agar chocolate contiene hemoglobina, que aporta al medio un importante elemento para el crecimiento: el factor X o hemina termoestable. El agar chocolate es un medio destinado principalmente al aislamiento de Neisserias (gonococos ymeningococos) y Haemophilus, pero en l pueden crecer muchos otros microorganismos exigentes. El agar chocolate puede convertirse quizs en uno de los medios ms enriquecidos si aadimos una mezcla de factores de crecimiento no contenidas en la sangre. Estas mezclas, denominadas de forma diferente segn las casas comerciales (Polivitex, Isovitalex, etc.) contienen ms de una docena de compuestos que confieren a este medio unas cualidades nutritivas extraordinarias. Por adicin de uno o varios antibiticos pueden lograrse medios inhibidores o selectivos para el crecimiento de determinados microorganismos. Un ejemplo clsico es el Thayer-Martin, utilizado para el aislamiento del gonococo y que no es otra cosa que un agar chocolate enriquecido al cual se ha aadido unamezcla de tres antibiticos especficos que impedirn el crecimiento del resto de la flora acompaante. Agar MacConkey: Es un medio utilizado para el aislamiento e identificacin de enterobacterias. Es un medio inhibidor de los grmenes Gram positivos por su contenido en cristal violeta y selectivo para enterobacterias por su contenido en sales biliares. En su composicin lleva un azcar (lactosa) y un indicador (rojo de metilo) que lo convierten en un medio diferencial. Los grmenes que fermenten la lactosa producen una acidificacin del medio que hacen aparecer de color rojo fuerte a las colonias resultantes. Las colonias lactosa negativas sern incoloras, apareciendo del mismo color que el medio subyacente (naranja). Agar C.L.E.D.: El medio C.L.E.D. (Cistina Lactosa Electrlito Deficiente) est recomendado para el recuento e identificacin presuntiva de los microorganismos de las vas urinarias. Su bajo contenido en electrolitos evita la invasin de los cultivos por Proteus.La presencia de lactosa en su composicin le confiere el

carcter de medio diferencial, aunque la interpretacin sea diferente al anterior medio por la incorporacin de otro indicador: el azul de bromotimol. Las colonias lactosa positivas aparecern de color amarillo y las lactosa negativas lo harn con un color verdoso, blanco o azulado.

Agar S.S.: El agar SS es un medio selectivo empleado para el aislamiento de Salmonella y Shigella a partir demuestras fecales. El medio contiene sales biliares y verde brillante para impedir el crecimiento de coliformes y grmenes Gram positivos. La presencia de lactosa y rojo de metilo nos permiten diferenciar las colonias que fermentan la lactosa (rosas o rojas) de las que no lo hacen (incoloras).Las especies de Salmonella y Shigella no fermentan nunca la lactosa por lo que este medio es excelente para descartar todas las colonias que no cumplan este requisito. El agar SS es doblemente diferencial, porque adems de indicarnos el comportamiento de los grmenes con relacin a la lactosa, nos muestra los grmenes que son capaces de producir cido sulfhdrico, que se manifiesta como un precipitado de color negro en el centro de la colonia. As, una colonia incolora y con un punto negro central es sospechosa de Salmonella, y ser exclusivamente a estas colonias a quienes se hagan las pruebas bioqumicas confirmatorias de esta especie. El agar SS es un medio muy inhibidor que a veces impide incluso el crecimiento de ciertas especies de Salmonella y sobre todo de Shigella. Por esta razn debe utilizarse siempre junto con otro medio menos inhibidor como el Hektoen. Agar Hektoen : Es un medio ms diferencial y menos selectivo que el agar SS. Se utiliza para facilitar el aislamiento de las enterobacterias. La presencia de tres azcares (lactosa, sacarosa y salicilina ) permiten ampliar el poder diferencial de este medio. Este medio es capaz de detectar los grmenes formadores de SH2, igual que el SS. Las cualidades del agar Hektoen se deben a su riqueza en peptonas y azcares, que neutralizan el efecto inhibidor de las sales biliares respecto a ciertos grmenes de cultivo delicado (Shigella en particular).El crecimiento de Salmonella es excelente, igual que el de Shigella, obtenindose colonias ms numerosas y voluminosas que en los medios selectivos usuales. La inhibicin tiene lugar, esencialmente, sobre E. coli y en menor medida sobre Proteus y Citrobacter. Hay que sealar que el vibrin colrico crece bien en este medio.

C.P.S. ID3. : Medio cromognico desarrollado por Biomerieux, que permite la identificacin de E. coli, P. mirabilisy E. faecalis, con la simple visualizacin del cambio de color de la colonia sobre el medio (rojo burdeos, azulo marrn). La identificacin solo requiere la adicin de un reactivo para confirmar o descartar la especie sospechada. Otros microorganismos diferentes requieren los sistemas de identificacin habituales (API, p. ej) Granada, Islam o New GBS: Medios utilizados para deteccin de Streptococcus agalactiae, mediante la utilizacin de un sustrato cromognico especfico de este microorganismo. Agar Mueller-Hinton: Es el medio universalmente aceptado para la realizacin de los antibiogramas o pruebas de sensibilidada los antimicrobianos. A l nos referiremos ms ampliamente en el captulo correspondiente Agar Tripticase de soja: Es un medio utilizado para el crecimiento de grmenes exigentes, como Brucella, Neisseria o Streptococcus. Es un medio muy enriquecido, pero no es diferencial. Caldo tioglicolato con resazurina: Es un medio recomendado para controles de esterilidad. Permite el cultivo de aerobios, anaerobiosy microaerfilos. Tiene un bajo potencial redox que, al aumentar, se manifiesta por un color rosa del medio. Agar Chapman: Es un medio selectivo para el aislamiento de estafilococos. Su elevado contenido en cloruro sdico permite la inhibicin de la mayora de los otros grmenes. La presencia de manitol y rojo fenol convierten a este medio en diferencial: as se puede identificar presuntivamente el Staphylococcus aureus, ya que estegrmen crece bien en medios salados y fermenta el manitol (colonias amarillas). Agar Baird-Parker: Permite el crecimiento de estafilococos coagulasa positivos, a la vez que los diferencia del resto. Medio de Loeffler:

Es un medio especfico para el cultivo de Corynebacterium difteriae. Agar Desoxicolato Citrato Lactosa Sucrosa (DCLS): Similar al agar SS. Es un medio diferencial e inhibidor a la vez. Agar Kligler: Medio especfico para pruebas de identificacin de enterobacterias. Aunque de l hablaremos conms detenimiento en el captulo de pruebas de identificacin bacteriana, podemos ir adelantando que se tratade un medio diferencial que permite conocer el comportamiento del microorganismo ante dos azcares (glucosa y lactosa), investigar la formacin de gas y comprobar si el microorganismo puede producir sulfatoferroso a partir del tiosulfato sdico. Agar Levine EMB (Eosina azul de metileno):Se utiliza para aislamiento de enterobacterias, pues impide el crecimiento de Gram positivos y diferencia muy bien a E. coli, cuyas colonias adquieren un color negruzco con un brillo metlico caracterstico. Caldo selenito-F: Se utiliza exclusivamente para enriquecimiento de Salmonellas. Agar Cetrimida. Agar King: Permiten el crecimiento de Pseudomonas, inhibiendo Gram positivos y la mayora de enterobacterias.El segundo pone adems de manifiesto la pigmentacin fluorescente de Pseudomonas bajo luz UV. Agar Schaedler: Es un medio con sangre y vitamina K muy adaptado para el cultivo de anaerobios. Agar Gardnerella: Agar con sangre humana ms una mezcla de antibiticos que permiten la observacin de colonias betahemolticas caractersticas de Gardnerella vaginalis Campylosel: Se utiliza para el aislamiento de Campylobacter intestinales creciendo a 42 C en microaerofilia.

Agar BCYE (Buffer Charcoal Yeast Extract): Se utiliza para el aislamiento de bacterias del gnero Legionella Lwenstein-Jensen: Este medio se utiliza para el cultivo de Mycobacterium tuberculosis. Contiene verde malaquita parainhibir parcialmente el crecimiento de otras bacterias. El huevo se utiliza como sustancia de enriquecimiento.

MATERIAL POR EQUIPO: - 2 mecheros

- 1 agitador - 1 matraz de 500 mL - 1 balanza - 1 esptula - 1 probeta de 250 mL - 10 cajas de Petri estriles desechables - Papel aluminio - Plumn indeleble

PROCEDIMIENTO:

1. Pesar los reactivos necesarios para preparar 250 mL de medio (por equipo). Ponerlos en el matraz.

2. Con la probeta, medir 250 mL de agua destilada y aadirla al matraz con el polvo.

3. agitar la suspensin para que se mezcle homogneamente.

4. Cuando la solucin est homognea, retirarla del agitador

CONCLUSIN:

Se prepar el medio en un matraz de acuerdo a las instrucciones del envase y se dejo enfriar hasta que el alumno lo pudo soportar con las manos y de vaci en las cajas de petri; despus se dej hasta que enfre y gelifque. Se tapan las cajas de petri y se envuelven en papel almacenadas hasta que se vayan a utilizar en un refrigerador. En la presente prctica se prepararon exitosamente los medios de cultivo En esta prctica se puede concluir que el alumno elaboro de manera correcta los medios entes mancionados y podran ser utilizados en la proxima clase.

BIBLIOGRAFIA

http://www.ecologia.unam.mx/laboratorios/evolucionmolecular/images/file/ ClaseProcariontes/Alejandra/Pr%C3%A1ctica%204%20%20Medios%20de% 20cultivo.pdf http://www.reviberoammicol.com/2002-19/095098.pdf www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp4.pdf