Mediada por Agrobacterium transformacin de la planta: la biologa detrs de la "Gene-Las maniobras" Herramienta

INTRODUCCIN Veinticinco aos atrs, el concepto de la utilizacin de Agrobacterium tumefaciens como vector para crear plantas transgnicas fue visto como una perspectiva y un "deseo". Hoy en da, muchos agronmica y hortcola especies importantes son sistemticamente transformados con esta bacteria, y la lista de especies que son susceptibles de transformacin mediada por Agrobacterium parece crecer da a da. En algunos pases desarrollados, un alto porcentaje de la superficie de cultivos econmicamente importantes tales como maz, soja, algodn, canola, patatas y tomates es transgnica, un nmero creciente de estas variedades transgnicas son o pronto sern generados por Agrobacterium, en lugar de bombardeo de partculas mediada por la transformacin. Todava quedan, sin embargo, muchos desafos para el genotipo independiente de la transformacin de muchas especies de cultivos de importancia econmica, as como las especies forestales utilizadas para madera, papel y celulosa. Adems, la expresin predecible y estable de los transgenes sigue siendo problemtica. Varios excelentes crticas han aparecido recientemente que describen en detalle los aspectos diversos de la biologa de Agrobacterium. En esta revisin, se describe cmo los cientficos utilizan el conocimiento de la biologa bsica de Agrobacterium Agrobacterium para el desarrollo como una "herramienta" para la ingeniera gentica de plantas. Tambin exploro cmo nuestra creciente comprensin de la biologa de Agrobacterium puede ayudar a prolongar la utilidad de la transformacin mediada por Agrobacterium. Es mi creencia de que las mejoras en la tecnologa de transformacin implicar necesariamente la manipulacin de estos procesos biolgicos fundamentales. AGROBACTERIUM "especie" y rango de hospederos El gnero Agrobacterium se ha dividido en una serie de especies. Sin embargo, esta divisin se ha reflejado, en su mayor parte, la enfermedad y la sintomatologa rango de hospederos. As, A. radiobacter es un "virulento" de especies, A. tumefaciens causa la enfermedad de agalla de la corona, A. rhizogenes causa la enfermedad de raz peluda, y A. rubi causa la enfermedad de la caa de la vescula. Ms recientemente, una nueva especie ha sido propuesta, A. vitis, lo que provoca agallas en las uvas y algunas otras especies de plantas (244). Aunque Manual Bergey de Bacteriologa Sistemtica an refleja esta nomenclatura, la clasificacin es complejo y confuso, ahora sabemos que los sntomas se deben, en su mayor

parte, el tipo de tumorignico plsmido contenido dentro de una cepa en particular. Curar un determinado plsmido y la sustitucin de este plsmido con otro tipo de tumorignico plsmido puede alterar los sntomas de la enfermedad. Por ejemplo, la infeccin de las plantas con A. tumefaciens C58, que contiene la nopalina tipo de plsmido Ti pTiC58, los resultados en la formacin de teratomas agalla de la corona. Cuando este plsmido se cura, la cepa se convierte en patgena. Introduccin de plsmidos Ri en la cepa curada "convierte" la bacteria en una cepa rizognica (191, 358). Adems, se puede introducir un Ti (inductor de tumores) plsmido de A. tumefaciens en A. rhizogenes, la cepa resultante incita a los tumores de la alteracin de la morfologa de las plantas Kalanchoe (53). Por lo tanto, ya que A. tumefaciens puede ser "convertida" en A. rhizogenes la simple sustitucin de un tipo oncognico del plsmido por otro, el trmino "especie" carece de sentido. Tal vez un sistema de clasificacin ms significativa divide el gnero Agrobacterium en "biotipos", basada en el crecimiento y las caractersticas metablicas (171). El uso de este sistema, la mayora de A. tumefaciens y A. rub (316) pertenecen a cepas biovar I, A. rhizogenes cepas encajar en biovar II y biovar III est representado por las cepas de A. vitis. Ms recientemente, un nuevo sistema de clasificacin taxonmica para el gnero Agrobacterium se ha propuesto (374). La reciente finalizacin de la secuencia de ADN de todo el genoma de A. tumefaciens C58 (que se compone de una lineal y un cromosoma circular, un plsmido Ti, y otro gran plsmido [114, 115, 363]) puede proporcionar un punto de partida para la reclasificacin de Agrobacterium "tensiones" en un verdadero "especie". A pesar de la confusin actual en la clasificacin de las especies, a los fines de ingeniera gentica de plantas, el aspecto ms importante puede ser la gama de huspedes de diferentes cepas de Agrobacterium. Como gnero, Agrobacterium puede transferir ADN a un grupo muy amplio de organismos, incluyendo numerosas especies de angiospermas dicotiledneas y monocotiledneas (12, 68, 262, 341) y gimnospermas (198, 206, 215, 228, 307, 357, 371). Adems, Agrobacterium puede transformar los hongos, as como las levaduras (32, 33, 260), ascomicetos (1, 71), y basidiomicetos (71). Recientemente, se inform Agrobacterium para transferir ADN a las clulas humanas (187). Las bases moleculares y genticas de la gama de huspedes de una cepa de Agrobacterium dado no est claro. Los primeros trabajos indican que los genes del plsmido Ti, en lugar de los cromosomas, era el principal determinante gentico de la gama de los huspedes (207, 315). Varios de virulencia (vir) loci en el plsmido Ti, incluyendo Virc (367, 368) y VirF (220, 267), se muestra para determinar el rango de especies de plantas que pueden ser transformados para producir tumores agalla de la corona. El virH (antes llamado PINF) lugar pareca estar implicado en la capacidad de Agrobacterium para transformar el maz, segn lo establecido por un ensayo

en el que los sntomas de la infeccin por virus del rayado del maz se determinaron los siguientes agroinoculation de las plantas de maz (153). Otros genes vir, incluyendo virG, contribuir a la "hypervirulence" de determinadas cepas (41, 146). Sin embargo, ahora est claro que van de acogida es un proceso mucho ms complejo, que est bajo el control gentico de mltiples factores, tanto dentro de la bacteria y la planta husped. La nica forma para los ensayos de transformacin puede afectar la forma en un rango de hospederos puntos de vista. Por ejemplo, muchas especies de plantas monocotiledneas, incluyendo algunas variedades de gramneas como el maz (152), arroz (39, 40, 85, 139, 265, 321), cebada (317), y el trigo (42), ahora pueden ser genticamente transformado por muchas cepas de Agrobacterium con el fenotipo de resistencia a los herbicidas o antibiticos. Sin embargo, estas especies de plantas no soportan el crecimiento de tumores agalla de la corona.

Figura. 1. Representacin esquemtica de un tpico plsmido octopina de tipo Ti (A) y la regin de T-ADN de una tpica octopina de tipo plsmido Ti (B). (A) El ADN-T se divide en tres regiones. TL (T-ADN de la izquierda), TC (T-ADN centro) y TR (T-ADN de la derecha). El crculo negro indica T-DNA de secuencias repetidas frontera. oriV, el origen vegetal de la replicacin del plsmido Ti, se indica mediante un crculo blanco. (B) Los distintos T-ADN codificada transcripciones, y su sentido de la transcripcin, se indican con flechas. Los genes que codifican las funciones implicadas en la sntesis de auxina (auxina), la sntesis de citoquininas (CyT), y la sntesis de la octopina opina (OCS), manopina (MAS), y agropina (AGS) se indican. Gama de huspedes ms puede resultar de la interaccin de determinados plsmidos Ti con ciertos antecedentes cromosmicas bacterianas. Por ejemplo, el pTiBo542 plsmido Ti, cuando en su husped natural cepa A. tumefaciens Bo542, dirige potencial tumorignico limitada cuando se ensaya en muchas especies de plantas leguminosas. Sin embargo, cuando se coloca en el fondo C58 cromosmicas, pTiBo542 dirige virulencia fuerte hacia la soja y otras leguminosas (143). Finalmente, la susceptibilidad a la enfermedad de la agalla de corona tiene una base gentica en cucurbitceas (292), guisantes (272), soja (15, 214, 246), y la vid (312) e incluso entre diferentes ecotipos de Arabidopsis thaliana (231). Las funciones de los genes de virulencia bacteriana y los genes de acogida en el proceso de transformacin, y las formas en las que posiblemente pueden ser manipulados para propsitos de ingeniera gentica, se analizan a continuacin. BASES MOLECULARES DE LA transformacin mediada por Agrobacterium Qu es el ADN-T?

La base molecular de la transformacin gentica de las clulas vegetales por Agrobacterium es la transferencia de la bacteria y la integracin en el genoma de la planta nuclear de una regin de un gran inductor de tumores (Ti) o rizognica (Ri) residente en el plsmido de Agrobacterium (Fig. 1A). Plsmidos Ti son del orden de 200 a 800 kpb de tamao (81, 100, 111, 114, 145, 166, 175, 177, 245, 250, 251, 261, 311, 332, 342, 363). El ADN transferido (T-ADN) (Fig. 1B) se conoce como la regin T, cuando se encuentra en el plsmido Ti o Ri. T-regiones en Ti nativos y los plsmidos Ri son aproximadamente 10 a 30 kpb de tamao (17, 34, 197, 311, 378). Por lo tanto, T-regiones por lo general representan menos del 10% del plsmido Ti. Algunos plsmidos Ti contienen una regin T, mientras que otros contienen mltiples T-regiones (17, 311). El procesamiento de los tDNA del plsmido Ti y su posterior exportacin de la bacteria a la clula de la planta resultado en gran parte de la actividad de la virulencia (vir) los genes transportados por el plsmido Ti (106, 147, 148, 174, 208, 303 ). T-regiones estn definidas por secuencias borde del ADN-T. Estos lmites son de 25 pb de longitud y altamente homloga en secuencia (167, 366). Que flanquean la regin T en una orientacin directa repetida (257, 276, 335, 345, 352). En general, los bordes del T-ADN delimitar el T-ADN (vase ms adelante para las excepciones), ya que estas secuencias son el blanco de la frontera especfica VirD1/VirD2 endonucleasa que procesa el ADN-T del plsmido Ti. Parece haber una polaridad establecida entre T-ADN de las fronteras: las fronteras de la derecha que inicialmente pareca ser ms importante que las fronteras de la izquierda (136, 156, 286, 352, 353). Ahora sabemos que esta polaridad puede ser causada por varios factores. En primer lugar, no las secuencias de las fronteras slo sirven como blanco para la endonucleasa VirD1/VirD2 sino tambin servir como sitio de unin covalente de la protena VirD2. En el plsmido Ti o Ri (o T-ADN de vectores binarios [ver abajo]), T-ADN de las fronteras se componen de ADN de doble cadena. La escisin de las secuencias frontera doublestranded requiere VirD1 y VirD2 protenas, tanto in vivo (82, 99, 155, 369) e in vitro (281). In vitro, sin embargo, VirD2 protena por s sola puede romper una sola hebra de ADN-T secuencia de la frontera (154, 249). La escisin de los resultados de la frontera de 25 pb de ADN-T sobre todo de la formacin de muescas de la T-DNA "menor cadena", como convencionalmente se presentan, entre los nucletidos 3 y 4 de la secuencia de la frontera (301, 353). Sin embargo, la doble cadena de divisin de la frontera de T-ADN tambin se ha observado (155, 305, 344). Muescas de la frontera est asociado con el firme (probablemente covalentes) la vinculacin de la protena VirD2, a travs de la tirosina 29 (351), al final 5 de la resultante singlestranded T-molcula de ADN denominado T-hilo (91, 99, 137, 150, 355, 373). Este es el T-cadena, y no una doble cadena de ADN-T molcula, que se transfiere a la clula vegetal (318, 375). Por lo tanto, es la protena VirD2 adjunto a la orilla derecha, y no la secuencia de la frontera en s misma, que

establece la polaridad y la importancia de las fronteras de la derecha en relacin a las fronteras de la izquierda. Cabe sealar, sin embargo, que debido a que la izquierda de la frontera mellar tambin se asocia con VirD2 apego a la molcula restante (el "no-T-ADN" de la Ti "columna vertebral" del plsmido o de una regin del vector binario T-DNA [ 91]), es posible que el proceso T-hilos de estas regiones de Ti y los plsmidos Ri y de vectores binarios T-ADN (182, 264, 356). El problema de los vectores de transferencia de "espina dorsal" de secuencia para las plantas se discute a continuacin. En segundo lugar, la presencia de T-ADN "overdrive" secuencias de cerca de muchos de T-ADN bordes derecho, pero no las fronteras a la izquierda, tambin puede ayudar a establecer la polaridad funcional de los bordes derecho e izquierdo. Secuencias Overdrive mejorar la transmisin de la Thilos para las plantas, aunque el mecanismo molecular de cmo ocurre esto sigue siendo desconocido (131, 156, 256, 291, 336, 337, 345). Los primeros reportes sugieren que la protena VirC1 une a la secuencia overdrive y puede mejorar el T-ADN divisin fronteriza por la endonucleasa VirD1/VirD2 (322). virC1 y virC2 funciones son importantes para la virulencia, la mutacin de estos genes da lugar a la prdida de virulencia en muchas especies de plantas (299). Sin embargo, varios laboratorios han sealado que la T-cadena de produccin en Virc cepas mutantes de Agrobacterium se produce en los niveles de tipo salvaje (301, 344). Por lo tanto, cualquier efecto de Virc debe ser posterior a T-ADN de procesamiento. Cmo se trata T-ADN transferido de las clulas vegetales Agrobacteriumto? Como se ha indicado anteriormente las protenas, codificadas por muchos genes vir juegan un papel esencial en el proceso de transformacin mediada por Agrobacterium. Algunas de estas funciones se han discutido en varios artculos de revisin excelente (44, 109, 325, 327, 328, 384), y por lo tanto, limitar mi descripcin de las funciones de las protenas Vir que pueden servir como puntos de manipulacin para la mejora de el proceso de transformacin. Protenas vira y Virg funcin como miembros de una twocomponent sensorial de transduccin de seales reguladoras del sistema gentico. Vira es una antena periplsmico que detecta la presencia de determinados compuestos fenlicos de plantas que son inducidos por heridas (3, 87, 162, 195, 303, 324, 359). En coordinacin con el ChvE transportador de monosacridos y en presencia de los fenlicos apropiado y molculas de azcar, autophosphorylates Vira y posteriormente transphosphorylates la protena Virg (160, 161). Virg en forma nonphosphorylated est inactivo, sin embargo, en la fosforilacin de la protena ayuda a activar o aumentar el nivel de la transcripcin de los genes vir, muy probablemente por la interaccin con secuencias de caja de vir-que forman un componente de los promotores de genes vir (59, 60, 252). Protenas vira y Virg constitutivamente activa que no requieren inductores fenlicos de la

actividad, o de las protenas que interactan Virg de forma ms productiva con las secuencias de caja de vir-para activar la expresin de genes vir, puede ser til para aumentar la eficiencia de transformacin con Agrobacterium o rango de hospederos. Los experimentos se describen algunos intentos de manipulacin de Vira y / o Virg para estos fines se discuten a continuacin. Junto con la protena VirD4, el 11 protenas virB conforman un sistema de secrecin tipo IV necesarios para la transferencia del T-ADN y otras protenas Vir, incluyendo VirE2 y VirF (44, 349). VirD4 puede servir como un "conector" para promover la interaccin de los procesados ??T-DNA/VirD2 complejo con el aparato de secrecin virB codificados (126). La mayora de las protenas virB una u otra forma el canal de la membrana o servir como ATPasas para proporcionar energa para el montaje del canal o los procesos de exportacin. Varias protenas, incluyendo VirB2, VirB5 y VirB7 posiblemente, hacer que el T-pilus (94, 163, 189, 190, 278, 283). VirB2, que se procesa y se cicla, es la protena pilin principales (94, 163, 189, 190). La funcin del pilus de T-ADN de transferencia an no est claro, ya que puede servir como conducto para el T-ADN y la transferencia de protenas Vir, o simplemente puede funcionar como un "gancho" para apoderarse de la clula de la planta receptora y llevar a las bacterias y las plantas en las proximidades de efectuar la transferencia molecular. Uno de los aspectos de la biologa pilus que pueden ser importantes para la transformacin es la labilidad de la temperatura. A pesar de la induccin de genes vir es mxima en aproximadamente 25 a 27 C (8, 162, 323), el pilus de algunos, pero no todas, las cepas de Agrobacterium es ms estable a temperaturas ms bajas (aproximadamente 18 a 20 C) (18, 105 , 188). Los primeros experimentos de Riker indica un efecto de la temperatura de transformacin (268). Por lo tanto, se puede considerar cocultivating Agrobacterium con las clulas vegetales a temperaturas ms bajas durante los primeros das algunos de los procesos de transformacin. El VirD2 y VirE2 protenas juegan un papel esencial y complementaria tal vez en transformacin mediada por Agrobacterium. Estas dos protenas se han propuesto para constituir, con el T-cadena, una "T-complejo" que es la forma de transferir el ADN-T (149). Si este complejo rene dentro de la bacteria sigue siendo controvertido. Citovsky et al. (50) demostr que VirE2 podra funcionar en una clula vegetal: VirE2 transgnicos que expresan las plantas de tabaco podran "complementar" la infeccin por una cepa mutante virE2 Agrobacterium. Varios laboratorios han demostrado que VirE2 puede transferir a la clula vegetal en ausencia de un T-hilo (27, 193, 244, 309, 349), y es posible que VirE2 complejos con el T-cadena, ya sea en el canal de exportacin de bacterias o dentro de la clula vegetal. Un informe reciente sugiere que tal vez otro papel para VirE2 temprano en el proceso de exportacin: Dumas et al. (90) demostr que VirE2 podra asociar con membranas artificiales in vitro y crear un canal para el transporte de molculas de ADN. Por lo tanto, es posible que una funcin de

VirE2 es para formar un poro en la membrana citoplasmtica de plantas para facilitar el paso de la T-cuerda. Debido a su apego a la final 5 de la T-hebra, VirD2 puede servir como una protena piloto para guiar a los T-hilo a travs del aparato y el tipo de exportacin IV. Una vez en la clula vegetal, VirD2 puede funcionar en los pasos adicionales del proceso de transformacin. VirD2 contiene la seal de localizacin nuclear (NLS) secuencias que pueden ayudar a dirigirlo y el adjunto de T-ADN al ncleo de la planta. El NLS de VirD2 puede dirigir fusionado protenas periodista e in vitro-ensamblados T-complejos a los ncleos de las clulas vegetales, animales y hongos (48, 119, 138, 151, 185, 186, 229, 319, 326, 381, 382 ). Adems, VirD2 puede asociar con un nmero de Arabidopsis importina protenas de una manera dependiente de NLS, tanto en la levadura e in vitro (16, S. Bhattacharjee y Gelvin SB, datos no publicados). Importina-es un componente de una de las vas de transporte de protenas nucleares se encuentran en los eucariotas. Los datos ms recientes, sin embargo, sugieren que VirD2 puede no ser suficiente para dirigir T-hilos del ncleo. Ziemienowicz et al. (382) mostr que en las clulas permeabilizadas, VirD2 podra afectar a los ataques nucleares de pequea oligonucletidos ligados generados in vitro, pero no pudo dirigir el transporte nuclear de molculas ms grandes ligados. Para alcanzar objetivos nucleares de estas molculas ms grandes, VirE2 adems tuvo que ser asociado con el T-captulos. Por ltimo, VirD2 pueden jugar un papel en la integracin del T-ADN en el genoma de la planta. Varias mutaciones en VirD2 puede afectar tanto a la eficiencia (229) o la "precisin" (320) de T-ADN de integracin. El papel de VirE2 de T-ADN de transporte nuclear sigue siendo polmica. VirE2 es una protena no-secuencia especfica de ADN de cadena sencilla de unin (45, 46, 49, 112, 286). En las clulas de Agrobacterium, VirE2 probablemente interacta con la chaperona molecular VirE1 y por tanto no estarn disponibles para obligar a T-hilos (77, 84, 310, 380). Sin embargo, cuando se unen a ADN de cadena sencilla (tal vez en la clula vegetal?), VirE2 puede alterar el ADN de una conformacin al azar de la bobina a una forma que se asemeja a un cable de telfono en espiral (47). Esta forma alargada puede ayudar a dirigir la T-cadena a travs del poro nuclear. VirE2 tambin contiene secuencias NLS que puede dirigir protenas fusionadas reportero a los ncleos de las plantas (48, 50, 326, 383). Al igual que con VirD2, VirE2 interacta en la levadura con Arabidopsis importina las protenas de una manera dependiente de NLS (Bhattacharjee y Gelvin, indito). Un informe indica que VirE2 obligado a ADN de cadena sencilla y de microinyeccin en clulas vegetales puede dirigir el ADN en el ncleo (381). Sin embargo, otros informes demuestran que no puede dirigir VirE2 obligado ADN de cadena sencilla a los ncleos de cualquiera de las clulas vegetales o animales que se permeabilized con el fin de llevar a cabo la absorcin de ADN (380). La causa de estos resultados contradictorios no est claro, pero puede reflejar diferencias en los tipos de clulas y sistemas de entrega de ADN utilizados por los dos grupos. Cuando T-ADN se entrega

a las clulas vegetales de las cepas de Agrobacterium que codifica una forma mutante de VirD2 contiene una supresin precisa de la NLS, hay a lo sumo, una disminucin del 40% en la eficiencia de transformacin (229, 233, 290). Plantas transgnicas que expresan VirE2 puede complementar una cepa doble mutante que carece de Agrobacterium virE2 y contiene una supresin en la regin de codificacin de NLS virD2 (110). Estos resultados sugieren que en ausencia de las secuencias NLS VirD2, otro mecanismo nuclear objetivo (tal vez VirE2) puede tener lugar. Cuando se une al ADN, los motivos de NLS VirE2 puede ser ocluido e inactivos. Esto se debe a los dominios de NLS y la unin al ADN de VirE2 superposicin (50). Grupo de Hohn ha hiptesis de que la funcin principal de VirE2 en el transporte nuclear es independiente y que NLS VirE2 slo da forma a la T-cadena para que pueda serpentean a travs de los poros nucleares (274). Mayor controversia implica la capacidad de VirE2 protenas para localizar a los ncleos de las clulas animales. Ziemienowicz et al. (381) mostr que en permeabilized clulas HeLa, octopina tipo VirE2 podra apuntar al ncleo, mientras que en la microinyeccin de Drosophila y clulas de Xenopus, la secuencia NLS de nopalina tipo VirE2 tuvo que ser cambiado a fin de efectuar la localizacin nuclear de la protena alterada (50). Aunque la razn de esta discrepancia no se conoce, no es probable que los resultados de la utilizacin de octopina contra nopalina tipo VirE2 por los dos grupos (326). Por ltimo, VirE2 puede proteger T-hebras de la degradacin nucleolytic que puede ocurrir tanto en el citoplasma de las plantas y tal vez en el ncleo (274, 374). La existencia de un T-complejo formado por una sola molcula de VirD2 covalentemente al extremo 5 de la T-hebra, que a su vez est recubierto por VirE2 molculas, por lo general ha sido aceptado por la comunidad de investigacin Agrobacterium (149). Sin embargo, el lector debe ser consciente de que este complejo no ha sido identificado, ya sea en Agrobacterium o clulas de las plantas. Es posible que otras protenas, como importins (16), VIP1 (329), e incluso VirF (285), adems, pueden interactuar, ya sea directa o indirectamente, con el T-cadena para formar grandes complejos de T en la clula vegetal . Aunque el papel de los genes vir Ti plsmidos codifican a menudo ha sido considerado de importancia primordial para la transformacin, muchos de los genes cromosmicos Agrobacterium tambin son esenciales para este proceso. El papel de los genes de los cromosomas se estableci por primera vez por mutagnesis aleatoria insercin de todo el genoma de Agrobacterium (106). La investigacin adicional se definen las funciones de muchos de estos genes. Entre estas funciones estn la produccin de exopolisacridos, modificacin, y la secrecin (PSCA / exoC, chvA y chvB [36, 37, 88, 89, 313]) y otros papeles en la adhesin bacteriana a las clulas de las plantas (genes att [212, 213] ), los transportistas de azcar que participan en coinduction de los genes vir (chvE [86, 172, 289]), la regulacin de la induccin de genes vir (chvD [204]), y T-ADN de transporte

(ACVB [168, 248, 360, 361, 362 ]). Otros genes, como MIAA (116), tambin pueden desempear un papel ms secundario en el proceso de transformacin. El esclarecimiento reciente de la A. tumefaciens C58 toda la secuencia (114, 363) seguramente ser un terreno frtil para el descubrimiento de nuevos genes implicados en la transformacin mediada por Agrobacterium. MANIPULACIN DE AGROBACTERIUM DE INGENIERA GENTICA CON FINES Introduccin de genes en las plantas mediante Agrobacterium Aos antes que los cientficos dilucidar el mecanismo molecular de la transformacin mediada por Agrobacterium de las plantas, Armin Braun propuso el concepto de un "principio de la induccin de tumores", que fue trasladado de manera estable y se propaga a en el genoma de la planta (30). La investigacin en la dcada de 1970 result en la identificacin de los grandes plsmidos en cepas virulentas de Agrobacterium (376), aunque ahora sabemos que muchas cepas contienen plsmidos relacionados con la virulencia. Los experimentos genticos indican que una clase particular de plsmidos, el Ti (y ms tarde Ri) plsmidos, fueron los responsables de la tumorignesis (339) y que una parte de estos plsmidos, el T-ADN, fue transferido a las clulas vegetales y se incorporan en el genoma de la planta (43). Era, pues, evidente para proponer que los plsmidos Ti ser utilizado como vector para introducir genes extraos en clulas vegetales. Sin embargo, los plsmidos Ti son muy grandes y de T-ADN regiones por lo general no contienen sitios nicos de restriccin de endonucleasa que no se encuentran en otras partes del plsmido Ti. Por lo tanto, uno no puede simplemente clonar un gen de inters en la T-regin. Por lo tanto, los cientficos desarrollaron una serie de estrategias para la introduccin de genes extraos en el ADN-T. Estas estrategias implicadas dos enfoques diferentes: la clonacin del gen, por medios indirectos, en el plsmido Ti de tal manera que el nuevo gen fue en cis con los genes de virulencia en el mismo plsmido, o clonar el gen en un T-regin que estaba en una por separado replicn de los genes vir (T-ADN de vectores binarios). Se utilizaron dos mtodos para la clonacin de ADN extrao en el plsmido Ti. El primer mtodo se basa en una estrategia desarrollada por Ruvkin y Ausubel (277) (Fig. 2). Una regin del ADN (ya sea la T-regin o regin de ADN especficas para la ruptura), que contiene sitios nicos de restriccin de endonucleasa se clona en una amplia gama de hospedadores plsmido, tal como un vector basado en IncP. Estos plsmidos pueden replicarse tanto en Escherichia coli, en el que la clonacin inicial se lleva a cabo, y en el Agrobacterium. El gen exgeno de inters, junto con un marcador de resistencia a los antibiticos, es el siguiente clonado en un sitio de endonucleasa de restriccin nicos en la regin de destino de ADN. Por otra parte, un gen de resistencia a los antibiticos pueden ser introducidos en el fragmento de ADN de inters por la transposicin (107, 297). El plsmido

resultante se introduce en Agrobacterium por conjugacin o transformacin. La presencia de este plsmido en Agrobacterium se confirma con la seleccin de resistencia a los antibiticos codificada por tanto el esqueleto del vector plsmido y el marcador de resistencia cerca del gen de inters. A continuacin, otro plsmido del grupo de incompatibilidad mismo que el primer plsmido, pero alberga otro marcador de resistencia a los antibiticos, se introduce en la cepa de Agrobacterium que contiene el primer plsmido. Las bacterias resultantes se colocan en medio de antibiticos que contienen a seleccionar para el segundo (el desalojo) plsmido y el marcador de resistencia al lado del gen de inters. Debido a que los plsmidos del grupo de incompatibilidad mismo por lo general no puede coreside dentro de la clula bacteriana misma, las bacterias pueden volverse resistentes a ambos antibiticos slo si (i) la cointegrates primer plsmido en el plsmido Ti y utiliza el oriV del plsmido Ti de replicar o (ii) un intercambio de ADN en el plsmido primero y el plsmido Ti se produce por doble recombinacin homloga (homogenotization) utilizando secuencias homlogas en el plsmido Ti que flanquean ambos lados del gen de inters, ms el marcador de resistencia. En el primer caso (cointegracin del plsmido entero con el plsmido Ti), el marcador de resistencia del esqueleto del plsmido se expresara, estas bacterias son examinados para detectar y desechar. En el segundo caso (homogenotization), el marcador de resistencia codificada por el esqueleto del plsmido se pierde. Doble recombinacin homloga puede ser confirmado por anlisis de ADN blot de ADN total de la cepa resultante (107). Una variante de este procedimiento utiliza un gen sacB en el esqueleto del plsmido del primer plsmido. Slo la eliminacin de la columna vertebral del plsmido despus de homogenotization hace que la bacteria resistente al crecimiento de la sacarosa (194). Otro mtodo para introducir ADN extraos en la regin T del plsmido Ti implica en primer lugar la introduccin de un replicn ColE1, tales como pBR322, en la regin T de un plsmido Ti. De ADN para ser integrados en el T-regin se clona en un aparte pBR322 derivado de molcula que contiene un segundo marcador de resistencia a antibiticos. Este plsmido se introduce en la alteracin de la tensin de Agrobacterium, y la tensin resultante es seleccionado para la resistencia a los antibiticos segundos. Porque ColE1 replicones no puede funcionar en Agrobacterium, el plsmido pBR322 basada tendra que cointegran en el segmento de pBR322 de la alteracin de T-regin de la expresin estable del gen de resistencia codificada por plsmidos (379). Una modificacin de este procedimiento se utiliz para desarrollar el "split-vector final" del sistema. El uso de este sistema, un gen de inters se clona en un vector basado en pBR322 que contiene un borde derecho del T-ADN, un gen quimrico que nos-nptII para la seleccin de las plantas transgnicas, un marcador de resistencia a la espectinomicina, estreptomicina para seleccionar a la presencia de la plsmido de Agrobacterium, y una regin de homologa con una parte no oncognico de octopina de tipo T-regin. Cointegracin del plsmido con un plsmido Ti falta un borde derecho, pero que contienen el ADN-T regin

homloga restaura la actividad fronteriza y se localiza el gen de inters y el marcador de la planta puede seleccionar dentro de la reconstituida regin T (101). Cada uno de estos mtodos de integracin cis-tiene ventajas y desventajas. La primera estrategia puede dirigirse al gen ajeno a cualquier parte de la regin T (u otra regin en el plsmido Ti). Sin embargo, es complicado de realizar y consiste en un tanto sofisticados procedimientos genticos microbianos que muchos laboratorios rechazados. El segundo mtodo es tcnicamente ms fcil, pero permite cointegracin del gen forneo slo en Ti-plsmido pBR322 lugares donde haban sido colocadas anteriormente. Sin embargo, una modificacin de este procedimiento permite cointegracin de un plsmido pBR322 basada en cualquier regin del plsmido Ti (338, 377). Una de las ventajas de ambos sistemas es que mantienen el gen extrao en el nmero de copias del mismo bajo que el del plsmido Ti de Agrobacterium. Figura. 2. Representacin esquemtica de los pasos involucrados en la sustitucin de genes por doble recombinacin homloga (homogenotization [107, 277]). Las lneas verdes representan las regiones seleccionadas para la ruptura. (A) Un gen de resistencia a los antibiticos (en este caso, que codifica una lactamasa que confiere resistencia a carbenicilina) se ha insertado en el gen diana que ha sido clonado en un plsmido IncP (que contiene un gen de resistencia a kanamicina [kan] en su columna vertebral) e introducido en Agrobacterium. Doble recombinacin homloga se le permite tomar su lugar. (B) Despus de doble recombinacin homloga, el gen alterado se intercambia en el plsmido Ti (PTI). (C) Un plsmido del grupo de incompatibilidad mismo que el primer plsmido se introduce en Agrobacterium. Un ejemplo es el pPH1JI plsmido de la RIPC, que contiene un gen de resistencia a la gentamicina (Gent). (D) Debido a que los plsmidos del grupo de incompatibilidad mismo (en este IncP caso) no puede replicar de forma independiente en la clula, al mismo tiempo, la seleccin de los resultados de resistencia a la gentamicina en el desalojo de la RIPC otro plsmido, en que se ha intercambiado el gen de tipo salvaje. Debido a la complejidad de la introduccin de genes forneos directamente en la regin T de un plsmido Ti laboratorios, varias desarrollado una estrategia alternativa a la utilizacin de Agrobacterium para entregar genes extraos a las plantas. Esta estrategia se basa en conclusiones fundamentales de Hoekema et al. (140) y de Frammond et al. (70). Estos autores determinaron que la regin T y los genes vir se pueden separar en dos replicones diferentes. Cuando estos replicones estaban dentro de la clula de Agrobacterium mismo, los productos de los genes vir podra actuar en trans en la regin T para llevar a cabo de T-ADN tratamiento y la transferencia de una clula vegetal. Hoekema et al. llam a este sistema binario-vector, el replicn que alberga la regin T constituye el vector binario, mientras que el replicn que contiene los genes vir que se conoce como el ayudante de vir. El ayudante general vir plsmido contena una

delecin total o parcial de la T-regin, haciendo que las cepas que contienen este plsmido no puede incitar a los tumores. Un nmero de cepas de Agrobacterium que contiene no oncognico plsmidos auxiliares vir se han desarrollado, incluyendo LBA4404 (242), GV3101 MP90 (181), AGL0 (192), EHA101 y su cepa derivada EHA105 (144, 146), y NT1 (pKPSF2) (247 ). T-ADN de vectores binarios revolucionado la utilizacin de Agrobacterium para introducir genes en las plantas. Los cientficos, sin formacin especializada en gentica microbiana ahora podra manipular fcilmente Agrobacterium para crear plantas transgnicas. Estos plsmidos son pequeos y fciles de manipular, tanto en E. coli y Agrobacterium y generalmente contienen mltiples sitios nicos de restriccin de endonucleasa en el T-regin en la que los genes de inters podra ser clonado. Muchos vectores se han diseado para propsitos especiales, que contienen marcadores de diferentes plantas seleccionables, promotores, y poli (A) Adems de las seales entre las que los genes de inters se podran insertar, potenciadores de traduccin para aumentar la expresin de los transgenes, y la protena de metas de las seales para dirigir el transgn protena codificada a determinados lugares dentro de la clula de la planta (algn representante del T-ADN sistemas vector binario se describen en las referencias 10, 20, 25, 26, 62, 113, 120, 216, 364 y ??386 y en http://www . cambia.org). Hellens et al. (134) proporcionan un resumen de muchas cepas de A. tumefaciens y vectores de uso comn para la ingeniera gentica de plantas. Aunque el trmino "sistema de vector binario" se utiliza generalmente para describir dos componentes (un componente del ADN-T y un componente de ayuda de la boca), cada uno situado en un plsmido separado, la definicin original colocado los dos mdulos slo en replicones diferentes. Estos replicones no necesariamente tienen que ser los plsmidos. Varios grupos han demostrado que el ADN-T, cuando se encuentra en el cromosoma de Agrobacterium, se puede movilizar a las clulas vegetales por un ayudante vir plsmido (141, 224). Cunto ADN puede ser transferido de Agrobacterium para las plantas? El T-regiones de los plsmidos Ti y Ri naturales pueden ser lo suficientemente grande como para codificar decenas de genes. Por ejemplo, el T-regin de pTiC58 es de aproximadamente 23 kpb de tamao. Adems, algunos plsmidos Ti y Ri contienen mltiples T-regiones, cada una de las cuales se pueden transferir a las plantas de forma individual o en combinacin (34, 314). Para los fines de ingeniera gentica de plantas, los cientficos deseen introducir en las grandes instalaciones de T-ADN con la capacidad de codificar productos de mltiples genes en una va biosinttica. Por otra parte, la reintroduccin de grandes regiones del genoma de una planta en una planta mutante puede ser til para identificar, por la complementacin gentica, los genes responsables de un fenotipo particular. Qu tamao de T-regin se pueden transferir a las plantas?

Miranda et al. (224) demostraron que mediante la inversin de la orientacin de un borde derecho del T-ADN, que podra movilizar a todo un plsmido Ti, aproximadamente 200 kpb, en las plantas. Aunque el evento fue poco frecuente, este estudio demostr que las molculas de ADN de gran tamao podran ser introducidos en las plantas mediante transformacin Agrobacteriummediated. Hamilton et al. (124) demostr por primera vez la transferencia dirigida de grandes molculas de ADN de Agrobacterium a las plantas mediante el desarrollo de un sistema binario BAC (BIBAC) del sistema. Estos autores mostraron que un inserto de 150 kpb clonado del ADN humano podra ser introducido en las clulas vegetales mediante el uso de este sistema. Sin embargo, la transferencia eficaz de este segmento de ADN de gran tamao requiere la sobreexpresin de uno o ambos virG virG y Vire. VirE2 codifica una protena de ADN de cadena sencilla vinculante que protege el ADN-T de la degradacin en la clula vegetal (275). Porque virG es un activador de la transcripcin de los operones vir (303), expresin de copias de este gen vir regulacin fue pensado para mejorar la expresin de protenas Vir VirE2 y otros involucrados en la transferencia de T-ADN. La sobreexpresin de Vire formado parte del sistema de BIBAC que se utiliz para transformar grandes (30 - 150 kpb) fragmentos de ADN en el tabaco y el tomate ms recalcitrantes y Brassica (56, 103, 123, 125). Sin embargo, la transferencia de diferentes tamaos T-ADN de varias cepas de Agrobacterium tena diferentes requisitos para la sobreexpresin de virG y vire (103). Liu et al. (203, 204) desarroll un sistema artificial transformationcompetent vector cromosoma basado en un origen de replicacin y P1 utiliza este sistema para generar bibliotecas de gran tamao (40 - 120 kpb) de Arabidopsis y las molculas de ADN de trigo. Este sistema no requiere la sobreexpresin de virG o vire a efectuar la transferencia precisa de grandes fragmentos de Arabidopsis. Lo que el ADN es transferido desde Agrobacterium a las plantas? T-ADN fue inicialmente definido como la parte (la regin T) del plsmido Ti que fue trasladado de Agrobacterium a clulas de plantas para formar tumores agalla de la corona. T-ADN repetir secuencias definidas las fronteras de la regin T (366), y las regiones del plsmido Ti fuera de estas fronteras no se encontraron inicialmente en las clulas tumorales (43). Sin embargo, la transferencia de plsmido Ti secuencias fuera de la regin T convencionales pueden en un primer momento se han perdido debido a la falta de seleccionable conocido (por ejemplo, la tumorignesis) o screenable (por ejemplo, la produccin de opinar) marcadores. Ooms et al. (241) observaron la incorporacin al ADN de las plantas de las regiones del plsmido Ti ms tarde demostrado que fuera de los clsicos del T-ADN de las fronteras. Ramanathan y Veluthambi (264) tambin mostr que un casete de nosnptII, situado fuera de la frontera de T-ADN a la izquierda, podra ser transferida y confieren resistencia a la kanamicina en las clulas infectadas por el tabaco.

El uso de vectores binarios relativamente pequea del ADN-T hizo ms fcil para los cientficos para evaluar la transferencia de la "no-T-ADN" a las plantas de las regiones. Martineau et al. (211) por primera vez la transferencia de secuencias de vectores binarios de columna vertebral en el ADN de plantas transgnicas y cuestion la definicin de T-ADN. Wenck et al. (356) encontr que el vector binario completo, incluyendo secuencias de columna vertebral, as como secuencias de ADN-T, con frecuencia podran ser transferidos a Nicotiana plumbaginifolia y las clulas de Arabidopsis thaliana. Kononov et al. (182) examin cuidadosamente la estructura de las secuencias del vector binario columna vertebral que se puede encontrar hasta en un 75% de las plantas transgnicas de tabaco y la conclusin de que dicha transferencia podra resultar de saltar a la izquierda de T-ADN en la frontera de T-ADN fue procesada a partir del binario vector o el inicio de T-ADN de transferencia desde el borde izquierdo para traer secuencias del vector columna vertebral en las clulas vegetales. Teniendo en cuenta la observacin anterior por Durrenberger et al. (91) que VirD2 protena covalentemente pudo unirse al extremo 5 de la cadena no-T-ADN, Kononov et al. sugiere que la transferencia de secuencias de vector columna vertebral de las plantas fue una consecuencia natural del mecanismo de VirD2 funcin. Por lo tanto, la definicin de T-ADN y la columna vertebral de vectores constituye un argumento semntico. Parece, pues, que la transferencia de no tDNA secuencias a las plantas puede ser un resultado inevitable, pero con frecuencia no observadas y no probada, de la transformacin. De hecho, Frary y Hamilton (103) observaron la incorporacin de BIBAC secuencias de plsmido en 9 a 38% de los transformantes de tomate a prueba. Debido a la presencia de ADN caracterizado en las plantas transgnicas es importante que las preocupaciones regulatorias, este enfoque puede ser til en el futuro para la produccin de plantas (especialmente difcil para transformar especies), con una composicin ms alta se define transgnicos. La transferencia de mltiples T-ADN en la clula vegetal mismo, y la generacin de "Marcador-Free" Plantas transgnicas Debido a la preocupacin por la propagacin de los genes de resistencia a los antibiticos en la naturaleza o el escape de genes de resistencia a herbicidas a especies silvestres de malezas, los cientficos han desarrollado varios mtodos para generar marcadores libre de plantas transgnicas. Estas plantas seran inicialmente seleccionadas por su resistencia a un antibitico o un herbicida, pero el marcador de seleccin sera eliminado en la manipulacin posterior y el crecimiento de las plantas. Varios mtodos han sido propuestos para eliminar el marcador de seleccin de los transformantes primarios. Estos incluyen el uso de un sistema de recombinacin especfica de sitio, como Cre-salmn o Flp Frt-(2, 19, 57, 209, 235, 347, 348) para eliminar el marcador, transposn basado en el movimiento del marcador de seleccin de la inicial del sitio de insercin del genoma de la planta entera o no vinculados a otro sitio desde el cual puede ser segregados en las generaciones subsiguientes (93), o el uso de

mltiples T-ADN que se puede insertar en sitios no vinculados a la segregacin futuro (revisado en las referencias 142 y 372). Cada uno de estos sistemas tiene ventajas y desventajas. Por ejemplo, la supresin de genes marcadores con un sitio especfico de sistema de recombinacin requiere la introduccin de la recombinasa especfica de sitio en las plantas, ya sea por transformacin gentica o por cruce. La segregacin de los marcadores puede ocurrir slo en la descendencia cuando se la generacin de la planta transgnica inicial y se limita a las especies naturales propagan a travs de la semilla y no los propagan vegetativamente. Las primeras investigaciones que caracteriza el patrn de integracin de TADN en los tumores de la agalla de corona indic que cada uno de los dos TADN codificado por un plsmido Ti octopina de tipo independiente podra integrarse en el genoma de la planta, a veces en varias copias (43, 63, 314 ). El anlisis molecular sugiere que los T-ADN puede ser integrado en los sitios enlazados. Estos resultados sugieren que co-transformacin se puede realizar la integracin de los transgenes llevado por dos diferentes TADN y que tal vez estos de T-ADN que se segregan en las generaciones posteriores. Tres enfoques fueron utilizados posteriormente para la cotransformacin: (i) la introduccin de dos T-ADN, cada uno de una bacteria diferente, (ii) la introduccin de dos T-ADN realizado por replicones diferentes dentro de la misma bacteria, y (iii) la introduccin de la de dos TADN se encuentra en el mismo replicn en una bacteria. Los primeros experimentos con estos distintos enfoques indic que cotransformacin podra ser un caso frecuente. An et al. (9) demostr que las clulas del tabaco podra ser cotransformed a dos diferentes fenotipos de una sola cepa de Agrobacterium que contienen un plsmido Ti (fitohormonas independiente de crecimiento) y un vector binario de T-ADN (resistentes a la kanamicina de crecimiento). Este experimento representa un "un esfuerzo de dos replicn" para la co-transformacin. Cuando las clulas fueron seleccionados para la resistencia a la kanamicina, de 10 a 20% de ellos tambin se muestra fitohormona independiente de crecimiento, cuando las clulas fueron seleccionados para la fitohormona independiente de crecimiento, el 60% del resultado callos eran tambin resistentes a la kanamicina. Los autores acreditan estas frecuencias diferentes a la mayor nmero de copias (5-10) del vector binario de la bacteria en relacin con la copia del plsmido Ti solo. Estos experimentos se extendieron por el de Frammond et al. (69), que mostr que las plantas transgnicas frtiles pueden regenerarse a partir de tejido del tabaco que fue clonado cotransformed de T-ADN de un plsmido Ti y de un micro-Ti (el de una cepa, dos replicn enfoque). Los dos T-ADN separados en plantas de la progenie, lo que indica que el T-ADN se haban integrado en loci genticamente separables. Otros grupos han utilizado la onestrain, dos replicn enfoque para generar plantas transgnicas que expresan un principio tanto del T-ADN marcadores pero que posteriormente podran segregar los marcadores de los dems (58). Depicker et al. (80)

realiz un experimento similar en el que los marcadores de seleccin se fitohormona independiente del crecimiento y la sntesis de la nopalina (codificada por un plsmido Ti) y el crecimiento resistentes a la kanamicina (codificado por un vector binario de T-ADN). Se realiz el experimento de dos maneras: o bien los dos T-ADN fueron entregados por dos diferentes cepas de Agrobacterium (las dos cepas, dos replicones enfoque), o ambos TADN fueron lanzadas, desde un nico replicn en una cepa (la onestrain , un enfoque replicn). Los resultados de estos experimentos indicaron que cotransfer de T-ADN del plsmido mismo en una de ellas fue mucho ms eficaz que fue la transferencia a partir de dos cepas diferentes. El uso de una cepa de Agrobacterium solo cotransform plantas con dos T-ADN de la misma replicn, seguida por la segregacin del gen de seleccin para generar marcadores libre de plantas transgnicas, ha sido descrito por Komari et al. (178) y Xing et al. (365). En cada uno de estos estudios, los autores fueron capaces de generar marcadores de plantas libres de transgnicos a alta frecuencia. El uso de dos cepas de Agrobacterium para ofrecer diferentes T-ADN de las clulas de la misma planta fue estudiada por una serie de grupos (65, 66, 67, 76, 217). Aunque cotransfer de T-ADN a los sitios no vinculados genticamente se inform, algunos autores tambin informaron de una estrecha vinculacin de los dos diferentes T-ADN en muchos casos. Por lo tanto, no est claro cul de los tres protocolos de cotransformacin ser reproducible mejor para la generacin de marcador de plantas libres de transgnicos. Expresin de genes de virulencia y la transformacin de plantas El tratamiento y la transferencia de T-ADN de Agrobacterium a las clulas vegetales est regulada por la actividad de los genes vir. La actividad de genes de virulencia es inducida por los compuestos fenlicos inducidos por la planta de heridas, tales como molculas acetosiringona y relacionados (28, 74, 75, 92, 228, 293, 295, 298, 300). Sin embargo, puede haber casos en los que los cientficos quieren inducir los genes vir a niveles superiores a la realizada por extractos de plantas. Varios grupos han identificado por lo tanto, los mutantes vira y virG que la funcin constitutiva, en la ausencia de inductores fenlicos. Constitutiva mutantes vira se caracteriza por varios grupos (13, 218, 253). Sin embargo, ms nfasis se ha puesto en inductor independiente de mutantes virG, posiblemente debido a virG funciones aguas abajo de Vira. Amplia estudios genticos como resultado la identificacin de una serie de mutaciones que hacen que la protena Virg activo en la ausencia de compuestos que inducen fenlicos (127, 254). Estas protenas alteradas contienen mutaciones que convierten de asparagina-54 en cido asprtico (virGN54D) o isoleucina-106 a la leucina (virGI106L). Ambas protenas mutantes estimulado un alto nivel de expresin de los genes vir, especialmente cuando se expresa de un alto nmero de copias del plsmido (118). Cuando se prob en el tabaco transitorio y ensayos de maz de transformacin, las cepas que contienen el mutante virGN54D a cabo un

mayor nivel de transformacin que se codifica el gen de las cepas de tipo salvaje virG (130). Un efecto an mayor se observ cuando el alelo virGN54D fue albergado en un plsmido de alto nmero de copias, la presencia de este gen mutante en el Agrobacterium aumentado la transformacin transitoria de arroz y soja entre dos y siete (170). Varios laboratorios han determinado el efecto de las copias adicionales de genes virG de tipo salvaje en la induccin de genes vir y transformacin de plantas. Rogowski et al. (273) mostraron que las copias adicionales de tipo nopalina virG dio lugar a una mayor expresin de genes vir. Liu et al. (200) mostraron que las copias mltiples de virG alterado el perfil de respuesta de pH para la induccin de genes vir. Normalmente, la induccin de genes vir es muy pobre con un pH neutro o alcalino, o en medio rico; copias adicionales de virG permite un alto grado de induccin en medio rico, incluso a pH 8,5. Copias adicionales de virG tambin aument la frecuencia de transformacin transitoria de los tejidos del arroz, el apio y la zanahoria (199). Teniendo en cuenta estos resultados en su totalidad, se puede concluir que el aumento del nmero de copias de Vira o virG o disminuir la dependencia de las protenas codificadas en inductores fenlicos en general, aumentara la eficiencia de transformacin de las cepas resultantes. Sin embargo, la situacin es probable que sea ms compleja. Belanger et al. (23) demostraron que los genes individuales vira puede ser especialmente adecuado para funcionar en ciertos contextos genticos y Krishnamohan et al. (183) ha demostrado recientemente que los plsmidos Ti puede haber evolucionado para optimizar las combinaciones especficas de Vira, virG, y las cajas de vir. Como se seal anteriormente, la pTiBo542 plsmido Ti en el fondo C58 cromosmicas es hipervirulenta en ciertas especies de leguminosas, posiblemente debido a un gen asociado virG (41, 146, 159), pero no en su nativo Bo542 fondo cromosmicas (143). Los resultados recientes de mi laboratorio indican que la induccin de genes vir y la produccin de T-cadena por la eficiencia y la transformacin de determinadas cepas de Agrobacterium no se correlacionan bien. A. tumefaciens A277, que contiene el plsmido Ti pTiBo542 en el fondo C58 cromosmicas, es mucho ms virulenta que las cepas A348 y A208, que contenan los plsmidos Ti pTiA6 y pTiT37, respectivamente, en el fondo mismo cromosoma. Sin embargo, la induccin de genes vir por exudados de plantas y la produccin de T-cadena son los ms altos en A. tumefaciens A208 (L.-Y. Lee y Gelvin SB, datos no publicados). Estos datos sugieren que la induccin de genes vir mayor y T-cadena de produccin no necesariamente pueden ser predictores confiables de la eficiencia de transformacin. T-ADN de Integracin y la expresin del transgn transformacin de la planta no siempre se traduce en la expresin del transgn eficiente. La literatura est repleta de ejemplos de los niveles de expresin variable de los transgenes, que a menudo no se correlacionan con

el nmero de copias del transgn (vase, por ejemplo, referencia 255). Esta falta de correspondencia fue inicialmente atribuido a los efectos de posicin, es decir, la posicin dentro del genoma en el que los integrados T-ADN fue acreditado con la capacidad de los transgenes que expresan. T-ADN podran integrar cerca o lejos de la activacin de la transcripcin o elementos potenciadores, lo que resulta en la activacin (o su ausencia) de T-ADN realizado transgenes (22, 35, 296, 308). T-ADN tambin podran integrarse en regiones transcripcionalmente competente o en silencio transcripcional del genoma de la planta. El alto porcentaje (30%) de los eventos de integracin de T-ADN que result en la activacin de un transgn reportero promotor situado cerca de la frontera de T-ADN sugieren que el T-ADN preferentemente puede integrarse en regiones transcripcionalmente activas del genoma. Slo los eventos de integracin que unira el transgn promotor con un activo promotor se traducira en la actividad del reportero (180). Sin embargo, un inconveniente para algunos de estos experimentos fue que los eventos transgnicos pueden estar sesgados por la seleccin de plantas resistentes a los antibiticos que expresan un gen marcador antibitico realizado por el T-ADN. No est claro si el ADN-T inserciones en regiones transcripcionalmente inerte del genoma que han pasado desapercibidos debido a la falta de expresin del gen marcador de resistencia a los antibiticos. Una manera obvia de evitar los problemas de la supuesta influencia de la posicin es la integracin de T-ADN en conocidas regiones transcripcionalmente activas del genoma de la planta. Sin embargo, la orientacin de genes en las plantas mediante recombinacin homloga ha sido el mejor de los extremadamente ineficiente (72, 173, 223, 237, 238, 269, 270). Un sistema alternativo para la seleccin de genes es el uso de sistemas de integracin en sitios especficos, tales como Cre-lox. Sin embargo, una sola copia transgenes introducidos en un sitio de salmn en la misma posicin del genoma de la planta tambin mostraron niveles variables de expresin de los transformantes independientes. El silenciamiento de transgenes en estos casos puede ser el resultado de la metilacin del ADN transgnico (61). Metilacin asociados, el silenciamiento se inform a principios de origen natural del T-ADN genes (135, 340). Por lo tanto, el silenciamiento transcripcional puede ser consecuencia de la integracin de los transgenes en las regiones del genoma de la planta susceptible a la metilacin del ADN y puede ser una consecuencia natural del proceso de transformacin de plantas. Ahora sabemos no slo que los transgenes silenciar los resultados de "transcripcin" de mecanismos, por lo general asociados con la metilacin del promotor del transgn (222), sino tambin que el silenciamiento de transgenes es a menudo "posttranscriptional", es decir, el transgen se transcribe, sino que es el resultado de ARN inestables (219). El silenciamiento de genes tales posttranscriptional se asocia con frecuencia copias de transgenes mltiples dentro de una clula. Las plantas transgnicas generadas por mtodos directos de transferencia de ADN (por

ejemplo, polietileno glicol, o la transformacin mediada por liposomas, electroporacin, o el bombardeo de partculas) a menudo integran un gran nmero de copias del transgn en las matrices de repeticin en tndem o invertido, en loci mltiples o individuales ( 176). Aunque la transformacin de Agrobacteriummediated por lo general resulta en un menor nmero de copias de transgenes integrados, es comn encontrar copias en tndem de unos pocos T-ADN integrados en un solo lugar (165). Silenciamiento de transgenes puede ocurrir en las plantas que alberga un nico e integrado de T-ADN (95). Sin embargo, la integracin de las repeticiones de ADN-T, sobre todo repeticiones invertidas de cabeza a cabeza "en torno a la frontera de T-ADN derecha, con frecuencia resulta en el silenciamiento del transgn (51, 164, 304). Por lo tanto, una cepa de Agrobacterium procedimiento o que se podran utilizar para generar plantas transgnicas con un nico e integrado de T-ADN podra ser una bendicin para la industria de la biotecnologa agrcola y biologa molecular de plantas en general. Grevelding et al. (117) seal que plantas transgnicas de Arabidopsis derivada de un procedimiento de transformacin de raz tienden a tener menos del T-ADN inserciones que se derivan de las plantas de discos de hojas. Sin embargo, no est claro si esta observacin puede ser aplicable en general a otras especies vegetales. La informacin anecdtica de varios laboratorios indican que las cepas de Agrobacterium que son menos eficientes en la entrega de T-ADN puede ser ms eficiente en la produccin de una sola copia del ADN-T inserciones. Sin embargo, estos hallazgos deben ser probados rigurosamente, es posible que el ADN-T el nmero de copias tambin se pueden correlacionar con el estado de crecimiento de la bacteria o las plantas a transformar. El uso de las Regiones de Fijacin a la Matriz Para mejorar silenciamiento del transgn En la actualidad, la generacin de una sola copia de las plantas transgnicas es todava un poco al azar. Los cientficos suelen producir un nmero relativamente grande de los transformantes independientes y la pantalla para que las plantas que contienen una sola copia del ADN-T de insercin. Mejor de los casos, esto puede ser una molestia mucho tiempo. Sin embargo, para las especies de importancia agronmica, los cultivares de lite, o lneas que son recalcitrantes a la transformacin, puede convertirse en un paso limitante. Una alternativa a este enfoque puede ser la generacin de plantas transgnicas que contienen unas cuantas copias de T-ADN que estn aislados unos de otros. Un mecanismo propuesto para lograr esto es a los transgenes en el flanco de T-ADN con las regiones de unin de la matriz (Marte). Marte son secuencias de ADN que o bien estn asociadas con el cromosoma "matrices" en forma aislada o puede asociarse con estas matrices in vitro (121, 122, 294, 350). Entre otras propiedades, que se han atribuido el papel de los genes de aislamiento dentro de un dominio de la cromatina en bucle de la transcripcin de activacin o silenciamiento de los efectos de los campos vecinos. En las clulas

animales, como los efectos de aislamiento pueden hacer que la expresin del transgn proporcional al nmero de copias del transgn (306). Sin embargo, algunos de los MARs inicialmente utilizado en los experimentos con animales tambin pueden contener elementos potenciadores, confundiendo la interpretacin de los experimentos originales (29, 259). Cuando los transgenes flanco entregados a las centrales a travs de transformacin mediada por Agrobacterium, Marte parecen tener slo un efecto pequeo sobre la expresin del transgn (128, 198, 201, 225, 226, 227, 334). Mayores aumentos en la expresin del transgen se han observado con bombardeo de partculas mediada por la transformacin (5, 6, 236). Sin embargo, este aumento se asocia generalmente con la expresin de transgenes en clulas de las plantas en lugar de plantas enteras (330, 333). Es posible que los efectos de los transgenes ms alta expresin de Marte usando el bombardeo de partculas refleja el nmero transgn copia mayor integracin resultante de esta tcnica en comparacin con el nmero de copias relativamente ms bajos de T-ADN integrado entregado por Agrobacterium (7). Como tal, no est claro si Marte ser, por su propia cuenta, de gran utilidad para reducir el silenciamiento de transgenes entregados a las centrales de transformacin mediada por Agrobacterium. El uso de supresores virales de silenciamiento de genes para aumentar la expresin del transgn Los datos recientes de una serie de laboratorios indican que algunos virus de plantas, tanto de virus ADN y ARN, contienen genes que suprimen el silenciamiento de genes (4, 11, 21, 31, 38, 55, 169, 210). Varios investigadores han especulado que antisilencing viral ha evolucionado como un mecanismo para que los virus para evadir la defensa de la planta a travs de silenciamiento de los genes virales (55, 266). Independientemente de la razn y el mecanismo de antisilencing, supresores virales de silenciamiento puede ser til para mitigar el silenciamiento de transgenes. Como se indica en algunas de las referencias citadas anteriormente, los supresores virales de silenciamiento de los genes puede activar un transgn estable antes silenciadas. Uno podra preguntarse si tales supresores silenciador podra evitar el silenciamiento de transgenes introducidos en las plantas de forma estable por transformacin mediada por Agrobacterium. Aunque esta hiptesis an no ha sido probado y las posibles consecuencias negativas (como el aumento de la susceptibilidad del virus) pueden derivarse de la incorporacin estable de los genes antisilencing en un genoma de la planta, los experimentos en los que los supresores de silenciamiento viral han sido utilizados para aumentar los niveles de la expresin transitoria de Agrobacterium transgenes introducidos parecen prometedores. O. Voinnet y sus colegas (datos no publicados) han demostrado recientemente que cuando cotransformed con transgenes que codifican varias protenas verdes fluorescentes, el virus de la papa Y Nia protena, o tomate Cf-9 y CF-4 protenas resistencia a las enfermedades,

varios supresores de silenciamiento viral aument drsticamente la expresin de estas protenas otros. Los niveles de expresin de hasta 50 veces superiores a los alcanzados en las transformaciones de control (que carecen de los genes supresores de silenciamiento viral) se obtuvieron. Varios supresores de silenciamiento viral diferentes, incluyendo la protena p25 de PVX, la protena P1-HcPro del virus del grabado del tabaco, y la protena p19 del virus de la atrofia de tomate espesa, fueron capaces de mejorar la expresin del transgn transitoria tanto del promotor del virus del mosaico de coliflor 35S y del promotores nativos transgn. De estos, la protena p19 fue el ms efectivo, tanto en el aumento transitorio la expresin del transgn y la disminucin de los niveles de pequea (21 - 25 pb) las molculas de ARN asociada con el silenciamiento gnico postranscripcional. Los autores concluyeron que los supresores virales de silenciamiento de los genes podra ser til para la produccin de grandes cantidades de protenas en las plantas. Cuando la expresin del transgn no es para siempre Experimentos para expresar transgenes en las plantas inicialmente utiliz elementos, como el virus del mosaico de la coliflor 35S y 19S promotores o promotoras opinan sintasa, que expresan el transgen de una manera relativamente constitutiva (24, 133, 179, 196 , 234, 280, 343). Sin embargo, como los experimentos de ingeniera gentica de plantas se hizo ms refinada, los cientficos recurrieron a los promotores regulados que expresan un transgn en un determinado patrn de desarrollo, medio ambiente, o en tejidos especficos. Los sistemas fueron desarrollados tambin que permitira a los cientficos para inducir la expresin de los transgenes a voluntad, lo que permite la sobre-expresin de un determinado producto o la expresin de un producto que puede ser txico durante ciertas etapas del desarrollo de la planta. Estos sistemas inducible incluidos los regulados por la tetraciclina (108), alcohol (279), cobre (221), choque trmico (284), y las hormonas esteroides (14, 282) (vase la referencia 158 para una revisin reciente de los sistemas de induccin del gen inducible qumicamente ). Muchos de estos sistemas con fugas, lo que permite la expresin de transgenes en las condiciones noninduced. Puede haber casos, sin embargo, cuando uno no quiere un transgn o su producto para estar presente despus de las primeras horas o das despus de la transformacin. Dichos rasgos son los que ayudan en el proceso de transformacin en s o que efecto reordenamientos de ADN de plantas deseadas slo durante el evento inicial de transformacin (por ejemplo, la orientacin de genes usando sitespecific sistemas de recombinacin). Dos estrategias se estn desarrollando actualmente para permitir la expresin transitoria nica de productos de los genes en las plantas. Estas son el uso de "nonintegrating" sistemas tDNA y la transferencia de las protenas, en lugar de las molculas de ADN, de Agrobacterium a las clulas vegetales. Nonintegrating T-DNA de los sistemas incluyen el uso de cepas mutantes de Agrobacterium y / o clulas de las plantas que son competentes en T-ADN

de transferencia nuclear, pero deficiente en la integracin de T-ADN. Durante un registro para los dominios de VirD2 necesarias para la orientacin nuclear de la T-DNA, Shurvinton et al. (290) se define un dominio C-terminal, denominado, que mostr alta homologa de secuencia de aminocidos de los genes virD2. A pesar de este dominio no se requiere tanto para la actividad endonucleasa VirD2 o nucleares objetivo de la TADN, la sustitucin de cuatro aminocidos conservados por dos residuos de serina dio lugar a una protena mutante que hizo el esfuerzo de codificacin Agrobacterium muy atenuada en la virulencia. Narasimhulu et al. (233) y Mysore et al. (229) mostr adems que las cepas de Agrobacterium albergar esta sustitucin VirD2 fueron muy deficientes en la transformacin estable (con un 2% de la eficiencia de las cepas de tipo salvaje), pero an eran capaces de transformar las clulas de la planta transitoria en el 20% de la eficiencia de tipo salvaje cepas. Por lo tanto, esta mutacin prestados cepas de Agrobacterium muy deficiente en la integracin de T-ADN, pero sigue siendo relativamente competentes en la entrega de T-ADN al ncleo de la planta. Este mutante VirD2 protena por lo tanto puede ser utilizada para combatir T-hilos en el ncleo, donde se pueden expresar de forma transitoria, pero no integrar de manera eficiente. Nam et al. (231) utilizaron una prueba para detectar la raz de casi 40 ecotipos de A. thaliana por su capacidad de ser transformados por Agrobacterium. Entre estos ecotipos, UE-1 se transforma fcilmente de forma transitoria, pero mal transformado de forma estable. Caracterizacin gentica y molecular de este ecotipo indic que el bloque en la transformacin se produjo en la etapa de integracin del ADN-T. Nam et al. (232) ms identificado un gran nmero de Arabidopsis mutantes de insercin de T-ADN que eran resistentes a la transformacin de Agrobacterium (mutantes rat). Del perodo inicial de 21 mutantes, 5 fueron transitoriamente transformado de manera eficiente, pero fueron muy recalcitrantes a la transformacin estable, un fenotipo asociado con una deficiencia en la integracin de T-ADN. Mysore et al. (230) caracteriza uno de estos mutantes, el mutante rat5, con mayor detalle. Este mutante se gener mediante la insercin de T-ADN en la regin 3 no traducida del gen de la histona H2A (HTA1). Los datos bioqumicos y moleculares indican que este mutante podra ser transitoriamente transformado de manera eficiente, sino que la integracin del ADN-T fue interrumpido. Aunque la funcin precisa del gen HTA1 en la integracin del ADN-T todava no se ha dilucidado, transformacin de la raz de este mutante (y quizs otros de TDNA de mutantes deficientes en la integracin) se puede utilizar para la prestacin transitoria del T-ADN, sin eficientes posteriores T-ADN de integracin. El uso del gen HTA1 para mejorar la eficiencia de transformacin de plantas silvestres se discute a continuacin. Vergunst et al. (349) descrito recientemente un nuevo procedimiento para la transferencia de las protenas directamente de Agrobacterium a las clulas vegetales. Este sistema se basa en la capacidad del sistema de secrecin tipo IV de protenas codificadas por los genes y virB

Agrobacterium virD4 la transferencia de ciertas protenas Vir a las clulas vegetales. VirD2, VirE2 y VirF son las tres protenas identificadas hasta la fecha que se pueden transferir por este sistema. Estos autores mostraron que las fusiones traduccionales de la protena recombinasa Cre en el extremo N de cualquiera de VirE2 o VirF podra ser transferido a las clulas vegetales y la recombinacin del efecto en los sitios lox. Asimismo, mostr que el C-terminal de 37 aminocidos de VirF eran suficientes para la transferencia de la protena de fusin. Estos experimentos conducen a la posibilidad de utilizar las protenas Vir como portadores de introducir otras protenas de forma transitoria en las clulas vegetales. Manipulacin de los genes de plantas para mejorar TRANSFORMACIN Respuesta de la planta a la infeccin por Agrobacterium A pesar de los grandes avances se han hecho en la ltima dcada para aumentar el nmero de especies de plantas que se pueden transformar y regenerar con Agrobacterium, muchas especies importantes o las lneas puras siguen siendo muy recalcitrantes a transformacin mediada por Agrobacterium. La cuestin ha surgido a menudo, "Quin tiene el problema de la transformacin, Agrobacterium o el investigador?" El rango de hospederos muy amplio de Agrobacterium, incluyendo las gimnospermas y tal vez menor de plantas phyla, una variedad de hongos, e incluso clulas animales, sugiere que la T- la transferencia de ADN para el receptor (es decir, la exclusin de entrada) no puede ser el problema. Agrobacterium que transitoriamente puede transformar un nmero de estas especies de manera eficiente, incluyendo las especies de importancia agronmica como el maz y la soja (170, 271, 288), sugiere que en muchos casos de T-ADN de integracin puede seguir siendo el paso limitante. Alteracin de las condiciones de cultivo de tejidos, por ejemplo, el uso de antioxidantes en la transformacin de la uva, arroz, maz y soja, ha aumentado la probabilidad de transformar de manera estable los tipos de clulas que pueden ser regenerados (96, 102, 239, 240, 258 ). Sin embargo, tales manipulaciones de las condiciones de transformacin pueden tener limitaciones. Infeccin por Agrobacterium de los tejidos vegetales, en algunos casos resultado de la necrosis de tejidos vegetales. Varios grupos han descrito una necrosis lenta, la difusin de uvas infectadas por cepas de Agrobacterium en particular (79, 263). Ms recientemente, Hansen (129) se describe una respuesta apopttica de maz a la infeccin por Agrobacterium. La respuesta incluy una rpida necrosis de los tejidos y la escisin del ADN nuclear en oligonucleosome del tamao de los fragmentos por nucleasas endgenas y es caracterstico de una cascada de la caspasa-proteasa. La expresin de dos genes supresores de clulas baculovirus muerte, p35 y el IAP, en gran medida inhibe tanto la necrosis del tejido y la escisin del ADN endgeno. La manipulacin de estos genes durante el proceso de transformacin mediada por Agrobacterium por lo tanto puede ser til para aumentar tanto la viabilidad de las clulas de plantas y la eficiencia de

transformacin de las especies de plantas con una respuesta de apoptosis a Agrobacterium. Varios grupos han empezado a identificar los genes de plantas y productos de protena implicada en el proceso de transformacin. Una de las razones de estos experimentos es la esperanza de que la identificacin de estos genes puede llegar a producir en su manipulacin ya sea para mejorar la transformacin o para hacer plantas resistentes a la enfermedad de la agalla de corona. Varios enfoques han sido empleados para identificar estos genes de plantas, incluyendo (i) el uso de la levadura de dos hbridos de sistemas de identificacin de protenas de origen vegetal que pueden interactuar con las protenas de virulencia, (ii) directa "hacia adelante gentica" de seleccin para identificar plantas mutantes que no pueden se transforma, (iii) "gentica inversa" de cribado para detectar si los genes de inters en particular pueden estar involucrados en la transformacin, y (iv) los diversos enfoques genmicos para identificar genes de plantas que pueden ser inducidos o reprimidos despus de la infeccin por Agrobacterium. Identificacin de Genes vegetales que codifican protenas que interactan con las protenas de virulencia de Agrobacterium Varias protenas de virulencia de Agrobacterium se espera que interacte con protenas vegetales. Estos incluyen la forma procesada de VirB2, el componente principal de la T-pilus que se requiere para la transformacin; VirD2, la protena que cubre el extremo 5 de la transfiere T-captulo; VirE2, la protena ADN de cadena nica unin que, presumiblemente, abrigos la Thebra, y VirF, que se transfiere a las clulas vegetales, pero cuya funcin se desconoce. Varias protenas Vir otros que estn en la superficie celular de las bacterias, tales como VirB5 y VirB7 (componentes menores de la Tpilus), y VirB1 (un producto elaborado de VirB1 que se pueden encontrar en el medio extracelular), tambin puede interactuar con protenas en la superficie de las clulas vegetales. Los primeros trabajos (16) utilizados VirD2 como la protena cebo en una levadura de dos sistema hbrido para identificar a un A. thaliana importina (AtKAP, ahora conocido como importina-1) como un socio que interactan. Importina-protenas estn involucradas en la translocacin nuclear de muchas protenas albergar secuencias NLS, y Arabidopsis codifica por lo menos nueve de estas protenas (Bhattacharjee y Gelvin, indito). Ballas y Citovsky (16) mostraron que la interaccin de VirD2 con importina-AtKAP NLS se depende tanto de la levadura e in vitro. La importancia de la importina protenas en el proceso de transformacin con Agrobacterium se ha sugerido recientemente al demostrar que una insercin de T-ADN en el gen importina-7, o la inhibicin antisentido de la expresin de la importina-1 (AtKAP) de genes, los resultados en un muy atenuada fenotipo de la transformacin (Bhattacharjee y Gelvin, indito).

VirD2 tambin interacta con al menos dos protenas de plantas por medio de una levadura sistema hbrido de dos. Deng et al. (78) identificaron tres VirD2 y dos protenas interactan VirE2. Se caracteriza ms a fondo uno de los VirD2 interactores, una de ciclofilina Arabidopsis. Esta protena, como la glutatin S-transferasa fusin, interactu intensamente con VirD2 in vitro. Los autores mostraron que el dominio de interaccin de VirD2 fue en la parte central de la protena, una regin para que no se haba atribuido la funcin anterior. La ciclosporina A, un inhibidor de la ciclofilinas, inhibe la transformacin mediada por Agrobacterium de las races de Arabidopsis y cultivos de tabaco suspensin celular. Los autores sugieren que esta protena vegetal puede servir como un acompaante para ayudar en la Tcomplejo trfico dentro de la clula vegetal. Los experimentos en mi laboratorio identificado un tipo de tomate la protena fosfatasa 2C como socio de la interaccin con VirD2. Esta puede ser la fosfatasa implicada en la fosforilacin y desfosforilacin de un residuo de serina cerca del motivo Cterminal de NLS VirD2. La sobreexpresin de esta fosfatasa en el tabaco transfectadas AP-2 clulas result en disminucin nuclear objetivo de una GUS-VirD2 NLS-protena de fusin, lo que sugiere que la fosforilacin de la regin NLS VirD2 pueden estar implicados en objetivos nucleares del complejo VirD2/T-strand (Y . Tao, Rao P., y Gelvin SB, pendiente de publicacin). Utilizando VirE2 como la protena cebo en una levadura sistema hbrido de dos, Tzfira et al. (329) identificado dos protenas que interactan de Arabidopsis, VIP1 y VIP2. VIP1 pueden estar implicados en objetivos nucleares de la T-complejo debido a la inhibicin antisentido de VIP1 expresin dio lugar a una deficiencia en la orientacin nuclear de VirE2. Tabaco VIP1 plantas antisentido tambin fueron muy recalcitrantes a la infeccin por Agrobacterium. Los resultados recientes sugieren adems un uso para VIP1 en la mejora de la transformacin de plantas: las plantas transgnicas que sobreexpresan VIP1 se hipersusceptibles de transformacin por Agrobacterium (327, 330). VirE2 tambin interacta en la levadura con varias de las protenas de Arabidopsis importina, lo que sugiere que VirD2 y VirE2 puede haber un mecanismo comn de importacin nuclear (Bhattacharjee y Gelvin, indito). Schrammeijer et al. (285) identificaron recientemente un Arabidopsis Skp1 protena como un interactor con el dominio de la caja de VirF. Skp1 protenas pueden estar involucrados en la seleccin protenas como ciclinas que el proteosoma 26S, lo que sugiere que VirF puede funcionar en el establecimiento del ciclo celular de las plantas para obtener una mejor transformacin. La interaccin de VirF con VIP1, pero no VirE2, tambin puede sugerir un mecanismo de rotacin de protenas Vir: si VirF est dirigido a los proteosomas, que puede ayudar a otras protenas de la meta Vir para la protelisis. El T-pilus es esencial para la transformacin mediada por Agrobacterium. Las mutaciones en las protenas de diferentes virB alterar la transformacin,

pero no de T-ADN de procesamiento (301, 344). Como se mencion anteriormente, el principal T-pilus componente es el procesado y cicla VirB2 protena (189), aunque otras protenas de virulencia, incluyendo VirB5 VirB7 y posiblemente, tambin son menores T-pilus componentes (278, 283). Aunque el papel preciso de la Tpilus sigue siendo controvertido, se espera que el T-pili podran interactuar con la pared celular de las plantas o de la membrana. Los experimentos en mi laboratorio han comenzado a abordar los posibles socios plantinteracting con T-pilus componentes. Utilizando una levadura sistema hbrido de dos y la forma procesada, pero no cicla, de VirB2 como cebo de protena, se han identificado dos clases de protenas de Arabidopsis que con fuerza y ??especficamente interactuar con este gran Tpilus constituyentes (H.-H. Hwang y SB Gelvin, datos no publicados). Una de estas clases de protenas de origen vegetal est codificada por un gen de la familia de tres miembros. Aunque la identidad de estas tres protenas relacionadas no se conoce actualmente, sus perfiles de hidroterapia sugieren que contienen dominios que atraviesa la membrana. La interaccin de protenas otra es una GTPasa Rab tipo. Cada una de estas cuatro protenas vegetales en la levadura interacta consigo misma y con los dems, pero no con otras protenas de virulencia de prueba, incluyendo VirB1, VirB1, VirB5, VirD2, VirE2 y VirF. En vivo los datos indican que cada una de estas protenas est implicada en la transformacin mediada por Agrobacterium. Antisentido o RNAi inhibicin de la expresin de los genes que codifican estas protenas en un fenotipo transformacin deficientes. Adems, una lnea de Arabidopsis mutante que contiene una insercin de TADN en la regin promotora de uno de los "desconocidos de protenas" genes tambin es muy recalcitrantes a la transformacin mediada por Agrobacterium. Adelante Seleccin gentica para identificar genes de la planta. Involucrados en transformacin mediada por Agrobacterium Los cientficos han demostrado una base gentica para la susceptibilidad a la enfermedad de la agalla de corona, en algunas especies de plantas (15, 214, 231, 246, 272, 292, 312). En un esfuerzo por identificar los genes involucrados en la planta de transformacin mediada por Agrobacterium, mi laboratorio se embarc en un proyecto importante para identificar el ADN de Arabidopsis mutantes de insercin de T-que son resistentes a la transformacin por Agrobacterium (mutantes rat [232]). Estos estudios han dado como resultado la identificacin de ms de 70 mutantes hasta la fecha. Las funciones de muchos de los genes mutados en el proceso de transformacin han sido revelados por diversos ensayos. Por lo tanto, rat1 (que codifica una protena arabinogalactano) y rat3 (probablemente codifica una protena de la pared celular de las plantas) estn implicados en la adhesin bacteriana a las races (23). Otros genes de ratas que pueden afectar a la estructura de la pared celular son una sintasa xilano (rat4 [232]) y un expansina (A. Kaiser, Kopecki A., Y. Zhu, y Gelvin SB, datos no publicados). Debido a la adhesin bacteriana a los orgenes del mutante

rat4 parece casi normal (A. Matthysse, datos no publicados), RAT4 pueden estar involucrados en la transferencia de T-ADN en el citoplasma. El uso de este enfoque con visin de la gentica, hemos identificado una serie de mutantes otra rata en las etapas posteriores del proceso de transformacin. T-DNA de las inserciones en los genes que codifican - y importins son probablemente bloqueado en el T-ADN nuclear proceso de focalizacin (S. Bhattacharjee, Cao H., J. Humara, Zhu Y., y Gelvin SB, datos no publicados). Otros mutantes, entre ellos el rat5 (a las histonas H2A mutante [230, 232]), rat17, rat18, rat20, y los mutantes rat22, probablemente estn involucrados en la integracin de T-ADN (232). Una insercin de T-ADN entre dos genes de reemplazo muy prximas entre s histona H3 (histona H3 y H3-4-5) tambin se traduce en el fenotipo de la rata (J. Li, Zhu Y., y Gelvin SB, datos no publicados). El hallazgo de que la histona H2A-1 gen afecta a la T-ADN de la integracin ha dado lugar a una caracterizacin ms amplia de este gen. La Arabidopsis de la familia de genes histona H2A incluye 13 miembros. Hemos iniciado un estudio del patrn de expresin de cada uno de estos genes y un examen del papel que cada uno de estos genes pueden jugar en la transformacin mediada por Agrobacterium (370; H. Yi, Fujinuma T., y Gelvin SB, datos no publicados) . La histona H2A-1 gen, codificado por RAT5, se expresa en numerosos tipos de clulas, incluyendo clulas que no se encuentran en rpida divisin. Este patrn de expresin es una caracterstica de un "reemplazo" de genes histona. En las races, el gen se expresa en los primordios de las races laterales, la regin de meristemas, y la zona de elongacin. Curiosamente, la zona de elongacin de la raz es la regin ms susceptible a la transformacin mediada por Agrobacterium (370). Otros experimentos indican que las histonas H2A-1 la expresin gnica y la susceptibilidad a la transformacin Agrobacteriummediated estn altamente correlacionados. As, la expresin de este gen puede ser predictivo de los tipos de clulas que son ms sensibles a la transformacin. El conocimiento de las competencias de transformacin de clulas vegetales puede ser importante para la ingeniera gentica de las especies de plantas recalcitrantes y cultivares. Debido a la mutacin de la histona H2A-1 gen dio lugar a la transformacin disminucin de la raz de Arabidopsis, se examin si la sobreexpresin de este gen podra aumentar la eficiencia de transformacin mediada por Agrobacterium. Plantas transgnicas de Arabidopsis que contienen genmica adicional (230) o cDNA (H. Yi y Gelvin SB, datos no publicados) H2A-1 copias son de dos a seis veces la transformacin ms competentes que son las plantas que contienen el normal histona H2A-1 complemento de genes. Adems, la expresin transitoria de la histona H2A-1 gen de una entrada de T-ADN tanto complementa el mutante rat5 (230) y aumenta la eficiencia de transformacin de los ecotipos de Arabidopsis normalmente sensibles y altamente recalcitrantes (L.-Y. Lee y Gelvin SB, datos no publicados). Finalmente, la sobreexpresin de la histona H2A RAT5-1 gen en

ratas mutantes diferentes (que no sea el mutante rat5) tambin se restaura la capacidad de transformacin (L.-Y. Lee, S. Davis, Sui X, y Gelvin SB, datos no publicados). La expresin del gen es por lo tanto, RAT5 epistticos sobre el fenotipo de los mutantes de rata rata otros y por lo tanto pueden sensibilizar clulas de las plantas de transformacin Agrobacteriummediated. Sugerimos que la sobreexpresin de la histona H2A RAT5-un gen puede mejorar la eficiencia de transformacin de plantas recalcitrantes. Deteccin gentica inversa para los genes de plantas que participan en los genes mediada por Agrobacterium transformacin de plantas codificacin varias protenas que interactan con las protenas de virulencia se han identificado utilizando una levadura sistema hbrido de dos. Tales interacciones son el mejor de los que sugieren un papel de estos genes en la transformacin de plantas. Sus funciones deben ser detectada directamente. Una forma de lograr esto es la inhibicin de la expresin gentica en las plantaciones, utilizando tcnicas tales como el ARN antisentido, RNAi, o mutagnesis. He discutido sobre el uso de ARN antisentido y RNAi para demostrar que VIP1 (un interactor VirE2), una GTPasa Rab, y varias protenas de la funcin no identificados (VirB2 interactores) estn involucrados en transformacin mediada por Agrobacterium. Supresin de la expresin de estos genes puede ser un mtodo para generar plantas resistentes a la enfermedad agalla de la corona. Otro mtodo para evaluar el papel de un gen en particular en la transformacin sera la mutacin de ese gen y despus del ensayo de la susceptibilidad de la planta de transformacin. Sin embargo, en la actualidad la mutagnesis dirigida no es un mtodo eficiente para el uso en las plantas. Un enfoque alternativo gentica inversa consiste en identificar las plantas mutantes que contienen transposones o inserciones de T-ADN en los genes de inters. Varias estrategias basadas en PCR han sido descritas para identificar tales mutaciones nocaut en Arabidopsis (98, 104, 184), tomate (52), y el arroz (157). El uso de una estrategia de este tipo, mi laboratorio ha identificado Arabidopsis mutante que contiene las lneas de las interrupciones en varias importina y importina-genes (supuestamente implicados en el transporte nuclear de la T-complejo) y diversos genes implicados en la estructura de la planta de la cromatina (supuestamente implicados en la integracin de T-ADN en el genoma de la planta). Algunas de estas mutaciones son moderadamente o altamente resistentes a la transformacin mediada por Agrobacterium (S. Bhattacharjee, H. Cao, Humara H., A. Kaiser, Kopecki A., J. Li, Zhao X, y Gelvin SB, datos no publicados ), y contienen ADN T-inserciones en o cerca de genes que codifican importina-7 o importina-3, las histonas diferentes (incluyendo las histonas H2A1, H2A3, H2B5, H2B6, H3-4, H3-5, y H4-1), histonas acetiltransferasas (incluyendo HAC4, HAC6, HAC9, HAC10 y HAC11), y una

histona deacetilasa (hda1). Todava no hemos, sin embargo, establece las funciones precisas de estos genes de la planta en el proceso de transformacin mediada por Agrobacterium. Escobar et al. (97) han descrito recientemente una estrategia inversa novela gentica para producir agallas de la corona de plantas resistentes. Que generaron Arabidopsis transgnicas y las plantas de tomate que expresan de doble cadena de ARN construcciones destinadas a T-ADN codificado auxina y citoquinina oncogenes biosintticas. Estos genes son altamente homlogos entre una gran variedad de diferentes cepas de Agrobacterium. Muchas plantas transgnicas que expresan estas construcciones RNAi eran altamente resistentes a la enfermedad de agalla de la corona dirigido por una amplia gama de cepas oncognicas, aunque no fueron generalmente resistentes a la transformacin mediada por Agrobacterium per se. Un enfoque similar ha sido utilizado para generar agalla de la corona resistente a las enfermedades y las plantas de tabaco de manzana (W. Ream, datos no publicados). Enfoques genmica para identificar genes de plantas que responden a la infeccin de Agrobacterium Como se describi anteriormente (129), las plantas pueden responder a la infeccin por Agrobacterium, y esta respuesta puede implicar la planta la expresin gnica diferencial. Los genes que son inducidos o reprimidos durante las primeras etapas de transformacin mediada por Agrobacterium puede proporcionar metas para la manipulacin de la mquina para mejorar la eficiencia de la transformacin de las especies de plantas recalcitrantes. Varios laboratorios han iniciado investigaciones por consiguiente, para identificar estos genes expresados ??diferencialmente planta. Ditt et al. (83) recientemente investig la respuesta de los cultivos celulares Ageratum conyzoides suspensin a la infeccin por una cepa nontumorigenic supervirulent A. tumefaciens (233). Usando cDNA de amplificacin del polimorfismo de longitud de fragmentos (AFLP) para amplificar fragmentos de 16.000, se identificaron 251 bandas que son regulados diferencialmente 48 h despus de la infeccin. Transcripcin inversa-PCR y anlisis de algunos de estos genes se confirmaron los resultados de los anlisis de cDNA-AFLP. Algunas de estas bandas tambin fueron inducidos o reprimidos de 24 horas despus de la inoculacin. Mientras que la mayora de las bandas investigadas (codificacin, por ejemplo, una RNasa, una quinasa recpetor supuesto, una peroxidasa y una protena relacionada con la patognesis) tambin fueron regulados diferencialmente tras la incubacin de las clulas vegetales con E. coli, cuatro genes, entre ellos uno que codifica una nodulin-como la protena, una respuesta concreta a la infeccin por Agrobacterium. Los autores especularon que este gen nodulin puede responder a las seales de la bacteria para regular la divisin celular de los vegetales o la diferenciacin.

Nuestro laboratorio ha realizado un estudio similar, el uso del tabaco AP-2 o la suspensin cultivos celulares inoculados con cinco diferentes no tumorignicos cepas de Agrobacterium (Veena, Jiang H., Doerge RW, y Gelvin SB, pendiente de publicacin). Una cepa puede transferir ADN-T, pero no VirE2 protena, se podra transferir protenas de virulencia, pero no de TADN, se puede transferir ninguna de las dos y dos pueden transferir tanto. Mediante hibridacin sustractiva supresores seguido por anlisis de ADN y ARN macrochips de muestras de ARN a partir de ocho diferentes puntos de tiempo despus de la inoculacin (de 0 a 36 h), se identificaron ms de 400 genes que son regulados diferencialmente despus de varios perodos de la infeccin. La mayora de estos genes mostraron una respuesta diferencial general de Agrobacterium inoculacin, sin embargo, algunos genes respondi especficamente a un T-ADN y la protena de transferencia de Vircompetente cepa. A unos pocos genes respondi especficamente a T-ADN o protena de transferencia de Vir solamente. Entre los genes que fueron inducidos (o cuya expresin se mantuvo en un nivel alto) fueron las histonas y codificacin de las protenas ribosomales. La actividad de varios genes de plantas respuesta de defensa y el estrs fue reprimida por la infeccin por Agrobacterium. Debido a la importancia de las histonas en el proceso de integracin del ADN-T (230), se propone que la infeccin por Agrobacterium induce la expresin de genes de plantas necesarias para la transformacin y al mismo tiempo la represin de la respuesta de defensa del husped. Un anlisis ms detallado de estos genes expresados ??diferencialmente se notifiquen si desean desempear un papel directo o indirecto en la transformacin de plantas mediada por Agrobacterium. PERSPECTIVAS 1111111 En menos de 20 aos, el uso de Agrobacterium para transformar genticamente plantas ha avanzado de un sueo a una realidad. La biotecnologa agrcola moderna depende en gran medida el uso de Agrobacterium para crear plantas transgnicas, y es difcil pensar en un rea de investigacin de las plantas que la ciencia no se ha beneficiado de esta tecnologa. Sin embargo, an quedan muchos desafos. Muchas especies de plantas de importancia econmica o variedades de lite de las especies en particular, siguen siendo muy recalcitrantes a la transformacin mediada por Agrobacterium, y el da no ha llegado an cuando las flores sern las nicas cosas que vea venir desde los caones de las pistolas de genes. Sin embargo, creo que ese da no est muy lejos en el futuro distante. Tambin siento que Agrobacterium desarrollado hace millones de aos para transformar genticamente un rango muy amplio de organismos, sino que ahora a los cientficos a aprovechar la capacidad natural de esta bacteria. Adems de ampliar la gama de huspedes y la eficiencia de transformacin de plantas mediante Agrobacterium, algunos de los retos pendientes para la comunidad cientfica la biotecnologa se resumen a continuacin. (I) El primero es la utilizacin de Agrobacterium para homloga o dirigida a un sitio de recombinacin. Muchos cientficos consideran que la recombinacin homloga para ser uno de los otros "santos griales" de la biologa molecular de plantas. La capacidad de realizar experimentos de sustitucin de genes se ha convertido en un

elemento bsico de la clula bacteriana, hongos y animales, incluso la investigacin y la biologa molecular. Sin embargo, la recombinacin homloga en las plantas por lo general se produce a 10 5 la frecuencia de recombinacin ilegtima (71, 173, 223, 237, 238, 269, 270). Necesitamos un sistema de transformacin mediada por Agrobacterium que ofrece T-ADN al ncleo de la planta de manera eficiente, pero es deficiente en T-ADN al azar de integracin. (Ii) El segundo se refiere a la expresin del transgn estable y predecible en las plantas. Con demasiada frecuencia, el nivel de expresin de los transgenes en las plantas es muy variable. A menudo, las lneas de plantas transgnicas que son "expresadores bueno" perder esta caracterstica despus de varias generaciones de crecimiento bajo condiciones de campo. Tenemos que entender las funciones de los efectos de posicin, los efectos de la cromatina, y T-ADN patrones de integracin en el silenciamiento gnico transcripcional y postranscripcional con el fin de desarrollar estrategias para mejorar el alcance y la estabilidad de la expresin del transgn. (Iii) La tercera es la manipulacin del genoma del Agrobacterium. La disponibilidad de la A. tumefaciens C58 completar la secuencia genmica (114, 363) nos presenta una oportunidad sin precedentes para investigar Agrobacterium patrones de expresin gnica y las formas en que pueden ser alterados durante el co-cultivo de la bacteria con varias especies de plantas. Esta informacin puede proporcionar pistas a los mtodos para manipular ms de Agrobacterium a fin de efectuar un mayor nivel de transformacin de las especies de plantas recalcitrantes. (Iv) La cuarta es la transformacin de plastidios gentica por Agrobacterium. A pesar de algunas referencias dispersas a la transformacin del cloroplasto por Agrobacterium existen en la literatura (vase, por ejemplo, las referencias 64 y 346), estos informes no han sido confirmadas por la comunidad cientfica. La existencia de secuencias de protenas NLS VirD2 y VirE2 puede garantizar T-ADN dirigido al ncleo. Incluso si estas secuencias NLS pueden ser destituidos sin alterar otras funciones esenciales de estas protenas, el reciente descubrimiento de que el citoesqueleto de actina planta est involucrado en transformacin mediada por Agrobacterium (P. Rao y SB Gelvin, datos no publicados) puede impedir la redireccin de la TEl ADN del ncleo de plstidos. (V) La quinta es la transformacin gentica de hongos patgenos de plantas y animales. Muchos hongos patgenos mdicamente o agronmicamente importantes siguen siendo muy recalcitrantes a la transformacin gentica. Los informes recientes de transformacin mediada por Agrobacterium de varias especies de hongos filamentosos (1, 71) sugieren que la Agrobacterium puede ser un til "gen-maniobras de herramientas" por ms de especies de plantas justo. (Vi) El desafo final consiste en la transformacin gentica de clulas humanas y animales. El reciente informe de la transformacin Agrobacteriummediated gentica de clulas humanas (187) sugiere que la

excitante posibilidad de la utilizacin de Agrobacterium, o los procesos de Agrobacterium como por la terapia gnica humana y animal.