Anlisis citogentico de linfocitos Mayra Janeth Tejeda Gonzlez correo: may_tejeda@hotmail.

com 6-diciembre-2011 INTRODUCCIN La citogentica es la parte de la gentica que estudia los cromosomas mediante el cultivo de tejidos. Y gracias a sta se han podido identificar gran cantidad de enfermedades raras (Canudas, 2008), causadas por un nmero o una estructura anmalos de los cromosomas (Navarro, sf.) que no se saba que existan y que no se haban catalogado (Canudas, 2008). Los cromosomas son estructuras complejas ubicadas en el ncleo de las clulas, compuestos por DNA, histonas y otras protenas, RNA y polisacridos
(Herrez, 2008).

Los linfocitos no se dividen en la sangre perifrica (Ordaz y Castaeda, 2005), ms sin embargo pueden entrar en mitosis en condiciones in vitro. Con este descubrimiento, se pudo realizar el cariotipo a partir de sangre perifrica, el cual muestra varias ventajas, ya que es fcil de obtener y permite la obtencin de un gran nmero de clulas con lo que se pueden observar mayor numero de clulas en metafase (Navarro, sf.), se logra que las clulas entren en mitosis adicionando al medio donde se encuentren un agente mitognico, siendo el ms utilizado la fitohemaglutinina. Este agente induce la transformacin de linfoblatos a linfocitos, las clulas deben mantenerse con la fitohemaglutinina durante 72 h a 37 C. Posteriormente se requiere detenerlas en metafase, esto se logra con el empleo de la colchicina, que es un alcaloide que impide la formacin del huso acromtico, para que las muestras tengan una adecuada dispersin de los cromosomas se utilizan soluciones hipotnicas, como el KCl 75 nM y se fijan con metanol-cido actico en proporcin 3:1 y por ultimo se tien con Giemsa (Ordaz y Castaeda, 2005).

El cromosoma metafsico est condensado lo que permite trabajar con comodidad ya que se pueden observar claramente (Canudas, 2008). A partir de 1970 se comenzaron a realizar una serie de tratamientos y tinciones a los cromosomas para identificarlos mejor, existen dos tcnicas de bandeo: Bandas de todo el cromosoma Bandas que tien solo determinados puntos del cromosoma La tcnica de bandeo de todo el cromosomas se utiliza para la realizacin del cariotipo. Esta nos permite observar los cromosomas con bandas alternantes oscuras y claras, adems de una configuracin caracterstica y estable de cada cromosoma. Existen diferentes bandas para esta tcnica como: Bandas Q, G y R. Siendo las ms sobresalientes las bandas G (Calasanz, sf.). Se obtienen tratando los cromosomas con una solucin proteoltica de tripsina, y posteriormente tiiendo con Giemsa (Herrez, 2008), permite detectar en un nico experimento, tanto las alteraciones numricas como monosomas, trisomas, etc., as como las estructurales como translocaciones, inversiones, deleciones, etc. presentes en todo el genoma (Calasanz, sf.). El cido carmnico es un colorante orgnico que tie el material gentico, resulta ser de gran eficacia en la tincin de cromosomas (Portillo).

OBJETIVO Obtencin de clulas en divisin mittica en la etapa de metafase a partir de sangre perifrica para estudios citogenticas.

METODOLOGA Se prepararon dos soluciones para la realizacin de la prctica la primera fue KCl, se pesaron 0.015 g de KCl en la balanza analtica, fueron colocado en un matraz aforado de 200 mL el cual de aforo con agua desionizada.

La otra solucin fue de metanol-cido actico la cual de preparo en proporcin 3:1, fueron colocados 25 mL de cido actico y 75 mL de metanol quedando un total de 100 mL. Se coloc 1 mL de sangre en un vial el cual contena 1 mL de suero bovino y 200 L de fitohemaglutinina, se llev al congelador donde se mantuvo a 4 C hasta ser utilizada. 72 h antes de ser utilizada se coloco en una incubadora la cual mantena una temperatura de 37 C, una vez transcurrido el tiempo se saco la muestra y en campana de flujo laminar le fueron colocados 35 L de colchicina al 2%, y se volvi a llevar a la incubadora durante 30 min, una vez cumplido el tiempo, se centrifugo la muestra durante 10 min a 1000 rpm, y se elimino el sobrenadante con una micropipeta. Fue aadido a la muestra 1 mL de KCl 75 nM suavemente por las paredes del tubo, esto con el objetivo de crear un choque hipotnico, despus fueron aadidos otros 9 mL de KCl y se homogeneiz por pipeteo, Se llev una vez ms a la incubadora a 37 C durante 30 min. Transcurrido este tiempo, se llev a centrifugar a 1000 rpm durante 10 min, y se elimin el sobrenadante con una micropipeta. Posteriormente se aadi 1 mL de metanol-acido actico 3:1, suavemente por las paredes del tubo, despus fueron agregados 9 mL ms de esta sustancia se homogeniz por pipeteo y se llev a incubar durante 30 min a 4 C. Pasado este tiempo se centrifug a 1000 rpm por 10 min y se decant el sobrenadante. Estos ltimos pasos de incorporacin de metanol-acido actico 3:1, incubar a 4 C durante 30 min, centrifugar y decantar fueron repetidos dos veces. Posteriormente se aadi 1 mL de metanol-acido actico 3:1, y se resuspendi por pipeteo. Se tom una alcuota de la muestra, la cual fue colocada en un portaobjetos y se le agrego una gota de acetocarmn al 1%, se fij la muestra con calor, se retiro el exceso de colorante, se puso un cubreobjetos y se observo al microscopio.

RESULTADOS Y DISCUSIN En una de las muestras solo se observa la hebra de ADN, indicativo de que la clula no se encontraba en metafase (figura 1).

Figura 1. Hebra de ADN 40x

En la muestra dos se pudieron observar aunque no con claridad los cromosomas (figura 2).

Figura 2. Cromosomas en metafase

Esto demuestra que tal como lo menciona Navarro, sf., los linfocitos pueden entrar en mitosis en condiciones in vitro, logrando esto con la adicin de la

fitohemaglutinina y as transformarse de linfoblatos en linfocitos, la colchicina una vez ms demuestra su eficiencia como arrestador mittico al impedir la formacin del huso acromtico. Al momento de estar preparando la solucin de KCl hubo un error, lo cual pudo haber provocado que los cromosomas no se dispersaran bien y se observen amontonados (Ordaz y Castaeda, 2005). La tincin con Giemsa fue sustituida por acetocarmn que tal como lo menciona Portillo resulto ser de gran eficacia en la tincin de cromosomas.

CONCLUSIONES Los resultados obtenidos no fueron los suficientes para realizar el cariotipo debido a que se realizaron muy pocas placas. La colchicina al ser un arrestador mittico permite la observacin de los cromosomas en diferentes fases, en este caso metafase. El acetocarmn muestra gran eficacia en la tincin del material gentico. Los cromosomas en metafase se encuentran condensados, lo cual permite y facilita la realizacin de cariotipos ya que se pueden observar claramente. LITERATURA CITADA Canudas, M. 2008. Qu es la citogentica?. (revisado

http://www.aollatinoblog.com/2008/02/19/que-es-la-citogenetica/ 3-diciembre-2011) Navarro, C. sf. El cariotipo

humano. (revisado 3-

http://mural.uv.es/monavi/disco/primero/biologia/Tema35.pdf diciembre-2011) Herrez, A. 2008. Citogentica

bsica. (revisado 3-

http://biomodel.uah.es/citogene/dynacare/geninfo.htm diciembre-2011)

Ordaz, M. y A. Castaeda. 2005. Prcticas de Gentica y Cuaderno de Trabajos. UNAM. Mxico. 155 p. Calasanz, M. sf. Revisin de tcnicas de citogentica convencional y molecular y su implicacin en el diagnstico y pronstico del cncer.

http://www.cfnavarra.es/salud/anales/textos/vol24/suple1/suple3a.html (revisado 3-diciembre-2011) Liberato Portillo, Profesor de la Universidad de Guadalajara, Guadalajara, Mxico.